CN104922666A - 超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米医学技术领域，公开了一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物及其制备方法。本发明通过浓硫酸和发烟硝酸氧化石墨得到超小氧化石墨烯，利用超小氧化石墨烯的还原性，还原氯金酸，合成超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料；超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料通过物理吸附及化学键的方式负载蛋白抗原，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物。该复合物制备方法简单，成本低，产率高，得到的超小氧化石墨烯粒径均一，为3-5nm，稳定性好；超小氧化石墨烯-金纳米粒子具有良好的生物相容性，不需要进行化学修饰，可有效提高金纳米粒子对蛋白抗原的负载效率，并提高机体对蛋白抗原的免疫反应尤其是细胞免疫反应效果。
Description
【技术领域】
本发明属于纳米医学技术领域，特别涉及一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物及其制备方法。
【背景技术】
佐剂是疫苗的重要组成部分，缺乏佐剂，绝大多数蛋白抗原很难引起机体强有力的免疫反应。目前应用于人体的佐剂主要是铝佐剂及MF59佐剂，但这两种佐剂难以引起机体强有力的细胞免疫反应即杀伤性免疫反应。
金纳米粒子因为制备方法简单、稳定、生物相容性好等特点在生物上有广泛的应用。目前已经有关于金纳米粒子用于增强机体免疫反应的研究报道。金纳米粒子与蛋白复合物应用于免疫反应主要是增强机体的体液免疫反应即抗体反应；且由于金纳米粒子负载蛋白抗原的能力较低，如果需要提高金纳米粒子对蛋白抗原的负载能力，需要对蛋白抗原进行修饰（如巯基化），这限制了金纳米粒子在机体免疫方面的应用。
【发明内容】
为了克服现有的金纳米粒子在蛋白抗原负载及引起细胞杀伤性免疫反应不足等缺点，本发明的首要目的在于提供一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物，以作为一种新型的佐剂，增强机体的细胞免疫反应。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将浓硫酸和硝酸按体积比10:1-1:1混合后加入石墨，均匀分散后于80-150℃加热搅拌5min-24h，冷却至室温后加水稀释，调节pH值至中性，过滤，取滤液透析，得到超小氧化石墨烯；每毫升硝酸加入10-1000mg石墨；
（2）将水加入步骤（1）的超小氧化石墨烯中，然后加入氯金酸溶液，0-60℃搅拌5min-24h后透析，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料；每一毫克超小氧化石墨烯加入1-100ml水，水与氯金酸溶液的体积比为20:1-200:1；氯金酸溶液与超小氧化石墨烯的质量比为0.1-100:1；
（3）将步骤（2）的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料与蛋白抗原按体积比1:3-10:3混合，室温震荡过夜后离心，取沉淀，除去杂质，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物；所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料与卵清蛋白的浓度比为1:2-2:1。
步骤（1）中：
所述的均匀分散优选为室温水浴超声1-15min；
所述的pH值调节优选采用碳酸氢钠进行调节；
所述的过滤优选采用滤纸进行过滤；
所述的透析优选为于截留分子量1000-10,000Da的透析袋中透析48h；
所述的超小氧化石墨烯的直径优选为3-5nm；
所述的硝酸优选为发烟硝酸或硝酸；
透析得到的超小氧化石墨烯的浓度较低，可以利用真空旋转蒸发仪于70℃进行水浴浓缩，得到黄褐色的超小氧化石墨烯。
步骤（2）中：
所述的透析优选为于截留分子量1000-100,000Da的透析袋中透析24h；
所述的氯金酸溶液优选为10mg/mL的氯金酸溶液；
透析得到的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料的浓度较低，可以利用真空旋转蒸发仪于70℃进行水浴浓缩，得到浓度较高的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料。
步骤（3）中：
所述的离心优选为于4000rpm、4℃离心10min；
所述的除去杂质优选采用以下步骤进行：将沉淀加水或PBS进行重悬，离心洗涤后再加水或PBS进行重悬，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物；
所述的离心洗涤优选为于12000rpm离心洗涤两次；
所述的水均为纯净水。
所述的蛋白抗原优选为病毒性外壳蛋白或肿瘤细胞表面特异性蛋白抗原。
一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合物，由上述制备方法得到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点和有益效果：
（1）本发明通过浓硫酸和硝酸氧化石墨得到超小氧化石墨烯，其制备方法简单，成本低，产率高，达60%，得到的超小氧化石墨烯粒径均一，为3-5nm，可以在培养基和盐溶液中稳定存在，保证了可以作为佐剂的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的生物学效应的稳定性，这对于保证疫苗的稳定是很重要的。
（2）本发明利用超小氧化石墨烯分子自身的还原性，还原氯金酸，原位合成金纳米粒子，形成超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料；超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料通过π-π堆垛、疏水相互作用、静电作用及形成Au-S键等方式负载蛋白抗原，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物。该制备方法简单，价格低廉，所采用的超小氧化石墨烯-金纳米粒子具有良好的生物相容性，能极大的提高金纳米粒子对蛋白抗原的负载效率，并提高了机体对蛋白抗原的免疫反应效果，尤其是细胞免疫反应效果。
【附图说明】
图1是实施例1的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的合成示意图；
图2是实施例1的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的透射电镜照片；
图3是实施例1的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的紫外可见吸收光谱图；
图4是实施例1的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物激发小鼠体液免疫反应性能示意图；
图5是实施例1的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物激发小鼠细胞免疫反应流式细胞分析图；
图6是效果实施例的超小氧化石墨的透射电镜照片；
图7是效果实施例的超小氧化石墨烯在纯水和PBS中分散性能的对比结果图。
【具体实施方式】
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
（1）超小氧化石墨烯的制备：
将15mL浓硫酸和5mL发烟硝酸混合，然后加入0.2g石墨，混合均匀后水浴室温超声10min，然后于120℃搅拌30min，冷却至室温后加入100mL水稀释，并用碳酸氢钠调节pH值到中性；采用滤纸过滤后，将溶液装入透析袋（截留分子量8000Da）中，在水中透析48h（去除溶液中的盐），透析后的溶液即为超小氧化石墨烯，此时制备得到的超小氧化石墨烯浓度较低，采用真空旋转蒸发仪、于70℃进行水浴浓缩，得到黄褐色超小氧化石墨烯。
（2）超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料的制备：
将3mg步骤（1）的超小氧化石墨烯加水稀释至30ml，然后加入150μL、10mg/L的氯金酸溶液，混合后室温搅拌40-45min后，用水透析（透析袋截留分子量50,000Da）24h以去除没有反应的氯金酸，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料；此时制备得到的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料浓度较低，可采用真空旋转蒸发仪、于70℃进行水浴浓缩。
（3）超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备及应用：
取5ml1.5mg/mL步骤（2）制备的超小氧化石墨-金纳米粒子复合材料与3mL1mg/mL的卵清蛋白(OVA)混合，室温下震荡过夜后4000rpm、4℃离心10min，取沉淀用600μL水重悬，12000rpm离心洗涤两次，再用600μL水重悬，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物（即“超小氧化石墨烯-金纳米粒子OVA”）。
取上述超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物进行透射电镜实验；结果如图2所示，从图2可以看出，在超小氧化石墨烯上原位合成了5-10nm的金纳米粒子。超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的紫外吸收光谱如图3所示，从图3可以看出，蛋白抗原已经成功负载在了超小氧化石墨-金纳米粒子复合材料的表面。
以C57BL/6小鼠为模型，比较了OVA、铝佐剂与OVA混合物、超小氧化石墨烯-金纳米粒子OVA引起的小鼠体液和细胞免疫反应性能。
将上述材料按每只小鼠50μg（按OVA的量计算）终体积100μL材料皮下注射免疫小鼠，一周免疫一次，共免疫三次。然后在第一次免疫后第21天摘除眼球取血处死小鼠，收集血清及脾脏细胞。血清用于检测小鼠产生的抗OVA抗体。与OVA及铝佐剂OVA混合物的免疫活性相比，在免疫21天后，超小氧化石墨烯-金纳米粒子OVA能提高小鼠产生抗OVA抗体的能力，结果如图4所示。将脾脏细胞按1×106/孔的量种植于48孔板中，然后与终浓度为10μg/mL的OVA孵育66h后，收集脾脏细胞，利用anti-CD3e-PE及anti-CD4-FITC抗体染色，检测脾脏细胞中OVA特异性CD4+T所占的比例。利用anti-CD3e-PE及anti-CD8a-FITC抗体染色，检测脾脏细胞中OVA特异性CD8+T所占的比例。与铝佐剂OVA混合物的免疫活性相比，超小氧化石墨烯-金纳米粒子OVA不但促进小鼠的抗原特异性CD4+T免疫反应，还能提高机体的CD8+T细胞免疫反应即机体的杀伤性免疫反应，结果如图5所示。
实施例2
（1）超小氧化石墨烯的制备：同实施例1的步骤（1）；
（2）超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料的制备：同实施例1的步骤（2）；
（3）超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备及应用：
取5ml1.5mg/mL步骤（2）制备的超小氧化石墨-金纳米复合材料与3mL1mg/mL的乙肝病毒表面抗原(HbsAg)混合，室温下震荡过夜后4000rpm、4℃离心10min，取沉淀用600μLPBS重悬，12000rpm离心洗涤两次，再用600μLPBS重悬，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物。
取步骤（3）的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物进行免疫小鼠试验，结果显示，与市售的三氧化二铝佐剂相比，所制备的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物更能引起小鼠体内的抗HbsAg抗体产生及细胞杀伤性免疫反应。
实施例3
（1）超小氧化石墨烯的制备：
将10mL浓硫酸和10mL发烟硝酸混合，然后加入0.2g石墨，混合均匀后水浴室温超声10min，然后于120℃搅拌12h，冷却至室温后加入100mL水稀释，并用碳酸氢钠调节pH值到中性；采用滤纸过滤后，将溶液装入透析袋（截留分子量8000Da）中，在水中透析48h（去除溶液中的盐），透析后的溶液采用真空旋转蒸发仪、于70℃进行水浴浓缩，得到黄褐色超小氧化石墨烯。
（2）超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料的制备：同实施例1的步骤（2）；
（3）超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备及应用同实施例1的步骤（3）;
取步骤（3）的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物进行免疫小鼠试验，结果显示，与市售的三氧化二铝佐剂相比，所制备的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物更能引起小鼠体内的抗OVA抗体产生及CD8+T细胞杀伤性免疫反应。
实施例4
（1）超小氧化石墨烯的制备：同实施例1的步骤（1）；
（2）向20mg步骤（1）的超小氧化石墨烯加水稀释至1L，然后加入500μL、10mg/L的氯金酸溶液，混合后室温搅拌24h后，用水透析（透析袋截留分子量50,000Da）24h以去除没有反应的氯金酸，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料；然后用真空旋转蒸发仪、于70℃水浴进行浓缩。
（3）超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备及应用：
取5ml1.5mg/mL步骤（2）制备的超小氧化石墨-金纳米复合材料与1.5mL2mg/mL的乙肝病毒表面抗原(HbsAg)混合，室温下震荡过夜后4000rpm、4℃离心10min，取沉淀用600μLPBS重悬，12000rpm离心洗涤两次，再用600μL PBS重悬，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物。
取步骤（3）制备的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物进行免疫小鼠试验，与实施例2产生的免疫效果一致。
效果实施例
超小氧化石墨烯的制备：将15mL浓硫酸和5mL发烟硝酸混合，然后加入0.2g石墨，混合均匀后水浴超声10min，然后于120℃搅拌30min，冷却至室温后加入100mL水稀释，并用碳酸氢钠调节pH值到中性；采用滤纸过滤后，将溶液装入透析袋（截留分子量8000Da）中，在水中透析48h（去除溶液中的盐），透析后的溶液采用真空旋转蒸发仪浓缩，得到黄褐色超小氧化石墨烯。TEM表明，合成的超小氧化石墨烯的直径为3-5nm，结果如图6所示。超小氧化石墨烯呈现出良好的稳定性，在PBS和细胞培养基中稳定存在，结果如图7所示。
对比实施例
（1）超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备及应用：
取5ml1.5mg/mL实施例1中步骤（2）制备的超小氧化石墨-金纳米粒子复合材料与3mL1mg/mL的卵清蛋白(OVA)混合，室温下震荡过夜后4000rpm、4℃离心10min，取沉淀用600μL水重悬，12000rpm离心洗涤两次，再用600μL水重悬，用bradford方法测定蛋白含量。
（2）金纳米粒子对蛋白的负载:
直径为20nm金纳米粒子制备：取1mL10mg/mL的氯金酸稀释到100mL水中，然后搅拌加热到沸腾，再加入5mL1%的柠檬酸三钠，继续恒温搅拌15min。停止加热，然后继续搅拌直至冷却到室温。
取1mL金纳米粒子，加入100μL1mg/mL的OVA，室温孵育5min后，于15000rpm离心30min，并用水洗涤两次，重悬于100μL水中。用bradford方法测定蛋白含量。结果表明，每毫克金纳米粒子负载蛋白约17μg，而超小氧化石墨烯-金纳米粒子负载的蛋白量大幅提高，每毫克超小氧化石墨烯-金纳米粒子负载蛋白约为200μg。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (12)
1.一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
（1）将浓硫酸和硝酸按体积比10:1-1:1混合后加入石墨，均匀分散后于80-150℃加热搅拌5min-24h，冷却至室温后加水稀释，调节pH值至中性，过滤，取滤液透析，得到直径为3-5nm的超小氧化石墨烯；
（2）通过超小氧化石墨烯原位还原氯金酸制备超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合纳米材料；
（3）于超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合纳米材料表面负载蛋白抗原形成超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物。
2.一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将浓硫酸和硝酸按体积比10:1-1:1混合后加入石墨，均匀分散后于80-150℃加热搅拌5min-24h，冷却至室温后加水稀释，调节pH值至中性，过滤，取滤液透析，得到超小氧化石墨烯；每毫升硝酸加入10-1000mg石墨；
（2）将水加入步骤（1）的超小氧化石墨烯中，然后加入氯金酸溶液，0-60℃搅拌5min-24h后透析，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料；每一毫克超小氧化石墨烯加入1-100ml水，水与氯金酸溶液的体积比为20:1-400:1；氯金酸溶液与超小氧化石墨烯的质量比为0.1-100:1；
（3）将步骤（2）的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料与蛋白抗原按体积比1:3-10:3混合，室温震荡过夜后离心，取沉淀，除去杂质，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物；所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合材料与卵清蛋白的浓度比为1:2-2:1。
3.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的超小氧化石墨烯的直径为3-5nm。
4.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的蛋白抗原为病毒外壳蛋白或肿瘤细胞表面特异性蛋白抗原。
5.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的均匀分散为室温水浴超声1-15min。
6.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的透析为于截留分子量1000-10,000Da的透析袋中透析48h。
7.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的透析为于截留分子量1000-100,000Da的透析袋中透析24h。
8.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的氯金酸溶液为10mg/mL氯金酸溶液。
9.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的除去杂质采用以下步骤进行：将沉淀加水或PBS进行重悬，离心洗涤后再加水或PBS进行重悬，得到超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物。
10.根据权利要求2所述的超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的硝酸为发烟硝酸或硝酸。
11.一种超小氧化石墨烯-金纳米粒子复合物，由权利要求1-10任一项所述的制备方法得到。
12.一种超小氧化石墨烯的制备方法，其特征在于，包括：将浓硫酸和硝酸按体积比10:1-1:1混合后加入石墨，均匀分散后于80-150℃加热搅拌5min-24h，冷却至室温后加水稀释，调节pH值至中性，过滤，取滤液透析，得到直径为3-5nm的超小氧化石墨烯。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150923 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |