CN103412085A

CN103412085A - 一种氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法

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Publication number: CN103412085A
Application number: CN2013103795538A
Authority: CN
Inventors: 秦敏; 杨国友; 张莉; 唐朝辉
Original assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Current assignee: Chengdu Institute of Biological Products Co Ltd
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103412085B

Abstract

本发明公开了一种氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法，包括如下步骤：（1）待测样品的配制（2）牛血清白蛋白溶液的配制（3）按1:4（v/v）的比例，将待检样品液分别与6个浓度梯度的牛血清白蛋白溶液混合，加NaCl至终浓度为5～9mg/ml，混匀，静置吸附，静置时间不低于40min，离心取上清，检测牛血清白蛋白含量。本发明检测方法可以准确检测氨水配制的氢氧化铝佐剂的吸附能力，可重复性强，检测结果真实可靠，为氢氧化铝佐剂质量标准的建立奠定了基础。

Description

一种氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法

技术领域

本发明涉及氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法。

背景技术

氢氧化铝佐剂是被FDA批准使用的人用疫苗佐剂之一，广泛用于疫苗制备，至今已有80多年的历史，目前，国际通用的氢氧化铝佐剂是丹麦生产的Alhydrogel佐剂，国内通常采用氨水制备的氢氧化铝佐剂。

氢氧化铝佐剂吸附能力是疫苗质量标准中最重要的指标之一，其吸附能力与其对抗原的吸附率密切相关，吸附能力越强，对抗原的吸附率越高。而佐剂对抗原的吸附率又与疫苗的免疫效果密切相关，湛琳丽等证实抗原与佐剂的吸附率越高，免疫效果越好；反之免疫效果越差（湛琳丽，温昊，祝明，马金花，徐爱平.铝佐剂的特性及影响因素[J].畜牧市场2009,5:13-15.）；Gupta等也在小鼠中证实，抗原的免疫原性依赖于几方面因素，但最重要的因素之一是佐剂对抗原的吸附率，吸附率越高，免疫效果越明显（Gupta Rk,Rost BE,Relyveld E,et al.Vaccine design:the subunit and adjuvant approach[M].New York:Plenum Press,1995:229-248）。因此，在氢氧化铝佐剂质量标准中吸附能力的检测显得尤为重要，WHO在相关指南中也提出应对疫苗佐剂的吸附能力进行检测。

目前，《欧洲药典》记载了氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法，其可以准确检测Alhydrogel佐剂的吸附能力，但用于检测氨水制备的氢氧化铝佐剂的吸附能力时，检测结果不准确。因此急需找到一种适当的方法以准确检测氨水制备的氢氧化铝的吸附能力，为疫苗生产提供可靠的依据。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法，用以检测氨水制备的氢氧化铝。

本发明氨水制备的氢氧化铝佐剂的吸附能力检测方法，包括如下步骤：

（1）待测样品液的配制：

取氨水制备的氢氧化铝佐剂，稀释，得铝含量为1.3～1.7mg/ml的氢氧化铝溶液；

（2）牛血清白蛋白溶液的配制：

取牛血清白蛋白，配制成如下6个浓度的溶液：1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、8mg/ml及10mg/ml；

（3）按1:4（v/v）的比例，将待检样品液分别与6个浓度梯度的牛血清白蛋白溶液混合，加NaCl至终浓度为5～9mg/ml，混匀，静置吸附，静置时间不低于40min，离心取上清，检测牛血清白蛋白含量。

铝含量，是指氢氧化铝溶液中铝元素的质量，可以如下方法检测：

测定法精密量取供试品适量(约相当于含铝1～10mg)，置250ml锥形瓶中，加磷酸溶液(6→100)1.5ml，使完全溶解，必要时于水浴中加温(难于溶解时尚可适当啬加磷酸量)。精密加入乙二胺四乙酸二钠滴定液(0.05mol/L)10ml、醋酸-酯酸铵缓冲液(pH4.5)(称取醋酸铵7.7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的水稀释至100ml)10ml，置沸水浴上加热10分钟取出冷至室温，加二甲酚橙指示液1ml，用锌滴定液(0.025mol/L)进行滴定，当溶液由亮黄色变为橙色，即为终点，并将滴定的结果用空白试验校正。

按下式计算：

铝含量

(mg / ml) = \frac{(V_{0} - V_{1}) \times c \times 26.98}{V_{2}}

式中V₀为空白试验消耗锌滴定液的体积，ml；

V₁为供试品消耗锌滴定液的体积，ml；

c为锌滴定液的浓度，mol/L；

V₂为供试品的体积，ml;

26.98为铝的分子量或相对原子质量。

步骤（1）中氢氧化铝溶液的pH为5.80～6.05。

步骤（1）所述氨水制备的氢氧化铝佐剂按照如下方法制备：

a、取浓度为4～8%（w/v）的氨水溶液，在温度50℃～70℃的条件下，缓慢加入3～6%（w/v）的AlCl₃溶液中，至pH6～7时，停止加入氨水溶液，继续搅拌20分钟；

b、透析，至残留铵含量低于0.01%，即可。

4～8%（w/v）的氨水，表示一百毫升水中含4～8克氨。

3～6%（w/v）的AlCl₃溶液，表示一百毫升水中含3～6克AlCl₃。

本发明方法可以准确检测氨水法制备的氢氧化铝，准确度高，可重复性好，精密度高，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实验材料和仪器：

氨水制备的氢氧化铝佐剂（样品氢氧化铝佐剂）采用AlCl₃加氨水法经透析除氨后制成，具体地，可以按照如下步骤操作：

（1）三氯化铝（AlCl₃）溶液的配制

配制4～8%的AlCl₃溶液，调节溶液温度至50℃～70℃。

（2）氨水溶液的配制

取25%的氨水溶液，用水稀释，配制成浓度3～6%的氨水溶液。

（3）氢氧化铝的配制

将氢氧化氨溶液缓慢加入AlCl₃溶液中，反应pH6～7时，停止加入氨水溶液，保持上述温度继续搅拌10～30分钟，使其充分反应。

（4）透析

将氢氧化铝溶液装入透析袋中，进行透析。

（5）残留铵含量检测

采用纳氏试剂检测残留铵含量，残留铵含量低于0.01%即为合格品。

（6）收集合并

残留铵含量合格后，将透析袋中的氢氧化铝收集并高压灭菌，即为氢氧化铝佐剂。

对照为Alhydrogel佐剂，购自丹麦Brenntag Biosector公司（批号4675），为国际公认的氢氧化铝佐剂；BSA购自BOVOGEN公司；药用级NaCl，购自天津海光药业有限公司；Sartorius PB-21酸度计购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司。

实施例1采用欧洲药典方法检测氢氧化铝佐剂的吸附能力

1、实验方法

将样品氢氧化铝佐剂和丹麦Alhydrogel佐剂按照《欧洲药典》方法进行吸附能力检测：

将样品氢氧化铝佐剂和对照佐剂稀释至铝含量为5mg/ml，分别与pH为6.0的0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml6个浓度的BSA溶液，按1:4的比例混合，使最终铝含量为1mg/ml，混匀后室温静置吸附1小时，离心取上清，采用Lowry法对上清液中残留的BSA蛋白含量进行检测。

合格标准：3个低浓度BSA溶液的上清液中应检测不到蛋白；3个高浓度BSA溶液的上清液中检测到的残留蛋白，且蛋白含量呈浓度梯度。

2、实验结果

实验结果如表1所示：

表1样品佐剂和对照佐剂检测结果（上清中残留蛋白含量mg/ml）

检测结果显示：采用对照佐剂吸附时，3个低浓度BSA溶液中无蛋白残留，3个高浓度BSA溶液中的残留蛋白呈浓度梯度，符合合格标准；采用氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附时，各浓度BSA溶液的残留量均较大，不符合合格标准。

实验说明，采用《欧洲药典》的方法可以准确检测Alhydrogel佐剂的吸附能力，但是不能准确检测以氨水为原料制备的氢氧化铝的吸附能力。

实施例2采用本发明方法检测氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附能力

1、实验方法

1.1检测方法：

将样品佐剂稀释至铝含量为1.5mg/ml，调pH至5.80～6.05，分别与pH为6.0的6个浓度的BSA溶液（1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml），按照1:4的比例混合，使最终铝含量为0.3mg/ml，再分别加入NaCl溶液，使NaCl的终浓度为8g/L，混匀，室温静置吸附1小时，离心取上清，采用Lowry法检测上清液中残留的BSA蛋白含量。

可接受标准：吸附1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml BSA的上清液中应检测不到蛋白；吸附5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml BSA的上清液中可检测到残留蛋白，且蛋白含量应呈一定的浓度梯度。标准与《欧洲药典》要求一致。

1.2样品检测

按照前述检测方法，对5批氨水法制备的氢氧化铝佐剂进行检测。

1.3检测方法的验证

1.3.1准确度

按照拟定的检测方法连续检测三次，考察该方法对氨水法配制氢氧化铝佐剂吸附能力检测的适应性。可接受标准：3次检测均满足拟定的可接受标准，与《欧洲药典》标准一致。

1.3.2精密度——重复性

对同一批氢氧化铝佐剂按照拟定的检测方法连续检测6次，考察同一批次氢氧化铝佐剂经同一实验员在同样条件下多次检测结果之间的差异。可接受标准：6次检测结果之间的相对标准偏差（RSD）≤5%。

1.3.3精密度——中间精密度

两名实验人员在三个工作日内，按照拟定的检测方法各检测三次，考察同一工作日不同实验员以及同一实验员三个工作日检测结果之间的差异。可接受标准：同一工作日不同实验员和同一实验员三个工作日检测结果之间的RSD≤5%。

1.3.4耐用性

在拟定的检测方法中，分别将氢氧化铝佐剂的pH值调节至5.80、5.90、6.0及6.05，各检测3次，考察各pH条件下检测结果之间的差异。可接受标准：4个pH条件下，检测结果之间的RSD≤5%。

2、实验结果

2.1样品检测结果

5批样品检测结果如表2所示：

表2采用本发明检测方法检测5批样品

以上结果显示，采用本发明方法检测5批氨水法制备的氢氧化铝佐剂，3个低浓度BSA溶液无残留蛋白，3个高浓度BSA溶液可检测到残留蛋白，且蛋白含量应呈浓度梯度。

实验结果说明，本发明方法可以准确检测氨水制备的氢氧化铝佐剂的吸附能力。

2.2检测方法验证结果

2.2.1准确度

表3吸附能力检测准确度验证结果

3次检测结果显示，3个低浓度BSA溶液中的蛋白均被完全吸附，上清中检测不到蛋白；3个高浓度BSA溶液中可检测到残留蛋白，且残留蛋白呈一定的浓度梯度，准确度结果符合可接受标准。

实验结果说明，本发明检测方法可用于氨水法配制的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测，检测结果准确可靠。

2.5.2重复性

表4吸附能力检测重复性验证结果

6次检测结果之间的RSD均≤5%，重复性检测结果符合可接受标准，说明本发明检测方法的重复性好。

2.5.3中间精密度

表5吸附能力检测中间精密度验证结果（同一工作日不同实验员的检测结果）

表6吸附能力检测中间精密度验证结果（同一实验员不同工作日的检测结果）

同一工作日不同实验员的检测结果，以及同一实验员三个工作日的检测结果之间的RSD均≤5%，中间精密度检测结果符合可接受标准，说明本发明检测方法不受操作人员和检测时间的影响，精密可靠。

2.5.4耐用性

表7吸附能力检测耐用性验证结果

4个pH条件下，检测结果之间的RSD均≤5%，耐用性结果符合可接受的标准，说明在pH为5.80～6.05的范围内，检测结果不受影响。

实验结果显示，本发明的氢氧化铝吸附能力检测方法的准确度、重复性、中间精密度及耐用性结果均符合要求，用于氨水法配制的氢氧化铝佐剂吸附能力检测时，结果准确、真实可靠。

实施例3本发明方法中氯化钠浓度筛选实验

1、实验方法

将样品佐剂稀释至铝含量1.5mg/ml，调pH至5.80～6.05，分别与pH为6.0的6个浓度的BSA溶液（BSA浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml的溶液），按照1:4的比例混合，再分别加入NaCl溶液，使NaCl的终浓度分别为2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L，吸附1小时后，离心取上清，采用Lowry法检测上清液中残留的BSA蛋白含量。

可接受标准：吸附1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml BSA的上清液中应检测不到蛋白；吸附5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml BSA的上清液中可检测到残留蛋白，且蛋白含量应呈一定的浓度梯度，与《欧洲药典》要求一致。

2、实验结果

实验结果如表8所示：

表8NaCl终浓度筛选结果

由以上结果可见，当NaCl终浓度为5～9g/L时，3个低浓度BSA溶液无残留蛋白，3个高浓度BSA溶液中的残留蛋白呈浓度梯度，满足可接受标准；当NaCl终浓度小于5g/L时，各浓度BSA溶液均有残留蛋白，并且，残留蛋白不呈浓度梯度，当氯化钠终浓度大于9g/L时，低浓度的BSA溶液仍有残留蛋白，不满足可接受标准。

实验结果说明，NaCl终浓度为5～9g/L时，可实现准确检测。

实施例4本发明方法中铝含量筛选实验

1、实验方法

将样品佐剂稀释至铝含量1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml，调pH至5.80～6.05，分别与pH为6.0的6个浓度的BSA溶液（BSA浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml的溶液），按照1:4的比例混合，再分别加入NaCl溶液，使NaCl的终浓度为8g/L，吸附1小时后，离心取上清，采用Lowry法检测上清液中残留的BSA蛋白含量。

2、实验结果

实验结果如表9所示：

表9铝含量筛选结果

由以上结果可见，当铝含量为1.3～1.7mg/ml时，3个低浓度BSA溶液无残留蛋白，3个高浓度BSA溶液中的残留蛋白呈浓度梯度，满足可接受标准；当铝含量低于1.3mg/ml或者高于1.7mg/ml时，都不能达到可接受标准。

实验结果说明，铝含量为1.3～1.7mg/ml时，可实现准确检测。

综上，本发明方法可以准确检测氨水法制备的氢氧化铝，准确度高，可重复性好，精密度高，应用前景良好。

Claims

1.一种氨水制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）待测样品的配制：

（2）牛血清白蛋白溶液的配制：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中氢氧化铝溶液的pH为5.80～6.05。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述氢氧化铝佐剂按照如下方法制备：

a、取浓度为4～8%（w/v）的氨水溶液，在温度50℃～70℃的条件下，缓慢加入3～6%（w/v）的AlCl₃溶液中，至pH6～7时，停止加入氨水溶液，继续搅拌10～30分钟；

b、透析，至残留铵含量低于0.01%，即可。