CN109781871A - 黄曲霉毒素b1和b2磁固相萃取材料及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。所述磁固相萃取材料以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核,以天然亲水性琼脂糖为基质,采用复合乳化技术将琼脂糖包裹在Fe3O4@SiO2表面,然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面,从而能够与适配体通过共价偶联的方式结合。与传统的羧基、氨基磁珠相比,表面含NHS基团的磁性琼脂糖微球无需采用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺或戊二醛进行活化,室温下将适配体溶液与NHS磁性琼脂糖磁珠混合1~2h便可将适配体共价偶联到磁珠上。本发明的磁固相萃取材料作为一种新型磁固相萃取吸附剂将用于食品、农产品以及中药中黄曲霉毒素B1和B2的检测分析。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域,具体地说,涉及黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。
背景技术
黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是由真菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的一类结构相似的有毒次生代谢物,常见的有黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2,具有极强的致癌性、致畸性和致突变作用。其中,黄曲霉毒素B1的毒性是氰化钾的10倍,砒霜的68倍,被国际癌症研究机构(IARC)划定为I类致癌物质。黄曲霉毒素B是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素,一般食品加工条件下不易破坏,因此给消费者的饮食安全埋下了巨大的隐患。全世界每年约有25%的食物在生产、加工、运输、贮藏等各环节可能受到黄曲霉毒素的污染,由于黄曲霉毒素对人类身体健康危害的严重性,许多国家和国际组织已对黄曲霉毒素在食品或中药中的残留量做出了限量规定。欧盟规定花生及其制品中黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)总量不得超过4μg/kg,黄曲霉毒素B1不得超过2μg/kg。我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素的允许量标准为(B1+B2+G1+G2)不得超过10ng/g,2015版《中国药典》收载的19味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目,限度为黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)总量不得超过10μg/kg。由于黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2危害较大,因而寻找一种简单、快速、准确、经济、特异性的前处理方法,消除基质干扰,对于监测黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的污染状况具有重要意义。
目前黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的检测方法有薄层色谱法,高效液相色谱法、酶联免疫吸附法,毛细管电泳法、液质联用法等。其中薄层色谱法是最早使用也是最广泛使用的检测黄曲霉毒素B2的方法,其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作,且成本低、无需价格昂贵的仪器。但是,薄层色谱法的样品处理繁琐,实验过程复杂,所需检测周期较长,容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量,存在主观影响较大,灵敏度不高等缺点,已远远不能满足现代检测要求。
酶联免疫吸附法具有检测特异性好、灵敏度高、并且检测成本较低的优点,适用于基层机构大量样品的筛选和普查,可以大大节省时间和费用。酶联免疫吸附法的主要问题是容易造成假阳性。因此,主要用于基层的筛查检测。
高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,是目前常用的食品中毒素检测的方法。但因其对样品纯度要求较高,需要经过一些前处理过程,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的要求。而传统的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等,这些净化柱价格较贵,且多为一次性的。因此,建立高选择、快速有效的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素B2检测分析中亟需解决的重要问题。
适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列(10~100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构,从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库,利用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)进行多次的富集和筛选,体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体,从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的、与抗体功能类似的新型分子,与主流的抗体技术相比,其研究还处于起步阶段,但是已经表现出一些有别于抗体的优势,如批间稳定性一致,易修饰,无免疫原性等。
基于适配体的磁性琼脂糖微球是一种新型高效的样品前处理材料。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化,这种吸附是可逆的,此法已成为真菌毒素分析的一个重要发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。
本发明的构思如下:将高特异性、高亲和力的黄曲霉毒素B1和B2的适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与N-羟基硫代琥珀酰亚胺修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到黄曲霉毒素B1和B2的特异性磁性琼脂糖微球,并将其作为磁固相萃取材料实现两种黄曲霉毒素B的高效分离和灵敏分析。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面,本发明提供所述核酸适配体在制备用于分离黄曲霉毒素B1和B2的材料中的应用,所述材料包括但不限于磁固相萃取材料。
第三方面,本发明提供黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料,所述磁固相萃取材料是以Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒为内核,外面包裹有琼脂糖,然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面得到磁性琼脂糖微球,再将权利要求1所述核酸适配体与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。
进一步地,所述磁固相萃取材料以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核,以天然亲水性琼脂糖为基质,采用复合乳化技术将琼脂糖包裹在Fe3O4@SiO2表面,然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面,从而将所述黄曲霉毒素B适配体特异性DNA与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。
其中,用于制备黄曲霉毒素B磁固相萃取材料的所述核酸适配体是经过化学修饰的适配体序列,修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。
优选地,所述核酸适配体是经过氨基修饰的适配体序列(3’或5’端修饰),修饰方法如下:在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂(-(CH2)7-)或C6间接臂(-(CH2)6-),然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基,从而得到氨基修饰的适配体。
第四方面,本发明提供所述磁固相萃取材料的制备方法,包括以下步骤:
1)Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的制备
将1-5g FeCl3·6H2O与6-20g醋酸钠分散至180-250mL乙二醇分析纯中,搅拌均匀投入反应釜中(磁力搅拌至均一状,加入聚四氟乙烯高压反应釜中),200-250℃下加热10-16h(优选200℃下加热10h),产物用磁铁收集,用水和无水乙醇反复清洗(3-5次)后烘干,得到Fe3O4粉末;
将1-5g Fe3O4粉末分散至由200-1000mL无水乙醇和100-500mL去离子水组成的混合液中,超声分散10-30min,加入1-5mL氨水溶液(25%-28%),搅拌10-30min,然后将4-15mL正硅酸四乙酯与20-100mL无水乙醇混匀后滴加至上述溶液体系中(每秒一滴),滴加完后于室温反应过夜,产物用磁铁收集,用水和无水乙醇反复清洗(3-5次)后烘干,得到Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒;
2)磁性琼脂糖微球的制备
①琼脂糖溶液的配制:称取1-5g琼脂糖放入烧瓶中,加热至琼脂糖完全溶解,向烧瓶中加入沸水至总体积90-200mL,摇匀后即得琼脂糖溶液;
②将1-5g Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒分散至10-50mL去离子水中,超声10-30min,得到磁流体;
③称取12-20g Span-80溶于350-500mL液体石蜡中,在300-500rpm转速下搅拌均匀,然后加热至80℃,得到有机相;
④将②的磁流体加入到①的琼脂糖溶液中,80℃下反应30-60min,然后将此混合液加入到③的有机相中,在600-800rpm搅拌下反应1-2h,然后降温至20℃,加入1-1.5L无水乙醇进行破乳化,所得产物用去离子水和无水乙醇反复清洗(3-5次),产物用磁铁收集,将产物溶于水中配制成体积百分数50-70%v/v(优选50%v/v)的溶液,即得磁性琼脂糖微球;
3)NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球的制备
取步骤2)制备的磁性琼脂糖微球10-30mL,加入50-150mL 1M氢氧化钠溶液、30-90mL环氧氯丙烷和50-150mL二氧六环,升温至50-70℃反应12-16h(优选50℃反应12h),用去离子水和无水乙醇反复清洗,产物用磁铁收集,将产物溶于水中配制成体积百分数50-70%v/v(优选50%v/v)的溶液I;
取10-30mL上述溶液I,加入2-5g甘氨酸和2-5g碳酸钠,室温下反应过夜,用去离子水和无水乙醇反复清洗,产物用磁铁收集,将产物溶于水中配制成体积百分数50%v/v的溶液II;
取1-5mL上述溶液II,用无水DMSO清洗,然后通过磁性分离去除磁性琼脂糖微球中的水分,加入200-500mg EDC和200-500mg NHS,混匀,45-60℃(优选40℃)反应3-5h;产物用无水DMSO反复清洗,即得NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球,并将NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球溶于无水二甲基乙酰胺中,配制成体积百分数10-30%v/v(优选10%v/v)的溶液III(即,将NHS修饰的磁性琼脂糖微球保存于无水二甲基乙酰胺溶液中);
4)黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料的制备
⑤取70-150uL步骤4)所得溶液III,磁性分离去除上清液;
⑥加入1-5mL无水乙醇,混合均匀,磁性分离去除上清液;
⑦重复⑥1-3次;
⑧加入核酸适配体溶液,室温振荡孵育2-5h(优选2h),磁性分离除去上清液,然后加入1-5mL封闭缓冲液重悬磁珠,室温振荡孵育2-5h,磁性分离去除上清液,得到适配体功能化的磁性琼脂糖微球;
其中,所述核酸适配体溶液是将1-5nmol所述核酸适配体溶于200-500μL反应缓冲液中得到的;所述反应缓冲液的配方为:0.1M MES,0.15M NaCl,pH6.0;
所述封闭缓冲液的配方为:0.2%BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0;
⑨将⑧的适配体功能化的磁性琼脂糖微球用清洗缓冲液反复洗涤(3-5次),产物用磁铁收集;最后,将洗涤后的上述适配体功能化的磁性琼脂糖微球分散于pH7.4的PBS中短期保存,或分散于pH 7.4的含有0.1%BSA和0.02%NaN3的PBS中长期保存;
其中,所述清洗缓冲液的配方为:50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.2。
前述方法中,烘干优选在60℃下真空干燥箱内烘干。
前述方法中,步骤2)中琼脂糖溶液的配制方法优选为:称取1-5g琼脂糖放入烧瓶中,用微波炉煮沸至琼脂糖完全溶解(设置微波时间3-10min),用沸水将烧杯中的琼脂糖溶液补至90-200mL,轻摇晃烧杯使其均匀,转移至250-500mL的三口烧瓶中,90℃(烧杯内温度为准)油浴,机械搅拌,转速300-500rpm,制得琼脂糖溶液。
前述方法中,步骤2)中所述有机相的配制方法优选为:称取12-20g Span-80将其溶于350-500mL液体石蜡并加入到容积为1000mL的三口烧瓶中,300-500rpm转速下,机械搅拌分散均匀,并在油浴中加热至80℃,制得有机相。
第五方面,本发明提供所述磁固相萃取材料在检测、净化、富集或纯化样品中黄曲霉毒素B1和B2中的应用。
其中,所述样品包括但不限于粮食、饲料、奶及乳制品、水产、血液、尿液、水和中药材。
第六方面,本发明提供利用所述磁固相萃取材料检测样品中黄曲霉毒素B1和B2的方法,将样品配制成液体样本,加入到所述磁固相萃取材料中,混合后在外加磁场下进行磁性分离,去除上清液,然后加入甲醇溶剂进行解吸附,再通过外加磁场进行磁性分离,收集上清液,并对上清液中的目标物进行检测。
其中,所述甲醇溶剂为甲醇分析纯与洗脱缓冲液按20:80体积比混合的混合液。所述洗脱缓冲液的配方为:10mM Tris和1mM EDTA。
优选地,采用高效液相色谱对上清液(上清液无需进行前处理)进行检测。
其中,高效液相色谱检测条件为:色谱柱为C18柱;柱温40℃;进样体积40μL;流动相为甲醇水溶液,甲醇和水的体积比为55:45;流速为0.8mL/min;荧光检测器的激发波长为360nm,发射波长为440nm。
本发明的黄曲霉毒素B磁固相萃取材料以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核,以天然亲水性琼脂糖为基质,采用复合乳化技术将琼脂糖包裹在Fe3O4@SiO2表面,然后将N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰在琼脂糖表面,从而能够与氨基修饰的适配体通过共价偶联的方式结合。与传统的羧基、氨基磁珠相比,表面含NHS基团的磁性琼脂糖微球无需采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺或戊二醛进行活化,室温下将适配体溶液与NHS磁性琼脂糖磁珠混合1~2h便可将适配体共价偶联到磁珠上,具有操作简单,偶联条件温和,生物配体偶联快速高效的优点。所述磁固相萃取材料具有超顺磁性且无磁性记忆,极低的非特异性吸附,丰富的结合位点,良好的亲水性等特点,且通过连接适配体实现其特异性识别捕获的功能,其作为一种新型高效的磁固相萃取吸附剂将成功用于食品、农产品以及中药中黄曲霉毒素B1和B2等真菌毒素的高效分离和灵敏分析。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)本发明的磁固相萃取材料具有制备简便,价格低廉,纯化黄曲霉毒素B1和B2效率高,可重复使用的优点。样品经过简单的提取后,利用磁铁即可实现靶标的选择性分离和富集,并且一次净化能够除去绝大部分干扰物,无需过滤和离心。净化后的提取液可用高效液相色谱等仪器进行分析检测。
(二)本发明充分利用了核酸适配体高特异性、高亲和力的优点,利用黄曲霉毒素B1和B2适配体特异性结合样品中的黄曲霉毒素B1及B2,可有效降低实际样品中的基质干扰,大幅度提高净化效率。核酸适配体受操作环境和有机溶剂的影响较小,尤其适合真菌毒素类脂溶性物质的纯化。相比之下,由于抗体不耐有机溶剂,有机溶剂的存在往往会造成抗体的失活低。此外,有机溶剂可能导致抗体失活,而核酸适配体可以耐受有机溶剂,因此基于适配体的磁固相萃取材料可重复使用多次,大幅度降低了使用成本。
(三)本发明使用的核酸适配体通过体外化学合成法获得,能够保证序列的正确性、批间的一致性,大幅度降低了不同批次间的差异。相比之下,不同批次的抗体来自于不同的小鼠或兔子,导致抗体间质量差异较大。
(四)N-羟基硫代琥珀酰亚胺修饰的磁性琼脂糖微球与黄曲霉毒素B适配体序列琼脂糖发生共价偶联,偶联产物稳定,且偶联率高。
(五)本发明制备的黄曲霉毒素B磁固相萃取材料以核酸适配体代替抗体作为识别元件,与传统的抗体相比,具有成本低,易于保存,性质稳定,批间差异小的优点。样品提取液经磁固相萃取技术净化后,所得黄曲霉毒素B1和B2纯度高,后续无需再做其他纯化处理,可直接用于高效液相色谱等仪器检测,与传统的免疫亲和柱净化相比,本发明利用磁固相萃取材料的超顺磁性,可于5s内实现固液分离,节省了操作者的时间和费用。
附图说明
图1为本发明实施例2中磁固相萃取材料的制备过程。
图2为本发明实施例3中黄曲霉毒素B标准品及样品中黄曲霉毒素B的高效液相色谱分析结果。
图3为本发明实施例3中黄曲霉毒素B1的光化学衍生反应过程。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体的设计与合成
设计并合成具有高特异性、高亲和力的黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体序列,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2利用氨基修饰的黄曲霉毒素B1和B2适配体制备磁固相萃取材料
1、Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的制备
将1g FeCl3·6H2O与6g醋酸钠分散至180mL乙二醇溶液中,磁力搅拌至均一状,加入聚四氟乙烯高压反应釜,200℃下加热10h,冷却至室温,产物用磁铁收集,用水和乙醇反复清洗3次,在60℃下真空干燥箱烘干,得到Fe3O4粉末。
将1g上述烘干后的Fe3O4分散至200mL乙醇和100-500mL去离子水中,超声分散10min,加入1mL 25%氨水溶液,机械搅拌10min,将4mL正硅酸四乙酯与20mL无水乙醇混合均匀后滴加至上述溶液中,每秒一滴,滴加完后后室温反应过夜,产物用磁铁收集,用水和乙醇反复清洗3次,在60℃下真空干燥箱烘干,得到Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒。
2、磁性琼脂糖微球的制备
1)称取1g琼脂糖放入烧瓶中,用微波炉煮沸至琼脂糖完全溶解(设置微波时间3min左右),用沸水将烧杯中的琼脂糖溶液补至90mL,轻摇晃烧杯使其均匀,转移至250mL的三口烧瓶中,90℃(烧杯内温度为准)油浴,机械搅拌,转速300rpm,制得琼脂糖溶液。
2)将1g上述烘干后Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒分散至10mL去离子水中,超声10min,制得磁流体。
3)称取12g Span-80将其溶于350mL液体石蜡并加入到1000mL的三口烧瓶中,300rpm转速下,机械搅拌分散均匀,并在油浴中加热至80℃,制得有机相。
4)将磁流体加入到琼脂糖溶液中,并在80℃下反应30min,然后将此混合溶液加入到有机相中,机械搅拌600rpm下反应1h,降温至20℃,反应结束。加入1L无水乙醇进行破乳化,去离子水和无水乙醇反复清洗3次,将产物保存在水重并配置成体积分数50%(v/v),制得磁性琼脂糖微球。
3、NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球的制备
取10mL上述制备的磁性琼脂糖微球,加入50mL 1M氢氧化钠水溶液,30mL环氧氯丙烷以及50mL的二氧六环,升温至50℃反应12h,用去离子水和无水乙醇反复清洗,将产物保存在水重并配置成体积分数50%(v/v)。
取上述产物10mL,加入2g甘氨酸以及2g碳酸钠,室温下反应过夜,用去离子水和无水乙醇反复清洗,将产物保存在水重并配置成体积分数50%(v/v)。
量取上述产物1mL,用无水DMSO清洗3次,磁性分离去除磁性琼脂糖微球中的水分,加入200mg EDC和200mg NHS,混匀,45℃反应3h。用无水DMSO溶液反复清洗3次,并将NHS修饰的磁性琼脂糖微球保存于无水二甲基乙酰胺溶液中,保存浓度为10%(v/v)。
4、黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料的制备
将磁珠混合均匀,取70uL所述磁性琼脂糖微球磁珠(10%,v/v)加入到2mL离心管中,磁性分离去除上清液。加入1mL无水乙醇,混合均匀,磁性分离去除上清液(重复1次);加入1nmol黄曲霉毒素B1和B2适配体溶液(预先用200μL反应缓冲液(0.1M MES,0.15M NaCl,pH6.0)溶解),室温旋转混合2h,磁性分离除去上清液;然后,加入1mL封闭缓冲液(0.2%BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0),混合重悬磁珠,室温旋转混合2h,磁性分离去除上清液,制得黄曲霉毒素B磁固相萃取材料。将上述制得磁固相萃取材料用1mL清洗缓冲液(50mMTris-HCl,0.15M NaCl,pH7.2)反复洗涤3次。最后,将上述黄曲霉毒素B磁固相萃取材料分散于0.5mL PBS,pH 7.4短期保存,或分散于PBS,pH 7.4,0.1%BSA,0.02%NaN3长期保存。
实施例2磁固相萃取材料制备过程如图1所示。其中,a和b分别为Fe3O4和Fe3O4@SiO2的透射电镜图;c:磁性琼脂糖微球的扫描电镜图;d:磁性琼脂糖微球的显微镜图;e:磁性琼脂糖微球的粒径分布图;f:Cy3-标记Apt-MAMs的激光共聚焦显微镜图;g:Fe3O4,Fe3O4@SiO2,磁性琼脂糖微球的磁力曲线;h:Fe3O4,Fe3O4@SiO2,磁性琼脂糖微球的傅立叶变换红外光谱。
实施例3利用磁固相萃取材料纯化玉米样品中的黄曲霉毒素B1和B2及其检测
本实施例通过向正常的玉米样品定量加入黄曲霉毒素B1和B2标准品,然后用实施例2制备的磁固相萃取材料进行净化,净化后用高效液相色谱-在线光化学衍生-荧光检测器检测,测定回收率。具体如下:
1、玉米样品处理
1)将玉米样品粉碎。
2)向粉碎后的玉米样品中分别添加黄曲霉毒素B1和B2标准品,加标水品分别为0.5μg/Kg,5μg/Kg,50μg/Kg。
3)称取5g样品,加入25mL甲醇-水(70:30,v/v),置于均质匀浆机上11000rpm高速匀浆3min。
4)取5mL滤液,40℃氮气吹至近干,加入0.5mL甲醇-水(70:30,v/v)复溶,并用结合缓冲液定容至5mL。其中,所述结合缓冲液的配方为:10mM Tris HCl,120mM NaCl,5mM KCl,1mM MaCl2。
5)用0.45μm针筒式滤膜过滤,得到复溶液。
2、将上述复溶液加入到实施例2制备的磁固相萃取材料中,置于摇床中120rpm混合3min;在外加磁场下进行磁分离,弃去上清液后,得到黄曲霉毒素B-适配体功能化磁性琼脂糖微球复合物。然后加入1mL甲醇:洗脱缓冲液(v/v,20:80)的混合溶液,使得黄曲霉毒素B从所述的黄曲霉毒素B-适配体功能化磁性琼脂糖微球复合物中解离出来,在外加磁场下进行磁分离,将得到的上清液收集,即为含黄曲霉毒素B的分离液。其中,所述洗脱缓冲液的配方为:10mM Tris和1mM EDTA。
3、上述含有含黄曲霉毒素B的分离液,用高效液相色谱-在线光化学衍生-荧光检测器检测,与标准曲线对照后实现黄曲霉毒素B的定量检测。
黄曲霉毒素B标准品及样品中黄曲霉毒素B的高效液相色谱分析的结果图2。其中,a:AFB1和AFB2标准溶液(5ng/mL);b:黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料净化后的玉米样品;c:黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料净化后的加标玉米样品(5ng/g);d:玉米提取液(未净化);e:黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料净化后的阳性玉米样品。
可见,玉米样品经黄曲霉毒素B磁固相萃取材料纯化后,可以显著减低基质干扰,提高检测的灵敏度。
本发明HPLC-PCD-FLD(高效液相色谱-在线光化学衍生-荧光检测)评价方法的建立:
由于反相洗脱液会淬灭黄曲霉毒素B1的荧光效应,通常需要衍生以增强这些分析物的反应,本发明采用在线光化学衍生法。将光化学衍生装置直接连在色谱柱和荧光检测器之间,黄曲霉毒素B1(AFB1)在强紫外光的照射下,最左边的五元环上的双键与H2O发生羟基化反应,分别生成荧光性更强、更稳定的黄曲霉毒素B1a(AFB1a),该方法操作简便且灵敏度高。光化学衍生反应过程如图3所示,经过光化学衍生或后AFB1的响应值可以至少降低10倍。仪器型号及检测参数如下:Agilent1260HPLC高效液相色谱仪,色谱柱为Venusil MP C18柱(250×4.6mm i.d.,颗粒平均粒径5μm);柱温40℃;进样体40μL;流速为0.8mL/min;流动相为甲醇:水(55:45;v/v)等度洗脱。荧光检测器的激发波长为360nm,发射波长为440nm。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京农业质量标准与检测技术研究中心
<120> 黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用
<130> KHP181117759.0
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaatcag cttgaacact agttagctat ccaggcccac a 41
Claims (10)
1.黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体,其特征在于,核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述核酸适配体在制备用于分离黄曲霉毒素B1和B2的材料中的应用,所述材料包括磁固相萃取材料。
3.黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料,其特征在于,所述磁固相萃取材料是以Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒为内核,外面包裹有琼脂糖,然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面得到磁性琼脂糖微球,再将权利要求1所述核酸适配体与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。
4.根据权利要求3所述的磁固相萃取材料,其特征在于,所述核酸适配体是经过化学修饰的适配体序列,修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。
5.根据权利要求4所述的磁固相萃取材料,其特征在于,所述核酸适配体是经过氨基修饰的适配体序列,修饰方法如下:在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-,然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基,从而得到氨基修饰的适配体。
6.权利要求5所述磁固相萃取材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的制备
将1-5g FeCl3·6H2O与6-20g醋酸钠分散至180-250mL乙二醇分析纯中,搅拌均匀投入反应釜中,200-250℃下加热10-16h,产物用磁铁收集,用水和无水乙醇反复清洗后烘干,得到Fe3O4粉末;
将1-5g Fe3O4粉末分散至由200-1000mL无水乙醇和100-500mL去离子水组成的混合液中,超声分散10-30min,加入浓度为25%-28%的氨水溶液1-5mL,搅拌10-30min,然后将4-15mL正硅酸四乙酯与20-100mL无水乙醇混匀后滴加至上述溶液体系中,滴加完后于室温反应过夜,产物用磁铁收集,用水和无水乙醇反复清洗后烘干,得到Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒;
2)磁性琼脂糖微球的制备
①琼脂糖溶液的配制:称取1-5g琼脂糖放入烧瓶中,加热至琼脂糖完全溶解,向烧瓶中加入沸水至总体积90-200mL,摇匀后即得琼脂糖溶液;
②将1-5g Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒分散至10-50mL去离子水中,超声10-30min,得到磁流体;
③称取12-20g Span-80溶于350-500mL液体石蜡中,在300-500rpm转速下搅拌均匀,然后加热至80℃,得到有机相;
④将②的磁流体加入到①的琼脂糖溶液中,80℃下反应30-60min,然后将此混合液加入到③的有机相中,在600-800rpm搅拌下反应1-2h,然后降温至20℃,加入1-1.5L无水乙醇进行破乳化,所得产物用去离子水和无水乙醇反复清洗,产物用磁铁收集,将产物溶于水中配制成体积百分数50-70%v/v的溶液,即得磁性琼脂糖微球;
3)NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球的制备
取步骤2)制备的磁性琼脂糖微球10-30mL,加入50-150mL 1M氢氧化钠溶液、30-90mL环氧氯丙烷和50-150mL二氧六环,升温至50-70℃反应12-16h,用去离子水和无水乙醇反复清洗,产物用磁铁收集,将产物溶于水中配制成体积百分数50-70%v/v的溶液I;
取10-30mL上述溶液I,加入2-5g甘氨酸和2-5g碳酸钠,室温下反应过夜,用去离子水和无水乙醇反复清洗,产物用磁铁收集,将产物溶于水中配制成体积百分数50%v/v的溶液II;
取1-5mL上述溶液II,用无水DMSO清洗,然后通过磁性分离去除磁性琼脂糖微球中的水分,加入200-500mg EDC和200-500mg NHS,混匀,45-60℃反应3-5h;产物用无水DMSO反复清洗,即得NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球,并将NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球溶于无水二甲基乙酰胺中,配制成体积百分数10-30%v/v的溶液III;
4)黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料的制备
⑤取70-150uL步骤4)所得溶液III,磁性分离去除上清液;
⑥加入1-5mL无水乙醇,混合均匀,磁性分离去除上清液;
⑦重复⑥1-3次;
⑧加入核酸适配体溶液,室温振荡孵育2-5h,磁性分离除去上清液,然后加入1-5mL封闭缓冲液重悬磁珠,室温振荡孵育2-5h,磁性分离去除上清液,得到适配体功能化的磁性琼脂糖微球;
其中,所述核酸适配体溶液是将1-5nmol所述核酸适配体溶于200-500μL反应缓冲液中得到的;所述反应缓冲液的配方为:0.1M MES,0.15M NaCl,pH6.0;
所述封闭缓冲液的配方为:0.2%BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0;
⑨将⑧的适配体功能化的磁性琼脂糖微球用清洗缓冲液反复洗涤,产物用磁铁收集;最后,将洗涤后的上述适配体功能化的磁性琼脂糖微球分散于pH 7.4的PBS中短期保存,或分散于pH 7.4的含有0.1%BSA和0.02%NaN3的PBS中长期保存;
其中,所述清洗缓冲液的配方为:50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.2。
7.权利要求1-5任一项所述磁固相萃取材料在检测、净化、富集或纯化样品中黄曲霉毒素B1和B2中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述样品选自粮食、饲料、奶及乳制品、水产、血液、尿液、水和中药材。
9.利用权利要求1-5任一项所述磁固相萃取材料检测样品中黄曲霉毒素B1和B2的方法,其特征在于,将样品配制成液体样本,加入到所述磁固相萃取材料中,混合后在外加磁场下进行磁性分离,去除上清液,然后加入甲醇溶剂进行解吸附,再通过外加磁场进行磁性分离,收集上清液,并对上清液中的目标物进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,采用高效液相色谱对上清液进行检测,且上清液无需进行前处理;
优选地,高效液相色谱检测条件为:色谱柱为C18柱;柱温40℃;进样体积40μL;流动相为甲醇水溶液,甲醇和水的体积比为55:45;流速为0.8mL/min;荧光检测器的激发波长为360nm,发射波长为440nm。
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