CN106423079A - 一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法及用途，属于天然多糖开发应用和功能材料制备技术领域。包括如下步骤：配制壳聚糖溶液，量取含乳化剂span 80的液体石蜡加入到壳聚糖溶液中，搅拌乳化得到混合液，加入交联剂进行搅拌交联，索氏抽提、乙醇漂洗、水洗、还原、再水洗后得到壳聚糖微球；将壳聚糖微球与抗生素抗体进行搅拌偶联，蒸馏水和PBS洗涤，最终得到壳聚糖微球免疫亲和吸附剂。所制备的壳聚糖微球免疫亲和吸附剂，微球粒径大小均一，且具有较好的pH稳定性，能用于净化分离和测定食品样品中的抗生素。

Description

一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种pH稳定、粒径均一壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备及其用途，属于天然多糖开发应用和功能材料制备技术领域。
背景技术
抗生素在临床治疗、畜牧业生产领域有着重要应用，但长期和过量使用给生态环境和人类健康带来了严重的危害，一方面是病原微生物耐药性的产生，另一方面是抗生素农产品和水环境中的残留。包括我国在内的许多国家和国际组织明确规定禁止或限量抗生素在畜牧生产中应用，并开始相关的监测工作。目前，针对农产品中抗生素残留检测以HPLC、GC/MS或LC/MS等仪器分析方法为主，样品前处理通常采用固相萃取方法进行净化富集，但固相萃取特异性低、易引入杂质干扰。免疫亲合色谱(IAC)利用抗原-抗体特异性可逆结合，实现目标物的分离分析，具有特异性高、操作简便快速等优点，因而备受关注。
目前最常用的商品化色谱填料载体是琼脂糖凝胶，性能稳定且具有良好的生物相容性，但在活化和再生过程中需要用到剧毒的溴化氰，价格也过于昂贵。因此，寻找开发一种性能优良且经济实用的色谱填料载体是目前许多实验室致力研究的方向。
壳聚糖，几丁质脱乙酰产物，自然界中仅次于纤维素的第二大天然多糖，来源丰富，具有安全无毒、易降解、良好的生物相容性等优点。此外，壳聚糖表面含有大量的可修饰功能基团(羟基和氨基)，可以通过酰化、羟基化、醚化、希夫氏反应、酯化、水解等反应制备出各种衍生物。因而，壳聚糖不仅是一种天然资源，更是一种新材料在医药、化工、农业等领域有着良好的应用前景。目前制备得到的壳聚糖微球为载体色谱填料存在着微球大小不均一、酸性条件下不稳定等缺点，限制了它的广泛使用。为了解决这一问题，本发明通过优化改良壳聚糖微球制备方法，并将其与抗生素抗体结合，获得了一种pH稳定、粒径均一壳聚糖微球免疫亲和吸附剂，利用所得的免疫亲和吸附剂对食品样品中的抗生素残留进行净化分离和分析测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种pH稳定、粒径均一壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，用该方法制备的免疫亲和吸附剂对食品样品中的抗生素残留进行吸附分离。
本发明中壳聚糖微球的制备采用乳化交联法，以壳聚糖为原料，戊二醛为交联剂，span 80为乳化剂。理化表征分析显示，壳聚糖微球粒径大小均一，且在pH 4-10范围内稳定。将所得的壳聚糖微球与抗生素抗体偶联得到的免疫亲和吸附剂，并将其用于实际样品中抗生素残留的净化分离和分析测定。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，按照下述步骤进行：
步骤(1)、配制壳聚糖溶液，量取含质量浓度为2％乳化剂span 80的液体石蜡加入到壳聚糖溶液中，搅拌乳化得到混合液，加入交联剂进行搅拌交联，索氏抽提、乙醇漂洗、水洗、还原、再水洗得到壳聚糖微球；
步骤(2)、将步骤(1)中制备的壳聚糖微球与抗生素抗体进行搅拌偶联，蒸馏水和PBS洗涤后得到免疫亲和吸附剂。
本发明步骤(1)中，所述的壳聚糖分子量为600kD，壳聚糖浓度为2wt％。
本发明步骤(1)中，所述的壳聚糖(水相)：含2％span 80的液体石蜡(油相)体积比为1:8。
本发明步骤(1)中，所述的交联剂为戊二醛，壳聚糖(氨基)：戊二醛(醛基)摩尔比为1:0.5。
本发明步骤(1)中，所述的搅拌速度为400rpm。
本发明步骤(2)中，所述的偶联剂为环氧氯丙烷，体积浓度为20％。
所制备的pH稳定、粒径均一壳聚糖微球免疫亲和吸附剂用于食品样品中抗生素残留的净化分离和分析测定。
本发明的有益效果：(1)本发明开发了一种来源丰富、安全无毒天然多糖色谱填料载体；(2)本发明制备的壳聚糖微球粒径大小均一，且具有较宽的pH稳定性；(3)本发明制备的壳聚糖微球免疫亲和吸附剂可用于实际样品中抗生素残留的净化分离和分析测定。
附图说明
图1.本发明不同分子量壳聚糖制备微球的扫描电镜图；
图2.本发明壳聚糖微球的粒径分布图；
图3.本发明壳聚糖微球pH稳定性图；
图4.本发明壳聚糖微球免疫亲和柱外观图；
图5.本发明icELISA评价方法标准曲线图；
图6.本发明HPLC评价方法标准曲线图。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1一种pH稳定、粒径均一壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备
(1)pH稳定、粒径均一壳聚糖微球的制备：
a.取0.24g壳聚糖，在12mL 2％的醋酸溶液中溶解配成2％的壳聚糖溶液；
b.加入98mL含有2％span 80的石蜡油，乳化3h；
c.加入3.6mL的交联剂交联反应3h，加入氢氧化钠溶液以保持体系pH在9～10；
d.反应完毕后，3000rpm，8min离心收集微球后用石油醚索氏抽提6h，乙醇梯度洗脱后蒸馏水洗至中性用5M NaBH4还原过夜最后再用蒸馏水洗至中性，冷冻干燥后备用。
(2)免疫亲和吸附剂的制备，本实施例以恩诺沙星为例：
a.称取0.4g的交联壳聚糖，用pH 8.3、0.1mol/L NaHCO3(含0.5mol/L NaCl)的偶联缓冲液洗涤2次后，沉淀重新悬浮于5mL的偶联缓冲液中，再加入2mL0.15mg/mL的单克隆抗体溶液，搅拌吸附3h；
b.加入偶联剂环氧氯丙烷，使其最终体积浓度为20％；在37℃下振荡交联5h；
c.交联结束后，8000r/min离心3min取上清测定280nm和260nm处的吸光度，根据公式：Cprotein(mg/mL)＝1.45A280nm-0.74A260nm计算未偶联的抗体含量，进而计算偶联率；
d.用大量水洗至中性，再用PBS洗涤2次。
试验一、本发明所述pH稳定、粒径均一壳聚糖微球制备条件的优化及性能表征
1、实施例1所制备的粒径均一壳聚糖微球条件的确定：(1)壳聚糖分子量：本实验中选择壳聚糖的分子量为50kD、100kD、600kD，壳聚糖溶液浓度为2％，水相油相比为1:10，氨基醛基比为1:0.5，搅拌速率为500rpm；(2)氨基醛基比：实验中壳聚糖分子量为600kDa，壳聚糖溶液浓度为2％，水相油相比为1:10，氨基醛基比为1:0.25，1:0.5，1:1，1:2，搅拌速率为500rpm；(3)壳聚糖溶液浓度：本实验中分别称取分子量为600kDa的壳聚糖0.1g、0.2g、0.3g、0.4g，溶于10ml 2％醋酸溶液中，制备成浓度为1％、2％、3％、4％壳聚糖溶液，水相油相比为1:10，氨基醛基比为1:0.5，搅拌速率为500rpm；(4)水相油相比：在本实验中，壳聚糖分子量为600kDa，壳聚糖溶液浓度为2％，水相油相总体积为110mL，水相油相比选择1:5、1:8、1:10、1:12，氨基醛基比为1:0.5，搅拌速率为500rpm；(5)搅拌速率：本实验中采用600kDa分子量的壳聚糖，壳聚糖溶液浓度为2％，水相油相比为1:10，氨基醛基比为1:0.5，搅拌速率选择200rpm、300rpm、400rpm、500rpm。按照实验方法制备壳聚糖微球，扫描电镜显示600kD分子量的壳聚糖交联制备的壳聚糖微球呈规则的球形(图1)，激光粒度分析仪测定微球的粒径分布与Span值，结果见表1。
经过单因素实验得到优化条件：壳聚糖分子量为600kD，壳聚糖溶液浓度为2％，氨基醛基比1:0.5，水相油相比为1:8，搅拌速率为400rpm，制备获得的壳聚糖微球呈球形(图1)，平均粒径124.8μm，粒径分布度SPAN 1.1(图2)。SPAN值按照下式计算：
SPAN＝(D90-D10)/D50
表1不同制备参数对壳聚糖微球粒径分布的影响
2、实施例1所制备得到的粒径均一的壳聚糖微球化学稳定性的确定：将0.1g交联壳聚糖分别悬浮于50mM HAc-NaAc(pH 4.0),50mM PBS(pH 6.0),50mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM NaHCO3-Na2CO3(pH 10.0)溶液中，4℃保存30h，扫描电镜结果显示壳聚糖微球结构没有发生明显变化(图3)。
试验二、本发明所述壳聚糖微球恩诺沙星免疫亲和吸附剂的制备与应用
1、实施例1所制备得到的壳聚糖微球恩诺沙星免疫亲和吸附剂结合容量的测定：取0.5mL制备的免疫亲和吸附剂填充到SPE柱中得到免疫亲和柱(图4)，将10mL 400ng/mL(共4000ng)的恩诺沙星标准品溶液过柱，上样液每1.0mL收集一管，用间接竞争ELISA(icELISA)测定每组份中恩诺沙星含量。根据下式计算：柱容量(即被吸附的恩诺沙星总量)＝恩诺沙星上样总量－洗下的恩诺沙星总量。结果显示，第1～5mL上样液中不含有恩诺沙星，上样第6mL时开始有恩诺沙星(204ng)被洗下。因此，IAC柱的最大柱容量约为：2196/0.5＝4392ng恩诺沙星/mL凝胶。
2、实施例1所制备得到的壳聚糖微球恩诺沙星免疫亲和吸附剂用于牛奶样品中恩诺沙星的加标回收：在5mL空白牛奶样品中加入含量为25ng/mL、50ng/mL的ENR标准品，每组三个平行，使用0.8％NaOH-PBS进行稀释，振荡15min，静置5min后，4℃9000rpm离心15min，收集上清液，沉淀重复加入0.8％NaOH-PBS处理一次，上清液合并。分别过柱，充分洗脱后，收集洗脱液，40℃旋转蒸发，0.8％NaOH-PBS定容至5mL，HPLC检测，计算回收率。
表2壳聚糖微球恩诺沙星免疫亲和吸附剂用于牛奶样品中恩诺沙星的加标回收
试验三、本发明所述壳聚糖微球恩诺沙星免疫亲和吸附剂的性能评价方法
1、icELISA评价方法的建立：包被封闭后，先加入50μL系列浓度(0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100、1000、10000ng/mL)的标准品溶液，每种浓度3个平行，再加入50μL最佳稀释倍数的一抗，加入酶标二抗，显色封闭后用酶标检测仪测定各个浓度在450nm的吸光度Ai和对照(即浓度为0ng/mL时)的吸光度A0，以Ai/A0为纵坐标，标准溶液浓度的对数值为横坐标作图。后经Origin软件拟合，得到标准曲线的线性范围为0.01～1000ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图5。
2、HPLC评价方法的建立：HPLC的色谱条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(250×4.6mm)；流动相：V(乙腈):V(0.05mol/L磷酸溶液)＝19:81；UV检测器检测波长：λ＝280nm；柱温：25℃；进样量：20μL；流速：1.0mL/min。
取标准工作液(1mg/mL)，配制成系列浓度(5、25、50、100、200、300ng/mL)，用HPLC测定，以各浓度和其对应的峰面积进行线性拟合。该标准曲线线性关系较好，其线性回归方程为：y＝100.85x+990.66(R2＝0.9969)，线性范围为5～300ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图6。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (7)

1.一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
步骤（1）配制壳聚糖溶液，量取含乳化剂span 80的液体石蜡加入到壳聚糖溶液中，搅拌乳化得到混合液，加入交联剂进行搅拌交联，索氏抽提、乙醇洗、水洗、还原、再水洗得到壳聚糖微球；
步骤（2）将步骤（1）中制备的壳聚糖微球与抗生素抗体进行搅拌偶联，蒸馏水和PBS洗涤后得到免疫亲和吸附剂。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的壳聚糖分子量为600 kD，壳聚糖浓度为2wt%。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的壳聚糖（水相）：含2% span 80液体石蜡（油相）体积比为1:8。
4.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的交联剂为戊二醛，壳聚糖（氨基）：戊二醛（醛基）摩尔比为1:0.5。
5.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的搅拌速度为400 rpm。
6.根据权利要求1所述的一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的偶联剂为环氧氯丙烷，体积浓度为20%。
7.权利要求1中所述的一种壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的制备方法制备的壳聚糖微球免疫亲和吸附剂的用途，其特征在于，所述的壳聚糖微球免疫亲和吸附剂用于净化分离和测定食品样品中的抗生素。
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