CN102258987B - 以壳聚糖为载体去氢甲睾酮免疫亲和柱的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种以壳聚糖（CTS）为载体去氢甲睾酮（DMT）单克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用，属于免疫亲和层析及兽药残留检测技术领域。公开了以CTS为载体DMT单克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及应用。通过将杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体纯化以后与交联成球状的壳聚糖进行偶联得到的免疫亲和吸附剂填充于固相萃取管中制得了对去氢甲睾酮具有特异性吸附的免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能够与去氢甲睾酮特异性结合，其最大结合容量约为1792ngDMT/mL凝胶；采用的洗脱液为90%的甲醇-水溶液时，平均加标回收率为86.85%~96.95%。本发明可以应用于去氢甲睾酮的快速检测。

Description

以壳聚糖为载体去氢甲睾酮免疫亲和柱的制备及其应用

技术领域

    本发明属于免疫亲和层析及兽药残留检测技术领域，涉及一种以壳聚糖（CTS）为载体去氢甲睾酮（DMT）单克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用。

背景技术

外源性蛋白同化激素去氢甲睾酮（DMT）作为一种生长促进剂被广泛用于畜牧生产领域，它的过量添加也给动物源性食品造成了严重的安全问题。包括我国在内的许多国家和国际组织明确禁止蛋白质同化激素在畜牧生产中应用，并开始相关的监测工作。与仪器检测方法相比，免疫亲合色谱（IAC）作为一种定量分析方法用于食品安全检测中的兽药、农药残留检测。它特异性强、分辨率高、纯化效能高、可重复使用、能简化样品前处理，因而备受关注。

IAC不仅要有合适的抗体，而且还要有合适的载体。目前应用最多的是载体是琼脂糖凝胶，它具有理想载体的特性：非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀、宜于活化等，但是此种凝胶最大的缺点是活化和再生过程中需要用到剧毒的溴化氰，此外价格也过于昂贵。因此，寻找开发一种性能优良且经济实用的新型载体是目前许多实验室致力研究的方向。

壳聚糖（Chitosan, CTS）是自然界资源量仅次于纤维素的可再生资源，是迄今为止唯一发现的阳离子动物纤维和唯一的碱性多糖。它具有独特的理化性质和生物功能，并且含有大量的可修饰功能基团（羟基和氨基），可以通过酰化、羟基化、醚化、希夫氏反应、酯化、水解等反应制备出各种衍生物。CTS及其衍生物通过吸附、吸附交联、复合载体、凝胶包埋等方式能作为蛋白、酶、细胞等的固定化载体。由于CTS来源丰富，具有网状结构，机械性能好，化学结构稳定，具有良好的吸附性、生物相容性生物可降解性，且无毒、价廉，是一种性能优良且应用前景广阔的载体。

发明内容   

本发明的目的在于提供一种以壳聚糖为载体的DMT单克隆抗体免疫亲和柱的制备与使用方法，所研制的亲和柱利用反相悬浮交联法将壳聚糖进行交联，使其成网状结构，与DMT单抗偶联得到的免疫亲和吸附剂填充于固相萃取管中，用于纯化含有DMT的待测样品。

本发明所述的以壳聚糖为载体的DMT单克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，即：（1）壳聚糖的交联：利用反相悬浮交联法，甲醛作为预交联剂，环氧氯丙烷作为交联剂，将乳化后的壳聚糖进行交联，制备出成球性能优良，具有较强吸附性能的交联壳聚糖；

（2）免疫亲和吸附剂的制备：采用戊二醛作为交联剂将步骤（1）中制备的交联壳聚糖

与去氢甲睾酮单克隆抗体偶联制成对去氢甲睾酮具有特异性吸附的免疫亲和吸附剂；

（3）装柱：将步骤（2）制备的免疫亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PBS缓冲液后自然沉降，即得到以壳聚糖为载体的去氢甲睾酮单克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃保存备用。

具体按照下述步骤进行制备：

（1）壳聚糖的交联：利用反相悬浮交联法，将壳聚糖样品完全溶解于2 % (v/v) 的醋酸缓冲液中配成1 % (w/v) 的CTS溶液，用等体积的石蜡油进行乳化，加入终浓度为0.5 % (v/v) 的甲醛反应1 h；再加入交联剂环氧氯丙烷，使其终浓度为0.4 %～0.6 % (v/v)，70 ℃交联3～5 h，pH保持在9～10；反应完毕后，用大量的蒸馏水清洗后用石油醚索氏抽提10～12 h，用蒸馏水洗涤至中性后冷冻干燥即制备出成球性能优良，具有较强吸附性能的交联壳聚糖；

（2）免疫亲和吸附剂的制备：采用25 %戊二醛作为交联剂将步骤（1）中制备的交联壳聚糖与DMT单抗以质量比为500:3进行偶联，戊二醛的终浓度为0.4 %～0.6 % (v/v)，在40 ℃下振荡交联8～10 h，按反应体系: NaBH₄体积比10:1的比例加入5 mol/L NaBH₄室温还原1 h，用蒸馏水和PBS洗涤后制成对DMT具有特异性吸附的免疫亲和吸附剂；

（3）装柱：将步骤（2）制备的免疫亲和吸附剂填充到与其体积比为4:1固相萃取柱中，得到以壳聚糖为载体的DMT单克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃保存待用。

本发明以壳聚糖为载体的DMT免疫亲和柱的应用，可以应用于DMT的快速检测

本发明的有益效果：（1）本发明开发了一种来源丰富，结构稳定，具有良好的吸附性，且无毒、价廉的载体—壳聚糖；（2）本发明制备的以壳聚糖为载体的免疫亲和柱能够与DMT特异性结合，一次净化能除去绝大部分干扰物，能得到纯度较高的DMT；（3）本发明制备的免疫亲和柱最大结合容量约为896 ng DMT/0.05 g交联壳聚糖；（4）本发明制备的免疫亲和柱的洗脱条件为3 mL 90%的甲醇-水溶液；（5）本发明制备的免疫亲和柱的加标回收率为86.85%～96.95%。 

附图说明

其中图1. 本发明纯化后DMT单抗的SDS-PAGE图；

图2. 本发明IAC柱外观图；

图3. 本发明IAC柱洗脱液选择优化图；

图4. 本发明IAC柱最大结合容量图；

图5. 本发明icELISA评价方法标准曲线图；

图6. 本发明HPLC评价方法标准曲线图。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 以壳聚糖为载体DMT单克隆抗体免疫亲和柱的制备

(1) 交联壳聚糖的制备

a. 取1.0 g CTS，在100 mL 2 %的醋酸溶液（含0.5 g PEG 4000）中溶解配成1 %的CTS溶液；

b. 加入 100 mL 含有1 % span-80的石蜡油，在60 ℃下乳化30 min；

c. 加入1 mL的预交联剂甲醛，60 ℃下反应1 h；

d. 静置分层，除去上层的液体石蜡，再用石油醚和蒸馏水反复清洗；

e. 加入交联剂环氧氯丙烷，使其终浓度为0.4～0.6 %，在70 ℃下交联3～5 h，pH保持在9～10；

f. 反应完毕后，用大量的蒸馏水清洗后用石油醚索氏抽提10～12 h，最后再用蒸馏水洗至中性，冷冻干燥后备用。

（2）免疫亲和吸附剂的制备

a. 称取0.05 g的交联壳聚糖，用pH 8.3、0.1 mol/L NaHCO₃ (含0.5 mol/L NaCl) 的偶联缓冲液洗涤2次后，沉淀重新悬浮于5 mL的偶联缓冲液中，再加入1 mL 0.15～0.30 mg/mL的单克隆抗体溶液，搅拌吸附3 h；

b. 加入偶联剂25 %戊二醛，使其终浓度为0.4 %～0.6 %；在40 ℃下振荡交联8～10 h；

c. 交联结束后，8 000r/min 离心3 min取上清测定280 nm和260 nm处的吸光度，根据公式：C_protein(mg/mL)=1.45A_280nm-0.74A_260nm计算未偶联的抗体含量，进而计算偶联率；

d. 按反应体系: NaBH₄溶液体积比1:10的比例加入5 mol/L NaBH₄室温还原1 h；

e. 用大量水洗至中性，再用PBS洗涤2次。

（3）装柱

将得到的亲和吸附剂填充入与其体积比为4:1的固相萃取管中，制成DMT多克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃冰箱保存待用。所制备的免疫亲和柱外观图见说明书附图1。图中显示的是装填了以上亲和吸附剂的IAC柱。柱子由两部分组成：柱身和套管，其中的液体是PBS。

用来偶联的单抗纯度如附图2所示；制备得到的IAC柱外观图如附图3所示。

试验一、本发明所述以壳聚糖为载体的DMT免疫亲和柱的条件优化方法：

1、实施例1所制备得到的以壳聚糖为载体的DMT免疫亲和柱最佳洗脱条件的确定：按上述方法制备5支IAC柱，每柱上样500 ng的DMT溶液，PBS充分洗涤后，分别选用60 %、70 %、80 %、90 %、100 %的甲醇-水溶液对IAC柱进行洗脱，收集洗脱液，用HPLC法测定回收率，当甲醇浓度在90 %时回收率为84.70 %，考虑有机溶剂的影响，选择90 %洗脱液，洗脱液选择见附图5。在此基础上，再用不同体积：3、5、7 mL的90 %甲醇-水溶液洗脱，结果见表1，选择洗脱体积为3 mL，此时回收率大于90 %。

表1洗脱体积的优化                

洗脱液体积（mL）	3	5	7
				回收率（%）	90.73	94.14	99.88

2、实施例1所制备得到的以壳聚糖为载体的DMT免疫亲和柱最大结合容量的测定：

取0.5mL制备的免疫亲和吸附剂装柱柱，将10 mL 200 ng/mL(共2000 ng)的DMT标准品溶液过柱，上样液每1.0 mL收集一管，用间接竞争ELISA（icELISA）测定每组份中DMT含量。根据下式计算：柱容量（即被吸附的DMT总量）=DMT上样总量－洗下的DMT总量。结果显示，第1 mL上样液中不含有DMT，上样第2 mL时开始有DMT被洗下，8.0 mL开始无吸附。因此，IAC柱的最大柱容量约为：896/0.5=1792 ng DMT/mL凝胶。最大结合容量的测定如说明书附图6所示；

3、实施例1、2所制备得到的以壳聚糖为载体的DMT免疫亲和柱加标回收率的测定：

取制备好的IAC柱，分别用2.5 mL的 20 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL(50 ng、250 ng、500 ng)三种不同浓度的DMT标准品过柱，每种浓度作两组平行。收集洗涤液后用HPLC测定回收率。结果见表2。用合适的洗脱液洗脱后，平均回收率为92.25 %；

表2 IAC柱的加标回收率

标品浓度（ng/mL）	标品加入量（ng）	回收率（%）
			20	50	98.46
100	250	94.60
			200	500	83.69

试验二、本发明所述DMT多抗免疫亲和柱的性能评价方法：

（1）    icELISA评价方法的建立

包被封闭后，先加入50 μL系列浓度（0.001、0.01、0.1、1.0、2.5、5.0、10.、25、50、100、500 ng/mL）的标准品溶液，每种浓度2个平行，再加入50 μL最佳稀释倍数的一抗，显色封闭后用酶标检测仪测定各个浓度在450 nm的吸光度A_i和对照（即浓度为0 ng/mL时）的吸光度A₀，以A_i /A₀为纵坐标，标准溶液浓度的对数值为横坐标作图。后经Origin软件拟合，得到标准曲线的线性范围为1～500 ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图7； 

（2）HPLC评价方法的建立

HPLC的色谱条件：Shim-pack VP-ODS 色谱柱(250 × 4.6 mm)；流动相：V（乙腈）:V（水）= 80:20；UV检测器检测波长：λ= 250 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；流速：0.8 mL/min。

取标准工作液（1 mg/mL），配制成系列浓度（5、10、50、100、200、300 ng/mL），用HPLC测定，以各浓度和其对应的峰面积进行线性拟合。该标准曲线线性关系较好，其线性回归方程为：y=1443.3x-1207.2 (R²=0.9999)，线性范围为5～300 ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图8。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (2)

1.壳聚糖载体的DMT单克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）壳聚糖的交联：利用反相悬浮交联法，将壳聚糖样品完全溶解于体积比计2 %的醋酸缓冲液中配成质量与体积比计为1 %的CTS溶液，用等体积的石蜡油进行乳化，加入终浓度体积比计为0.5 %的甲醛反应1 h；再加入交联剂环氧氯丙烷，使其终浓度体积比计为0.4 %～0.6 %，70 ℃交联3～5 h，pH保持在9～10；反应完毕后，用大量的蒸馏水清洗后用石油醚索氏抽提10～12 h，用蒸馏水洗涤至中性后冷冻干燥即制备出成球性能优良，具有较强吸附性能的交联壳聚糖；

（2）免疫亲和吸附剂的制备：采用25 %戊二醛作为交联剂将步骤（1）中制备的交联壳聚糖与DMT单克隆抗体以质量比为500:3进行偶联，戊二醛的终浓度体积比计为0.4 %～0.6 %，在40 ℃下振荡交联8～10 h，按反应体系: NaBH₄体积比10:1的比例加入5 mol/L NaBH₄室温还原1 h，用蒸馏水和PBS洗涤后制成对DMT具有特异性吸附的免疫亲和吸附剂；

（3）装柱：将步骤（2）制备的免疫亲和吸附剂填充到与其体积比为4:1固相萃取柱中，得到以壳聚糖为载体的DMT单克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃保存待用。

2.权利要求1所述的壳聚糖载体的DMT单克隆抗体免疫亲和柱的应用，可以应用于去氢甲睾酮的快速检测。

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