CN101900711A

CN101900711A - 土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法

Info

Publication number: CN101900711A
Application number: CN2010102336818A
Authority: CN
Inventors: 李兆君; 范菲菲; 梁永超
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2010-12-01

Abstract

本发明公开了一种土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其步骤包括：(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na₂EDTA-Mcllvaine；(2)提取土壤样品中的土霉素；(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液吹干后加入流动相，超声提取后过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。本发明的方法操作简便，准确度高，土霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的土壤，其回收率、灵敏度、检出限等在各种土壤中都有较好的准确度和精密度。

Description

土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明属于化学物质残留量检测技术，尤其涉及土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法。

背景技术

近年来，随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的发展，四环素类、大环内酯类、青霉素类、氨基糖类和磺胺/甲氧苄氨嘧啶类抗生素作为饲料添加剂越来越被广泛地应用于畜禽养殖业和水产养殖业中。据统计，欧共体每年养殖业中抗生素的消耗量已达5000多吨；美国每年动物养殖业中抗生素的用量约为11,000多吨，约占抗生素总用量的70％左右；我国抗生素用量约为美国的600倍左右。在所使用的抗生素中，土霉素(Oxytetracycline，OTC)和四环素(Tetracycline)等四环素类抗生素是应用最广泛、使用量最大的一类抗生素。我国畜禽粪便土霉素含量平均为9.09mg/kg。另据报道，我国农村每年畜禽粪便产生量约达40亿吨，80％以上的畜禽粪便没有经过综合处理，而直接被施于农田，经动物粪便排出的各种抗生素及其代谢产物极易进入农田土壤环境中，导致各种抗生素尤其是土霉素等四环素类抗生素在土壤环境中的累积，从而降低土壤生物活性，进而减弱土壤的生物功能。因此，急需建立一种适合于检测土壤中土霉素等四环素类抗生素残留的方法，以探明和摸清我国农田土壤中四环素类抗生素的残留及转化，从而实现我国农产品安全和农业可持续发展。然而，目前关于介质中土霉素等抗生素残留的测定方法大多是基于畜禽蛋肉、乳制品、动物组织、水产品、饲料和蜂胶等介质中四环素类抗生素中的提取及测定建立起来的，如猪肉中四环素类药物残留的测定方法(王立君，赵健，杨挺.固相萃取一高效液相色谱法测定猪肉中四环素类药物的残留[J].现代农业科技，2006(11)：120-121)；肉类及水产品中四环素类抗生素残留量的测定方法(许传梅，星玉秀，董琦，皮立，肖远，胡凤祖.肉类及水产品中四环素类抗生素残留量的高效液相色谱测定方法[J].分析实验室，2007，12(26)：258-260)；饲料中土霉素的测定方法(宋慧敏，耿士伟，冯三令，储瑞武，冯群科，贾书静.高效液相色谱法测定饲料中土霉素[J].中国农业科学与技术，2008，10(S2)：43-47)；畜、禽肉中土霉素残留量的测定方法(修丽华，姜世娟，迟惠，宋永健，郭伟伟，王娟.高效液相色谱法测定畜、禽肉中土霉素的残留量[J].现代食品科技，2007，11(23)：88-90)；鸡肝中土霉素、金霉素、四环素的测定方法(乔坤云.HPLC分析测定鸡肝中土霉素、金霉素、四环素方法[J].中国卫生检验杂志，2003，10(13)：610-611)；简单流动相测定土霉素含量的方法(徐春明，郑广军.简单流动相测定土霉素的含量[J].工程科学，2008，01(10)：25-30)；鸡肉中5种四环素类药物残留量的测定方法(余永新，王静，曹维强.RP-HPLC法快速检测鸡肉中5种四环素类药物残留量[J].毒理学杂志，2007，12(21)：495-497)；城市污水中氯霉素和四环素类抗生素的测定方法(刘虹，张国平，刘丛强.贵阳城市污水及南明河中氯霉素和四环素类抗生素的特征[J].分析化学，2007，35(3)：315-319)；畜牧粪便中13种抗生素药物残留的测定方法(胡献刚，罗义，周启星，徐琳.固相萃取-高效液相色谱法测定畜牧粪便中13种抗生素药物残留[J].分析化学，2008，36(9)：1162～1166)。鲜见关于土壤中四环素类抗生素残留的提取及测定方法的报道。我国土壤种类繁多，其性质和畜禽蛋肉等农产品具有较大的差异，因此，难以将上述介质中土霉素等四环素类抗生素的测定方法直接应用于土壤中。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术中无法快速、准确检测土壤中土霉素的缺陷，提供一种土壤中土霉素提取且测定残留量的方法，以期为探明土霉素在农田土壤中的残留及其转化提供方法依据。

本发明的技术方案为：土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，包括如下步骤：

(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na₂EDTA-Mcllvaine；

(2)提取土壤样品中的土霉素：在干燥土壤样品中加入提取缓冲液Na₂EDTA-Mcllvaine，混合均匀，提取、离心获得的上清液即为土霉素待测液；

(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；

(4)洗脱液干燥后加入流动相，提取过滤得滤液；

(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。

土霉素的提取方式为超声提取。

每次超声提取的时间为3-20分钟。最优为8分钟。

所述提取缓冲液的加入量为一份2g的土壤样品中共加入10-20ml的提取缓冲液。

所述土壤样品中的土霉素提取，一份土壤样品进行三次提取，三次提取获得的上清液混合后为土霉素待测液。

所述第(5)步骤中用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量，其色谱条件为：

流动相：乙腈/0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液的pH值为2-3；

恒速洗脱：流速范围为0.8-1.5ml/min；

柱温：25℃-30℃；

检测器：紫外检测器，检测波长350nm；

进样：进样量为20μl。

所述流动相的乙腈和0.01mol/L磷酸二氢钠溶液体积比为10-15∶85-90。

所述流动相的乙腈和0.01mol/L磷酸二氢钠溶液的最优体积比为10∶90，磷酸二氢钠溶液的pH值为2.5.

所述恒速洗脱的最优流速为1.2ml/min。

有益效果：

应用本方法进行土壤中土霉素残留的测定，操作简便，准确度高，土霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的土壤，其回收率、灵敏度、检出限等在各种土壤中都有较好的准确度和精密度。

附图说明

图1是5％高氯酸作为缓冲提取液对土壤中土霉素分离效果的影响；

图2是0.1mol/L EDTA-Mcllvaine作为缓冲提取液对土壤中土霉素分离效果的影响；

图3是流动相为甲醇∶乙腈∶0.01mol/L草酸时对土霉素分离效果的影响；

图4是流动相为乙腈∶0.01mol/L NaH₂PO₄对土霉素分离效果的影响；

图5是流动相中乙腈∶0.01mol/L NaH₂PO₄的比例为15∶85时对土霉素分离效果的影响；

图6是流动相中乙腈∶0.01mol/L NaH₂PO₄的比例为10∶90时对土霉素分离效果的影响；

图7是流动相的pH为2.0时对土霉素分离效果的影响；

图8是流动相的pH为2.5时对土霉素分离效果的影响；

图9是流动相的pH为3.0时对土霉素分离效果的影响；

图10是流动相的流速为0.8ml/min时对土霉素分离效果的影响；

图11是流动相的流速为1.0ml/min时对土霉素分离效果的影响；

图12是流动相的流速为1.2ml/min时对土霉素分离效果的影响。

具体实施方式

下面结合具体实验进一步阐述本发明的方法。

材料

供试土壤

供试土壤为潮土、红壤和紫色土3种土壤。3种土壤均为未受土霉素等抗生素污染的农田耕层(0～20cm)土壤，土壤采集后，风干，过2mm筛备用。土壤基本理化性状见表1。

表1供试土壤基本理化性质

主要仪器与试剂

安捷伦1100型高效液相色谱仪；Speedisk Column H₂O-Philic DVB萃取小柱：3ml，100mg填料；色谱柱：Aglient ZORBAX SB-C₁₈(3.5μm，4.6mm×150mm)；土霉素(OxytetracyclineHydrochloride，OTC)，分子式：C₂₂H₂₄N₂O₉，分子量：496.90，纯度≥98％；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

试验方法

(1)土霉素标准溶液及提取缓冲溶液的配制

土霉素标准品溶液的配制：精密称取土霉素标准品0.06g(精确到0.0001g)于100ml容量瓶中，加入少量1mol/L盐酸溶解，然后用超纯水定容至100ml，制成600mg/L标准品贮备液，4℃保存备用。

采用梯度稀释法，将土霉素标准品储备液准确配制成浓度分别为0.4、4、20、40、80、160和400mg/L的土霉素标准工作液，准确吸取上述标准工作液各0.5ml，加入2g(精确到0.0001g)风干的空白供试土壤中，使土壤中土霉素含量分别为0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0和100.0mg/kg，每个浓度重复6次，充分混匀，用超纯水调节土壤含水量为土壤最大田间持水量的80％，于25℃生化培养箱中暗培养平衡12h，获得不同土霉素含量浓度的土壤样品。

Na₂EDTA-Mcllvaine提取缓冲溶液的配制：分别称取柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)12.9g(精确到0.0001g)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)71.628g(精确到0.0001g)，EDTA-2Na 37.2g(精确到0.0001g)于100mL烧杯中，加少量超纯水溶解后，转移至1000mL容量瓶中，加适量超纯水，用0.1mol/L HCl调节pH至4.000±0.005，最后用超纯水定容，即为EDTA-McIIlvaine提取缓冲液，放于4℃冰箱中保存备用。

提取缓冲液的选择直接决定了土霉素残留量的测定，经对比试验，本发明选择了0.1mol/LEDTA-Mcllvaine作为提取缓冲液，见图1和图2的结果对比。图1显示了采用其他介质土霉素测试方法中较为常用的5％高氯酸作为提取缓冲液时对土霉素分离效果的影响，图2显示了采用本发明的0.1mol/L EDTA-Mcllvaine作为提取缓冲液时对土霉素分离效果的影响。图中箭头所指的峰为土霉素峰，在相同条件下，土壤中的土霉素经5％高氯酸提取后，经HPLC测定后峰面积为285.56，而经0.1mol/L EDTA-Mcllvaine提取后，峰面积仅为55.67，两者相差约5倍。此外，由于四环素类抗生素在强酸性条件下(pH＜2.0)，易于降解为脱水产物，加热时又可转变为差向异构体，而5％高氯酸溶液pH值小于2.0，因此，从这个意义上讲，选取5％高氯酸溶液作为土壤中土霉素的提取也是不合适的。因此，选用含有EDTA的弱酸性的0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取土壤中土霉素残留的提取液较为合适。

(2)提取土壤样品中的土霉素

土壤样品中土霉素的提取方法是在干燥土壤样品中加入提取缓冲液Na₂EDTA-Mcllvaine，混合均匀，超声提取离心获得上清液即为土霉素待测液。通过以下试验，获得最佳的提取效果。

取两种土霉素浓度的土壤样品，分为20mg/kg组和40mg/kg组；分别称取2g(精确到0.0001g)不同土霉素浓度组的土壤样品于不同50ml离心管(T1)中；

A、确定提取缓冲液加入量试验：

分三种方式加入提取缓冲液，第一种在2g土壤中加入10ml 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine溶液，首先在离心管(T1)中加入提取缓冲液4ml，旋涡混合30s，3000r/min超声8min，离心5min，倾出上清液于另一干净的50ml离心管(T2)中；然后在离心管(T1)中再加入提取缓冲液4ml，重复上述步骤；第三次在离心管(T1)中加入提取缓冲液2ml，重复上述步骤后在离心管(T2)中混合的上清液即为土霉素待测液。

第二种在2g土壤中加入15ml0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，除第一次加入5ml，第二次加入5ml，第三次加入5ml外，其余步骤与第一种相同。

第三种在2g土壤中加入20ml0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，除第一次加入10ml，第二次加入5ml，第三次加入5ml外，其余步骤与第一种相同。

试验结果见表2，加入量为15ml时，所得峰面积最大。当土壤中土霉素的添加浓度为20mg/kg，提取液加入量为10ml时，所得峰面积明显小于15ml和20ml提取液加入量的处理，而后两者所得的峰面积相差不明显，并且提取液加入量为20ml的峰面积略小于提取液加入量为15ml的。当土壤中土霉素的添加浓度为40mg/kg时，提取液加入量为15ml时，峰面积为284.13，明显高于其他加入量为10ml和20ml时的峰面积。因此，就提取液加入量而言，选择在2g土壤中加入15ml提取液是最优的。

表2提取液加入量对土霉素出峰面积的影响

B、确定提取过程中超声时间的试验：

在确定缓冲提取液及其加入量后，将每次土霉素提取过程中的超声时间分别设为3、8、13和18min(表3)。由表3可知，这些超声时间都能实现土霉素的提取，但不同的超声时间对土霉素的出峰面积有一定的影响，随着超声时间的延长，土霉素样品的峰面积先逐渐增加而后降低，不管土壤中土霉素添加浓度为20mg/kg还是40mg/kg，均以超声时间为8min时土霉素的峰面积最大。因此，在提取过程中，超声时间8min更为合适。

表3超声时间对土霉素出峰面积的影响

因此，土壤中土霉素的最优提取方法是在装有2g土壤样品离心管(T1)中首先加入5ml0.1mol/L EDTA-Mcllvainel，旋涡混合30s，3000r/min超声8min，离心5min，倾出上清液于另一干净离心管(T2)中，重复上述步骤两次，总共加入15ml0.1mol/L EDTA-Mcllvainel，在离心管(T2)中获得土霉素待测液。对土壤样品中的土霉素进行三次提取，将三次的上清液混合获得土霉素待测液，每次超声提取的时间为8分钟，提取缓冲液的加入量为每2g土壤样品加入10-20ml提取缓冲液，分三次加入。

(3)用HLB固相萃取小柱对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液。

用Speedisk Column H₂O-Philic DVB萃取小柱对上述所得到的待测液进行纯化和洗脱。首先用6ml无水甲醇和8ml提取液对固相萃取小柱进行活化，然后加入待测液，待待测液全部通过小柱后，用12ml超纯水冲洗固相萃取小柱，之后再用10ml无水甲醇进行洗脱。

(4)洗脱液用氮气流吹干后加入流动相乙腈：0.01mol/L NaH₂PO₄，其体积比为乙腈∶0.01mol/L NaH₂PO₄＝10∶90，超声提取后过滤得滤液。

将上述收集到的洗脱液，用氮气流在50℃条件下吹干。之后精确加入1ml流动相，超声10min，用0.45μm尼龙微孔滤膜进行过滤，滤液用于HPLC分析。

(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。

确定色谱条件的试验

流动相的选择

分别以甲醇∶乙腈∶0.01mol/L草酸和乙腈∶0.01mol/L NaH₂PO₄为流动相对土霉素待测液进行分离，结果如图3、4所示。由图3可知，相同条件下，流动相为用甲醇∶乙腈∶0.01mol/L草酸时，出现连峰现象，不能实现土霉素样品很好的分离；而当流动相为乙腈∶0.01mol/LNaH₂PO₄时(见图4)，土霉素样品分离效果较好，没有连峰现象，可以较好地将土霉素样品与杂质分开。图中箭头所指的峰为土霉素峰。

参见图5和图6，当流动相中乙腈和0.01mol/L NaH₂PO₄溶液的比例分别为15∶85(图5)和10∶90(图6)时，均能够在一定程度上实现土霉素样品的分离，虽然乙腈和0.01mol/LNaH₂PO₄溶液的比例为15∶85时，土霉素样品峰明显高于10∶90，但是当比例为10∶90时，更能实现土霉素样品与杂质的很好分离。故而10∶90作为流动相中乙腈和0.01mol/L NaH₂PO₄溶液的比例来分离土霉素样品是更为合适的。图中箭头所指的峰为土霉素峰。

流动相pH的选择

在确定了合适的流动相之后，我们发现流动相乙腈∶0.01mol/L NaH₂PO₄中0.01mol/LNaH₂PO₄溶液的pH值对土霉素的分离效果具有一定的影响，在pH值为2、2.5、3的情况下都有出峰(见图7、8、9)，但pH值为2.5时无连峰现象(见图8)，能够实现土霉素样品峰与杂质的最好分离，能够更好地满足测定的分离要求。图中箭头所指的峰为土霉素峰。

流动相流速的选择

由图10、11、12可知，流速可以选择0.8，1.0和1.2ml/min，它们对土霉素样品峰形没有明显的影响。但对土霉素样品出峰时间是有一定影响的，当流速为1.2ml/min时，土霉素的出峰时间约为12.8min(见图12)，而当流速为0.8和1.0ml/min(见图10、图11)时，土霉素的出峰时间则分别约为19.9和15.2min，明显长于土霉素在流速1.2ml/min时的出峰时间。由此可见，选择为1.2ml/min作为HPLC检测土霉素样品的流速能够明显缩短土霉素样品的出峰时间，提高仪器的分析效率，1.2ml/min的流速为更好选择。

根据以上试验，可以确定用高效液相色谱仪测定滤液中的土霉素含量的最佳色谱条件为：

色谱柱：Aglient ZORBAX SB-C₁₈(3.5μm，4.6mm×150mm)

流动相：乙腈∶0.01mol/L磷酸二氢钠溶液为10∶90，磷酸二氢钠溶液的pH值为2.5；

恒速洗脱：流速范围为1.2ml/min；

柱温：25℃；

检测器：紫外检测器，检测波长350nm；

进样：HP1100型自动进样器进样，进样量为20μl。

(6)线性回归方程、相关系数、检出限和回收率的计算

将不同土霉素含量浓度的土壤样品分别按上述的最优方式进行土霉素的提取(第(2)步骤)，纯化和洗脱(第(3)步骤)，洗脱液吹干后加入流动相过滤(第(4)步骤)，滤液用高效液相色谱仪分析(第(5)步骤)，制备标准曲线，并进行回归分析。

结果见表4。由表4可知，在此浓度范围内，3种土壤中土霉素含量与峰面积呈良好的线性关系，不同土壤R值分别为0.997(红壤)、0.995(紫色土)和0.987(潮土)。分别配制土壤中土霉素含量为5mg/kg的3种土壤样品，每一种土壤做12次重复，以3倍信噪比(S/N＝3)，求得不同土壤的检出限见表4。本方法测定土壤中土霉素含量的检出限为0.09～0.17mg/kg，其中对潮土中土霉素含量的测定限最低。

表4线性回归方程、相关系数和检出限

x：土壤中土霉素样品浓度(concentration of OTC in soils)，mg/kg；y：样品峰面积(Peakarea of the sample)。

将土霉素含量浓度分别为5，50，100mg/kg的3种土壤，每个浓度重复6次，按上述的最优方式实施(2)、(3)、(4)、(5)步骤后进行测定，计算土霉素的相对回收率和相对标准偏差(结果见表5)。从表5可知，土壤中土霉素样品的相对回收率介于61.5％～128.8％，其中潮土中土霉素的相对回收率为61.5％～103.9％，红壤中土霉素的相对回收率为80.7％～128.8％，紫色土中土霉素的相对回收率为70.5％～100.0％。测定的相对标准偏差介于4.1％～38.1％，其中潮土中土霉素测定的相对标准偏差为4.1％～17.0％，红壤中土霉素测定的相对标准偏差为7.1％～28.2％，紫色土中土霉素测定的相对标准偏差为11.9％～38.1％。由此可见，应用本方法进行土壤中土霉素含量的测定能够得到较好的准确度和精密度。

表5方法的相对回收率与相对标准偏差

Claims

1.一种土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na₂EDTA-Mcllvaine；

(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；

(4)洗脱液干燥后加入流动相，提取过滤得滤液；

(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。

2.根据权利要求1所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于土霉素的提取方式为超声提取。

3.根据权利要求2所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于每次超声提取的时间为3-20分钟。

4.根据权利要求3所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于一份2g的土壤样品共加入10-20ml的提取缓冲液。

5.根据权利要求4所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于一份土壤样品进行三次土霉素的提取，三次提取获得的上清液混合后为土霉素待测液。

6.根据权利要求5所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于每次超声提取的时间为8分钟。

7.根据权利要求1所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量的色谱条件如下：

恒速洗脱：流速范围为0.8-1.5ml/min；

柱温：25℃-30℃；

检测器：紫外检测器，检测波长350nm；

进样：进样量为20μl。

8.根据权利要求7所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于所述流动相的乙腈和0.01mol/L磷酸二氢钠溶液体积比为10-15∶85-90。

9.根据权利要求8所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于所述流动相的乙腈和0.01mol/L磷酸二氢钠溶液的最优体积比为10∶90，磷酸二氢钠溶液的pH值为2.5。

10.根据权利要求7所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于所述恒速洗脱的最优流速为1.2ml/min。