CN114609273A - 基于固相萃取-upc2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗生素生化检测技术领域，尤其涉及一种固相萃取‑超高效合相色谱法（UPC2）分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法。该方法使用氨化乙酸乙酯对样品进行提取，通过HLB柱对样品进行净化后，采用CHIRALPAK AD‑3柱手性色谱柱分离，以超临界CO2和含0.5%（体积分数）氨水的甲醇溶液）为流动相梯度洗脱，外标法定量。在0.05‑0.3 mg/kg范围内进行添加回收实验，两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的加标回收率为81.2%‑107%，RSD为5.0%‑9.0%，使用该方法对市售的20份猪肉样品中的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺残留进行测定，均未检出（+）‑氟苯尼考，1份猪肉样品检出（‑）‑氟苯尼考，检出量为248µg/kg。

Description

基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代 谢物的方法
技术领域
本发明涉及抗生素生化检测技术领域，尤其涉及一种基于固相萃取-超高效合相色谱法 (UPC2)分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法。
背景技术
氟苯尼考(Florfenicol，FF)又称氟甲砜霉素，是一种新型的氯霉素类动物专用抗生素，主要代谢产物为氟苯尼考胺[1,2](Florfenicol amine，FFA)，具有抗菌谱广、高效、安全等特点，在防治畜禽养殖过程中的细菌性疾病方面有广泛的应用[3,4]。氟苯尼考在畜禽动物体内的半衰期长，分布较广，又具有耐药性和胚胎毒性，在动物组织中残留会严重危害人体的健康与安全。氟苯尼考化学结构中存在两种对映体[5]，分别为(-)-氟苯尼考左旋体和(+)- 氟苯尼考右旋体，两种对映体及其代谢物氟苯尼考胺的结构式如图1所示。其中(-)-氟苯尼考左旋体具有抗菌活性，而(+)-氟苯尼考右旋体无活性甚至对氟苯尼考的活性有一定的抑制作用[6-8]。而GB 31650-2019[9]规定猪肉中氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺之和的最高残留限量≤300μg/kg，如果能进一步研究氟苯尼考的两种对映体及其代谢物氟苯尼考胺在猪肉中的残留量，那将能为氟苯尼考对映体残留分析提供精确的判定。
目前国内外检测氟苯尼考对映体的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)[7,8,10-12]。该方法分离度好，但存在检测时间较长，有机试剂消耗量大等问题，无法实现快速分离检测的目的。因此，建立一种快速高效的检测方法具有广泛的应用前景。超高效合相色谱技术(UPC2)主要以超临界状态的CO2为流动相主体，加入少量甲醇、乙腈、异丙醇等助溶剂，通过调节色谱柱温、系统背压及助溶剂的比例来改变CO2的密度和洗脱能力，从而精确调控目标化合物的分离，因此该新型色谱分离技术对结构相似的手性化合物具有很好的分离效果[13-17]。目前，UPC2技术应用于氟苯尼考对映体的分离及残留测定未见有报道。
申请人申请的中国发明专利(申请号：2022100921237，申请日：20220125)公开了超高效合相色谱法分离和测定氟苯尼考对映体的方法，采用UPC2对氟苯尼考对映体进行分离，考察了氟苯尼考检测波长和储存稳定性，同时还考察了手性色谱柱、梯度分离条件、助溶剂、系统背压、柱温、定容试剂对氟苯尼考对映体分离的影响。最佳色谱条件为：手性色谱柱 Acquity Trefoil CEL2(150mm×3.0mm，2.5μm)，助溶剂甲醇，流速1.0mL/min，检测波长224nm，柱温40℃，系统背压17.2MPa。在6.0min内可实现两种氟苯尼考对映体的分离。该方法分离效果好、检测时间短、稳定性良好，为氟苯尼考对映体的精确测定提供了一种新方法，但该方法中并不涉及氟苯尼考代谢物的检测。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种基于UPC2分离和测定两种氟苯尼考对映体及其代谢物氟苯尼考胺的方法，该方法并应用于猪肉中氟苯尼考及其代谢物的分离和残留的测定，从而为畜禽类产品中的氟苯尼考对映体及代谢物残留测定提供技术支持。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，氟苯尼考对映体为(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考，代谢物为氟苯尼考胺；该方法包括以下的步骤：
1)样品的提取
称取10.0g(精确至0.01g)猪肉样品置于50mL具塞离心管中，加入25mL含3％体积分数氨水的乙酸乙酯溶液，涡旋1min混匀，在3000r·min-1转速下离心5min，吸取上清液至浓缩瓶中，以25mL乙酸乙酯重复提取，合并两次提取液，在40℃以下水浴减压浓缩至近干，加10mL磷酸盐缓冲液分次溶解残渣，待净化；
2)样品的净化
依次用3mL甲醇、3mL水活化HLB固相萃取柱；移取上述溶液注入活化好的HLB固相萃取柱中，用10mL水淋洗，弃去淋洗液，真空抽柱1min，用6mL甲醇洗脱，洗脱液收集在15mL离心管中，在40℃下氮气吹至近干，加入1mL体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液，涡旋3min 充分溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，滤液供UPC2分析；
3)UPC2测试方法
UPC2采用CHIRALPAKAD-3手性色谱柱，填料为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯；检测波长为224nm；系统背压为13.8Mpa；色谱柱温为40℃；流动相：A为CO2，B为含0.5％体积分数氨水的甲醇溶液；梯度洗脱，流量：1.0mL·min-1；进样量5.0μL。
作为优选，步骤3)中梯度洗脱程序为：0-2min时，B为10％；2.0-3.0min时，B由10％升至25％，保持3min；6.0～6.1min时，B由25％降至10％，保持2min。
作为优选，(-)-氟苯尼考在0.5～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝1.15×104X+5.19×103，相关系数R2大于0.999，LOQ为0.05mg/kg；(+)-氟苯尼考在0.5～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝9.20×103X+3.24×103，相关系数R2大于0.999，LOQ为0.05mg/kg；氟苯尼考胺在1.0～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝1.10×104X-2.51×104，相关系数R2大于0.999，LOQ为0.1mg/kg。
作为优选，(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范围为81.2％-107％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为5.0％-9.0％。
作为优选，(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的单标准储备溶液：1.0g·L-1，分别称取0.01g(精确至0.1mg)(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中。
作为优选，(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合标准溶液系列：取一定量的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的单标准储备溶液，用体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液逐级稀释配制成0.50、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00mg·L-1的混合标准工作溶液系列。
本发明由于采用了上述的技术方案，采用超高效合相色谱法分离了两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺，并对猪肉中两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的残留量进行测定。使用氨化乙酸乙酯对样品进行提取，通过HLB柱对样品进行净化后，采用CHIRALPAK AD-3柱手性色谱柱分离，以超临界CO2和含0.5％(体积分数)氨水的甲醇溶液)为流动相梯度洗脱，外标法定量。在0.05-0.3mg/kg范围内进行添加回收实验，两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的加标回收率为81.2％-107％，RSD为5.0％-9.0％，使用该方法对市售的20份猪肉样品中的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺残留进行测定，均未检出(+)-氟苯尼考，1份猪肉样品检出(-)-氟苯尼考，检出量为248μg/kg。
附图说明
图1氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的结构式。
图2不同定溶剂对(+)-氟苯尼考、(-)-氟苯尼考和氟苯尼考胺分离效果的影响。
图3不同色谱柱温度对(+)-氟苯尼考、(-)-氟苯尼考和氟苯尼考胺分离效果的影响。
图4氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺标准品的色谱图。
具体实施方式
1材料与方法
1.1仪器与试剂
Acquity型超高效合相色谱仪；AE260型电子天平；R215型旋转蒸发仪；ELGACLXXXUVM2 型超纯水净化系统；MS2型涡旋混匀器；N-EVAPTM 111型氮吹仪；Oasis HLB型聚合物固相萃取小柱(3mL，60mg)；Oasis MCX型混合型强阳离子交换固相萃取柱(3mL，60mg)；Supleco C18型固相萃取小柱(3mL，300mg)。
标准品：氟苯尼考胺标准品(CAS：76639-93-5，纯度≥99.7％)(BePure公司)，氟苯尼考对映体标准品：(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考(纯度≥99.0％)(中国牧工商总公司研究院)；
两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的单标准储备溶液：1.0g·L-1，分别称取0.01g(精确至0.1mg)(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中。
两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的混合标准溶液系列：取一定量的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的单标准储备溶液，用体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液逐级稀释配制成0.50、 1.00、2.00、4.00、10.00、20.00mg·L-1的混合标准工作溶液系列。
乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正庚烷、乙酸乙酯均为色谱纯；氨水、磷酸氢二钾K2HPO4、磷酸二氢钾KH2PO4均为分析纯；二氧化碳(CO2)纯度为99.999％；其他所用试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。
磷酸盐缓冲溶液：称取8.00g K2HPO4和2.00g KH2PO4,用水溶解并定容至1000mL。
1.2仪器工作条件
CHIRALPAK AD-3手性色谱柱(150mm×3.0mm，3μm)，填料为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯；检测波长为224nm；系统背压为13.8Mpa；色谱柱温为40℃；流动相： A为CO2，B为含0.5％(体积分数，下同)氨水的甲醇溶液；梯度洗脱程序为：0-2min时，B为 10％；2.0-3.0min时，B由10％升至25％，保持3min；6.0～6.1min时，B由25％降至10％，保持2min；流量：1.0mL·min-1；进样量5.0μL。
1.3试验方法
1.3.1样品的提取
称取10.0g(精确至0.01g)猪肉样品置于50mL具塞离心管中，加入25mL含3％(体积分数)氨水的乙酸乙酯溶液，涡旋1min混匀，在3 000r·min-1转速下离心5min，吸取上清液至浓缩瓶中，以25mL乙酸乙酯重复提取，合并两次提取液，在40℃以下水浴减压浓缩至近干，加10mL磷酸盐缓冲液分次溶解残渣，待净化。
1.3.2样品的净化
依次用3mL甲醇、3mL水活化HLB固相萃取柱。移取上述溶液注入活化好的HLB固相萃取柱中，用10mL水淋洗，弃去淋洗液，真空抽柱1min，用6mL甲醇洗脱，洗脱液收集在15mL离心管中，在40℃下氮气吹至近干，加入1mL体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液，涡旋3min 充分溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，滤液供UPC2分析。
2结果与讨论
2.1提取条件的选择
文献报道的氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的提取方法有许多，提取试剂通常为乙酸乙酯[18-20]、水-丙酮溶液[21]、乙腈[22,23]、甲醇[24]等溶剂。实验结果表明，采用水-丙酮溶液、乙腈或甲醇提取时，提取率较差，回收率较低；氟苯尼考胺为弱碱性物质，实验在乙酸乙酯中加入氨水，采用含3％(体积分数)氨水的乙酸乙酯溶液提取时，氟苯尼考胺的平均回收率为95.4％，且干扰峰较少。因此，本发明选择氨化乙酸乙酯作为提取试剂。
2.2净化条件的选择
本发明研究考察了混合型阳离子交换固相萃取柱(MCX)、亲水亲脂固相萃取柱(HLB) 和非极性疏水C18净化小柱对猪肉中氟苯尼考及其代谢物的回收率和净化效果。结果表明，采用C18或HLB净化小柱净化后，色谱图的干扰峰较少；采用3种净化小柱净化后的平均回收率依次为32.8％、97.7％和80.1％。综合考虑，因此本发明采用HLB柱作为净化小柱。
2.3定容试剂的选择
本发明比较了5种常用的定容试剂：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷对两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺分离效果的影响。结果显示，5种定容试剂中，当使用正庚烷作为定容试剂时，两种氟苯尼考对映体的色谱峰分离度和响应最佳；当使用异丙醇作为定容试剂时，氟苯尼考胺的色谱峰响应最佳(图2)。因此，为了保证两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的色谱峰响应，本发明考察了异丙醇和正庚烷的不同比例混合溶液对两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺分离效果的影响。结果表明，正庚烷浓度越高，(-)-氟苯尼考的峰形越尖锐；异丙醇浓度越高，氟苯尼考胺的峰形越尖锐。综合考虑3个目标化合物的峰形，本发明选择体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液作为定容试剂。
2.4系统背压的选择
超高效合相色谱中，主要通过调节系统背压来控制CO2在仪器运行过程中的超临界状态，从而改变其对物质的洗脱能力、溶解能力和选择性。由于CO2的压力超过7.38MPa且温度超过31℃以上，CO2才会进入超临界CO2状态。本发明考察了系统背压在10.3、13.8、17.2、 20.7、24.1MPa对目标化合物分离的影响。结果表明，随着系统背压的增加，3个目标物的分析时间提前，(-)-氟苯尼考峰高降低，(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的色谱峰形峰高升高。综合考虑色谱峰形及保留时间，当系统背压为13.8MPa时，3个目标化合物色谱峰形和分离度均达到最佳，故本发明选择系统背压为13.8MPa。
2.5柱温的选择
在UPC2系统中，色谱柱的温度对目标物的保留时间和分离度有一定的影响，当柱温升高，超临界CO2流体的密度发生改变，流动相粘度减小，目标化合物的洗脱能力也随之减小，保留时间就会延长。考虑到CHIRALPAK AD-3手性色谱柱的最高使用温度为40℃，CO2的温度超过 31℃且压力超过7.38MPa以上，系统才会处于超临界CO2状态。因此实验在其他色谱条件不变的情况下，分别考察了柱温在31℃、35℃、40℃对目标化合物分离的影响。如图3所示，当柱温为31℃和35℃时，3个目标化合物中只有(-)-氟苯尼考得到完全分离，(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺两个色谱峰未能实现完全分离；当柱温达到40℃时，3个目标化合物完全分离，且峰形良好。因此，本发明最终选择色谱柱柱温为40℃。
2.6标准品的拆分
应用本方法对所采购的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺标准品进行拆分。如图4所示， 3种目标化合物的分离效果良好，在5.0min内实现了有效分离，分离度分别为4.0和1.8，符合R≥1.5完全分离的要求[25]。按照色谱峰的保留时间顺序，依次为：(-)-氟苯尼考、(+) -氟苯尼考和氟苯尼考胺。
2.7标准曲线和定量限
将(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的系列混合标准溶液按“1.2”色谱条件进行标准工作溶液测定，以标准溶液的质量浓度为横坐标(X)，对应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。如表1所示，3种目标化合物在0.5～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(R2)大于0.999。通过在不含有氟苯尼考和氟苯尼考胺的猪肉空白样品中添加标准品，按照本方法进行测定，以信噪比(S/N)＝10计算定量限(LOQ)，得到(-)-氟苯尼考和(+)-氟苯尼考的LOQ为0.05mg/kg，氟苯尼考胺的LOQ 均为0.1mg/kg。
表1各个化合物的线性范围、线性方程、相关系数、定量限
Figure BDA0003525669900000061
2.8精密度和回收率
采用分别在不含有氟苯尼考和氟苯尼考胺的猪肉空白样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定和方法的精密度测定，(-)-氟苯尼考和(+)-氟苯尼考的添加水平分别为0.05， 0.1，0.3mg/kg，氟苯尼考胺的添加水平分别为0.1，0.2，0.3mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表2。3种目标化合物的回收率范围为81.2％-107％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为5.0％-9.0％。该回收率和精密度符合GB/T27404-2008[26]的要求，能够满足猪肉样品的分析要求，可用于日常分析的检测。
表2猪肉样品中氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)
Figure BDA0003525669900000071
2.9实际样品的测试
采用优化后的色谱条件以及前处理方法对市售20份猪肉样品中的氟苯尼考对映体及其代谢物氟苯尼考胺进行测定。结果显示，20份猪肉样品均未检出(+)-氟苯尼考，1份猪肉样品中检出(-)-氟苯尼考，含量为248μg/kg，该情况与文献[7,10,12]报道采用HPLC法所测试氟苯尼考样品的现象相符。
3结论
本发明采用超高效合相色谱法分离了两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺，并对猪肉中两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的残留量进行测定。使用氨化乙酸乙酯对样品进行提取，通过HLB柱对样品进行净化后，采用CHIRALPAK AD-3柱手性色谱柱分离，以超临界CO2和含0.5％ (体积分数)氨水的甲醇溶液)为流动相梯度洗脱，外标法定量。在0.05-0.3mg/kg范围内进行添加回收实验，两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的加标回收率为81.2％-107％，RSD 为5.0％-9.0％，使用该方法对市售的20份猪肉样品中的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺残留进行测定，均未检出(+)-氟苯尼考，1份猪肉样品检出(-)-氟苯尼考，检出量为248 μg/kg。
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Claims (6)

1.一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，氟苯尼考对映体为(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考，代谢物为氟苯尼考胺；其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1)样品的提取
称取10.0g(精确至0.01g)猪肉样品置于50mL具塞离心管中，加入25mL含3％体积分数氨水的乙酸乙酯溶液，涡旋1min混匀，在3000r·min-1转速下离心5min，吸取上清液至浓缩瓶中，以25mL乙酸乙酯重复提取，合并两次提取液，在40℃以下水浴减压浓缩至近干，加10mL磷酸盐缓冲液分次溶解残渣，待净化；
2)样品的净化
依次用3mL甲醇、3mL水活化HLB固相萃取柱；移取上述溶液注入活化好的HLB固相萃取柱中，用10mL水淋洗，弃去淋洗液，真空抽柱1min，用6mL甲醇洗脱，洗脱液收集在15mL离心管中，在40℃下氮气吹至近干，加入1mL体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液，涡旋3min充分溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，滤液供UPC2分析；
3)UPC2测试方法
UPC2采用CHIRALPAKAD-3手性色谱柱，填料为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯；检测波长为224nm；系统背压为13.8Mpa；色谱柱温为40℃；流动相：A为CO2，B为含0.5％体积分数氨水的甲醇溶液；梯度洗脱；流量：1.0mL·min-1；进样量5.0μL。
2.根据权利要求1所述的一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，其特征在于，步骤3)中梯度洗脱程序为：0～2min时，B为10％；2.0～3.0min时，B由10％升至25％，保持3min；6.0～6.1min时，B由25％降至10％，保持2min。
3.根据权利要求1所述的一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，其特征在于，(-)-氟苯尼考在0.5～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝1.15×104X+5.19×103，相关系数R2大于0.999，LOQ为0.05mg/kg；(+)-氟苯尼考在0.5～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝9.20×103X+3.24×103，相关系数R2大于0.999，LOQ为0.05mg/kg；氟苯尼考胺在1.0～20.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝1.10×104X-2.51×104，相关系数R2大于0.999，LOQ为0.1mg/kg。
4.根据权利要求1所述的一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，其特征在于，(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范围为81.2％～107％，相对标准偏差(RSD，n＝6)范围为5.0％～9.0％。
5.根据权利要求1所述的一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，其特征在于，(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的单标准储备溶液：1.0g·L-1，分别称取0.01g(精确至0.1mg)(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中。
6.根据权利要求5所述的一种基于固相萃取-UPC2分离和测定猪肉中氟苯尼考对映体及其代谢物的方法，其特征在于，(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合标准溶液系列：取一定量的两种氟苯尼考对映体和氟苯尼考胺的单标准储备溶液，用体积比8:2的正庚烷-异丙醇溶液逐级稀释配制成0.50、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00mg·L-1的混合标准工作溶液系列。
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