CN106770804A - 烟草幼苗中土霉素含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草幼苗土霉素含量的检测方法，依次进行以下步骤：将新鲜烟草幼苗叶1g用蒸馏水洗净磨碎，然后用体积浓度为5％甲酸水溶液进行匀浆；在匀浆液中加入提取液经漩涡振荡、超声处理、高速离心后过滤，得滤液；将滤液加入ODS C8固相萃取柱中进行吸附、洗脱，收集全部甲醇洗脱液，干燥后用0.2ml流动相进行溶解，超高速离心后，取上清液作为待测液；将待测液用高效液相色谱‑紫外色谱法检测；按照土霉素标准曲线方程Y＝15581X+201.56，获得待测液的土霉素质量浓度X，该X的单位为μg/mL；最后经换算获得新鲜烟草幼苗叶中的土霉素含量。

Description

烟草幼苗中土霉素含量的检测方法

技术领域

本发明属于抗生素痕量检测技术领域，具体地说，涉及一种烟草幼苗土霉素含量的检测方法。

背景技术

抗生素在人类和动物疾病的预防与治疗、畜禽养殖和水产养殖中作为添加剂从而加快动物生长和促进增产方面都起到了极其重要的作用。人用和兽用的抗生素大部分不能被机体完全吸收，85％以上抗生素以原形或代谢物形式随粪尿排入环境，造成土壤与水体污染。抗生素及其代谢产物在土壤环境中性质稳定，难降解，易溶于水，极易向植物体内富集，其富集率可高达万倍以上，故当人畜粪便作为有机肥料施用于农田时，可能导致一些难降解、易吸附的抗生素(如喹诺酮类、磺胺类和四环素类)通过食物链积累，对人类健康产生危害。

烟草是我国重要的经济作物之一，面积和总产量居世界第1位。至今，烟草行业仍是我国某些省市县的经济支柱产业，在国民经济飞速发展中起着举足轻重的作用。随着社会的发展和进步，吸烟与健康问题越来越被人们所重视，烟草制品是以烟叶为原料的吸食品，因而，烟叶原料的安全性与广大消费者的健康息息相关，其安全性越来越受到消费者的关注。卷烟原料安全性主要指烟叶中含有的有毒有害物质的多少。烟叶有毒有害物质包括内源与外源两个方面。内源有害物质主要指烟草本身所含有的对人体有毒有害物质，如焦油、一氧化碳(烟叶燃烧产生而被人吸入)、苯酚、巴豆醛、亚硝胺、氢氰酸等，外源有害物质主要指农药残留、重金属等有害物质。一般认为，农药残留和重金属是烟叶质量安全的核心。抗生素作为一种新型的环境污染物，能够通过水、土壤和有机肥料进入到烟草生产环境中。这些抗生素可能会被烟草吸收，并在烟株体内驻留，经过长期蓄积，除可以显著影响烟草生长之外，可能经过烟草吸食进入吸烟者呼吸系统和消化系统中，从而对吸烟者健康造成危害。

目前，关于抗生素在烟草中研究，在国内外尤其是国内，其研究程度极其薄弱，只有零星的报道。高效液相色谱法检测蔬菜、鱼类、水以及药品等中的土霉素含量已经很成熟，但烟叶中土霉素抗生素含量的检测方法还没有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种烟草幼苗土霉素含量的检测方法，该方法检测时间短，检查结果误差小、精确。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种烟草幼苗土霉素含量的检测方法，依次进行以下步骤：

1)、将新鲜烟草幼苗叶1g用蒸馏水洗净磨碎，然后用体积浓度为5％甲酸水溶液进行匀浆；

所述烟草幼苗叶与体积浓度为5％甲酸水溶液的重量比为1：1；

2)、称取(准确称取)匀浆液1.0g于带塞容器中(例如为15ml带塞试管中)，并向其中加入2.0毫升提取液；所述提取液由体积比为70：30的甲醇和超纯水组成；

将带塞试管密封后先进行漩涡振荡，然后超声处理，接着再高速离心，取上清液过滤，得滤液；

3)、将步骤2)的滤液加入ODS C8固相萃取柱中进行吸附，先用2ml纯水洗脱，然后用2ml甲醇(色谱甲醇)进行洗脱，收集全部甲醇洗脱液，干燥后用0.2ml流动相进行溶解，超高速离心后，取上清液作为待测液；

上述洗脱流速均为1.0ml/min；

4)、将待测液用高效液相色谱-紫外色谱法检测；

检测条件为：5μm，250mm×4.6mm的安捷伦ODS C18column色谱柱，流动相的流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长280nm；

得待测液的土霉素峰面积Y；

所述步骤3)和步骤4)的流动相均为乙腈-0.01M甲酸水溶液＝13：87(v/v)；

5)、按照土霉素标准曲线方程Y＝15581X+201.56，获得待测液的土霉素质量浓度X，该X的单位为μg/mL；

最后经换算得知新鲜烟草幼苗叶中的土霉素含量。

含量的换算公式为：即经即X*0.2*2μg/g的换算后能获得叶片中的土霉素含量。

作为本发明的烟草幼苗土霉素含量的检测方法的改进：

所述步骤2)中：

漩涡振荡为：于200±20r/min振荡频率下振荡2±0.5min；

超声处理为：于20KHz超声波下进行超声处理3.0±0.5min；

高速离心为于5000±500r/min离心5±1min。

作为本发明的烟草幼苗土霉素含量的检测方法的进一步改进：

所述步骤3)中：

所述干燥为：于40℃水浴中氮气流挥干；

所述超高速离心为：于18000±1000r/min高速离心5±1min。

作为本发明的烟草幼苗土霉素含量的检测方法的进一步改进：

所述步骤2)中：

所述过滤为经有机滤头过滤，有机滤头的孔径为0.22μm。

在本发明中：步骤1)中烟草幼苗叶是指幼苗期(播种后60天以内)烟草叶子。新鲜一般是指采摘5小时内。

本发明具有如下技术优势：

本发明依据抗生素的物理化学特点和烟草内在的生理生化性质，通过线性范围、检出限、精密度、稳定性、重现性、回收率的系统性试验分析，可以快速检测到烤烟烟叶内抗生素—土霉素的含量，为分析抗生素对烤烟生长、产质量提供技术支持；本方法对烤烟幼苗进行预处理，可以有效减少杂质对抗生素—土霉素色谱图的影响，提高含量检出的回收率和准确性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为标准液色谱图(20μ/mL)；

图2为土霉素的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种烟草幼苗土霉素含量的检测方法，依次进行以下步骤：

1)、将1.0g的新鲜烟草幼苗叶用蒸馏水洗净磨碎，并加入1g的5％(体积％)甲酸水溶液进行匀浆；共得到2g的匀浆液。

2)、准确称取匀浆液1.0g于15ml带塞试管中，并向其中加入2.0毫升体积比为70：30的甲醇-超纯水提取液；

将上述带塞试管密封后进行漩涡振荡2min(漩涡振荡的频率为200r/min)；然后于20KHz超声波下进行超声处理3.0min，再5000r/min高速离心5min，取出全部上清液，经0.22μm的有机滤头过滤，收集全部滤液(3.0ml)。

3)、将步骤2)所得滤液加入ODS C8固相萃取柱中，充分吸附后，先用2ml纯水洗脱(洗脱流速为1.0ml/min)，然后用2ml色谱甲醇进行洗脱(洗脱流速为1.0ml/min)，收集全部甲醇洗脱液，于40℃水浴中氮气流挥干，干燥后用0.2ml流动相进行溶解，18000r/min超高速离心5min后，取全部上清液(0.2ml)作为待测液进入HPLC系统检测。

此流动相同下述步骤4)的流动相。

4)、将步骤3)所得的全部待测液用高效液相色谱-紫外色谱法检测，检测条件为：5μm，250mm×4.6mm的安捷伦ODS C18column色谱柱，流动相为乙腈-0.01M甲酸＝13：87(v/v)，流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长280nm。

从而获得土霉素峰面积(Y)。

5)、按照土霉素标准曲线方程Y＝15581X+201.56，获得待测液的土霉素质量浓度X，该X的单位为μg/mL；

最后经换算得知新鲜烟草幼苗叶中的土霉素含量。

含量的换算公式为：即X*0.2*2μg/g的换算后能获得叶片中的土霉素含量。

实验分析

1、色谱分析方法：

日本岛津shimadzu 20AT高效液相色谱系统，浙江大学智达N2000色谱工作站，安捷伦ODS C18 column(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱，流动相为乙腈-0.01M甲酸＝13-87(v/v)，流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长280nm，本实验采用外标法定量。

2、标准曲线制备：

准确称取0.1g土霉素标准品溶解于2ml色谱甲醇中，作为储备液；

将储备液用1％醋酸溶液(醋酸与水按照1:99的体积比混合而得)分别稀释得土霉素浓度为100.0，20.0，5.0，1.0，0.2，0.05μg/mL系列标准液；

分别吸取上述标准液20μL进HPLC检测，色谱条件如上所述；以土霉素峰面积(Y)为纵坐标，以质量浓度(X)为横坐标进行线性回归。

结果显示土霉素标准曲线方程为Y＝15581X+201.56(r＝0.9999)，由此说明在0.05-100μg/mL范围内线性关系较好，标准曲线见图2。

3、精密度试验：

分别取3种浓度的土霉素标准溶液0.2、1.0、5.0μg/mL，分别在同一条件下连续测定3次，记录土霉素的峰面积，计算RSD值。结果显示3种浓度土霉素的RSD均＜3％，表明本发明方法精密度良好。

4、回收率试验：

准确制备空白烟苗(事先已知该烟苗中不含土霉素)上清液适量，精密称定，分别加入土霉素标准品适量，进样5次，测定土霉素的峰面积，计算平均回收率及RSD，结果见表1。

表1、烟草幼苗土霉素加样回收率试验结果(n＝5)

实际案例一：将事先经现有的LC-MS/MS法检测得知土霉素含量分别为0.80、0.40、0.20μg/g的3种烟草幼苗(烟草幼苗A、烟草幼苗B、烟草幼苗C)，按照上述实施例1所述方法进行检测，所得待测液的土霉素峰面积Y、待测液的土霉素质量浓度X、烟草幼苗叶中的土霉素含量分别如下表2所述。

表2

对比例1：将实施例1的步骤1)匀浆中所用的“体积浓度为5％甲酸水溶液”改成“水”，且将步骤2)中的提取液由“体积比为70：30的甲醇和超纯水组成”改成“体积比为80：20：0.3的甲醇、超纯水、甲酸组成”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例1所述方法进行检测，所得结果如下表3所述。

表3

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.73
烟草幼苗B	0.33
		烟草幼苗C	0.14

对比例2-1：取消实施例1的步骤2)中的“超声处理”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例2-1所述方法进行检测，所得结果如下表4所述。

表4

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.67
烟草幼苗B	0.19
		烟草幼苗C	0.040

对比例2-2：将实施例1步骤2)中的“200r/min漩涡振荡2min，20KHz超声处理3.0min”改成“50r/min漩涡振荡8min；超声处理为于10KHz下超声6min”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例2-2所述方法进行检测，所得结果如下表5所述。

表5

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.69
烟草幼苗B	0.30
		烟草幼苗C	0.12

对比例2-3：将实施例1步骤2)中的“200r/min漩涡振荡2min，20KHz超声处理3.0min”改成“500r/min漩涡振荡2min；超声处理为于40KHz下超声3min”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例2-3所述方法进行检测，所得结果如下表6所述。

表6

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.71
烟草幼苗B	0.33
		烟草幼苗C	0.18

对比例3-1：取消实施例1的整个步骤3)中的“ODS C8固相萃取”；即，直接以步骤2)所得的滤液作为待测液；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例3-1所述方法进行检测，所得结果如下表7所述。

表7

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.46
烟草幼苗B	0.17
		烟草幼苗C	0.044

对比例3-2：将实施例1的步骤3)中的“ODS C8固相萃取柱”改成“ODS C18固相萃取柱”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例3-2所述方法进行检测，所得结果如下表8所述。

表8

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.71
烟草幼苗B	0.29
		烟草幼苗C	0.14

对比例3-3：将实施例1的步骤3)中的“ODS C8固相萃取柱”改成“ODS C12固相萃取柱”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例3-3所述方法进行检测，所得结果如下表9所述。

表9

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.70
烟草幼苗B	0.29
		烟草幼苗C	0.12

对比例3-4：将实施例1的步骤3)中的“先用2ml纯水洗脱，然后用2ml甲醇(色谱甲醇)进行洗脱，收集全部甲醇洗脱液，”改成“先用50％甲醇2ml洗脱，然后用2ml甲醇(色谱甲醇)进行洗脱，收集全部甲醇洗脱液，”；其余内容等同于实施例1。

将实际案例一中的3种样品按照上述对比例3-4所述方法进行检测，所得结果如下表10所述。

表10

样品	烟草幼苗叶中的土霉素含量(μg/g)
		烟草幼苗A	0.62
烟草幼苗B	0.18
		烟草幼苗C	0.10

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.烟草幼苗土霉素含量的检测方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、将新鲜烟草幼苗叶1g用蒸馏水洗净磨碎，然后用体积浓度为5％甲酸水溶液进行匀浆；

所述烟草幼苗叶与体积浓度为5％甲酸水溶液的重量比为1：1；

2)、称取匀浆液1.0g于带塞容器中，并向其中加入2.0毫升提取液；所述提取液由体积比为70：30的甲醇和超纯水组成；

将带塞容器密封后先进行漩涡振荡，然后超声处理，接着再高速离心，取上清液过滤，得滤液；

3)、将步骤2)的滤液加入ODS C8固相萃取柱中进行吸附，先用2ml纯水洗脱，然后用2ml甲醇进行洗脱，收集全部甲醇洗脱液，干燥后用0.2ml流动相进行溶解，超高速离心后，取上清液作为待测液；

4)、将待测液用高效液相色谱-紫外色谱法检测；

检测条件为：5μm，250mm×4.6mm的安捷伦ODS C18column色谱柱，流动相的流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长280nm；

得待测液的土霉素峰面积Y；

所述步骤3)和步骤4)的流动相均为乙腈-0.01M甲酸水溶液＝13：87的体积比；

5)、按照土霉素标准曲线方程Y＝15581X+201.56，获得待测液的土霉素质量浓度X，该X的单位为μg/mL；

最后经换算获得新鲜烟草幼苗叶中的土霉素含量。

2.根据权利要求1所述的烟草幼苗土霉素含量的检测方法，其特征是：

所述步骤2)中：

漩涡振荡为：于200±20r/min振荡频率下振荡2±0.5min；

超声处理为：于20KHz超声波下进行超声处理3.0±0.5min；

高速离心为于5000±500r/min离心5±1min。

3.根据权利要求2所述的烟草幼苗土霉素含量的检测方法，其特征是：

所述步骤3)中：

所述干燥为：于40℃水浴中氮气流挥干；

所述超高速离心为：于18000±1000r/min高速离心5±1min。

4.根据权利要求3所述的烟草幼苗土霉素含量的检测方法，其特征是：

所述步骤2)中：过滤为经有机滤头过滤，有机滤头的孔径为0.22μm。