PT937462E - Composições de vacina para administração através de mucosas - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Composições de vacina para administração através de mucosas" 0 presente invento refere-se à indução, num mamífero, de uma resposta imunitária a um antigénio ou a uma mistura de antigénios por entrega do antigénio ou mistura de antigénios a uma superfície mucosa do mamífero.

Mais concretamente, o presente invento refere-se à inoculação de um mamífero, tal como um ser humano, contra infecções de tétano e de B. pertussis. Há muito que é prática corrente dos médicos imunizar bebés humanos contra várias doenças comuns através de vacinas mistas que são dirigidas contra uma pluralidade de doenças. Por exemplo, composições de vacina de múltiplos componentes dirigidas contra a difteria, tétano e tosse convulsa estão disponíveis há um número de anos considerável. Tais vacinas têm até agora sido administradas por injecção. As vantagens das vacinas de múltiplos componentes tornam-se facilmente evidentes uma vez que o doente (habitualmente um bebé) é submetido a um número muito menor de injecções potencialmente dolorosas do que seria em caso contrário. A maioria das doenças infecciosas são iniciadas por contacto com uma superfície mucosa. 0 agente infeccioso pode permanecer nas membranas mucosas ou no seu interior durante o decurso da infecção ou pode penetrar no corpo e posicionar-se noutros locais. A importância das membranas mucosas na primeira linha de defesa contra doenças infecciosas pode ser deduzida do facto de 90% dos linfócitos do corpo se encontrarem por baixo de tais superfícies. Seria vantajoso fazer reagir as superfícies mucosas por imunização de modo a estas responderem vigorosamente e controlarem eficazmente os organismos patogénicos que encontram. Infelizmente, os regimes tradicionais de imunização são ineficazes a desencadear respostas por parte da mucosa. Os sistemas imunitários sistémico e local (da mucosa) parecem ser compartimentados e em geral não se influenciam mutuamente; ou seja, a imunização parentérica com vacinas não vivas estimula fracamente ou não estimula as respostas imunitárias da mucosa. A imunização 2 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ através da mucosa (oral ou intranasal) pode invocar anticorpos do soro mas tal é habitualmente menos eficaz que a imunização parentérica. Os imunócitos das diferentes membranas mucosas formam uma vasta rede de intercomunicação denominada sistema imunológico da mucosa comum, de modo que a imunização tópica de uma superfície (por exemplo o tracto gastrointestinal) pode levar a uma resposta imunitária nessa superfície e também em superfícies distantes tais como no tracto respiratório. EP-A-0209281 sugere que composições de vacina incluindo uma proteína ou péptido da toxina do tétano podem ser administradas oralmente, mas os exemplos neste documento referem-se apenas a administração por injecção. 0 pedido internacional WO-A-9015871 revela um processo para a produção de fragmento C da toxina do tétano e revela também que uma composição de vacina contendo fragmento C pode ser administrada, entre outras, por via oral ou parentérica, mas apenas a administração por injecção é especificamente exemplificada. S.N. Chatfield et al, Vaccine vol. 10, fascículo 1, 1992 p. 53-60 descrevem a construção e utilização como uma vacina de uma forma mutante de salmonela que contém no seu cromossoma um gene para o fragmento não tóxico de 50kD da toxina do tétano. Apesar da administração oral da vacina ser mencionada, mais uma vez, não se proporcionam quaisquer dados experimentais.

Fairweather et al, Infection and Immunity, Maio de 1990 p. 1323-1326, revelam a entrega oral de uma estirpe de salmonela que contém um gene para o fragmento C da toxina do tétano. Também é revelada a administração de fragmento C da toxina do tétano pela via subcutânea, mas não se faz referência à administração oral do fragmento C por si só, ou à administração do fragmento C pela via intranasal. EP-A-462534 descreve vacinas anti-pertussis acelulares incluindo um mutante duplo de toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa e a proteína 69kD, sozinhas ou em combinação com anatoxina da difteria e tétano. Contudo, não se faz referência no documento à administração oral das 3 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ composições de vacina, nem há qualquer referência a administração intranasal. WO-A-9013313 descreve uma combinação sinérgica de FHA de B. pertussis e antigénio de 69kD e sugere que tais vacinas podem ser administradas oralmente, mas não se apresentam exemplos neste documento da administração oral de tais antigénios. Além disso, não há revelação de administração intranasal. JP-A-63002932 revela genericamente a administração de péptidos pela via intranasal em combinação com um facilitador de absorção especifico.

Manclark e Shahin (pedido de patente US número 07/532 327, apresentado a 5.6.90 - disponível através do US Department of Commerce, National Technical Information Service, Springfield, Virgínia 22161, EUA) - descreveram a administração intranasal e intraduodenal de hemaglutinina filamentosa (FHA) obtida de Bordetella pertussis e ilustraram que FHA é um imunogénio da mucosa eficaz. Manclark e Shahin especularam em USSN 07/532 327 que a proteína de 69-kD da membrana externa (P69) de B. pertussis seria também um imunogénio da mucosa eficaz, mas não apresentaram quaisquer dados experimentais para demonstrar este facto. 0 facto de existirem muito poucas vacinas mucosas disponíveis comercialmente indica que há problemas com o desenvolvimento de tais vacinas. Muitos antigénios solúveis não vivos, nomeadamente os utilizados tradicionalmente por imunologistas, tais como ovalbumina (OVA) e hemocianina de lapa Fissurella (KLH), são imunogénios mucosos fracos. São necessárias doses elevadas destes antigénios para induzir qualquer resposta mas as doses elevadas podem também causar tolerância no indivíduo a exposição parentérica subsequente ao antigénio, uma condição conhecida como tolerância oral. Alguns componentes microbianos tais como a toxina de cólera (CT) ou a toxina lábil ao calor de E. coli (LT) ou as partes de ligação não tóxicas destas toxinas (CT-B e LT-B) têm revelado ser imunogénios mucosos potentes desencadeando anticorpos de excreção e circulação fortes, mas a razão de tais moléculas serem bons imunogénios mucosos ainda não foi completamente 4 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ elucidada. Uma propriedade que pode ser importante é a capacidade dessas moléculas se ligarem a células epiteliais da mucosa através de determinados receptores de superfície, apesar de ter sido revelado em estudos por outros que não há necessariamente uma correlação entre a capacidade de um antigénio se ligar a células eucarióticas e a sua imunogenicidade mucosa.

Assim, tanto quanto sabemos, não existe presentemente modo de prever com alguma certeza se um determinado antigénio apresentará boa imunogenicidade mucosa.

Revelamos agora que determinadas moléculas são excelentes imunogénios mucosos e tais componentes podem ser utilizados no desenvolvimento de uma vacina entregue por via mucosa (intranasal ou oral) contra as doenças tosse convulsa e tétano. Nomeadamente, verificámos que a proteína da membrana externa P69 (P69 - também conhecida como pertactina) de B. pertussis e a parte 50Kd imunogénica não tóxica da toxina do tétano (fragmento C) de C. tetanii são altamente imunogénicos quando administrados por via intranasal. Geraram-se fragmento C e P.69 por tecnologia de ADN recombinante. Demonstrou-se que fragmento C e P.69 produzidos a partir de E. coli e levedura são imunogénicos e protectores em ratinhos, consultar M. Roberts et al, Recombinant P.69/pertactin: immunogenicity and protection of mice against Bordetella pertussis infection; Vaccine 10, 43 (1992); e consultar igualmente N.F. Fairweather et al, Infection and Immunity, 55, 2541 (1987) .

Num primeiro aspecto, o invento proporciona a utilização de um antigénio acelular imunogenicamente activo na mucosa incluindo fragmento C de 50kD da toxina do tétano, um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos para o fabrico de uma composição de vacina acelular para administração a uma superfície mucosa para induzir uma resposta imunológica na superfície da mucosa contra infecção por tétano.

Numa concretização particular do invento, proporciona-se a utilização de uma mistura de antigénios para o fabrico de uma composição de vacina para administração a uma superfície 5 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ mucosa para induzir uma resposta imunitária na superfície mucosa contra cada um dos referidos antigénios, a mistura de antigénios incluindo: (a) uma substância imunogenicamente activa na mucosa incluindo o fragmento C de 50kD da toxina do tétano, um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos; e (b) uma substância imunogenicamente activa na mucosa incluindo a proteína da membrana externa P.69 de B. pertussis; um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos.

Numa concretização preferida o invento proporciona a utilização de uma mistura de antigénios tal como aqui definida supra mas em que a referida mistura inclui, além de (a) e (b); (c) uma substância imunogenicamente activa na mucosa incluindo hemaglutinina filamentosa de B. pertussis, um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos.

As composições de entrega por via mucosa podem ser formuladas, por exemplo, para entrega a uma ou mais das mucosas oral, gastrointestinal e respiratória (por exemplo, nasal e brônquica).

Quando se pretende que a composição seja entregue à mucosa respiratória (por exemplo, nasal ou brônquica), tipicamente é formulada com uma solução aquosa para administração na forma de aerossol ou gotas nasais, ou na forma de um pó seco, por exemplo, para inalação.

As composições para administração na forma de gotas nasais podem conter um ou mais excipientes do tipo habitualmente incluído em tais composições, por exemplo conservantes, agentes de ajuste da viscosidade, agentes de ajuste da tonicidade, agentes tampão e semelhantes.

As preparações antigénicas podem também tomar a forma de composições que se pretende que entreguem a mistura de antigénios em superfícies mucosas no tracto gastrointestinal. Prefere-se que tais composições sejam proporcionadas com meios 6 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ para evitar a degradação dos antigénios pelos sucos gástricos. Por exemplo, as composições podem tomar a forma de cápsulas, por exemplo, microcápsulas, nas quais os antigénios são retidos no interior de uma matriz protectora ou revestimento formado a partir de um polímero protector adequado tal como poli(glicolido), poli(lactido-co-glicolido), amido poliacrílico, ou revestimentos dependentes do pH tais como os poliacrilatos ou ftalato de hidroxipropilmetilcelulose.

Os antigénios podem tomar a forma do fragmento C da toxina do tétano por si só, da proteína P.69 por si só, ou de hemaglutinina de B. pertussis por si só. Ou pode tomar a forma de uma molécula maior contendo um ou mais dos antigénios supra mencionados, seus fragmentos imunogenicamente activos ou derivados formados por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos, desde que a molécula maior seja imunogenicamente activa quando administrada directamente à mucosa. 0 antigénio ou mistura de antigénios são tipicamente seleccionados de modo a não serem tóxicos para um seu recebedor em concentrações utilizadas para desencadear uma resposta imunitária.

Numa concretização, mais dois dos antigénios que formam a mistura podem ser apresentados numa molécula única. Tal molécula pode ser preparada por métodos recombinantes por preparação de uma construção de ADN contendo genes que codificam dois ou mais antigénios e expressão num hospedeiro adequado de acordo com métodos conhecidos.

As substâncias antigénicas individuais podem também actuar como transportadores para um ou mais outros antigénios. Por exemplo, um antigénio tal como a proteína P.69 da membrana externa ou fragmento C pode ser acoplado a outro antigénio e exemplos de tais "outros" antigénios incluem Haemophilus do grupo B e antigénios de polissacáridos de meningococos.

De modo a aumentar a imunogenicidade mucosa da mistura de antigénios ou de qualquer sua componente antigénica ou seus fragmentos imunogénicos apropriados, estes podem ser incorporados em transportadores apropriados, por exemplo virossomas. A imunogenicidade pode também ser aumentada por 7 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ incorporação de adjuvantes mucosos apropriados tais como toxina da cólera ou toxina lábil ao calor de E. coli, suas variantes geneticamente destoxifiçadas ou as suas subunidades (B) de ligação na vacina. A composição de vacina pode conter opcionalmente outra parte imunogenicamente activa na mucosa da molécula da toxina do tétano. Adicionalmente, a vacina mista pode conter um ou mais antigénios imunogenicamente activos adicionais na mucosa.

Numa concretização, a composição de vacina pode, adicionalmente a formas imunogénicas não tóxicas dos antigénios da toxina do tétano e pertussis, conter formas imunogénicas não tóxicas de toxina da difteria e formas imunogénicas de polissacárido de Haemophilus influenzae grupo B (HiB), proporcionando assim uma vacina difteria-tétano-pertussis (DTP) mucosa ou vacina DTPHiB. A proteína da membrana externa P.69 de B. pertussis é uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 61 KD; consultar A.J. Makoff et al, "Protective surface antigen P.69 of Bordetella pertussis: its characteristics and very high levei expression in Escherichia coli", Bio-Technology, 8, 1030 (1990) .

Pode ser preparada e isolada de acordo com o método revelado em P. Novotny et al: The Journal of Infectious Diseases, 164, 114 (1991), ou material recombinante preparado a partir de E. coli pelo método apresentando no artigo de A.J. Makoff et al referido supra. Pode ligar-se a células eucarióticas. e causar A hemaglutinina filamentosa de B. pertussis purificada contém habitualmente polipéptidos de diferentes pesos moleculares variando na gama 98-220 KD e pode ser isolada e purificada a partir de sobrenadantes de cultura de células de B. pertussis, por exemplo tal como descrito no artigo de P. Novotny et al referido supra. A hemaglutinina filamentosa é capaz de se ligar a células eucarióticas hemaglutinação de eritrócitos de ovelha. 8 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ Ο fragmento C da toxina do tétano é um péptido de peso molecular aproximadamente 50KD que pode ser isolado e purificado de E. coli pelo método descrito em A.J. Makoff et al, Bio/Technology, 1_, 1043 (1989). O fragmento C caracteriza-se por uma capacidade de ligar as células eucarióticas apresentando o tri-sialoganliósido GT16 e por uma capacidade de desencadear protecção em ratinhos contra provocação letal com toxina do tétano.

As moléculas de antigénio utilizadas no presente invento podem ser preparadas por isolamento e purificação a partir dos organismos nos quais ocorrem naturalmente, ou podem ser preparadas por técnicas recombinantes e expressas num hospedeiro adequado tal como E. coli de maneira conhecida. Quando preparadas por um método recombinante ou por síntese, podem efectuar-se uma ou mais inserções, deleções, inversões ou substituições dos aminoácidos que constituem o péptido.

Cada um dos antigénios supra mencionados é preferivelmente utilizado no estado substancialmente puro. A quantidade da mistura de antigénios administrada dependerá, em parte, da pureza dos antigénios individuais. Assim, para uma forma substancialmente pura da proteína da membrana externa P.69, seria administrada tipicamente a um humano uma dose na gama de cerca de 1-100 microgramas/dose, a quantidade real dependendo da imunogenicidade da preparação em seres humanos quando aplicada em superfícies mucosas.

Para uma forma substancialmente pura da hemaglutinina filamentosa de B. pertussis e o fragmento C de 50KD da toxina do tétano, uma gama de dosagem típica seria da ordem apresentada supra relativamente à proteína P.69. Num regime de imunização típico utilizando as preparações de antigénio do presente invento, a vacina pode ser administrada em várias doses (por exemplo, 1-4), contendo cada dose 1-100 microgramas de cada antigénio. O regime de imunização pode envolver puramente imunização pela via mucosa ou por uma combinação de imunização mucosa e parentérica. A dosagem dependerá geralmente da imunogenicidade dos diferentes antigénios quando aplicados aos tractos respiratório ou gastrointestinal de seres humanos. 9 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ Ο invento será agora ilustrado com mais detalhes por referência às concretizações especificas descritas nos exemplos seguintes.

Os exemplos pretendem-se puramente ilustrativos do invento e não se pretende gue limitem de gualguer modo o seu âmbito.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS A figura 1 ilustra o crescimento de B. pertussis nos pulmões de ratinhos imunizados por via intranasal. Os ratinhos foram imunizados por via intranasal com duas doses de antigénio no dia 0 e dia 29 e seguidamente provocados com aerossol de B. pertussis 14 dias depois (dia 43). As contagens representam as médias de 4 pares de pulmões ± EPM. A figura 2 ilustra a resposta imunitária local nos pulmões de ratinhos em resposta a imunização intranasal e provocação. Os linfócitos foram purificados dos pulmões de grupos de ratinhos após imunização intranasal e provocação com aerossol e determinou-se o número de células gue excretam anticorpo contra o antigénio de imunização pelo ensaio ELISPOT. As contagens representam a resposta de linfócitos reunidos de 4 ratinhos. A figura 3 ilustra a resposta primária de anticorpos nos pulmões de ratinhos após provocação com aerossol. Os linfócitos dos pulmões removidos 10 dias após provocação com aerossol foram ensaiados relativamente a produção de anticorpos contra P69 ou FHA. Os ratinhos imunizados com um antigénio foram ensaiados contra o outro antigénio. As contagens representam a resposta de linfócitos reunidos de grupos de 4 ratinhos.

EXEMPLO 1 COMPONENTES PERTUSSIS

Imunizaram-se ratinhos com 12 μρ de P.69, de FHA ou de OVA no dia 1 e no dia 29. Os ratinhos foram então provocados com aerossol de Bordetella pertussis no dia 43 (14 d após o reforço) . Removeram-se os pulmões dos grupos de ratinhos em diferentes períodos de tempo após provocação, homogeneizaram-se e efectuaram-se contagens de bactérias 10 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ viáveis para determinar ο crescimento de B. pertussis no tracto respiratório. Apresentam-se os resultados na figura 1. Os números de bactérias aumentaram nos pulmões dos ratinhos de controlo (OVA) durante os primeiros sete dias. Contrariamente, tanto em animais imunizados com P.69 como com FHA, o número de bactérias diminui durante este período e no ponto temporal do dia 7 os níveis de bactérias nos pulmões de ratinhos imunizados foram apenas 1-4% dos apresentados pelo grupo de controlo. No dia 14 as bactérias tinham praticamente desaparecido dos pulmões dos ratinhos imunizados mas estavam ainda presentes em grande número nos ratinhos imunizados com OVA. A resposta imunitária local nos pulmões de ratinhos foi analisada por enumeração das células que excretam anticorpo contra FHA, P.69 ou OVA entre os linfócitos isolados dos pulmões de ratinhos por "ELISPOT". Ocorreram números reduzidos de células excretoras de anticorpos (ASC) que produzem anticorpo contra os antigénios de imunização após o segundo (figura 2). Após provocação com aerossol de ASC nos pulmões de ratinhos imunizados com FHA ou P.69, mas não com OVA, aumentaram várias ordens de grandeza (figura 2). Detectaram-se células que excretam anticorpos dos isotipos IgG, IgA e IgM. O aumento de ASC após provocação com aerossol pode representar uma resposta primária aos antigénios presentes nos organismos provocados ou um reforço de resposta em ratinhos imunizados. A fim de verificar qual destas opções era a correcta, rastrearam-se linfócitos de pulmão contra antigénios que os ratinhos não tinham encontrado antes da provocação (ensaiaram-se ratinhos imunizados com FHA contra P.69 etc.). Tal como se pode verificar na figura 3, as respostas foram semelhantes em todos os ratinhos e comparações com o mesmo ponto temporal (d23) na figura 1 mostram que a imunização intranasal anterior reforça a resposta várias vezes.

Estudou-se a resposta sérica utilizando ELISA e apresentam-se os resultados na tabela 1 infra: 11 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ

Tabela 1. Resposta de anticorpos séricos anti-pertussis de ratinhos imunizados por via intranasal TÍTULO DE ANTICORPOS3 Dias após imunização 8 20 24 Grupo FHA P.69 OVA FHA P.69 <50 <50 <50 <50 <50 <50 FHA P.69 400 100 < 50 200 <50 <50 FHA P.69 1600 100 200 400 100 200 a Determinado por Elisa b Ratinhos provocados com aerossol ao d 14 Não se detectaram anticorpos contra FHA de P.69 antes da provocação com aerossol (d8) . Não se detectaram anticorpos anti-OVA contra soro de ratinhos imunizados com OVA (dados não apresentados). Após a provocação (>dl4) a resposta anti-FHA não apresentou um grande aumento em ratinhos imunizados com FHA. Este aumento foi especifico, a resposta anti-P.69 não aumentou proporcionalmente nestes ratinhos. Ocorreu um pequeno aumento do titulo anti-P.69 em ratinhos imunizados com P.69 comparativamente com ratinhos imunizados com FHA ou P.69. Tal demonstrou que a exposição respiratória prévia a FHA, e possivelmente a P.69, pode fazer com que os ratinhos desencadeiem uma resposta sérica de resposta amnéstica por contacto com o patogénio.

EXEMPLO 2 COMPONENTE TÉTANO

Imunizaram-se grupos de 10 ratinhos por via intranasal com uma ou duas doses de 2 0 μg de fragmento C ou OVA como controlo. 28 dias após a imunização final provocaram-se ratinhos com 500LD50 da toxina do tétano e a sua sobrevivência foi monitorizada durante 4 dias, sendo os resultados apresentados na tabela 2 infra. A sobrevivência foi aumentada em ratinhos que receberam 1 ou 2 doses de fragmento C comparativamente com os ratinhos de controlo. Todos os ratinhos de controlo morreram no dia após a provocação. A protecção foi grandemente aumentada por administração de 2 doses de fragmento C, no dia 4 após provocação 80% dos ratinhos nos 2 grupos de dose ainda estavam vivos 12 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ comparativamente com 10% nos ratinhos que receberam apenas uma dose.

Tabela 2. Protecção de ratinhos contra provocação com toxina do tétano por imunização I/N com fragmento C

Grupo Dose N° de ratinhos Sobrevivência após provocação Dia 2 3 4 5 1. frag-C 20 μg 10 3 3 2 1 2. frag-C 2x20 μg 10 10 8 8 8 3 . Ova 2x20 μg 10 0 0 0 0

RESPOSTA SÉRICA

Os ratinhos que receberam 2 doses de fragmento C apresentaram um título sérico médio de anti-fragmento C superior a 200 antes da provocação.

MATERIAIS E MÉTODOS ANTIGÉNIOS

Sintetizou-se P. 69 intracelularmente em E. coli e purificou-se como descrito em A.J. Makoff et al, Bio/Technology 8, 1030 (1990) . Proporcionou-se FHA por SKB sob convenção de permuta de reagentes. O fragmento C foi produzido a partir de E. coli tal como em A.J. Makoff et al, Bio/Technology 7, 1043 (1989). Diluíram-se os antigénios em PBS imediatamente antes de imunização.

IMUNIZAÇÃO

Anestesiaram-se ratinhos BALB/c adultos (6-8 semanas) com metatano. Adicionaram-se 30 μΐ de solução de antigénio às narinas externas de ratinhos (15.μΐ/narinas) à medida que recuperavam a consciência. O antigénio foi administrado ao tracto respiratório por inalação.

PROVOCAÇÃO COM AEROSSOL DE B.PERTUSSIS

Colocaram-se ratinhos em gaiolas num carrossel rotativo numa câmara de exposição em plástico tal como descrito em 13 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ Ρ. Novotny et al. Development for Biological Standards, 61, 27 91985). Preparou-se uma suspensão bacteriana em PBS a partir de culturas com 2 a 3 dias de B. pertussis BBC26 cultivada em placas de ágar-ágar e sangue CW. Expuseram-se os ratinhos a um aerossol (gerado a partir da suspensão bacteriana) de 2 x 109 unidades formadoras de colónias (CFU) em PBS através de tubagem oral Turret operada através de um compressor de elevado caudal System 22 CR60 (Medic-Aid), Pagham, West Sussex, R.U.) que proporciona uma neblina muito fina a um caudal dinâmico de 8,5 litros/min. A neblina gerada foi transportada através de uma câmara por uma bomba de vácuo com uma passagem de cerca de 12L de ar por mistura nebulizada por minuto, que manteve 70% de humidade relativa na câmara. A exposição a aerossol durou 30 min; um período de 10 min permitiu então a limpeza da câmara. O decurso da infecção foi avaliado através de contagens de bactérias viáveis nos pulmões. Removeram-se grupos de quatro ratinhos a intervalos, mataram-se por deslocação cervical e os seus pulmões foram removidos assepticamente e homogeneizados num homogeneizador Potter-Elveh jem com 2 ml de PBS. Colocaram-se gotas de diluições do produto homogeneizado em placas de ágar-ágar e sangue Cohen-Wheeler (CW) e determinou-se o número de CFU para cada conjunto de pulmões.

PROVOCAÇÃO COM TÉTANO

Provocaram-se ratinhos com 500 LD5o da toxina do tétano subcutaneamente e observaram-se regularmente durante 5 dias.

ELISA

Mediram-se soros de anticorpos anti-P.69, anti-FHA e anti-fragmento C utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) . Adsorveu-se o antigénio (50 μΐ; 1 g/ml em solução salina tamponada de fosfato, pH 7,2) em placas de microtitulação de 96 poços (EIA 'Costar' NBL, Northumbria, R.U.) por incubação a 4°C durante a noite. Aspiraram-se os poços e lavaram-se três vezes com PBS contendo Tween 20 (PBS-T; Sigma) a 0,05% (v/v) e seguidamente bloquearam-se com albumina de soro bovino (BSA; Sigma) a 3% (p/v) em PBS. Após lavagem, adicionaram-se 50 μΐ de soro de ensaio adequadamente 14 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ diluído em PBS-T-BSA a 0,1% por poço. Após incubação a 37°C durante 2 h, lavaram-se os poços e incubaram-se à temperatura ambiente com 50 μΐ de substrato (cloridrato de O-fenilenodiamina a 0,04%; Sigma) dissolvido em tampão de fosfato citrato (pH 5,0 [citrato 24 mM, hidrogenofosfato dissódico 64 mM] contendo 40 μΐ de peróxido de hidrogénio). Terminou-se a reacção por adição de 50 μΐ de ácido sulfúrico 1 M. Leram-se placas num leitor de ELISA Titertek Multiscan MCC a 492 nm. O título foi expresso como o recíproco da diluição mais elevada do soro de ensaio que forneceu uma leitura de absorvância correspondente ao dobro da leitura obtida com um soro de pré-sangramento com igual diluição. Os valores de absorvância menores que 0,1 foram desprezados.

Ensaio ELSIPOT para células excretoras de anticorpo (ASC) específicas em pulmões de murino.

Determinou-se a produção local de anticorpos no pulmão murino utilizando a técnica ELISPOT. Isolaram-se linfócitos a partir de pulmões murinos do seguinte modo: lavaram-se os pulmões rapidamente em PBS para remover restos de sangue e seguidamente cortaram-se finamente com uma lâmina de bisturi. Adicionou-se 1 ml de PBS contendo MgCl2 10 mM, colagenase A (Boehringer Mannheim, Lewes, R.U.) a 0,5 U/ml e ADNase 1 (Boehringer) a 0,25 mg/ml a cada par de pulmões e incubou-se a 37°C com agitação suave durante 45 min. Seguidamente passou-se a mistura através de um peneiro de calibre 40. Os bocados foram pressionados através do peneiro com o êmbolo de uma seringa de 5 ml. Colocou-se a suspensão celular num tubo de centrífuga e deixou-se em repouso durante vários minutos para permitir a sedimentação dos bocados maiores. Removeu-se o sobrenadante e sedimentaram-se e lavaram-se as células várias vezes. Removeram-se glóbulos vermelhos e células não viáveis por centrifugação num gradiente de Ficol-Isopaque (LSM, Flow Laboratories Ltd, Herts, R.U.). Após lavagem determinou-se a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano. Finalmente ressuspenderam-se as células em meio completo RPM11640 (soro fetal de vitelo a 10%, penicilina a 100 Ul/ml, estreptomicina a 100 g/ml, L-glutamina 2 mm; Flow). 15 ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ Ο ensaio ELSIPOT foi efectuado do seguinte modo. Sucintamente, revestiram-se durante a noite placas de cultura de tecidos de 24 poços (Costar) com P.69, FHA ou OVA (0,5 ml de 1 g/ml em PBA) após lavagem e bloqueio, adicionaram-se aos poços volumes de 0,5 ml de diluições da suspensão de linfócitos em meio completo RPMi 1640 e incubou-se a 37°C/C02 a 10% durante 3 h. Após lavagem, adicionaram-se sequencialmente IgG, IgA ou IgM de cabra anti-ratinho (1/1000, Sigma) e IgG de coelho anti-cabra-fosfatase alcalina (1/1000, Sigma). Finalmente, adicionou-se solução de substrato (0,5 μΐ de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) a 1 mg/ml em tampão 2-amino-2-metil-l,3-propanodiol (AMP), Sigma) e incubaram-se as placas até que fossem visíveis manchas azuis em microscopia de baixa potência.

Lisboa,

Claims (6)

1. ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um antigénio acelular (doravante aqui referido como "(a)"), que é uma substância imunogenicamente activa na mucosa, substância activa incluindo o fragmento C de 50 kD da toxina do tétano, um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos para o fabrico de uma composição de vacina acelular para administração a uma superfície mucosa para induzir uma resposta imunitária na superfície mucosa contra infecção por tétano.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que a composição de vacina inclui adicionalmente: (b) uma substância imunogenicamente activa na mucosa incluindo a proteína da membrana externa P.69 de B. pertussis; um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que a composição de vacina inclui adicionalmente: (c) uma substância imunogenicamente activa na mucosa incluindo hemaglutinina filamentosa de B. pertussis; um seu fragmento imunogénico, ou um seu derivado formado por deleção, substituição ou inserção de aminoácidos.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que a composição de vacina é para administração à mucosa respiratória (por exemplo, nasal ou brônquica) ou à mucosa gastrointestinal.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que a composição de vacina inclui adicionalmente um antigénio ou antigénios imunogenicamente activo(s) na mucosa, adicionais, e opcionalmente uma forma imunogénica não tóxica da toxina do tétano.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5 em que o antigénio ou antigénios adicionais é/são seleccionado(s) de ΕΡ Ο 937 462 /ΡΤ uma forma difteria e Lisboa, 2/2 nao tóxica imunogénica na mucosa da toxina da polissacárido de Haemophilus influenzae grupo B.