RO120819B1 - Vaccinuri dtp multivalente - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o compoziţie imunogenă multivalentă, împotriva bolii cauzată de infecţia cu Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphteriae şi poliovirus, compoziţia conţinând: a) toxoid pertussis, hemaglutinină filamentoasă, pertactină şi aglutinogeni în formă purificată, b) toxoid tetanic, c) toxoid difteric şi d) poliovirus, care este formulată ca un vaccin pentru administrare in vivo la o gazdă şi în care, pentru fiecare doză unică umană, toxoidul pertussis menţionat este prezent într-o cantitate de 5 până la 30 niu g azot, hemaglutinina filamentoasă menţionată este prezentă într-o cantitate de 5 până la 30 niug azot, pertactina menţionată este prezentă într-o cantitate de 3 până la 15 niu g azot şi aglutinogenii menţionaţi sunt prezenţi într-o cantitate de 1 până la 10 niu g azot.

Description

Invenția se referă la o compoziție imunogenă multivalentă, în special pentru administrare pediatrică.

Această cerere este o continuare - în parte - a cererii US 08/501743, depusă în 12 iulie 1995 și aflată în curs de rezolvare, care ea însăși este o continuare - în parte - a cererii US 08/433646, depusă în 4 mai 1995.

Tușea convulsivă sau pertussis este o infecție gravă, foarte contagioasă, a tractului respirator superior, cauzată de Bordetella pertussis. Organizația Mondială a Sănătății estimează că există 60 milioane de cazuri de tuse convulsivă pe an și 0,5 la 1 milion decese asociate. La populațiile nevaccinate, s-a observat o incidență a ratei tusei convulsive de ordinul a 80% la copiii în vârstă de până la 5 ani. Deși tușea convulsivă este considerată în general a fi o boală a copilăriei, există evidența în creștere a bolii clinice și asimptomatice la adolescenți și adulți.

Introducerea vaccinurilor cu celule întregi compuse din organisme B. pertussis inactivate chimic și termic în 1940 a fost responsabilă de o reducere puternică în incidența tusei convulsive cauzate de 8. pertussis. Ratele eficacității pentru vaccinurile din celule întregi au fost la până la 95%, depinzând de definirea cazului. Cu toate că infecția cu B. pertussis conferă imunitate de lungă durată, există dovezi în creștere pentru dispariția protecției după imunizare cu vaccinuri cu celule întregi. Câteva lucrări citează o relație între vaccinarea pertussis cu celule întregi, reactogenicitate și efecte secundare serioase, care conduc la un declin al acceptării vaccinului și la epidemii ulterioare reînnoite. Au fost dezvoltate vaccinuri pertussis, având componente definite mai recent.

Antigeni pentru vaccinuri pertussis definite.

S-au dezvoltat diverse vaccinuri pertussis acelulare, care includ antigenii Bordetella pertussis, toxină pertussis (PT), hemaglutinină filamentoasă (FHA), proteina membranei exterioare de 69 kDa (pertactina) și aglutinogeni fimbriali (vezi tabelul 1). [Tabelele apar la sfârșitul descrierii.]

Toxina pertussis

Toxina pertussis este o exotoxină care este un membru al familiei A/B de toxine bacteriene cu activitate ADP-riboziltransferază. Porțiunea A a acestor toxine prezintă activitate ADP-riboziltransferază și porțiunea B mediază legarea toxinei la receptorii celulei gazdă și translocarea lui A la locul său de acțiune. PT facilitează, de asemenea, aderența 8. pertussis la celule epiteliale ciliate și, de asemenea, joacă un rol în invazia macrofagelor de către 8. pertussis.

Toate vaccinurile pertussis acelulare au inclus PT, care a fost propus ca un factor principal al virulenței și antigen de protecție. Infecția naturală cu 8. pertussis generează răspunsuri mediate atât umoral, cât și celular, față de PT. Sugarii au anticorpi anti-PT derivați transplacentar și colostrul uman care conține anticorpi anti-PT a fost eficient în protecția pasivă a șoarecilor împotriva infecției cu aerosol. Un răspuns imun mediat celular (CMI) față de subunități PT a fost demonstrat după imunizare cu un vaccin acelular și un răspuns CMI față de PT s-a generat după vaccinare cu celule întregi. PT inactivat chimic în vaccinuri cu celule întregi sau componente este protector în modele animale și la oameni. Mai mult, anticorpii monoclonali specifici pentru subunitatea S1 protejează împotriva infecției 8. pertussis.

Principalele efecte patofiziologice ale PT sunt datorate activității sale ADP-riboziltransferază. PT catalizează transferul ADP-ribozei de la NAD la G₍ proteina de legare a guaninei, distrugând astfel sistemul de reglare al adenilat ciclazei celulare. De asemenea, PT previne migrarea macrofagelor și limfocitelor spre locurile inflamației și interferează cu fagocitoza mediată de neutrofil și omoară bacteriile. Au fost folosite un număr de teste in vitro și in vivo pentru cercetarea activității enzimatice a SI și/sau PT, incluzând ADP-ribozilarea

RO 120819 Β1 transducinei bovine, testul de grupare al celulelor ovariene de hamster chinezesc (CHO), 1 sensibilizarea histaminică, leucocitoza și NAD glicohidrolaza. Când se expun la PT, celulele CHO dezvoltă morfologie caracteristică de grupare. Acest fenomen este dependent de 3 legarea PT-ului și translocarea ulterioară și activitatea ADP-riboziltransferază a S1 și astfel analiza de grupare a celulelor CHO este răspândită pe larg pentru testarea integrității și 5 toxicității holotoxinelor PT.

Hemaglutinină filamentoasă 7

Hemaglutinina filamentoasă este o polipeptidă mare (220 kDa), netoxică, care mediază atașarea S. pertussis la celulele ciliate ale tractului respirator superior în timpul 9 colonizării bacteriene. Infecția naturală induce anticorpi anti-FHA și imunitate mediată celular. Anticorpii anti-FHA se găsesc în colostrul uman și sunt de asemenea transmiși transpla- 11 centar. Vaccinarea cu vaccinuri pertussis cu celule întregi sau acelulare generează anticorpi anti-FHA și vaccinurile acelulare care conțin FHA induc de asemenea un răspuns CMI față 13 de FHA. FHA este un antigen protector într-un model de provocare respiratorie la șoarece, după imunizare activă sau pasivă. Cu toate acestea, doar FHA nu protejează în testul de 15 potență de provocare intracerebrală la șoarece.

Proteina de 69 kDa a membranei exterioare (pertactină)17

Proteina de 69 kDa este o proteină a membranei exterioare, care a fost identificată inițial de la B. bronchiseptica. Proteina este cunoscută de asemenea ca pertactină și P.69.19

Ea s-a dovedit a fi un antigen de protecție împotriva B. bronchiseptica și a fost identificată ulterior atât la B. pertussis, cât și la B. parapertussis. Proteina de 69 kDa se leagă direct la 21 celule eucariotice și infecția naturală cu B. pertussis induce un răspuns umoral anti-P. 69 și

P.69 induce de asemenea un răspuns imun mediat celular. Vaccinarea cu vaccinuri cu celule23 întregi sau acelulare induce anticorpi anti-P.69 și vaccinurile acelulare induc CMI P.69. Pertactină protejează șoarecii împotriva provocării prin aerosol cu B. pertussis și în corn- 25 binație cu FHA, protejează în testul provocării intracerebrale împotriva B. pertussis.

Transferul pasiv de anticorpi policlonali sau monoclonali anti-P.69, de asemenea, protejează27 șoarecii împotriva provocării cu aerosol.

Aglutinogeni29

Serotipurile B. pertussis sunt definite prin aglutinarea lor cu aspect fimbriat. Organizația Mondială a Sănătății (OMS) recomandă ca vaccinurile cu celule întregi să in- 31 ciudă tipurile 1,2 și 3 de aglutinogeni (Agg), deoarece ei nu protejează încrucișat. Agg 1 este nefimbriat și este găsit pe toate tulpinile B. pertussis, în timp ce Agg de serotipurile 2 și 3 33 sunt fimbriali. Infecția naturală sau imunizarea cu vaccinuri cu celule întregi sau acelulare induce anticorpi anti-Agg. Un răspuns imun mediat celular specific poate fi generat la șoareci 35 prin Agg 2 și Agg 3 după infecția cu aerosol. Agg 2 și 3 sunt protectori la șoareci împotriva provocării respiratorii și colostrul uman care conține anti-aglutinogeni va proteja de 37 asemenea în această analiză.

Vaccinuri pertussis acelulare 39

Primul vaccin pertussis acelular dezvoltat a fost vaccinul din 2 componente PT + FHA (JNIH 6) al lui Sato et al. Acest vaccin s-a preparat prin copurificare a antigenilor PT și FHA 41 din supernatantul culturii B. pertussis, tulpina Tohama, urmată de toxoidizare cu formalină. Vaccinuri acelulare de la diverse unități producătoare și de compoziții diverse s-au folosit cu 43 succes pentru imunizarea copiilor japonezi împotriva tusei convulsive încă din 1981, rezultând o scădere puternică a incidenței bolii. Vaccinul JNIH 6 și un vaccin mono-compo- 45 nent toxoid PT (JNIH 7) s-au testat într-un experiment clinic extins în Suedia în 1986. Rezultatele inițiale au indicat eficacitate mai scăzută decât eficacitatea raportată a unui vaccin cu 47 celule întregi, dar studiile care au urmat au dovedit că este mai eficient împotriva bolii mai

RO 120819 Β1 blânde diagnosticată prin metode serologice. Cu toate acestea, a existat dovada pentru revenirea toxicității PT inactivat cu formalină din aceste vaccinuri. De asemenea, aceste vaccinuri s-au dovedit a proteja mai degrabă împotriva bolii decât a infecției.

în mod curent sunt cercetate numeroase vaccinuri noi acelulare și cu componente pertussis care includ combinații ale PT, FHA, P.69 și/sau aglutinogeni, și acestea sunt listate în tabelul 1. S-au folosit câteva tehnici pentru detoxifiere chimică a PT, incluzând inactivarea cu formalină, glutaraldehidă, apă oxigenată și tetranitrometan.

Tetanic

Tetanicul este o infecție acută cauzată de Clostridium tetani. Boala este caracterizată prin contracții dureroase ale mușchiului, însoțite de hipersensibilitate, hiperreflexe și stimulare autonomă crescută a părții(lor) afectate ale corpului. Stimuli ușori pot produce spasme musculare reflexe severe. Poate fi prezentă febra datorată spasmului muscular extrem. Tetanicul poate fi generalizat, implicând fața, gâtul, abdomenul și trunchiul sau localizat la o parte specifică a corpului (locul leziunii). Implicarea mușchiului masseteral feței rezultă în trismus sau contracție a fălcii, dând naștere la expresia facială clasică cunoscută ca risus sardonicus.

C. tetani există ca un organism nepatogenic în intestinul oamenilor și al animalelor. De asemenea, organismul este găsit în sol contaminat prin fecale și poate supraviețui în sol timp de ani ca spori infecțioși.

Tetanicul rezultă din creșterea anaerobică a C. tetani și producerii neurotoxineiîn răni infectate. Infecția este produsă de introducerea materialelor contaminate prin organisme sau spori în țesut. Scenariul cel mai obișnuit este infecția printr-o leziune penetrantă. Cu toate acestea, în numeroase cazuri nu se poate obține nici un istoric al leziunii. Prezența țesutului necrotic sau ischemic facilitează creșterea bacilului.

Prevenirea infecției este prin vaccinare și prin menținerea rănii în condiții bune, incluzând curățarea cu grijă și îndepărtarea chirurgicală a țesutului devitalizat. Indivizii cu răni contaminate și care au serii de vaccinări nefinalizate vor primi atât vaccin tetanic, cât și imunoglobulină tetanică.

Tratamentul sindromului este în principal de susținere și poate să includă sprijin respirator, administrarea antitoxinei tetanice și curățarea atentă a rănilor infectate. în ciuda îngrijirii medicale moderne, rata cazurilor fatale ajunge încă de la 30 la 90%. Aceasta este într-adevăr reală la populația în vârstă. Infecția naturală nu produce întotdeauna imunitate pentru infecția ulterioară.

Prevenirea infecției prin vaccinare este cea mai eficientă metodă de combatere a bolii. Odată cu introducerea vaccinării universale, tetanicul a devenit extrem de rar în țări dezvoltate. Cazuri se întâlnesc aproape exclusiv la indivizi care nu au reușit să-și completeze seriile lor de vaccinări sau care nu au primit dozele corespunzătoare de rapel. Indivizii vor primi o doză de rapel la fiecare zece ani.

Difteric

Difteric este o infecție acută produsă de către bacteria Corynebacterium diphtheriae. Locul principal al infecției este în căile tractului respirator superior (nas, faringe, laringe și trahee). Leziunea caracteristică, un rezultat al citotoxinei, reprezintă pete ale pseudomembranei cenușii înconjurată de către inflamație. Aceasta este însoțită de limfoadenopatia cervicală, umflare și edem al gâtului. în cazurile grave, umflarea poate progresa până la punctul obstrucției (difteric laringeală). Alte complicații includ miocardite, efecte ale sistemului nervos central (neuropatii craniale, motorii și senzoriale, cum ar fi paralizia progresivă) și trombocitopenia. Mai rar pot fi afectate alte membrane mucozale. Prezentarea clinică poate varia de la infecția asimptomatică la amenințarea multisistem și moarte. Infecțiile cutanoase și ale rănii cu difterie sunt obișnuite la tropice și au fost raportate frecvent la populația indigenă din SUA. Singura sursă pentru C. diphteriae este omul.

RO 120819 Β1

Un diagnostic prezumtiv poate fi făcut prin observarea clinică a leziunilor caracte- 1 ristice, dar va fi confirmată prin examinarea bacteriană a leziunilor. Dacă există o mare bănuială clinică a difteriei, tratamentul va fi inițiat imediat cu antibiotice (penicilină sau eritro- 3 micină) și antitoxina difteriei, chiar dacă diagnosticul nu este confirmat. Mortalitatea crește suplimentar odată cu perioada de așteptare după izbucnirea simptomelor clinice. Cazul 5 domeniilor ratei morții violente se întinde de la 5 la 10% în ciuda îngrijirii medicale moderne și se întâlnește în principal la cei foarte tineri și cei mai vârstnici. Infecția naturală nu produce 7 totdeauna imunitate din infecție suplimentară.

Transmiterea este prin contact direct cu secrețiile sau scurgerile de la un individ 9 infectat. Indivizii sunt contagioși atât timp cât bacteria se observă în secreții. Aceasta poate dura până la 4 săptămâni după infectare. Transmiterea poate avea loc de asemenea cu 11 vome infectate. Se recomandă izolarea strictă a cazurilor.

Rar, indivizii pot deveni purtători și organisme depozit până la 6 săptămâni după 13 infectare. Purtătorii umani vor fi rapid vaccinați cu serii întregi. Tratamentul cu antibiotice elimină trăsăturile și contagiozitatea cazurilor în 4 zile. 15

Poliomielita

Atât vaccinul poliovirus inactiv (IPV), cât și cel viu atenuat (OPV) au fost eficiente în 17 combaterea poliomielitei la scară mondială. Un vaccin DTP-IPV combinat este autorizat în prezent în Europa și Canada, și s-a dovedit a fi sigur și a fi eficient la milioane de copii din 19 lume.

Haemophilus influenzae tip b 21 înainte de a dispune de vaccinuri eficiente, Haemophilus influenzae tip b (Hib) a fost o cauză majoră a infecțiilor de meningită invazivă a măduvei coloanei vertebrale la copii mici 23 și a fost cauza principală la meningitele din primii 2 ani de viață. Aproximativ 10% dintre victimele cu meningită Haemophilus influenzae mor în ciuda îngrijirii medicale. Sechele per- 25 manente sunt obișnuite la supraviețuitori. Imunizarea împotriva Haemophilus influenzae a început în Canada în 1987, cu un vaccin polizaharid (ribitol fosfat de poliriboză [PRP] de la 27 Haemophilus influenza tip b). Imunogenitate îmbunătățită s-a realizat la copii în vârstă de 18 luni și mai mari, cu introducerea în 1988 a unui vaccin care constă din PRP conjugat la 29 toxoidul difteric (PRP-D). Din 1992, imunizarea infantilă a fost posibilă cu autorizarea vaccinurilor conjugate PRP imunogenic la copii cu vârsta de sub 1 an (PRP conjugat cu toxoid 31 tetanic sau PRP-T). Utilizarea acestor vaccinuri Haemophilus influenzae conjugate a fost asociată cu o creștere drastică în incidența infecției Haemophilus invazive în Canada și în 33 alte locuri. Două studii clinice canadiene, implicând aproape 900 copii din Columbia Britanică și Alberta, au demonstrat că PRP-T liofilizat poate fi reconstituit cu DPT (COMBIPACK) sau 35 cu DPT-Polio Adsorbed (ΡΕΝΤΑ™) în plus față de diluantul salin obișnuit. Studii clinice, implicând mai mult de 100.000 copii din întrega lume, au demonstrat eficiența PRP-T liofilizat 37 (ActHib™), Mai mult de 90% au obținut niveluri anti-PRP considerate a fi de protecție (> 0,15 pg/ml) după 3 doze de PRP-T, începând de la 2 luni sau după o singură doză de 39 PRP-T luat după vârsta de 12 luni. Proporția celor care au atins nivelurile care să indice o protecție pe termen lung (>1,0 pg/ml) variază de la 70 la 100%, depinzând de studii. Milioane 41 de doze de PRP-T au fost vândute în Canada începând cu 1992. Cazurile descoperite ale infecției Haemophilus invazivae după vaccinare cu PRP-T sunt rare și pot fi asociate cu boli 43 cum ar fi imunodeficiența.

Vaccinuri combinate 45

Deși sunt multe beneficii prezente și potențiale ale vaccinurilor care combină antigeni pentru a conferi protecție împotriva mai multor patogeni, aceste combinații au efect în detri- 47 mentul imunogenicității componentelor individuale. Combinații ale toxoizilor difteric și tetanic

RO 120819 Β1 cu vaccinul pertussis cu celulă întreagă (DTP) sunt disponibile de mai bine de 50 ani și răspunsul anticorpului la aceste combinații este superior celui al componentelor individuale, poate ca o rezultantă a efectului adăugat al vaccinului pertussis cu celulă întreagă. Combinații DTP care includ de asemenea vaccinuri poliovirus inactivate sunt autorizate în mai multe jurisdicții, deși răspunsul anticorp la antigenii pertussis poate fi diminuat de această combinație. Efectul combinării vaccinurilor DTP cu vaccinuri conjugate Hib a fost variabil. Studiile cu DTP franțuzesc și PRPT au demonstrat siguranță similară, dar un răspuns anticorp la PRP scăzut, în timp ce studiile cu DTP canadian și vaccin PRPT nu au arătat alt efect asupra răspunsului PRP în afară de scăderea aglutinogenilor pertussis și creșterea sensibilității poziției de injecție în grupul de imunizare combinat.

Acum au început să fie disponibile date asupra efectului combinării vaccinurilor ARDT cu vaccin Hib conjugat. La copii în vârstă de două luni care au primit trei doze dintr-un vaccin acelular pertussis-difteric-tetanic (ATDP) combinat cu un vaccin Hib conjugat (PRP-T), răspunsul anticorp la PRP a fost semnificativ mai scăzut decât în grupul care a primit injecții separat în aceeași zi. Rezultate similare s-au raportat cu alt vaccin acelular pertussis-difteric-tetanic combinat cu PRP-T dat pentru primele trei doze.

în contrast cu alte studii raportate, copiii imunizați cu vaccinul combinat au avut un răspuns superior la anticorp PRP difteric și mai mulți antigeni pertussis în comparație cu copii la care li s-a dat PRP la o vizită separată. Pot exista mai multe motive pentru imunogenitate echivalentă sau mai bună pentru aceste vaccinuri când au fost date ca o injecție combinată, mai degrabă decât imunogenitatea scăzută raportată cu alte produse. Toate vaccinurile acelulare și cu componentă pertussis nu sunt identice în conținutul lor antigenic, metoda toxoidă, adjuvant sau conservant. Totuși, imunogenitatea scăzută a fost raportată cu vaccinuri pertussis acelulare care conțin PT, FHA și 69K și care conțin PT, FHA, 69K și fimbrial.

Vaccinul APDT cu cinci componente, examinat în această lucrare, s-a găsit a avea o eficiență de protecție de >85% (exemplul 5) (95% CI 81/89) într-o testare clinică cu III faze, recent realizată în Suedia, sub auspiciile Institutului Național al Sănătății.

Vaccinurile combinate, disponibile comercial, în prezent, pot să nu conțină formulări adecvate de antigeni corespunzători, în forme imunogenice potrivite, pentru a atinge un nivel dorit al eficacității într-o populație umană susceptibilă-pertussis.

Ar fi de dorit să se asigure vaccinuri combinate eficiente, care cuprind componente pertussis acelulare conținând cantități corespunzătoare selectate de antigeni selectați.

Prezenta invenție este orientată spre vaccinuri combinate sau multivalente, care conțin componente de vaccin pertussis acelular și metode pentru folosirea lor.

Compoziția imunogenă multivalentă pentru conferirea protecției la o gazdă împotriva bolii cauzată de Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae și poliovirus, conform invenției, constă în aceea că aceasta cuprinde:

a) toxoid pertussis, hemaglutinină filamentoasă, pertactină și aglutinogeni în formă purificată,

b) toxoid tetanic,

c) toxoid difteric și

d) poliovirus inactivat, care este formulată ca un vaccin pentru administrare in vivo la o gazdă și în care pentru fiecare doză unică umană, toxoidul pertussis menționat este prezent într-o cantitate de 5 până la 30 pg azot, hemaglutinina filamentoasă menționată este prezentă într-o cantitate de 5 până la 30 pg azot, pertactina menționată este prezentă într-o cantitate de 3 până la 15 pg azot și aglutinogenii menționați sunt prezenți într-o cantitate de 1 până la 10 pg azot.

RO 120819 Β1

Compoziția imunogenă multivalentă, conform invenției, prezintă următoarele1 avantaje:

a) este formulată ca un vaccin pentru administrare in vivo, în care componentele indi- 3 viduale ale compoziției sunt formulate, astfel încât imunogenitatea fiecărei componente individuale nu este deteriorată de către alte componente individuale cu rol de adjuvanți;5

b) asigură o vaccinare simplă împotriva unor boli multiple, fără interferență între răspunsurile imunogenice diferite.7

Compoziția imunogenă poate cuprinde suplimentar un adjuvant, mai ales hidroxid de aluminiu sau fosfat de aluminiu.9

O astfel de compoziție imunogenică poate conține aproximativ 5 până la aproximativ pg azot de toxoid pertussis, aproximativ 5 până la aproximativ 30 pg azot de hema- 11 glutinină filamentoasă, aproximativ 3 până la 15 pg azot de pertactină și aproximativ 1 până la 10 pg azot de aglutinogeni. 13 într-o realizare specifică, compoziția imunogenică poate cuprinde toxoid pertussis, hemaglutinină fimbrială, proteina 69 kDa și aglutinogeni filamentoși de Bordetella pertussis 15 la un raport de greutate de aproximativ 20:20:5:3, așa cum s-a asigurat de către aproximativ pg toxoid pertussis, aproximativ 20 pg hemaglutinină filamentoasă, aproximativ 5 pg de 17 aglutinogeni fimbriali și aproximativ 3 pg proteină 69 Kda, într-o doză simplă umană. în altă realizare specifică, vaccinul poate conține toxoid pertussis, hemaglutinină filamentoasă, 19 proteina 69 kDa și aglutinogen fimbrial de Bordetella pertussis, la un raport de greutate 10:5:5:3, așa cum s-a asigurat de către aproximativ 10 pg toxoid pertussis, aproximativ 5 pg 21 hemaglutinină filamentoasă, aproximativ 5 pg aglutinogen fimbrial și aproximativ 3 pg proteină 69 kDa, într-o doză simplă umană. într-o realizare a compoziției imunogenice asigurată 23 aici, vaccinul conține aproximativ 15 Lf-uri toxoid difteric și aproximativ 5 Lf-uri toxoid tetanic.

Poliovirusul inactivat, folosit în compoziția imunogenică a invenției, cuprinde, în 25 general, un amestec de poliovirus inactivat, tipurile 1,2 și 3. Astfel de amestec de poliovirus inactivat, tipurile 1, 2 și 3, poate fi folosit în compozițiile.· 27 aproximativ 20 până la aproximativ 50 D unități antigen poliovirus tip 1, aproximativ 5 până la aproximativ 10 D unități antigen poliovirus tip 2,29 aproximativ 20 până la aproximativ 50 D unități antigen poliovirus tip 3, într-o doză simplă, umană. într-o formulare, astfel de amestecuri de tipuri de poliovirus 31 inactivate pot conține:

aproximativ 40 D unități antigen poliovirus tip 1,33 aproximativ 8 D unități antigen poliovirus tip 2, aproximativ 32 D unități antigen poliovirus tip 3, într-o doză simplă, umană.35

Componentul moleculă conjugată al compoziției imunogenice poate cuprinde un conjugat de toxoid tetanic sau toxoid difteric și ribitol fosfat de poliriboză (PRP) al 37 Haemophilus influenzae tip b. O astfel de moleculă conjugată poate fi asigurată într-o formă liofilizată, care este reconstituită pentru administrarea prin combinarea cu celelalte compo- 39 nente. Compoziția imunogenică poate conține conjugatul într-o cantitate de aproximativ 5 până la aproximativ 15 pg PRP conjugat până la aproximativ 35 pg toxoid tetanic, într-o 41 singură doză umană. într-o formulare, conjugatul este folosit într-o cantitate de aproximativ pg PRP conjugat până la aproximativ 20 pg toxoid tetanic. 43 în astfel de realizări speciale, compozițiile imunogenice asigură un profil de răspuns imun, la fiecare dintre antigenii pertussis conținuți aici și profilul de răspuns asigurat de 45 componentele acelulare fiind echivalent substanțial celui produs de către un vaccin pertussis cu celulă întreagă. 47

RO 120819 Β1 într-o realizare preferată a acestei invenții, se asigură o compoziție vaccin multivalent, cuprinzând per 0,5 ml doză, 20 pg toxoid pertussis, 20 pg gemaglutinină filamentoasă; 5 pg fimbrie 2 și 3; 3 pg proteină membrană pertactină; 15 Lf toxoid difteric; 5 Lf toxoid tetanic; poliovirus tip 1 40 D unități antigen; poliovirus tip 2 8 D unități antigen; 1,5 pg fosfat de aluminiu.

O astfel de compoziție poate cuprinde suplimentar, per 0,5 ml doză, 10 pg polizaharidă capsulară de ribitol fosfat de poliriboză purificat (PRP) de Haemophilus influenzae tip b, legat covalent la 20 pg toxoid tetanic. în plus, astfel de compoziții pot conține, per 0,5 ml doză, 2-fenoxietanol 0,6%.

într-un aspect suplimentar al invenției, se asigură o metodă de imunizare a unei gazde împotriva bolilor multiple, care cuprinde administrarea la gazdă, care poate fi om, a unei cantități imunoeficiente a compoziției imunogenice sau a vaccinului, cum s-a asigurat aici.

Prezenta invenție va fi înțeleasă suplimentar, din următoarea descriere detaliată și exemplele cu referire la desenul însoțitor, în care figura reprezintă fluxul tehnologic schematic al unui procedeu pentru izolarea unui preparat aglutinogen de la o tulpină Bordetella.

Prepararea aglutinogenului

Referitor la figură, este ilustrat fluxul tehnologic al unei metode pentru prepararea unui concentrat aglutinogen de la o tulpină Bordetella. Așa cum se vedea în figură, o pastă de celule Bordetella conținând aglutinogeni, cum ar fi pastă de celule B. pertussis, s-a extras cu, de exemplu, un tampon care conține uree, cum ar fi fosfat de potasiu 10 mM, NaC1150 mM și uree 4M, pentru a extrage selectiv aglutinogenii din pasta de celule, pentru a produce un prim supernatant (sp1) care conține aglutinogeni și un prim precipitat rezidual (ppt1). Primul supernatant (sp1) s-a separat de primul precipitat rezidual (ppt1), cum ar fi prin centrifugare. Precipitatul rezidual (ppt 1) este îndepărtat. Supernatantul limpezit (sp1) apoi poate fi concentrat și diafiltrat pe, de exemplu, fosfat de potasiu 10 mM/ NaC1150 mM/Triton X-100 0,1%, folosind, de exemplu, un filtru membrană NMWL de 100 până la 300 kDa.

Apoi, primul supernatant s-a incubat la temperatură, pentru un timp, pentru a produce un supernatant limpezit (sp2), conținând aglutinogeni, și un al doilea precipitat îndepărtat (ppt2), conținând non-aglutinogeni contaminanți. Temperaturile corespunzătoare includ aproximativ 50 până la aproximativ 100’C, incluzând aproximativ 75 până la aproximativ 85°C, iar timpii de incubare corespunzători includ de la aproximativ 1 la aproximativ 60 min. Apoi supernatantul limpezit s-a concentrat prin, de exemplu, adăugarea de propilenglicol cu greutate moleculară de aproximativ 8000 (PEG 8000), la o concentrație finală de aproximativ

4,5 ± 0,2% și agitând blând pentru un minim de aproximativ 30 min, pentru a produce un al treilea precipitat (ppt3), care poate fi colectat prin centrifugare. Precipitatul rămas sp3 s-a îndepărtat.

Acest al treilea precipitat (ppt3) s-a extras cu, de exemplu, un tampon conținând fosfat de potasiu 10 mM/NaCI 150 mM, pentru a asigura soluția care conține aglutinogen fimbrial brut. Poate fi adăugat fosfat de potasiu 1 M la soluția brută fimbrială, pentru a o face de aproximativ 100 mM în conformitate cu fosfatul de potasiu. Alternativ, supernatantul limpezit de aglutinogeni fimbriali poate fi purificat fără precipitare prin cromatografie filtrare-gel, folosind un gel precum Sepharose CL6B. Aglutinogenii fimbriali în soluția brută pot fi apoi purificați prin cromatografie pe coloană, cum ar fi, prin trecerea printr-o coloană silica PEI, pentru a produce preparatul aglutinogen fimbrial filtrat.

Acest aglutinogen fimbrial, care conține filtratul, poate fi concentrat suplimentar și diafiltrat din nou pe, de exemplu, un tampon conținând fosfat de potasiu 10 mM/NaCI 150 mM, folosind o membrană NMWL 100-300 kDa. Preparatul aglutinogen poate fi sterilizat

RO 120819 Β1 prin filtrare printr-un filtru cu membrană $0,22 μΜ, pentru a asigura preparatul aglutinogen 1 fimbrial final purificat conținând aglutinogen fimbrial 2 și 3, substanțial lipsit de aglutinogen

1. Raportul de greutate al Agg 2 la Agg 3 poate fi de la aproximativ 1,5:1 până la aproximativ 3 2:1. Vaccinurile pot conține alți imunogeni Bordetella purificați, incluzând hemaglutinină filamentoasă, proteina membranei exterioare 69 kDa și toxina pertussis sau un toxoid al 5 acesteia, incluzând analogi genetici dezintoxicați ai PT.

Ceilalți imunogeni Bordetella, toxina pertussis (incluzând analogi genetici detoxifiați, 7 cum s-a descris în, de exemplu, Klein et al., brevet US 5085862, a desemnat asocierea acestora și a fost încorporat aici prin referire), FHA și proteina 69 kDa pot fi produși în forma 9 purificată printr-o varietate de metode așa cum s-a descris mai jos.

Purificarea PT 11

PT poate fi izolat din supernatantul de cultură al unei tulpini B. pertussis, folosind metode convenționale. Poate fi folosită, de exemplu, metoda lui Sekura et al. PT s-a izolat 13 mai întâi prin absorbția supernatantului de cultură pe o coloană conținând matricea de colorare ligand gel, Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). PT s-a eluat din 15 această coloană prin sare puternică, cum ar fi clorură de magneziu 0,75 M și, după îndepărtarea sării, s-a trecut printr-o coloană a matricei de afinitate fetuin-Sepharose, compusă din 17 fetuin legat la bromură de cian activată de Sepharose. PT s-a eluat din coloana fetuin, folosind sare de magneziu 4 M. 19

Alternativ, poate fi folosită metoda lui Irons et al. Supernatantul de cultură poate fi absorbit pe o coloană Sepharose 4B activată de CNBr, la care haptoglobina s-a legat întâi 21 covalent. PT se leagă la absorbant la pH 6,5 și este eluată din coloană, folosind tampon Tris

0,1 M/NaCI 0,5 M printr-o schimbare în trepte la pH 10. 23

Alternativ, poate fi utilizată metoda descrisă în brevetul US 4705686, acordat lui Scott et al., la 10 noiembrie 1987, și încorporat aici prin referire. în această metodă, supernatantele 25 de cultură sau extractele celulare de B. pertussis sunt trecute printr-o coloană dintr-o rășină schimbătoare de anion, cu capacitate suficientă pentru a absorbi endotoxină, dar care per- 27 mite antigenilor Bordetella să curgă prin, sau, altfel, să fie separați din endotoxină.

Alternativ, PT poate fi purificat prin folosirea cromatografiei perlit, așa cum s-a descris 29 în brevetul EP 336736, desemnat solicitantului acestuia și încorporat aici prin referire.

Detoxifierea PT 31

PT s-a detoxifiat pentru a îndepărta activități nedorite care ar cauza reacții secundare ale vaccinului final. Pot fi folosite oricare dintr-o varietate de metode convenționale chimice 33 de detoxifiere, cum ar fi tratament cu formaldehidă, apă oxigenată, tetranitro-metan, sau glutaraldehidă. 35

De exemplu, PT poate fi detoxifiat cu glutaraldehidă, folosind o modificare a procedeului descris în Munoz et al. în acest procedeu de detoxifiere, PT purificat s-a incubatîntr-o 37 soluție care conține 0,01 M fosfat salin tamponat. Soluția s-a adus la 0,05% cu glutaraldehidă și amestecul s-a incubat la temperatura camerei timp de două ore și apoi s-a adus la 0,02 39

M cu L-lizină. Amestecul s-a incubat suplimentar, timp de 2 h, la temperatura camerei și apoi s-a dializat timp de două zile împotriva PBS 0,01 M. într-o realizare specială, poate fi folosit 41 procedeul de detoxifiere din brevetul EP 336736. Pe scurt, PT poate fi detoxifiat cu glutaraldehidă, după cum urmează: 43

PT purificată în fosfat de potasiu 75 mM la pH 8,0, conținând clorură de sodiu 0,22 M, s-a diluat cu un volum egal de glicerol la concentrații de proteină de aproximativ 50 până la 45 400 pg/ml. Soluția s-a încălzit până la 37°C și s-a detoxifiat prin adăugare de glutaraldehidă până la o concentrație finală de 0,5% (g/v). Amestecul este păstrat la 37’C timp de 4 h și 47 apoi s-a adăugat acid aspartic (1,5 M) până la o concentrație finală de 0,25 M. Amestecul

RO 120819 Β1 s-a incubat la temperatura camerei timp de o oră și apoi s-a diafiltrat cu 10 volume de fosfat de potasiu 10 mM la pH 8,0, conținând clorură de sodiu 0,15 M și glicerol 5%, pentru a reduce glicerolul și pentru a îndepărta glutaraldehida. Toxoidul PT s-a filtrat steril printr-o membrană 0,2 uM.

Dacă tehnici recombinante sunt utilizate pentru a prepara o moleculă PT mutantă, care nu arată sau arată puțină toxicitate, pentru utilizare ca moleculă toxoidă, nu este necesară detoxifierea chimică.

Purificarea FHA

FHA poate fi purificată din supernatantul de cultură, în esență cum s-a descris de către Cowell et al. (ref. 58). Promotori de creștere, cum ar fi be/a-ciclodextrina metilat, pot fi folosiți pentru a crește randamentul de FHA în supernatantele de cultură. Supernatantul de cultură s-a aplicat la o coloană de hidroxiapatită. FHA este adsorbit pe coloană, dar PT nu este. Coloana s-a spălat abundent cu Triton X-100 pentru a îndepărta endotoxina. FHA s-a eluat apoi, folosind NaCI 0,5 M în fosfat de sodiu 0,1 M și, dacă este necesar, s-a trecut printr-o coloană fetuin-Sepharose pentru a îndepărta PT rezidual. Purificarea suplimentară poate implica trecerea printr-o coloană CL-6B Sepharose.

Alternativ, FHA poate fi purificată folosind anticorpi monoclonali la antigen, unde anticorpii sunt marcați la o coloană de afinitate CNBr-activată (ref. 59).

Alternativ, FHA poate fi purificat prin folosirea cromatografiei perlit, așa cum s-a descris în brevetul EP 336736 menționat.

Purificarea proteinei membranei exterioare 69 kDa (pertactină)

Proteina membranei exterioare 69 kDa (69 K sau pertactină) poate fi îndepărtată din celulele bacteriene printr-o primă inactivare a celulelor cu un agent bacteriostatic, cum arfi timerosal, așa cum s-a descris în publicația EP 484621 încorporată aici prin referire.

Celulele inactivate s-au suspendatîntr-un mediu apos, cum arfi PBS (pH 7 până la 8) și s-au supus la extracție repetată la temperatură ridicată (45 până la 60°C), cu răcire ulterioară la temperatura camerei sau 4°C. Extracțiile eliberează proteina de 69K din celule. Materialul care conține proteina de 69K s-a colectat prin precipitare și s-a trecut printr-o coloană Affi-gel Blue. Proteina de 69K s-a eluat cu o concentrație ridicată a sării, cum arfi clorură de magneziu 0,5 M. După dializă, aceasta s-a trecut printr-un suport de cromatofocalizare.

Alternativ, proteina de 69K poate fi purificată din supernatantul de cultură al unei culturi B. pertussis, așa cum s-a descris în cererea PCT WO 91/15505, în numele solicitantului acesteia și încorporată aici prin referire. O astfel de metodă este preferată pentru că s-a asigurat pertactină lipsită de materiale de cromatografie ca adenilat ciclază de colorare.

Alte metode corespunzătoare, de purificare ale proteinei membranei exterioare 69 kDa de la B. pertussis, au fost descrise în brevetul US 5276142, acordat lui Gotto et al. la 4 ianuarie 1984 și în brevetul US 5101014, acordat lui Burns la 31 martie 1992.

Alte componente ale invenției

Vaccinurile invenției conțin de asemenea imunogeni non-Bordetella, incluzând toxoid tetanic, toxoid difteric, poliovirus inactivat (IPV) și, opțional, un conjugat al toxoidului difteric sau toxoidului tetanic și o polizaharidă capsulară a Haemophilus influenzae tip b. Alte componente potențiale ale vaccinurilor multicomponente includ proteinele membranei exterioare Haemophilus antigen de suprafață al hepatitei B, oreion, pojar și rubeolă.

Conjugatele toxoidului tetanic sau ale toxoidului difteric și polizaharida capsulară a Hib potfi formate prin izolarea ribitol fosfatului de poliriboză (PRP) izolat de la H. influenzae tip b, derivare PRP, pentru a asigura un acid adipic dihidrazid și conjugare covalentă la toxoidul tetanic sau toxoidul difteric pentru a asigura conjugate PRP-T sau respectiv, PRP-D.

RO 120819 Β1

Fiecare dintre antigeni este absorbit individual la un adjuvant, cum ar fi fosfat de alu-1 miniu sau hidroxid de aluminiu, numiți colectiv alaun, pentru a întreține producerea avantajoasă și rapidă a vaccinurilor care conțin cantități relativ selectate ale acestor antigeni în 3 vaccinuri așa cum s-au asigurat aici.

Formulări de vaccin multivalent selectate5 în realizări selectate, invenția asigură vaccinuri cu următoarele caracteristici (ug proteine, folosit aici, se bazează pe rezultatele testului Kjedahl efectuat asupra concentratelor7 purificate și sunt exprimate ca pg azot de proteină), dintre care toate pot fi administrate prin injectare intramusculară:9 (a) CP_2W20/5/3DT-mlPV (HYBRID):

O formulare cuprinde o combinație a vaccinului component pertussis (CP), combinat 11 cu toxoizi difteric (Dl) și tetanic (T) și poliovirus inactivat (mlPV) și s-a numit CP_20/20/5/3DTmlPV (HYBRID). Creșterea poliovirusului pe celule MRC-5 s-a desemnat mlPV, în timp ce 13 poliovirusul crescut pe celule Vero s-a desemnat IPV sau vIPV. Orice material poliovirus inactivat poate fi folosit interschimbabil în formulări. 15

Fiecare 0,5 ml doză umană din CP_20/20/5/3DT-mlPV (HYBRID) s-a formulat pentru a conține aproximativ:17 pg toxoid pertussis (PT), pg hemaglutinină filamentoasă (FHA),19 pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIM), pg proteina membranei exterioare pertactină (69 kDa),21

Lf toxoid difteric,23

Lf toxoid tetanic,

D unități antigen Poliovirus tip 1,

D unități antigen Poliovirus tip 2,27

D unități antigen Poliovirus tip 3,

1,5 mg fosfat de aluminiu,

0,6% 2-fenoxietanol, drept conservant.31 (b) CP_20/20/5/3DT-mlPV (HYBRID) + PRP-T:33

Altă formulare cuprinde o combinație a vaccinului component pertussis (CP), combinat cu toxoizi difteric (D) și tetanic (T) și poliovirus inactivat (mlPV) numit CP_20/20/5/3DT-mlPV35 (HYBRID) și s-a folosit pentru a reconstitui PRP-T liofilizat. Compoziția rezultată conține, per

0,5 ml doză, aproximativ:37 pg toxoid pertussis (PT), pg hemaglutinină filamentoasă (FHA),39 pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIM), pg proteina membranei exterioare pertactină (69 kDa),41

Lf toxoid difteric,43

Lf toxoid tetanic,

RO 120819 Β1 pg polizaharidă capsulară ribitol fosfat de poliriboză purificată (PRP) a Haemophilus influenzae tip b, legată covalentă la 20 pg toxoid tetanus,

D unități antigen Poliovirus tip 1,

D unități antigen Poliovirus tip 2,

D unități antigen Poliovirus tip 3,

1,5 mg fosfat de aluminiu,

0,6% 2-fenoxietanol.

(c) CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (HYBRID):

O formulare suplimentară cuprinde o combinație de vaccinului component pertussis (CP), combinat cu toxoizi difteric (D) și tetanic (T), poliovirus inactivat (mlPV) și PRP-T și s-a numit CP_20;20/5/3DT-PRP-T-IPV (HYBRID). Fiecare doză umană de 0,5 ml, a acestei compoziții, conține aproximativ:

pg toxoid pertussis (PT), pg hemaglutinină filamentoasă (FHA), pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIM), pg proteina membranei exterioare pertactină (69 kDa),

Lf toxoid difteric,

Lf toxoid tetanic, pg polizaharidă capsulară ribitol fosfat de poliriboză purificată (PRP) a Haemophilus influenzae tip b, legată covalentă la 20 pg toxoid tetanic,

D unități antigen Poliovirus tip 1,

D unități antigen Poliovirus tip 2,

D unități antigen Poliovirus tip 3,

1,5 mg fosfat de aluminiu,

0,6% 2-fenoxietanol.

Teste clinice (a) Vaccin DTP component pertussis

Un număr de teste clinice s-au realizat la oameni, așa cum s-a descris aici, pentru a stabili siguranța, non-reactogenitatea și utilitatea vaccinurilor component pertussis, conținând aglutinogeni fimbriali preparați așa cum s-a descris aici, pentru protecția împotriva pertussis. S-au obținut, în special, răspunsuri imune la fiecare dintre antigenii conținuți în vaccinuri (așa cum se arată, de exemplu, în tabelul 3). Un vaccin multivalent pertussis special CP_10/10/5/3DT s-a analizat într-un mare test clinic dublu-randomizat, multicentru, controlat placebo la o populație umană cu risc, pentru a estima eficiența vaccinului împotriva pertussis specific.

Definiția cazului pentru boala pertussis tipică a fost:

douăzeci și unu zile sau mai mult de tuse spasmodică și fie B. pertussis confirmat în cultură, fie evidența serologică a infecției specific Bordetella indicată printr-o creștere de 100% a anticorpului IgG sau IgA în ELISA pe FHA sau PT în serul pereche, fie dacă datele serologice lipsesc, copilul studiat a fost în contact în familie cu un caz de B. pertussis confirmat în cultură, cu începerea tusei cu 28 zile înainte, sau după începerea tusei la copilul studiat.

RO 120819 Β1

Rezultatele acestui studiu, au arătat că CP_10/10/5/3DT este aproximativ 85% eficient în 1 prevenirea pertussis, așa cum s-a definit în definiția cazului pentru boala pertussis tipică, așa cum s-a descris mai sus. în același studiu, un vaccin acelular pertussis cu două componente, 3 care conține numai PT și FHA, a avut 58% eficacitate (PT26 FHA25 DT) și un vaccin pertussis cu celulă întreagă (DTP) a avut Pro 48% eficiență (vezi, tabelul 4 de mai jos). 5 Suplimentar, vaccinul CP_10/10/5/₃DT a prevenit pertussis moderat, definit ca o tuse de cel puțin o zi durată, la o eficacitate de aproximativ 77%. în particular, profilul răspunsului imun obținut 7 a fost substanțial același, cum s-a obținut urmând imunizarea cu vaccinuri pertussis cu celulă întreagă, care s-a raportat a fi foarte eficient împotriva pertussis. 9 (b) Vaccin multivalent DTP-PRP-T-IPV (I) Siguranța și imunogenicitatea vaccinurilor cu component pertussis în combinație 11 cu toxoid defiteria și toxoid tetanic adsorbit, vaccin conjugat Haemophilus influezae tip b toxoid tetanic și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule Vero (CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV) 13 s-au comparat cu vaccin pertussis cu celulă întreagă (a) în combinație cu toxoizi difteric și tetanic și vaccin poliomielită inactivat, (b) în combinație cu toxoizi difteric și tetanic adsorbit 15 și vaccin poliomielită inactivat, crescut pe celule MRC-5 (DTP-polio adsorbit), utilizat pentru a reconstitui vaccin conjugat Haemophilus influenzae tip b toxoid tetanic liofilizat (ΡΕΝΤΑ™), 17 sau (c) vaccin component pertussis în combinație cu toxoizi difteric și tetanic a adsorbit vaccin conjugat Haemophilus influenzae tip b toxoid tetanic și vaccin poliomielită inactivat, 19 crescut pe celule MRC-5 (CP_20/20/5/3DT-mlPV), primit separat din, sau folosit pentru a reconstitui vaccin conjugat Haemophilus influenzae tip b toxoid tetanic liofilizat (PRP-T) la 21 copiii în vârstă de 2,4, 6 și 18 luni.

Acest test randomizat, controlat, a înscris 897 copii în vârstă de 2 luni, pentru a primi 23 unul dintre cele 8 ramuri diferite de vaccin: CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IP\/ (lichid); CP_20/20/5/3DT dat curent, dar într-un loc diferit de PRP-T; sau vaccinul de control, DPT-Polio cu celulă întreagă 25 folosit pentru PRP-T reconstituit (ΡΕΝΤΑ™).

Toate vaccinurile studiate au fost bine tolerate. Nu s-au observat diferențe semnifi- 27 cative în vitezele de reacție dintre două tipuri de combinații pertussis. Copiii care au primit CP_20/20/5/3DT-mlPV combinat, folosit pentru PRP-T reconstituit, au avut viteze ușor mai ridi- 29 cate ale reacțiilor locale comparativ cu aceleași produse administrate la locuri diferite. Toate combinațiile component pertussis au avut viteze considerabil mai scăzute ale reacțiilor locale 31 și sistemice decât combinația cu celulă întreagă. Diferențele în vitezele de reacție dintre vaccinuri component pertussis și cu celulă întreagă au fost mai evidente în 24 h, imediat 33 după vaccinare.

Ambele combinații cu componenta pertussis au produs răspunsuri foarte bune la toți 35 antigenii. în toate situațiile, răspunsurile pertussis PT, FHA și pertactină au fost superioare răspunsurilor observate la combinații cu celulă întreagă. Nu s-au observat diferențe semni- 37 ficative între combinațiile cu componentă și cu celulă întreagă. Nu s-au observat diferențe semnificative între formulările cu componentă și cu celulă întreagă pentru anti-PRP, difteria 39 și polios 1 și 2. Ambele formulări cu component pertussis au produs răspunsuri la tetanos mai ridicate decât ΡΕΝΤΑ™. Ambele formulări cu componentă au produs răspunsuri sero- 41 logice similare la toți antigenii, excepție polio 3, pentru care CP_20/20/5/3DT-mlPV s-a folosit pentru a reconstitui PRP-T, a produs răspunsuri mai ridicate decât CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV. 43

Metoda de administrare nu a afectat răspunsurile serologice față de orice antigeni, excepție tetanosul, în ambele grupuri combinate și separate, 100% din copii au fost protejați (> 0,01 45

EU/ml) împotriva tetanic, după 3 zile de la vaccin.

RO 120819 Β1

Mai important, toate grupurile de vaccin au avut răspunsuri bune la PRP-T, cu 98,3% din copii realizând niveluri >0,15 pg/ml și peste 86,1% din copii realizând niveluri >1,0 pg/ml. Aceste figuri sunt comparabile celor observate în studii anterioare în care vaccinul pertussis cu celulă întreagă s-a folosit cu PRP-T. Răspunsurile serologice obținute și descrise mai sus sunt arătate în tabelele 5 până la 7 (H= hibrid).

(II) Siguranța și imunogenicitatea vaccinului cu componenta pertussis în combinație cu toxoizi difteric și tetanic adsorbit și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule MRC-5 (CP_2o/2o/5/3DT-mlPV) administrat separat din, sau utilizat la reconstituirea vaccinului conjugat Haemophilus influenzae tip b toxoid tetanic liofilizat (PRP-T) s-au comparat cu vaccin pertussis cu celulă întreagă în combinație cu toxoizi difteric și tetanic adsorbiți și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule MRC-5 (DPT-polio adsorbit), folosit pentru a reconstitui vaccinul conjugat Haemophilus influezae tip b toxoid tetanic liofilizat (ΡΕΝΤΑ™) la copiii în vârstă de 18 până la 19 luni.

Aceste cinci direcții studiate includ o direcție control cu celulă întreagă ΡΕΝΤΑ™ și CP2_O/2o/₅/3DT-mlPV folosită pentru a reconstitui PRP-T. Al cincelea grup a primit CP₂₀/20/5/3DT-mlPV concurent, dar la un loc diferit de PRP-T. 489 subiecți au primit vaccin la vârsta de 18-19 luni, dintre care 466 (95%) au terminat studiul conform protocolului. CP20/20/5/3DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T a fost semnificativ mai puțin reactogenic decât ΡΕΝΤΑ™, în special în primele 24 h după vaccinare. Produsul reconstituit a avut viteze ușor mai ridicate ale reacțiilor locale decât produsul administrat separat.

ΡΕΝΤΑ™ a produs răspunsuri polio 1 mai ridicate decât CP_2o/2o_/5/3DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T. Nu au fost observate diferențe semnificative pentru anti-PRP, difteric, aglutinina pertussis, fimbrie, polio 2 sau polio 3. CP_20/20/5_/3DT-mlP\/ folosit pentru a reconstitui PRP-T a produs răspunsuri semnificativ mai ridicate pertussis PT, FHA și pertactină serologică. CP_2o/2o/5/₃DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T a produs răspunsuri consistente serologic la toți antigenii testați. Nu s-au observat diferențe semnificative între CP_20/20/_5/3DT-mlPV administrat separat față de cel utilizat pentru a reconstitui PRP-T, excepție pentru cel cu antitoxină tetanus (6,78 față de 4,91 EU/ml).

Acest studiu a demonstrat că CP_20/20/5/3DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T a produs răspunsuri consistente serologice în trei loturi și a fost mai imunogenic decât ΡΕΝΤΑ™ pentru răspunsuri pertussis. De asemenea, CP_20/20/5/3DT-mlPV a produs viteze semnificativ mai săzute ale reacțiilor local și sistemic decât ΡΕΝΤΑ™.

(III) Siguranța și imunogenicitatea vaccinului cu component pertussis combinat cu toxoizi difteric și tetanic adsorbit și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule MRC-5 (CP₂o/2o/₅/₃DT-mlPV) s-au comparat cu vaccinul pertussis cu celulă întreagă în combinație cu toxoizi difteric și tetanic adsorbit și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule MRC-5 (DPT-polio adsorbit) la copiii în vârstă de 4 până la 6 ani.

164 subiecți s-au repartizat randomic într-un raport de 4 la 1, pentru a primi fie CP₂₀/20/5/3DT-mlPV (n= 131), fie DPT-Polio, perioada de la 0 până la 24 h. Reacțiile locale au fost comune pentru ambele grupuri de primitori cu 97% DTP-Polio și 76,9% CP„_/3DT-mlPV având aceeași reacție locală în perioada de la 0 până la 24 h. Reacțiile locale CP₂o/2o/5/₃DT-mlPV au fost de obicei blânde sau moderate. în contrast, mai mult de jumătate dintre primitorii DPT-Polio au avut reacții locale calificate ca severe. Sensibilitatea locului de injectare dispare în mod obișnuit la 72 h, dar roșeața sau umflătura tinde să persiste încă, în perioada de la 24 până la 72 h.

Reacțiile sistemice în perioada de la 0 până la 24 h au fost mai puțin obișnuite la primitori CP₂o/₂o/5/₃DT-mlP\/ (38,5%) decât la primitori DPT-Polio (90,9%). Reacții sistemice în perioada 24-72 h nu sunt obișnuite pentru ambele grupuri.

RO 120819 Β1

Răspunsurile la difterie, tetanos, polio 2 și 3 au fost comparabile între cele două 1 vaccinuri. Primitorii DPT-polio au avut un răspuns polio 1 semnificativ mai mare (15,462) decât au avut primitorii CP_20/20/5/3DT-mlPV (10,903). Toți subiecții au avut răspunsuri foarte 3 bune și se vor considera protejați împotriva bolilor respective. Răspunsurile serologice la toți antigenii pertussis au fost semnificativ mai ridicate la primitori CP_20;20,_5;3DT-mlPV. 5 (IV) Siguranța și imunogenicitatea vaccinului cu component pertussis în combinație cu toxoizii difterie și tetanic adsorbiți, vaccin conjugat Haemophilus influezae tip b toxoid 7 tetanic și vaccin poliomelită crescut pe celule MRC-5 (CP_20/20/5/3DT-PRP-T-mlPV) s-au comparat cu vaccin pertussis cu celulă întreagă în combinație cu toxoizii difterie și tetanic 9 adsorbiți și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule MRC-5 (DPT-polio adsorbit) folosit pentru a reconstitui vaccinul liofilizat conjugat Haemophilus influenzae tip b toxoid tetanos 11 (ΡΕΝΤΑ™), sau vaccinul cu component pertussis în combinație cu toxoizi difterie și tetanic adsorbit și vaccin poliomielită inactivat crescut pe celule MRC-5 (CP_20/20Z5/3DT-mlPV)13 folosit pentru a reconstitui vaccin conjugat liofilizat Haemophilus influenzae tip b toxoid tetanic (PRP-T) la copiii în vârstă de 18 până la 19 luni.15

Scopul acestui studiu simplu orb, controlat randomic cu trei direcții, a fost de a evalua siguranța și imunogenicitatea celor două combinații pertussis acelulare, CP_20;20/5Z3DT-PRP-T-17

IPV și CP_20/20/5/3DT-mlPV folosite pentru a reconstitui PRP-T, cu ΡΕΝΤΑ™ (DPT-polio pertussis cu celulă întreagă folosit pentru a reconstitui PRP-T la copiii în vârstă de la 18 până la 19 19 luni.

Au participat un total de 99 copii; 33 în fiecare din cele trei grupuri de vaccin, dintre 21 care 97 (98%) au terminat studiul conform protocolului.

Nu s-au observat reacții grave în acest studiu. Primitori ΡΕΝΤΑ™ au fost semnificativ 23 mai expuși la a experimenta, au avut reacții locale sau sistemice moderate sau severe față de primitorii altor două vaccinuri. Diferențele au fost mai pronunțate la 24 h și au atins semni- 25 ficație statistică pentru febră, roșeață, umflătură, sensibilitate, agitație, activitate scăzută și hrănire mai puțină. Reacțiile tind să fie blânde la copiii care au primit combinații cu compo- 27 nenta pertussis. Nu s-au observat diferențe semnificative în vitezele de reacții între cele două formulări cu componenta pertussis, deși agitația la 24 h s-a observat mai frecvent la cei care 29 au primit CP_20/20/5/3DT-mlPVfolosit pentru a reconstitui PRP-T față de CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IP\/ (18% față de 3%). 31

Răspunsurile serologice au fost satisfăcătoare cu 100% dintre participanți, atingând niveluri considerate de protecție pentru antitoxina difterie (>0,01 lU/ml), antitoxina tetanic 33 (>0,01 lU/ml) și anti PRP U 1,0 lU/ml). Anticorpi de neutralizare detectabili la polio tipuri 1, 2 și 3 s-au observat la toți participanții postimunizare. 35

Răspunsuri la difterie au fost mai ridicate la primitori ΡΕΝΤΑ™ ceea ce reflectă conținutul mai ridicat de antigen al acestui vaccin (25 Lf față de 15 Lf). 37

Anticorpii pertussis au fost considerabil mai ridicați în cele 2 combinații cu componenta pertussis față de ΡΕΝΤΑ™, atingând semnificația statistică pentru răspunsurile 39 anti-PT, anti-FHA și anti-pertactină GMT. Anticorpii de aglutinare pertussis și antifimbrial au fost de asemenea mai ridicați la primitori de component pertussis, cu toate că diferențele nu 41 au atins semnificație statistică.

în rezumat, acest studiu a arătat că cele două combinații pertussis acelular 43 CP₂₀,_20/5/3DT-mlPV folosite pentru a reconstitui PFP-T și CP₂₀,_20/5/3DT-PRP-T-IPV au fost comparabile și au produs viteze de reacție suficient de scăzute și răspunsuri serologice ridicate 45 când s-au primit ca un auxiliar la copiii în vârstă de la 18 până la 19 luni.

(V) Siguranța și imunogenicitatea vaccinului cu component pertussis în combinație 47 cu toxoid difterie și tetanic adsorbit (CP_20/20/5/3DT) singur sau în combinație cu unul sau două poliovirusuri inactivate, unul mlPV, crescut pe celule MRC-5 și celălalt vIPV, crescut pe 49 celule Vero, sau vaccin oral poliomielită (OPV), la copiii în vârstă de la 17 până la 19 luni.

RO 120819 Β1

Acest studiu cu cinci direcții studiate a fost desemnat să examineze interacția dintre CP20/20/5/3DT și două IPV-uri (crescut pe celule Vero sau pe celule MRC-5). Ambele IPV-uri s-au combinat ca un singur produs lichid cu CP_20/20/5/3DT-mlPV și CP_20/20/5/3DT-vlPV, s-au dat în mod simultan, dar la un loc de injectare separat (CP_20/20/5/3DT+mlP\/ și CP_20/20/5/3DT+vlPV). Al cincilea grup studiat a primit CP_20/20/5/3DT și în mod simultan OPV. Toți subiecții au primit PRP-T după recoltarea sângelui postimunizare. în acest studiu nu s-au evaluat răspunsuri anti-PRP.

SCHEMA STUDIULUI

NUMĂR	VIZITAI (17-19 luni)	VIZITA 2 (+1 lună)
85	1. CP2„3DT-mlPV (1 injecție)	PRP-T
85	2. CP20/20/5/3DT-mlPV (2 injecții)	PRP-T
85	3. CP2o/2o/5/3DT-vIPV (1 injecție)	PRP-T
85	4- CP20/20/5/3DT+vIPV (2 injecții)	PRP-T
85	5. CP20/20/5/3DT+OPV (1 injecție)	PRP-T

în general, nu există diferențe în vitezele reacțiilor adverse prezentate după vaccinuri poliomielită inactivate cu celulă derivată MRC-5 sau Vero, dacă vaccinul s-a primit ca o injecție separată sau combinată cu vaccinul CP_20/20/5/₃DT (HYBRID).

Nu s-au observat diferențe semnificative între grupuri pentru PT, FHA și pertactină. Răspunsuri la copiii care au primit CP_20/20/5/3DT (HYBRID) și OPV au fost ușor, dar nesemnificativ, mai mari, decât la copiii care au primit CP_20/20/5/3DT (HYBRID) și IPV cu celulă Vero pentru FIM, aglutinină pertussis, difteric și tetanic. Răspunsurile polioau fost în general comparabile sau mai mari la copiii care au primit IPV față de un vaccin OPV. Toți, mai puțin unul au avut aglutinină pertussis >1:64. Toți, dar mai puțin unul au atins niveluri antitoxină difterie 0,1 U/ml și toți au atins niveluri antitoxină tetanic >0,1 EU/ml.

Rezultatele acestui studiu au demonstrat că CP_20/20/5/3DT (HYBRID) în combinație cu IPV (fie celulă MRC-5, fie Vero) este sigur și imunogenic la copii în vârstă de 17 până la 19 luni. Vaccinurile combinate au fost cel puțin la fel de imunogenice ca vaccinul primit ca injecții separate și în câteva cazuri mai imunogenice. Combinarea vaccinului ca o singură injecție nu s-a asociat cu o creștere semnificativă în reacțiile adverse locale. Nu s-au detectat diferențe substanțiale în reacțiile adverse sau răspunsul imun la cele două preparări IPV fie ca injecții separate, fie ca produse combinate. Includerea IPV nu a crescut viteza reacțiilor adverse comparate cu CP_20/20/5/3DT (HYBRID) primit singur (adică, cu OPV).

Rezultatele serologice obținute în studiu au fost rezumate în tabelul 8 (H= hibrid).

(VI) Siguranța și imunogenicitatea vaccinurilor cu component pertussis în combinație cu toxoizi difteric și tetanic adsorbit (CP_20/20/5/3DT și CP_10/10/5/3DT) singur și în combinație cu vaccin conjugat Haemophilus influenzae tip b s-au determinat la copiii în vârstă de la 17 până la 19 luni.

Studiul cu șase direcții a fost desemnat să examineze interacțiunea dintre ambele formulări cu component pertussis clasic (CP_10/5/5/3DT) și (CP_20/20/5/3DT) Hybrid și vaccinul conjugat Haemophilus influenzae tip B (PRP-T) la copiii în vârstă de la 18 până la 19 luni.

S-au folosit trei programe, în care (a) fiecare dintre vaccinurile cu component pertussis s-au folosit pentru a reconstitui PRP-T, (b) date simultan, dar în locuri separate de PRP-T sau (c) PRP-T s-a dat o lună după vaccinul cu component pertussis. Toți copii au primit OPV la prima vizită și s-au rapelat cu același vaccin cu componente pertussis la vârsta de 2, 4 și 6 luni. Toți copiii au participat anterior la studiul de mare siguranță a acestor două formulări de vaccin.

RO 120819 Β1

Un total de 545 subiecți s-au înscris în studiu, dintre care 542 (99%) au terminat 1 studiul.

SCHEMA STUDIULUI 3

NUMĂR	VIZITAI (17-19 luni)		VIZITA 2 (+1 lună)	VIZITA 3 (+2 luni)
154	1. CP20/20/5/3DT folosit pentru a reconstitui PRP-T	SÂNGE + OPV	Sânge	-
152	CP20/20/5/3DT primit în mod simultan cu PRP-T OPV	Sânge	-
159	CP20/20/5/3DT	PRP-T	Sânge
27	CP20/20/5/3DT folosit pentru a reconstitui PRP-T	SÂNGE + OPV	Sânge	-
29	CP10/5/5/3DT primit în mod simultan cu PRP-T	Sânge	-
21	CP10/5/5/3D τ	PRP-T	Sânge

Răspunsurile serologice au fost, în general, mai mari, la majoritatea antigenilor, când 19 un vaccin combinat cu component pertussis și PRP-T s-a dat în aceeași zi comparativ cu administrare în zile separate (vezi, tabelul 9). 21

Important, răspunsurile anti-PRP nu au diminuat când PRP-T s-a administrat separat față de combinația cu un vaccin combinat cu component pertussis în aceeași zi. 23

GMT-uri postimunizare la copiii care au primit vaccinuri în zile separate au fost semnificativ mai scăzute. Diferențe în răspunsuri anti-PRP între injecții combinate și separate s-au 25 observat când subiecții s-au stratificat prin formulare de vaccin cu componenta pertussis. Primitorii de CP_20/20/5/3DT (HYBRID) au demonstrat niveluri anti-PRP mai scăzute când vacci- 27 nul s-a administrat combinat mai degrabă decât separat. Aceste diferențe nu s-au observat la primitori CP_10/10/5/3DT și diferențele au dispărut când grupurile s-au combinat. Toți pârtiei- 29 panții au atins niveluri anti-PRP L 0,15 pg/ml și peste 98% din fiecare grup au avut nivel >1,0 pg/ml. Numai patru (0,7%) participanți la studiu nu au reușit să atingă acest nivel; trei dintre 31 injecțiile separate în zile separate și unul în grupul injecție combinată. Peste 82% din fiecare grup au depășit titrurile de 10 pg/ml de anticorp anti-PRP. 33

Dintre reacțiile locale provocate, numai sensibilitatea s-a raportat mai frecvent în grupul combinat (27,8%) comparativ cu grupul vaccinat în zi separată (16,7%). Această 35 viteză nu a fost diferită de cea observată la grupul care a primit vaccinuri în aceeași zi ca injecții separate (24,2%). 37 în general, o reacție sistemică s-a raportat cu frecvență similară (60 până la 62,1%) la participanții din fiecare dintre grupurile de vaccin. Febra a fost raportată la aproximativ o 39 treime dintre participanți. Numai agitația s-a raportat mult mai obișnuit la grupul cu injecție combinată (33,3%) comparat cu grupurile cu injecții separate (22,0%) sau zile separate 41 (22,8%).

Pentru a rezuma rezultatele acestui test, administrarea simultană a CP_10/10/5/3DT sau 43 CP_20/20/5/3DT și PRP-T în aceeași zi nu interferează cu răspunsurile anti-PRP, dar poate chiar să le sporească. Răspunsurile la alți antigeni au fost de asemenea foarte bune. Tetanicul a 45 fost singurul antigen afectat când cele două vaccinuri au fost amestecate, dar toți copiii au avut niveluri ridicate de protecție. 47

RO 120819 Β1

Pentru ultimele teste clinice, s-au preparat CP_1Q/10/5/3DT-IPV crescut pe celule MRC5 pentru reconstituire cu ActHib (PRP-T) și A5I (CP_10/5/5/3DT-PRP-T-IPV crescut pe celule Vero 3 pg/ml). Antigenii cu component pertussis s-au adsorbit individual pe sulfat de aluminiu 3 mg/ml în absență de conservant. în această privință, PT a fost în fosfat de potasiu 10 mM, NaCI 0,15 M, glicerol 5%, FHA a fost în fosfat de potasiu 10 mM, NaCI 0,5 M, 69 K a fost în fosfat de potasiu 10 mM, NaCI 0,15 M și fimbria a fost în fosfat de potasiu 10 mM, NaCI 0,15 M. D s-a absorbit la fosfat de aluminiu (6,25 mg/ml) la o concentrație de 300 Lf/ml. S-a adăugat 2-fenocietanol precum conservat până la 0,6%. T s-a adsorbit la fosfat de aluminiu (6,25 mg/ml) la o concentrație de 300 Lf/ml. S-a adăugat 2-fenoxietanol până la 0,6%.

Antigenii cu componenta pertussis adsorbit s-au combinat cu D adsorbit și T adsorbit la o concentrație de 3,65 doze/ml sau 55% din volumul final. Conținutul de 2-fenoxietanol a fost de 0,6%, înaintea combinării cu mlPV sau v-IPV/PRP-T, s-au confirmat sterilitatea, conținutul de aluminiu și conținutul de 2-fenoxietanol. Pentru 5 ml s-au adăugat m-IPV și 2-fenoxietanol și s-au diluat până la puterea finală. Pentru A5I, v-IPV, PRP-t și 2-feniletanol s-au adăugat și s-au diluat la tăria finală.

în rezumatul rezultatelor testului clinic cu vaccinuri multivalente, se poate observa că CP_20/20/5/3DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T produce răspunsuri serologice comparabile la difteric, tetanic și polio 1,2 și 3, comparat cu ΡΕΝΤΑ™ (care conține vaccin pertussis cu celulă întreagă). Răspunsuri anti-PRP sunt comparabile sau mai ridicate decât cele observat cu ΡΕΝΤΑ™ la ambele doze sugar și rapel. Răspunsurile la tetanos sunt mai scăzute decât CP_20/20/5/3DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T când s-a comparat cu CP_20/20/5/3DT-mlPV primit separat din PRP-T, dar această reducere nu este relevantă clinic. Corespunzător cu alte studii, vaccinul cu celulă întreagă produce răspunsuri fimbrie și aglutinine comparabile sau mai ridicate decât vaccinul cu componenta pertussis, totuși, vaccinul cu celulă întreagă folosit este cunoscut a conține un component fimbrial cu imunogenicitate înaltă. Toate celelalte răspunsuri pertussis au fost consecvent mai ridicate cu CP_20/20/5/3DT-mlPV folosit pentru a reconstitui PRP-T decât cu ΡΕΝΤΑ™. Astfel, prezenta invenție asigură compoziții imunogenice multivalente în care răspunsurile imune la antigeni nu sunt diminuate sau deteriorate de către alte componente sau de către includerea lor în vaccinul multivalent. Se face uneori referință la răspunsuri imune ca interferență.

Prepararea vaccinului și utilizare

Astfel, compoziții imunogenice, potrivite pentru a fi folosite ca vaccinuri, pot fi preparate din imunogeni, cum s-a descris aici. Vaccinul provoacă un răspuns imun într-un subiect, care produce anticorpi.

Compoziții imunogenice care includ vaccinuri pot fi preparate ca injectabile, ca soluții lichide sau emulsii. Imunogenii pot fi amestecați cu excipienți acceptabili farmaceutic care sunt compatibili cu imunogenii. Astfel de excipienți pot include apă, saramură, dextroză, glicerol, etanol și combinații ale acestora. Compozițiile imunogenice și vaccinurile pot conține suplimentar substanțe auxiliare, cum ar fi agenți de umezire sau emulsifiere, agenți pentru tamponarea pH-ului, sau adjuvanți, pentru a spori eficacitatea acestora. Compoziții imunogenice și vaccinuri pot fi administrate parenteral, prin injectare subcutanată sau intramusculară. Preparările imunogenice și vaccinurile sunt administrate într-un mod compatibil cu formularea dozată și într-o astfel de cantitate care va fi eficientă terapeutic, imunogenic și protectiv. Cantitatea de administrat depinde de subiectul de tratat, incluzând, de exemplu, capacitatea sistemului imunitar al individului pentru a sintetiza anticorpi și, dacă este nevoie, pentru a produce un răspuns imun mediat celular. Cantități precise din ingredientul activ, necesare pentru a fi administrate, depind de judecata practicianului. Totuși, domenii de dozaj potrivite sunt rapid determinabile de către un specialist cu pregătire în domeniu și pot fi de

RO 120819 Β1 ordinul a micrograme de imunogeni. Regimurile potrivite pentru administrare inițială și dozele 1 rapel sunt de asemenea variabile, dar pot include o administrare inițială urmată de o administrare ulterioară. Dozajul poate depinde de asemenea, de calea de administrare și va 3 varia conform greutății gazdei.

Concentrația imunogenilor într-o compoziție imunogenică, conform invenției, este în 5 general, de aproximativ 1 până la aproximativ 95%. Imunogenicitatea poate fi semnificativ îmbunătățită dacă antigenii sunt coadministrați cu adjuvanți, în mod obișnuit s-a folosit ca 7 soluție 0,005 la 0,5% în soluție salină fosfat tamponată. Adjuvanții sporesc imunogenicitatea unui antigen, dar nu sunt ei înșiși în mod necesar imunogenici. Adjuvanții pot acționa prin 9 reținerea locală a antigenului, lângă locul de administrare, pentru a produce un efect de depozit care să faciliteze o eliberare lentă, susținută, a antigenului, către celulele sistemului 11 imun. Adjuvanții pot atrage, de asemenea, celule ale sistemului imun la un depozit de antigen și stimula astfel de celule pentru a provoca răspunsuri imune. 13

Agenții imunostimulatori sau adjuvanții sunt folosiți de mulți ani pentru a îmbunătăți răspunsurile imune ale gazdei la, de exemplu, vaccinuri. Adjuvanți intrinseci, cum ar fi lipo- 15 polizaharide, în mod normal sunt componentele bacteriei omorâte sau atenuate, folosite ca vaccinuri. Adjuvanți extrinseci sunt imunomodulatori, care în mod tipic sunt legați necovalent 17 la antigeni și sunt formulate pentru a spori răspunsurile imune ale gazdei. Astfel, adjuvanții au fost identificați că sporesc răspunsul imun la antigeni administrați parenteral. Unii dintre 19 acești adjuvanți sunt toxici și pot cauza efecte secundare nedorite, făcându-i nepotriviți pentru utilizare la oameni și multe animale. într-adevăr, numai hidroxidul de aluminiu și fosfatul 21 de aluminiu (frecvent se face referire colectivă ca alaun) sunt folosiți de obicei ca adjuvanți în vaccinurile umane și veterinare. Eficacitatea alaunului în creșterea răspunsurilor anticorp 23 la toxoizi difteric și tetanic este bine stabilită.

Un domeniu larg de adjuvanți extrinseci poate provoca răspunsuri imune eficace la 25 antigeni. Aceștia includ saponine complexate la proteina membranei antigenilor (complexe de stimulare imună), polimeri pluronici cu ulei mineral, micobacterie omorâtă în ulei mineral, 27 adjuvant complet Freund, produse bacteriene, cum ar fi muramil dipeptidă (MDP) și lipopolizaharidă (LPS), la fel ca și lipida A și lipozomi. 29

Pentru a induce eficient răspunsuri imune umorale (HIR) și imunitate mediată-celulă (CMI), imunogenii sunt adesea emulsificați în adjuvanți. Mulți adjuvanți sunt toxici, incluzând 31 granuloame, inflamații acute și cronice (adjuvant complet Freund, FCA), citoliza (saponine și polimeri Pluronic) și pirogenicitate, artrite și uveite anterioare (LPS și MDP). Deși FCA este 33 un adjuvant foarte bun și larg utilizat în cercetare, nu a fost autorizat pentru utilizare în vaccinuri umane sau veterinare, din cauza toxicității sale. 35

Caracteristici dorite ale adjuvanților ideali includ:

1) lipsa toxicității;37

2) capacitatea de a stimula un răspuns imun îndelungat;

3) simplificarea fabricării și stabilitatea la depozitare îndelungată;39

4) capacitatea de a provoca ambele CMI și HIR la antigeni administrați pe căi diferite;

5) sinergie cu alți adjuvanți;41

6) capacitatea interacțiunii selective cu populații ale celulelor care prezintă antigen (APC);43

7) capacitatea de a provoca specific răspunsuri imune specifice celulei corespunzătoare T_H1 sau T_H2; și45

8) capacitatea de a crește selectiv niveluri izotip anticorp corespunzătoare (de exemplu, IgA) împotriva antigenilor.47

RO 120819 Β1

Brevetul US 4855283, acordat lui Lockhoff et al., pe 8 august 1989, care este încorporat aici prin referință, în plus prezintă analogi de glicolipidă, incluzând N-glicozilamide, N-glicozilurei și N-glicozilcarbamați, dintre care fiecare este substituit în restul de zahăr printr-un aminoacid, ca imuno-modulatori sau adjuvanți. Astfel, Lockhoff et al. (US 4855283 și ref. 60) au raportat că analogi de N-glicolipidă, care prezintă similarități structurale la glicolipide întâlnite în natură, cum ar fi glicolipide și glicoglicerolipide, sunt capabili să provoace răspunsuri imune puternice atât în vaccin virus simplex herpes, cât și în vaccin virus pseudorabie. Câteva glicolipide au fost sintetizate de la alchilamine cu catenă lungă și acizi grași care sunt legați direct cu zaharuri prin atomul de carbon anomeric, pentru a imita funcțiile resturilor lipide întâlnite natural.

Brevetul US 4258029, acordat lui Moloney, menționat de solicitantul prezentei și încorporat aici prin referire, în plus, prezintă că clorhidratul de octadecil tirozina (OTH) funcționează ca un adjuvant când s-a complexat cu toxoid tetanic și formalină inactivată vaccin virus poliomielită tip I, II și III. De asemenea, Nixon-George et al. au raportat că esteri octodecil ai aminoacizilor aromatici complexați cu un antigen de suprafață hepatită B recombinant au sporit răspunsurile imune ale gazdei împotriva virusului hepatitei B.

Descoperirile de mai sus descriu în general prezenta invenție. O înțelegere mai completă se poate obține prin referire la următoarele exemple specifice. Aceste exemple sunt descrise numai pentru scopurile ilustrării și nu au intenția de a limita întinderea invenției. Schimbările în forma și substituirea echivalenților sunt considerate ca împrejurări care pot sugera sau oferi utilitate. Deși au fost folosiți aici termeni specifici, astfel de termeni se intenționează a fi într-un sens descriptiv și nu pentru scopul limitării.

Metode ale biochimiei, fermentării și imunologiei proteinei folosite, dar nu descrise explicit în această dezvăluire și aceste exemple sunt amplu raportate în literatura specifică și sunt bine cunoscute celor cu pregătire în domeniu.

Se prezintă, în continuare, următoarele 8 exemple de realizare a invenției.

Exemplul 1. Acest exemplu descrie creșterea Bordetella pertussis.

Spori principali

Culturi de semințe principale ale unei tulpini Bordetella pertussis s-au menținut ca loturi de semințe liofilizate, la 2 până la 8°C.

Spori de lucru

Cultura liofilizată s-a recuperat din mediul Hornibrook și s-a folosit pentru a însămânța plăci Bordet-Gengou Agar (BGA). Mediul Hornibrook a avut compoziția următoare:

Component pentru 1 litru

Hidrolizat de caseină (cărbune tratat) .............................10,0g;

Acid nicotinic ...............................................0,001g;

Clorură de calciu ............................................ 0,002g;

Clorură de sodiu...............................................5,0g;

Clorură de magneziu hexahidrat ................................ 0,025g;

Clorură de potasiu ........................................... 0,200g;

Fosfat de potasiu dibazic...................................... 0,250g;

Amidon......................................................1,0g;

Apă distilată...........................................până la 1 litru.

RO 120819 Β1 pH-ul s-a ajustat până la 6,9 ± 0,1, cu o soluție 1% de carbonat de sodiu. Mediul s-a distribuit în tuburi și s-a sterilizat prin fierbere în autoclavă, timp de 20 min, și autoclavare timp de 20 min, la 121 până la 124’C. Sporii s-au subcultivat de două ori, mai întâi pe plăci BGA, apoi pe Agar cu Component Pertussis (CPA). Agar cu Componenta Pertussis (CPA) a avut următoarea compoziție:

NaCI .......................................................2,5g/l;

KH₂PO4 ....................................................0,5g/l;

KCI ........................................................0,2g/l;

MgCI₂(H₂O)₆ .................................................0,1g/l;

Bază Tris....................................................1,5g/l;

Acizi Casamino..............................................10,0g/l;

NaCI .......................................................2,5g/l;

Glutamat acid de sodiu........................................10,0 g/l;

HCI conc.............................................până la pH 7,2;

Agar ......................................................15,0g/l;

Factori de creștere (CPGF) ...................................10,0ml/l.

Factorii de creștere cu Component Pertussis (CPGF) - 100X au avut compoziția următoare:

L-cisteină HCI................................................4,0g/l;

Niacin ......................................................0,4g/l;

Acid ascorbic ...............................................40,0g/l;

Glutation, redus .............................................15,0g/l;

Fe₂SO₄(H₂O)₇................................................1,0g/l;

Dimetil-p-ciclodextrină ........................................ 100g/l;

CaCI₂(H2O)₂.................................................2,0g/l.

Cultura finală s-a suspendat în Tampon de Suspensie cu Spori Pertussis (CPSB), s-a distribuit în 2 până la 4 ml alicote și s-a depozitat de rece la -60 până la -85°C. Tamponul de Suspensie cu Spori Pertussis (PSSB) a avut următoarea compoziție:

Acizi Casamino..............................................10,0g/l;

Bază Tris....................................................1,5 g/l;

Glicerol anhidru............................................. 100ml/l;

HCI conc.............................................până la pH 7,2.

Aceste suspensii de glicerol au asigurat materia primă pentru prepararea semințelor de lucru.

Procedeu de cultivare35

Propagarea sporilor de lucru s-a organizat în sticle Componenta Pertussis Agar Roux, timp de 4 până la 7 zile, la 34 până la 38°C. După această cultivare, celulele s-au spălat cu 37 Bulion cu Component Pertussis (CPB). Probele s-au observat prin colorare Gram, pentru puritatea de cultură și opacitate. 39

Celulele s-au transferat la baloane conice de 4 I, care conțin CPB și s-au incubat la până la 38°C, timp de 20 până la 26 h, cu scuturare. Probele s-au observat prin colorare 41 Gram și s-a cercetat puritatea culturii. Baloanele s-au adunat și suspensia s-a folosit pentru a însămânța două fermentatoare conținând CPB (10 I volum inițial la ΟΟθθ₀ 0,1-0,4). 43

Semințele au crescut la un OD₆₀₀ final de 5,0 până la 10,0. Probele s-au testat prin colorare Gram, pentru puritate de cultură, prin ELISA specific antigen și pentru sterilitate. 45

RO 120819 Β1

Exemplul 2. Acest exemplu descrie purificarea antigenilor din cultura de celule Bordetella pertussis.

Producerea de bulion și concentrate de celule

Suspensia bacteriană s-a crescut în două fermentatoare de producție, la 34 până la 37°C, timp de 35 până la 50 h. Fermentatoarele s-au eșantionat pentru testarea sterilității mediului. Suspensia s-a alimentat la o centrifugă cu grup de discuri în flux continuu (12.000 x g) pentru a separa celulele din bulion. Celulele s-au colectat pentru a aștepta extracția componentului fimbrial. Lichidul limpezit s-a trecut printr-o membrană de filtru ^0,22 pm. Lichidul filtrat s-a concentrat prin ultrafiltrare, folosind o membrană pentru limitarea greutății moleculare nominale (NMWL) de 10 până la 30 kDa. Concentratul s-a depozitat pentru a aștepta separarea și purificarea toxinei pertussis (PT), hemaglutoninei filamentoase (FHA) și componentele de 69 kDa (pertactină).

Separarea componentelor bulionului

Componentele bulionului (69 kDa, PT și FHA) s-au separat și purificat prin cromatografie cu perlite și etape de eluare selective, în principal, cum s-a descris în brevetul EP 336736 și cererile PCT publicate WO 91/15505, descrise mai sus. Operațiunile de purificare specifice efectuate s-au descris mai jos.

Toxina pertussis (PT)

Coloana de perlită s-a spălat cu tampoane Tris 50 mM, Tris 50 mM /Triton X-100 0,5% și Tris 50 mM. Fracția PT s-a eluat din coloana de perlită cu tampon Tris 50 mM/NaCI 0,12 M.

Fracția PT de la cromatografia cu perlită s-a încărcat pe o coloană cu hidroxilapatită și apoi s-a spălat cu tampon fosfat de potasiu 30 mM. PT s-a eluat cu tampon fosfat de potasiu 75 mM /NaCI 225 mM. Coloana s-a spălat cu fosfat de potasiu 200 mM/NaCI 0,6M pentru a obține fracția FHA care s-a îndepărtat. S-a adăugat glicerol la PT purificată până la 50% și amestecul s-a depus la 2 până la 8°C până la detoxifiere într-o săptămână.

Hemaglutonina filamentoasă (FHA)

Fracția FHA s-a eluat din coloana de pertilă cu Tris 50 mM/0,6 NaCI. Hemaglutinină filamentoasă s-a purificat prin cromatografie pe hidroxilapatită. Fracția FHA din coloana de perlită s-a încărcat pe o coloană de hidroxilapatită, apoi s-a spălat cu fosfat de potasiu 30 mM conținând Triton X-100 0,5%, urmat de tampon fosfat de potasiu 30 mM. Fracția PT s-a eluat cu tampon fosfat de potasiu 85 mM și s-a îndepărtat. Fracția FHA s-a eluat apoi cu fosfat de potasiu 200 mM/NaCI 0,6 M și s-a depozitat la 2 până la 8°C până la detoxifiere într-o săptămână.

kDA (pertactina)

Concentratul de bulion s-a diluat cu apă pentru injecție (WFI), pentru a atinge o conductivitate de 3 până la 4 mS/cm și s-a încărcat pe o coloană de perlită, la o încărcare de 0,5 până la 3,5 mg proteină per ml perlită. Trecerea fără oprire (fracția component 69 kDa) s-a concentrat prin ultrafiltrare, folosind o membrană NMWL 10 până la 30 kDa. S-a adăugat sulfat de amoniu la concentratul trecut fără oprire până la 35 ± 3% (g/v) și amestecul rezultat s-a depozitat la 2 până la 8°C, timp de 4 ± 2 zile sau s-a centrifugat (7.000 x g) imediat. Supernatantul în exces s-a decantat și precipitatul s-a colectat prin centrifugare (7.000 x g). Peletul de 69 kDa fie s-a depozitat prin congelare la -20 până la -30°C, fie s-a dizolvat în Tris sau tampon fosfat și s-a utilizat imediat.

Proteina membranei exterioare de 69 kDa, obținută prin precipitarea sulfatului de amoniu 35% (g/v) a produsului trecut fără oprire prin perlită concentrată, s-a utilizat pentru purificare. La fracția 69 kDa s-a adăugat sulfat de amoniu (100 ± 5 g per litru) și amestecul s-a agitat pentru cel puțin 2 h, la 2 până la 8°C. Amestecul s-a centrifugat (7.000 x g) pentru

RO 120819 Β1 a recupera supernatantul. La supernatant s-a adăugat sulfat de amoniu (100 până la 150 g 1 per litru) și amestecul s-a agitat pentru cel puțin 2 h, la 2 până la 8’C. Amestecul s-a centrifugat (7.000 x g) pentru a recupera peletul, care s-a dizolvat în Tris 10 mM, HCI, pH 8. 3

Puterea ionică a soluției s-a ajustat la echivalentul a Tris 10 mM HCI (pH 8), conținând sulfat de amoniu 15 mM. 5

Proteina 69 kDa s-a aplicat la o coloană hidroxilapatită, conectată în tandem cu o coloană Q-Sepharose. Proteina 69 kDa s-a colectat la trecerea fără oprire, s-a spălat 7 abundent din coloane cu Tris 10 mM, HCI (pH 8), conținând sulfat de amoniu 15 mM și s-a unit cu proteina 69 kDa din trecere fără oprire. Proteina 69 kDa unită s-a diafiltrat cu 6 până 9 la 10 volume de fosfat de potasiu 10 mM (pH 8), conținând NaCI 0,15 M pe o membrană NMWL 100 până la 300 kDa. Ultrafiltratul s-a colectat și proteina 69 kDa, s-a concentrat în 11 ultrafiltrat.

Proteina 69 kDa s-a schimbat în solvent în Tris 10 mM HCI (pH 8) și s-a adsorbit pe 13 Q-Sepharose, s-a spălat cu Tris 10 mM HCI (pH 8)/sulfat de amoniu 5 mM. Proteina 69 kDa s-a eluat cu fosfat de potasiu 50 mM (pH 8). Proteina 69 kDa s-a diafiltrat cu 6 până la 10 15 volume fosfat de potasiu 10 mM (pH 8) conținând 0,15 M NaCI pe o membrană NMWL 10 până la 30 kDa. Proteina 69 kDa s-a filtrat steril printr-un filtru ^0,22 um. Acest volum steril 17 s-a depozitat la 2 până la 8’C și adsorbția s-a terminat în trei luni.

Aglutinogeni fimbriali 19

Aglutinogenii s-au purificat de la pasta de celule, urmând separarea de la bulion.

Pasta de celule s-a diluat până la o fracție 0,05 volum de celule într-un tampon conținând 21 fosfat de potasiu 10 mM, NaC1150 mM și uree 4M și s-a amestecat timp de 30 min. Uzatul de celule s-a limpezit prin centrifugare (12.000 x g) contra fosfat de potasiu 10 mM/NaC1150 23 mM/Triton X-100 0,1%, folosind un filtru membrană NMWL 100 până la 300 kDa.

Concentratul s-a tratat la cald la 80’C, timp de 30 min, apoi s-a relimpezit prin centri- 25 fugare (9.000 x g). S-a adăugat PEG 8000 la supernatantul limpezit până la o concentrație finală de 4,5 + 0,2% și s-a agitat blând pentru un minimum de 30 min. Precipitatul rezultat s-a 27 colectat prin centrifugare (17.000 x g) și peletul s-a extras cu tampon fosfat de potasiu 10 mM/NaCI 150 mM, pentru a asigura o soluție brută de aglutinogen fimbrial. Aglutinogenii 29 fimbriali s-au purificat prin trecere pe silica PEI. Soluția brută s-a adus la 100 mM în conformitate cu fosfat de potasiu, folosind tampon fosfat de potasiu 1 M și s-a trecut prin coloana 31 silica PEI.

Trecerea fără oprire din coloane s-a concentrat și diafiltrat contra tampon fosfat de 33 potasiu 10 mM/NaCI 150 mM, folosind un filtru membrană NMWL 100 până la 300 kDa.

Acest volum steril s-a depozitat la 2 până la 8°C și adsorbția s-a terminat în trei luni. Concen- 35 tratul aglutinogen fimbrial a conținut Agg 2 fimbrial și Agg 3 fimbrial într-un raport de greutate de aproximativ 1,5 până la aproximativ 2:1 și s-a găsit a fi substanțial liberă de Agg 1. 37

Exemplul 3. Acest exemplu descrie toxoizarea antigenilor Bordetella pertussis, PT și FHA purificați.39

PT preparat în forma pură, așa cum s-a descris în exemplul 2, s-a toxoizat prin ajustarea concentrației de glutaraldehidă în soluția PT până la 0,5 ± 0,1% și incubarea la41

37°C ± 3’0, timp de 4 h. Reacția s-a stopat prin adăugare de L-aspartat până la 0,21 ± 0,02 M. Amestecul s-a ținut la temperatura camerei timp de 1 ± 0,1 h și apoi la 2 până43 la 8°C, timp de 1 până la 7 zile.

Amestecul rezultat s-a diafiltrat contra tampon fosfat de potasiu 10 mM/NaCI 45 0,15 M/glicerol 5% pe un filtru de membrană NMWL 30 kDa și apoi s-a sterilizat prin trecerea printr-o membrană de filtru ^0,22 um. Acest volum steril s-a depozitat la 2 până la 8’C și 47 adsorpția s-a terminat în trei luni.

RO 120819 Β1

Fracția FHA, preparată în forma pură, cum s-a desris în exemplul 2, s-a toxoizat prin ajustarea concentrației L-lizinei și formaldehidei până la 47 ± 5 mM și respectiv 0,23 ± 0,05% și incubarea la 35 până la 38’C, timp de 6 săptămâni. Apoi, amestecul s-a diafiltrat contra fosfat de potasiu 10 mM/NaCI 0,5 M, folosind o membrană de filtru MNWL 30 kDa și s-a sterilizat prin trecerea printr-un filtru cu membrană. Acest volum steril s-a depozitat la 2 până la 8°C și adsorbția s-a terminat în trei luni.

Exemplul 4. Acest exemplu descrie adsorpția antigenilor Bordetella pertussis purificat.

Pentru adsorbția individuală a PT, FHA, Agg și 69 kDa pe fosfat de aluminiu (alaun), s-a preparat o soluție stoc de fosfat de aluminiu până la o concentrație de 18,75 ± 1 mg/ml. S-a preparat un recipient corespunzător și oricare dintre antigeni s-a distribuit aseptic în recipient. S-a adăugat aseptic 2-fenoxietanol pentru a rezulta o concentrație finală de 0,6 ± 0,1% v/v și s-a agitat până la omogenizare. Volumul corespunzător de fosfat de aluminiu s-a adăugat aseptic în recipient. Un volum corespunzător de apă distilată sterilă s-a adăugat pentru a atinge concentrația finală până la 3 mg fosfat de aluminiu/ml. Containerele s-au etanșat și marcat și s-au lăsat să stea la temperatura camerei timp de 4 zile. Recipientul s-a depozitat apoi, așteptând formularea finală.

Exemplul 5. Acest exemplu descrie formularea unui vaccin cu component pertussis combinat cu toxoizi difteric și tetanic.

Antigenii B. pertussis preparați cum s-a descris în exemplele precedente s-au formulat cu toxoizi difteric și tetanic, pentru a asigura câteva vaccinuri cu componenta pertussis (CP) cum s-a descris mai jos.

Componente pertussis s-au produs de la Bordetella pertussis crescut în cultură submersă, cum s-a descris în detaliu în exemplele 1 până la 4 de mai sus. După terminarea creșterii, bulionul de cultură și celulele bacteriene s-au separat prin centrifugare. Fiecare antigen s-a purificat individual. Toxina pertussis (PT) și hemaglutinina filamentoasă (FHA) s-au purificat din bulion prin cromatografie secvențială pe perlită și hidroxilapatită. PT s-a detoxifiat cu glutaraldehidă și orice PT rezidual (aproximativ 1%) prezent în fracția FHA s-a detoxifiat cu formaldehidă. S-au preparat aglutinogeni fimbriali (2+3) (AGG) de la celule bacteriene. Celulele s-au spart cu uree și s-au tratat la cald și aglutinogenii fimbriali s-au purificat prin precipitare cu polietilenglicol și cromatografie pe polietilenimină silica. Componentul proteină 69 kDa (pertactină) s-a izolat din trecerea fără oprire din etapa de cromatografie pe perlită (exemplul 2) prin precipitare cu sulfat de amoniu și s-a purificat prin cromatografie secvențială pe hidroxilapatită și Q-sepharose. Toate componentele s-au sterilizat prin filtrare printr-un filtru cu membrană 0,22 um.

Toxoidul difteric s-a preparat din Corynebacterium diphteriae crescut în cultură submersă prin metode standard. Producerea toxoidului difteric s-a divizat în cinci etape, numite menținerea sporilor de lucru, creșterea Corynebacterium diphteriae, recoltarea toxinei difterice, detoxifierea toxinei difterice și concentrarea toxoidului difteric.

Prepararea toxoidului difteric (I) Sporii de lucru

Tulpina de Corynebacterium diphteriae s-a menținut ca un lot de spori liofilizat. Sporii reconstituiți s-au crescut pe pante Loeffler, timp de 18 până la 24 h, la 35°C ± 2°C și apoi s-a transferat la baloane cu mediu difteric. Apoi, cultura s-a testat pentru puritate și conținut Lf. Sporii rămași s-au folosit pentru a inocula un fermentator.

RO 120819 Β1 (II) Creșterea Corynebacterium diphteriae 1

Cultura s-a inoculat la 35*C ± 2’C și s-a agitatîn fermentator. Cantități predeterminate de sulfat feros, clorură de calciu și soluții fosfat s-au adăugat la cultură. Cantitățile reale ale 3 fiecărei soluții (fosfat, sulfat feros, clorură de calciu) s-au determinat experimental pentru fiecare lot de mediu. Nivelurile alese sunt cele care au dat conținutul Lf cel mai ridicat. La 5 sfârșitul ciclului de creștere (30 până la 50 h), culturile s-au comparat pentru puritate și conținut Lf. 7 pH-ul s-a ajustat cu bicarbonat de sodiu și cultura s-a inactivat cu toluen 0,4%, timp de 1 h, la o temperatură menținută la 35’C ± 2’C. Un test steril s-a realizat apoi pentru a 9 confirma absența C. diphtheriae vii.

(III) Recoltarea toxinei difterice 11

Culturile tratate cu toluen, din unul sau mai multe fermentatoare, s-au unificat într-un tanc mare. S-au adăugat aproximativ 0,12% bicarbonat de sodiu, 0,25% cărbune și 23% 13 sulfat de amoniu și s-a testat pH-ul.

Amestecul s-a agitat pentru aproximativ 30 min. S-a adăugat pământ de diatomee și 15 amestecul s-a pompat într-un filtru adânc. Filtratul s-a recirculat până s-a limpezit, apoi s-a colectat și s-a comparat pentru testarea conținutului Lf. La filtrat s-a adăugat suplimentar 17 sulfat de amoniu, pentru a găsi o concentrație de 40%. De asemenea, s-a adăugat pământ de diatomee. Acest amestec s-a menținut timp de 3 până la 4 zile, la 2 până la 8’C, pentru 19 a permite precipitatului să se stabilizeze. Toxina precipitată s-a îndepărtat și s-a dizolvat în soluție salină 0,9%. Pământul de diatomee s-a îndepărtat prin filtrare și toxina s-a dializat 21 contra soluție salină 0,9% pentru a îndepărta sulfatul de amoniu. Toxina dializată s-a colectat și s-a comparat pentru conținutul Lf și testarea purității. 23 (IV) Detoxifierea toxinei difterice

Detoxifierea a avut loc imediat după dializă. Pentru detoxifiere, toxina s-a diluat astfel25 încât soluția finală a conținut:

a) toxină difterică la 1000 ± 10% Lf/ml;27

b) bicarbonat de sodiu 0,5%;

c) formalină 0,5%;29

d) monoclorhidrat de L-lizină 0,9% g/v.

Soluția s-a adus la volum cu soluție salină și pH-ul s-a ajustat la 7,6 ± 0,1.31

Toxoidul s-a filtrat prin pat de filtrare din celuloză, pământ de diatomee și/sau un prefiltru cu membrană și filtru cu membrană 0,2 pm în recipientul de colectare și s-a incubat 33 timp de 5 până la 7 săptămâni la 34’C. S-a extras o probă pentru testarea toxicității.

(V) Concentrarea toxoidului purificat35

Toxoizii s-au colectat, apoi s-au concentrat prin ultrafiltrare și s-au colectat într-un container corespunzător. S-au luat probe, pentru conținutul Lf și testarea purității. S-a adău- 37 gat conservant (2-fenoxietanol) pentru a da o concentrație finală de 0,375% și pH-ul s-a ajustat la 6,6 până la 7,6. 39

Toxoidul s-a sterilizat prin filtrare printr-un prefiltru și un filtru cu membrană 0,2 um (sau echivalent) și s-a colectat. Toxoidul steril s-a testat apoi pentru ireversibilitatea conți- 41 nutului Lf toxoid, conținutul de conservant, testarea purității (conținutul de azot), sterilității și toxicității. Toxoidul steril concentrat s-a depozitat la 2 până la 8’C până la formularea finală. 43

Prepararea toxoidului tetanic

Toxoidul-tetanic (T) s-a preparat de la Clostridium tetani crescut în cultură submersă. 45 Producția de toxoid tetanic poate fi divizat în cinci etape, numite menținerea sporilor de lucru, creșterea de Clostridium tetani, recoltarea toxinei tetanic, detoxifierea toxinei tetanic 47 și purificarea toxidului tetanic.

RO 120819 Β1 (I) Sporii de lucru

Tulpina de Clostridium tetani utilizată în producerea toxinei tetanice pentru conversia la toxoid tetanic s-a menținut în formă liofilizată într-un lot de spori. Sporii s-au inoculat în mediu tioglicolat și s-a lăsat să crească pentru aproximativ 24 h, la 35°C ± 2’C. S-a luat o probă pentru testarea purității culturii.

(II) Creșterea de Clostridium tetani

Mediul tetanic s-a distribuit într-un fermentator, s-a tratat la cald și s-a răcit. Apoi, fermentatorul s-a însămânțat și cultura s-a lăsat să crească timp de 4 până la 9 zile, la 34”C ± 2°C. S-a luat o probă pentru testarea purității culturii și conținutului Lf.

(III) Recoltarea toxinei tetanice

Toxina s-a separat prin filtrare prin pat celuloză pământ de diatomee și toxina limpede s-a sterilizat prin filtrare, folosind filtre cu membrană. S-au luat probe pentru testarea conținutului Lf sterilității. Toxina s-a concentrat prin ultrafiltrare, folosind o mărime de por de 30.000 daltoni.

(IV) Detoxifierea toxinei tetanice

Toxina s-a comparat pentru testarea conținutului Lf înainte de dotoxifiere. Toxina concentrată (475 la 525 Lf/ml) s-a detoxifiat prin adiție de bicarbonat de sodiu 0,5% g/v, formalină 0,3% v/v și monoclorhidrat de L-lizină 0,9% g/v și s-a adus la volum cu soluție salină. S-a ajustat pH-ul până la 7,5 ±0,1 și amestecul s-a incubat la 37”C, timp de 20 până la 30 zile. S-au luat probe pentru testarea sterilității și toxicității.

(V) Purificarea toxoidului

Toxoidul concentrat s-a sterilizat prin prefiltre, urmat prin filtre cu membrană 0,2 um. S-au luat probe pentru testarea sterilității și conținutului Lf.

Concentrația optimă a sulfatului de amoniu s-a bazat pe o curbă de fracționare S determinată pentru probe de toxoid. Prima concentrație s-a adăugat la toxoid (diluat la 1900-2100 Lf/ml). Amestecul s-a păstrat timp de cel puțin 1 h, la 20 până la 25’C și supernatantul s-a colectat și precipitatul conținând fracția greutate moleculară ridicată s-a îndepărtat.

A doua concentrație a sulfatului de amoniu s-a adăugat la supernatant pentru a doua fracționare pentru a îndepărta impuritățile cu greutate moleculară scăzută. Amestecul s-a păstrat timp de cel puțin 2 h, la 20 până la 25°C, și apoi a putut fi păstrat la 2 până la 8°C, timp de maximum trei zile. Precipitatul care reprezintă toxoidul purificat s-a colectat prin centrifugare și filtrare.

S-a îndepărtat sulfatul de amoniu din toxoid, purificat prin diafiltrare, folosind membrane de ultrafiltrare Amicon (sau echivalent) cu PBS până când nu s-a mai putut detecta sulfat de amoniu în diluția de toxoid. S-a ajustat pH-ul la 6,6 până la 7,6 și s-a adăugat 2-fenoxietanol pentru a da o concentrație finală de 0,375%. Toxoidul s-a sterilizat prin filtrare cu membrană și s-au luat probe pentru testare (ireversibilitatea toxoidului, conținut Lf, pH, conținut de conservant, puritate, sterilitate și toxicitate).

Formularea vaccinului multivalent

O formulare a unui vaccin cu component pertussis combinat cu toxoizi difteric și tetanic s-a denumit CP_10/10/5/3DT (denumit uneori CLASSIC). Fiecare doză umană de 0,5 ml CP10/10/5/3DT s-a formulat pentru a conține:

pg toxoid pertussis (PT), pg hemaglutonină filamentoasă (FHA), pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIMB), pg proteină membrană exterioară 69 kDa,

RO 120819 Β1

Lf toxoid difteric,1

Lf toxoid tetanic,

1,5 mg fosfat de aluminiu,

0,6% 2-fenoxietanol drept conservant.5

Altă formulare a vaccinului cu component pertussis combinat cu toxoizi difteric și tetanic s-a numit CP_10/5/5DT (denumit uneori HYBRID). Fiecare doză umană de 0,5 ml 7 CP_10/5/5DT s-a formulat pentru a conține:

pg toxoid pertussis (PT),9

5 pg hemaglutonină filamentoasă (FHA), 5 pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIMB),	11
15 Lf toxoid difteric, 5 Lf toxoid tetanic,	13 15
1,5 mg fosfat de aluminiu, 0,6% 2-fenoxietanol drept conservant. Altă formulare a vaccinului cu component pertussis combinat cu toxoizi difteric și tetanic s-a denumit CP20/20/5/3DT. Fiecare doză umană de 0,5 ml CP20/20/5/3DT s-a formulat pentru a conține:	17 19
20 pg toxoid pertussis (PT), 20 pg hemaglutonină filamentoasă (FHA), 5 pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIMB), 3 pg proteină membrană exterioară 69 kDa,	21 23 25
15 Lf toxoid difteric, 5 Lf toxoid tetanic,	27
1,5 mg fosfat de aluminiu, 0,6% 2-fenoxietanol drept conservant. O formulare suplimentară a unui vaccin cu component pertussis combinat cu toxoizi	29 31

difteric și tetanic s-a denumit CP_20/10/10/6DT. Fiecare doză umană de 0,5 ml CP_20/10/10/6DT s-a

formulat pentru a conține:	33
20 pg toxoid pertussis (PT), 10 pg hemaglutonină filamentoasă (FHA), 10 pg aglutinogeni fimbriali 2 și 3 (FIMB), 6 pg proteină membrană exterioară 69 kDa,	35 37
15 Lf toxoid difteric, 5 Lf toxoid tetanic,	39 41
1,5 mg fosfat de aluminiu. 0,6% 2-fenoxietanol drept conservant. Exemplul 6. Acest exemplu descrie aprecierea clinică a vaccinurilor component pertussis acelular. (a) Studii la adulți Studiile la adulți și copii în vârstă de 16 până la 20 luni au arătat vaccinuri multicomponent, care conțin aglutinogeni fimbriali, a fi sigure și imunogenice (tabelul 2).	43 45 47

RO 120819 Β1

Un studiu clinic faza I s-a realizat la copii în vârstă de 17 și 18 luni în Calgary, Alberta, cu cinci vaccinuri cu component pertussis (CP_10/5/5/3DT) și s-a raportat reacția adversă. Au primit vaccinul 33 copiii și suplimentar 35 au primit același vaccin fără component proteină 69 kDa.

Reacțiile locale au fost rare. Reacțiile sistemice adverse, constând inițial în iritabilitate, au fost prezente la aproximativ jumătate dintre participanții la studiu, indiferent ce vaccin au primit. Creșteri semnificative de anticorp s-au măsurat pentru anti-PT, anti FHA, aglutinogeni anti-fimbriali și anticorpi IgG anti-69kDa prin imunotestul de enzimă și anticorpi anti-PT în testul de neutralizare a celulelor CHO. Nu s-a detectat nicio diferență în răspunsul anticorp, la copiii care au primit component patru (CP_10/5/5DT) sau 5 componente (CP_10/5/5/3DT), excepție la anticorpul anti-69 kDa. Copiii care au primit vaccinul cu 5 componente, conținând proteina 69 kDa, au avut un nivel al anticorpilor anti-69 kDa semnificativ mai ridicat.

Un studiu doză-răspuns s-a reluat cu vaccinul cu 4 componente în Winnipeg, Manitoba, Canada. S-au folosit două formulări vaccin cu componente: CP_10/10/5/3DT și CP_20/10/10/6DT. Un vaccin DPT cu celulă întreagă s-a inclus de asemenea ca un control.

Acest studiu a fost un studiu dublu-orb, la 91 copii în vârstă de 17 până la 18 luni la timpul dozei lor pertussis rapel. Atât CP_10/10/5/3DT, cât și CP_20/10/10/6DT au fost bine tolerate de acești copii. Nu s-a demonstrat nicio diferență la numărul de copii care au avut vreo reacție locală, sau reacții sistemice după fiecare dintre vaccinurile component. în contrast, semnificativ, mai mulți copii care au primit vaccinul cu celulă întreagă au avut reacții locale și sistemice, decât cei care au primit vaccinuri cu component CP_20/10/10/6DT.

Studii la copii

Faza II

S-a realizat un studiu, folosind vaccin CP_10/10/5/3DT în Calgary, Alberta și Columbia Britanică, Canada. în acest studiu, 432 copii, în vârstă de 2, 4 și 6 luni, au primit vaccinul cu componentă pertussis sau vaccinul DPT control cu celulă întreagă. Vaccinul CP_10/10/5/3DT a fost bine tolerat de către acești copii. Reacțiile locale au fost puțin obișnuite cu vaccinul cu componentă decât la vaccinul cu celulă întreagă după fiecare doză.

Un răspuns anticorp semnificativ la toți antigenii s-a demonstrat după vaccinare cu vaccinul cu componentă pertussis. Primitorii vaccinului cu celulă întreagă au avut un răspuns anticorp puternic la aglutinogeni fimbriali, D și T. La șapte luni, 82 până la 89% dintre primitorii de vaccin cu componentă și 92% dintre primitorii vaccin cu celulă întreagă au avut o creștere de 4 ori sau mai mare în titrul anticorp la aglutinogeni fimbriali, în contrast, răspunsul anticorp la FHA a fost 75 până la 78% în vaccinuri cu componentă, comparativ cu 31 % dintre primitori celulă întreagă. O creștere de 4 ori la anticorp anti-69 kDa s-a observat și 90 până la 93% dintre primitorii vaccinurilor cu componentă; și 75% dintre primitorii cu celulă întreagă. O creștere de 4 ori la anticorp împotriva PT prin imunotest enzimă s-a observat la 40 până la 49% dintre vaccinurile cu component și 32% dintre vaccinurile cu celulă întreagă; o creștere de 4 ori la anticorp PT prin neutralizarea CHO s-a găsit la 55 până la 69% dintre vaccinurile cu component și 6% dintre vaccinurile cu celulă-întreagă (tabelul 2).

Faza IIB

Vaccinurile CP_20/20/5/3DT și CP_10/10/5/3DT apreciat într-un studiu randomizat orb comparativ cu un control D₁₅PT cu un conținut difteric mai scăzut al 15 Lf comparativ cu o formulare 25 Lf la 100 copii la vârsta de 2, 4 și 6 luni. Nu s-au detectat diferențe în vitezele reacțiilor adverse între cele două formulări componente; ambele au fost mai puțin reactogenice decât controlul cu celulă întreagă. Titruri anticorp mai ridicate împotriva PT prin imunotest enzimă și neutralizare CHO și FHA au fost obținute la primitori ai vaccinului ΟΡ_20/2ο/5/3θΤ ^cu conținut antigen ridicat. La 7 luni, titrul mediu geometric anti-FHA a fost 95,0 la primitori CP₂o/2_O/_5/3DT, 45,2 la primitori CP_10/10/5/3DT au fost numai 8,9 la primitori D15PT. Titrurile anti-PT au fost 133,3, 58,4 și 10,4 prin imunotest și 82,4, 32,7 și 4,0 respectiv, prin neutralizarea CHO (tabelul 2).

RO 120819 Β1

Acest studiu a demonstrat că vaccinul cu component pertussis combinat cu toxoizi1 difteric și tetanic a adsorbit cu creșterea conținutului de antigen, a fost sigur și imunogen la copii și că conținutul antigen crescut a sporit răspunsul imun la antigenii preparați (PT și3

FHA) fără o creștere în reactogenicitate.

NIAID II faze, test comparativ SUA5

Un studiu în două faze s-a realizat în Statele Unite sub auspiciile Institutului Național al Bolilor Infecțioase și Alergie (NIAID) ca o acțiune premergătoare la o experiență eficientă7 la scară mare a vaccinurilor acelulare pertussis. Un vaccin cu component pertussis al invenției în combinație cu toxoizi difteric și tetanic adsorbit (CP_10/5/5/3DT) a fost inclus în acest 9 test împreună cu alte 12 vaccinuri acelulare și 2 vaccinuri cu celulă întreagă. Rezultate de siguranță s-au raportat asupra a 137 copii imunizați la vârsta de 2, 4 și 6 luni, cu vaccinul 11 component CP_10/10/5/3DT.

Așa cum s-a observat în studiile anterioare, vaccinul cu component s-a găsit a fi sigur, 13 cu reactogenicitate scăzută și a fi bine tolerat prin vaccinuri.

La 7 luni, anticorp anti-PT, anticorp anti-FHA, anticorp anti-69kDa și anticorp aglutino- 15 geni antifimbriali au fost toți mai ridicați decât, sau echivalenți cu nivelurile atinse după vaccinuri cu celulă întreagă (tabelul 2). Un studiu dublu orb s-a realizat cu copii care au fost 17 distribuiți randomic pentru a primi fie formulare vaccin CP_20/20/5/3DT, fie formulare vaccin CP10/10/5/3DT. Un total de 2050 copii s-au înregistrat în Statele Unite și Canada; 1961 copii au 19 terminat studiul. Ambele formulări de vaccin au fost sigure, cu reactogenicitate scăzută și imunogenice la acești copii. Imunogenicitatea s-a evaluat la un subgrup de 292. O creștere 21 de anticorpi s-a provocat la toți antigenii conținuți în vaccin prin ambele formulări de vaccin. Formularea CP_20/20/5/3DT a indus titruri mai ridicate de anticorpi împotriva FHA, dar nu PT. 23 Formularea CP_10/10/5/3DT provoacă titruri mai ridicate împotriva fimbrie și titruri mai ridicate aglutinogen. 25

Un studiu suplimentar pentru siguranță și imunogenicitate s-a realizat în Franța. Schema studiului a fost similară studiului din America de Nord, descris mai sus, cu excepția 27 că vaccinurile s-au administrat la vârsta de 2, 3 și 4 luni. Reacții locale și sistemice au fost în general minore. Pe ansamblu a fost bine acceptat de către participanții la studiul francez 29 folosind acest regim de administrare.

Test de eficiență a două vaccinuri acelulare pertussis și un vaccin cu celulă 31 întreagă ia 10.000 copii, controlat placebo

Urmând rezultatele testului comparativ NIAID II faze SUA, s-au selectat un vaccin 33 acelular cu două componente și un vaccin acelular cu cinci componente pentru un test eficient multicentru, controlat, dublu randomizat, controlat placebo. Testul clinic s-a realizat 35 în Suedia, unde există o incidență ridicată a pertussis. Vaccinul cu două componente a conținut gliceraldehidă și formalină inactivată (25 pg), FHA tratată formalină (25 pg) și toxoid 37 diteria 17 Lf și toxoid tetanic 10 Lf. Vaccinul pertussis cu cinci componente a fost CP_10/10/5;3DT. Pentru test, zece mii de copii, reprezentând aproximativ o jumătate dintre copiii 39 acestui grup de vârstă din Suedia, s-au recrutat în 14 așa numite studii definite geografic, prin folosirea registrului de nașteri. 41

Copiii născuți între ianuarie și februarie 1992 s-au randomizat într-un test în 3 direcții. După consințământul părintesc, două treimi dintre copii au primit unul dintre cele două 43 preparări pertussis difteric-tetanic-acelulare la vârsta de 2,4 și 6 luni. Grupul de control a primit numai DT. în mai 1992, un vaccin DPT cu celulă întreagă, disponibil comercial, autorizat 45 SUA, s-a introdus și copiii născuți din martie până în decembrie 1992 au randomizat într-un test în patru direcții. După consimțământul părintesc, trei sferturi dintre copii au primit unul 47 dintre cele trei preparări DTP la vârsta de 2, 4 și 6 luni. Grupul de control a primit numai DT.

RO 120819 Β1

Fiecare vaccin s-a administrat la aproximativ 2.500 copii. Vaccinurile s-au administrat în trei doze. Prima doză s-a dat la vârsta de 2 luni și nu mai târziu de vârsta de 3 luni. Doze succesive s-au primit cu intervale de 8 săptămâni. Vaccinurile s-au primit prin injecție intramusculară.

Copiii și familiile lor s-au urmărit timp de 30 luni. Dacă au fost suspecți pertussis, datele clinice s-au colectat și verificarea de laborator s-a cercetat prin diagnosticul aspiratelor nazale, prin cultura bacteriologică și reacția polimerazică de lanț (PCR). Pentru diagnostic serologic, s-au colectat probe de sânge în fazele acută și convalescentă.

înainte de acest studiu, nu s-a cunoscut extinderea pertactinei accesibilă prin vaccinuri cu component pertussis ale prezentei invenții la o populație umană cu risc (în special, nou-născuți). în particular, nu s-a cunoscut contribuția diferitelor componente Bordetella și prezența lor în vaccinuri pertussis în cantități selectate relativ la eficacitatea vaccinurilor.

Principala țintă a testului a fost estimarea capacității vaccinurilor acelulare pertussis și a vaccinului cu celulă întreagă de a proteja împotriva pertussis tipic comparativ ca placebo.

Țelul secundar a fost explorarea eficacității vaccinului împotriva infecției pertussis confirmată, cu gravitate variată.

Eficacitatea vaccinului s-a definit ca reducerea la sută în probabilitatea de a contracta pertussis printre primitorii de vaccin relativ la copiii nevaccinați.

Probabilitatea la pertussis contractat, numită de asemenea viteză de atac, poate fi estimată pe căi diferite. în calculele dimensiunii probei, probabilitatea de a contracta pertussis, într-un grup de studiu dat, s-a estimat prin coeficientul dintre numărul copiilor cu pertussis și copiii rămași în grupul de studiu la terminarea studiului următor.

Eficiența vaccinului component CP_10/10/5/3DTîn acest test, în prevenirea pertussis tipic, este arătată în tabelul 4 și a avut aproximativ 85%. în același test, un vaccin acelular pertussis cu două componente conținând numai PT și FHA a avut aproximativ 58% eficacitate și un vaccin cu celulă întreagă a avut 48% eficacitate. De asemenea, CP_10/10/5/3DT a avut eficiență în prevenirea ușoară a pertussis, la o eficiență estimată de aproximativ 77%.

Exemplul 7. Acest exemplu descrie formularea și imunogenicitatea vaccinului combinat multivalent, conținând o polizaharidă capsulară de Haemophilus influenzae.

(a) Prepararea componentului PRP-T

Polizaharida capsulară (PRP) de la H. influezae s-a purificat și s-a conjugat la toxoid tetanic în modul următor. S-au realizat trei preculturi succesive de la fiole liofilizate ale lotului cu spori de lucru ale H. influezae. Prima precultură a fost pe mediu solid. Fiolele s-au inoculat pe discuri de cărbune agar + sânge fierbinte (10% sânge de cal încălzit timp de 15 min la 80°C) și s-au incubat timp de 20 ± 4 h, la 36 până la 37°C sub CO₂. A doua precultură a fost în mediu lichid, timp de 8 h, la 37°C. Mediul lichid a avut următoarea compoziție per litru:

1.

Acizi-casamino Difco ........................................... 10g;

Fosfat monosodic 2H₂O........................................2,03g;

Fosfat disodic 12H₂O.........................................31,14g;

Lactat de sodiu (soluție 60%).................................... 1,5 ml;

L-cistină ....................................................0,07g;

L-triptofani ..................................................0,02g;

CaCI₂, 2H₂O.................................................0,02g;

Acizi-casamino Difco ........................................... 10g;

(NH₄)₂SO₄..................................................... 1g;

MgSO₄, 7H₂O.................................................0,4g;

Antispumă Dow Corning M.S.A la 25% în ulei de parafină 0,15.

RO 120819 Β1

2. Ultrafiltrarea heminei + dextrozei la proporția de 20 g dextroză și 1 mg hemină.1

Această soluție s-a suplimentat cu 5 mg nicotinamidă - adenin dinucleotidă.

Filtru sterilizat3

3. Extract de drojdie Difco 5 g.

Filtru sterilizat5

A treia precultură a fost în mediu lichid cu agitare timp de 4 h la 37”C. A treia precultură s-a folosit pentru a inocula fermentatorul și cultura s-a menținut cu agitare, la 37°C,7 timp de 12 până la 14 h. Cultura s-a colectat într-un tanc refrigerat. S-a adăugat formalină la o concentrație de 10 ml/l. Cultura s-a menținut, cu agitare blândă, la +4°C, timp de 2...249 h și apoi s-a centrifugat. Formalina adăugată nu a avut intenția să inactiveze complet bacteria, ci să oprească creșterea și să inhibe metabolismul. Această adiție a redus liza 11 celulelor cu contaminare ulterioară cu componente intracelulare. Durata acestei fixații a fost între 2 și 24 h și în mod tipic cultura s-a lăsat peste noapte înainte de a fi centrifugată. 13 Supernatantul conținând polizaharida s-a recoltat și peletul bacterian s-a îndepărtat. Procedeul de purificare s-a realizat în general într-o cameră rece sau în condiții astfel încât 15 temperatura produselor și reactivilor este mai mică decât sau egală cu +10°C, cu excepție pentru etapa de purificare cu fenol, care s-a realizat la temperatura camerei. După centrifuga- 17 rea culturii, supernatantul culturii s-a concentrat. Polizaharida capsulară s-a precipitat din concentratul rezultat prin adiție de centrimidă, pentru a da o concentrație finală de 5% G/V. 19 Centrimidă a precipitat PS din fluidul concentrat (SNF). De asemenea, o parte din proteină, acid nucleic și lipopolizaharida (LPS) au coprecipitat. Precipitatele s-au colectat prin cen- 21 trifugare, lăsând alți câțiva contaminanți și proteina în SNF. Peletul rezultat s-a colectat prin centrifugare și s-a depozitat la x -20’C. 23

Peletele s-au resuspendat în soluția 0,3 M NaCI și suspensia s-a centrifugat din nou.

NaCI a disociat selectiv complexele polizaharidă centrimidă. Unii contaminanți (acid nucelic, 25 LPS, proteina) au disociat de asemenea în procedeu. La supernatantul prerăcit s-a adăugat etanol absolut până la o concentrație finală de 60%. Precipitatul care rezultă s-a colectat prin 27 centrifugare și s-a spălat cu etanol absolut rece. Precipitatul s-a uscat sub vid la O...4°C și a fost produsul intermediar. Produsul intermediar s-a dizolvat în tampon acetat de sodiu și 29 cu fenol la temperatura camerei. Faza apoasă s-a colectat prin centrifugare continuă.

Extracția cu fenol și centrifugarea pot fi repetate de câteva ori și faza apoasă s-a dializat și 31 diafiltrat. Polizaharidele capsulare din soluția diafiltrată s-au precipitat prin adiție de etanol prerăcit până la o concentrație finală de 60% în prezența NaCI 0,3 M. Precipitatul s-a colectat 33 prin centrifugare, s-a spălat cu etanol absolut prerăcit, acetonă și eter, și s-a uscat sub vid la 4°C. Precipitatul uscat s-a măcinat apoi până la o pulbere fină sub umiditate scăzută și 35 acest produs constituie polizaharidă purificată Haemophilus înfluenzae tip b.

Polizaharida purificată s-a dizolvat în apă cu scopul de a obține 5 mg polizaharidă per 37 ml soluție și pH-ul s-a ajustat până la 10,8 ± 0,2 cu NaOH. S-a adăugat bromură de cian ca o soluție în apă în proporții de 0,5 mg CNBr/mg polizaharidă. pH-ul amestecului de reacție 39 s-a menținut cu NaOH la 10,8 ± 0,2, timp de 35 până la 40 min, la 23°C ± 3^0. S-a scăzut pH-ul până la pH 9 prin adiție de HCI. S-a adăugat acid adipic dihidrazină pentru a da o41 concentrație finală de 3,5 mg ADH/mg polizaharidă și pH-ul s-a ajustat până la 8,5. Amestecul de reacție s-a incubat la 23°C ± 3°C, timp de 15 min (pH menținut la 8,5) și apoi43 soluția s-a incubat peste noapte la + 4°C, cu agitare blândă. Amestecul de reacție s-a dializat contra soluție de NaCI și apoi s-a concentrat. Soluția s-a filtrat apoi printr-un filtru 0,45 μ și 45 s-a înghețat la < -40°C. Aceasta constituie polizaharida-AH și s-a depozitat la o temperatură

-40°C.47

RO 120819 Β1

Pentru a produce componenta toxină tetanic, o tulpină de Clostridium tetani s-a incubat într-o serie de tuburi conținând 10 ml mediu Rosenow sau mediu tioglicolat. Mediul Rosenow are următoarea compoziție:

Formula (în grame per litru de apă distilată)

Peptonă 10;

Extract de carne3;

Glucoză 2;

Clorură de sodiu5;

Indicator Andrade (acid Fuchsin 5%) .............................10 ml;

Marmură albă.............................................. 1 bucată;

Creier.................................................... 1 bucată.

Mediul, preparat imediat înainte de utilizare din produse gata de folosire, s-a filtrat în tuburi și s-a sterilizat la 120°C, timp de 20 min.

O sticlă de 5 I, conținând 3 I mediu Massachusetts, s-a inoculat cu C. tetani și s-a incubat timp de 16 până la 18 h, la 35°C ± 1°C, timp de 16 h. Conținuturile s-au transferat apoi la o sticlă de 201, conținând 151 mediu steril Massachusetts și s-a incubat 8 h, la 35”C ± 1 °C. Fiecare sticlă s-a folosit pentru a inocula un fermentator care conține 582 I mediu Massachusetts și s-a incubat la 35°C, timp de 5 până la 6 zile, cu aerare. Fermentările s-au răcit și la cultură s-au adăugat 12 kg clorură de sodiu, 8 kg citrat de trisodiu. Scuturarea s-a menținut timp de o zi, apoi s-a stopat și acest procedeu a permis extracția toxinei reziduale din bacterie, la sfârșitul culturii. Toxina s-a limpezit fie prin filtrare, fie prin trecerea printr-o centrifugă continuă.

Supernatantul de la 12001 cultură s-a concentrat prin ultrafiltrare și toxina concentrată diafiltrată contra fosfat disodic 0,07 M soluție pH 8,2. Volumul final s-a ajustat la 500 Lf/m.

S-a realizat o precipitare dublă cu sulfat de amoniu pentru a obține toxina tetanică purificată. Astfel, sulfat de amoniu și 10 g cărbune s-au adăugat blând per litru de toxină diafiltrată, obținută anterior. După 16 până la 24 h incubare la +4°C, toxina s-a filtrat pe cartuș pentru a elimina precipitatul. Apoi, o cantitate de sulfat de amoniu, suficientă pentru a face 320 g/l, s-a adăugat încet per litru de supernatant obținut anterior. După aproximativ 48 h la +4°C, peletul s-a colectat prin centrifugare și s-a dizolvat într-o soluție fosfat disodic 0,05M, pH 8,2. Soluția s-a diafiltrat contra soluție fosfat disodic 0.0-5M, pH 8,2 și s-a ajustat până la 300 Lf/ml. Apoi, soluția s-a sterilizat prin filtrare. S-au adăugat 7,5 μ moli (0,225%) formaldehidă per ml soluție toxină. Detoxifierea s-a realizat după incubare timp de 24 h la 37°C, incluzând perioade intermediare la +4 și +22°C. Sterilizarea prin filtrare (0,22 μ) s-a realizat pentru a obține toxoidul tetanic. Toxoidul tetanic s-a dializat și concentrat contra NaCI, folosind o membrană având o limită a greutății moleculare 50.000. Proteina concentrată s-a filtrat apoi aseptic și s-a depozitat la +4°C.

Cantități egale de polizaharidă-AH și toxoid tetanic (± 20%) s-au amestecat cu NaCI 0,05 M, pentru a da o concentrație de 7,5 mg polizaharidă per ml. S-a ajustat pH-ul soluției până la pH 5,7+0,2 cu HCI și s-a adăugat 1 -etil-3-(3-dimetil aminopropiljcarbodiimidă (EDAC) pentru a da o concentrație finală de 19,17 mg EDAC/ml amestec de reacție. Grupările carboxil ale proteinei tetanic se activează prin legare la EDAC. în condițiile acide slabe ale reacției, a urmat o reacție de condensare în care AH-PS și proteina tetanos activată cu EDAC devine legătură covalentă. Amestecul s-a incubat la pH constant (5,7), timp de 60 min la +4°C și apoi pH-ul s-a ajustat la pH 6,9 ± 0,2 cu NaOH și amestecul de reacție a dializat contra NaCI la +4°C. Conjugatul s-a purificat prin centrifugare zonală pe un gradient de

RO 120819 Β1 sucroză (4 până la 60%) pentru a elimina EDAC, a elibera polizaharidă-AH, a elibera proteină tetanică și conjugat cu greutate moleculară scăzută. La fracția care conține conjugatul polizaharidă, s-a adăugat apoi apă fără sulf, sucroză, tampon Tris-HCI pentru a obține o soluție conjugat cu următoarea compoziție:

sucroză............................................8,5% G/V ± 0,5%;

polizaharidă concentrată...........................aproximativ 200 pg/ml;

tampon Tris-HCI ................................... 10 mM pH 7,0 ±0,5.

Apoi, soluția s-a filtrat aseptic, folosind un filtru 0,2 u și s-a depozitat la -40°C. Volumul de conjugat polizaharidă Haemophilus influenzae tip b s-a diluat în condiții sterile cu diluant cu scopul de a obține compoziția finală:

Volum conjugat concentrat polizaharidă Haemophilus................ 200 mg;

tip b, până la............................................polizaharidă;

Tampon Tris-HCI 200 mM până la pH 7,2, până la .................. 10 mM;

Sucroză, până la.............................................. 850 g;

Apă pentru injecție, până la .......................................101.

Volumul final s-a filtrat în fiole și s-a liofilizat (vaccinul liofilizat s-a reconstituit cu 0,5 ml sau 0,4% NaCI pentru utilizare).

(b) Formulare

S-au testat două formulări de vaccin component multivalent (APTD). Primul (APDT-scăzut) a conținut 10 pg toxină pertussis (TP), 5 pg hemaglutinină filamentoasă (FHA), 5 pg fimbrie 2 și 3 pg proteină 69 K (69 K) per doză 0,5 ml (CLASSIC). A doua formulare (APDT-ridicat) a conținut de două ori cantitatea de PT (20 pg) și cantități identice de FIM și 69K (HYBRID). Ambele formulări au conținut 15 limită de floculare (Lf) toxoid difteric, 5 Lf toxoid tetanic, 1,5 mg fosfat de aluminiu ca adjuvant și 0,6% 2-fenoxietanol drept conservant. Vaccinul conjugat toxoid tetanic-Hib (PRPT) s-a produs, în modul descris mai sus, de către Connaught laboratories Inc. (Swiftwater, US).

Populație

S-au recrutat copii sănătoși în vârstă de 17 până la 21 luni, care au fost imunizați cu trei doze fie cu APDT-scăzut sau PRPT ca injecții separate, la vârsta de 2, 4 și 6 luni, într-un test clinic anterior. După consimțământul scris de informare, copiii au fost alocați printr-o listă bloc echilibrată, generată pe computer, a numerelor random, pentru a primi PRT-T fie ca o injecție separată în aceeași zi, ca o injecție separată cu PRP-T dat o lună după vaccin APDT, fie ca o singură injecție (PRP-T liofilizat reconstituit în APDT). Formularea APDT (ridicată sau scăzută) pentru fiecare copil a rămas aceeași așa cum s-a dat pentru primele trei doze (raport de distribuție 6:1 APDT-ridicat; APDT-scăzut). Vaccinurile s-au administrat i.m. cu un ac de 25 mM în mușchiul deltoid al brațului sau mușchiul vastus lateral al coapsei dacă deltoidul are masă insuficientă. Când a doua injectare a fost necesară pentru PRPT, s-a injectat membrul opus.

Supraveghere clinică și de laborator

Participanții s-au urmărit pentru reacții locale și sistemice adverse imediat după imunizare și prin părinți timp de 72 h postimunizare. Datele s-au colectat printr-un interviu telefonic structurat la 24 și 72 h. S-a măsurat temperatura corpului cel puțin o dată pe zi sau ori de câte ori copilul a fost găsit de părinți a fi febril. Slăbiciunea și reacțiile sistemice (iritabilitatea, activitatea scăzută, scăderea hrănirii) s-au gradat ca slab, moderat, sau grav conform criteriului prestabilit prin care părintele a selectat o severitate bazată pe exemple structurate. Reacțiile locale măsurate s-au gradat prin dimensiunea lor și plânsul prelungit prin durata sa.

RO 120819 Β1

Probele de sânge s-au colectat prin venipunctură sau prin înțepătură în deget înainte de și la 28 zile după imunizare; la copil s-a dat injecție PRP-T (totuși, 2 cu post-APDT). Anticorpii la polizaharida capsulară a Hib (PRP) s-au măsurat prin RIA. Anticorpii IgG la PT s-au măsurat prin ELA și anticorpul care neutralizeză cu PT prin neutralizarea citotoxicității celulei ovariene de hamster chinezesc (CHO). IgG anti-FHA, anti-FIM și anticorpii anti-69K s-au măsurat prin EIA; unitizarea s-a calculat folosind antiser (#3) de referință US FDA. S-au măsurat de asemenea aglutinele pertussis. Antitoxina difterică s-a măsurat prin testul microneutralizării și antitoxina tetanică prin EIA. Titrurile de anticorp s-au exprimat ca titruri geometrice medii; probele de ser cu titruri mai scăzute decât testul limită de sensibilitate au desemnat o valoare de jumătate din limita de sensibilitate, în scopul calculelor statistice.

Analiza statistică

Reacțiile adverse s-au analizat după gruparea pentru semnificație clinică. Vitezele reacțiilor adverse s-au comparat prin estimări Mantel-Haenszel ale riscului relativ, folosind formularea centrală și vaccin ca variabile de stratificare. Estimări punctiforme și 95% CI ale RR1/1 s-au evaluat în fiecare caz. CI care nu include 1,00 este semnificativ statistic.

Titrurile geometrice medii anticorp și CI 95% s-au calculat pentru titrul anticorp pentru fiecare antigen vaccin pre- și postimunizare. Titruri log (logaritmice) medii s-au comparat prin trei analize factoriale ale fluctuației. Proporția subiecților care au atins niveluri pre-specificate în fiecare grup s-au comparat prin regresie logistică. Nu s-au făcut adaptări pentru comparări multiple.

Un total de 545 copii (44% feminin) s-au încadrat în studiu, din care 74% au terminat studiul seriilor de copii. Proporția participanților în acest studiu, care au primit cele două formulări, a rămas 6:1 (468 APDT-ridicat, 77 APDT-scăzut). Vârsta medie a fost 18,9 luni (intervalul 17...21 luni); toți, mai puțin 3 copii (99,4%), au terminat studiul.

Reacții adverse *

Vitezele reacțiilor adverse nu diferă în grupurile imunizate cu APDT-ridicat și APDT-scăzut; vitezele au fost de asemenea similare, indiferent dacă imunizările s-au dat separat la o vizită, la vizite separate sau într-o singură injecție combinată.

Răspuns anticorp înainte de imunizare, nivelurile de anticorp împotriva tuturor antigenilor cu excepția FHA, au fost similare la copiii care au primit APDT-ridicată sau APDT-scăzută, pentru primele lor trei doze. Copiii tipici cu APDT-ridicat, cu conținutul lor FHA de patru ori, au avut titruri FHA semnificativ mai ridicate decât copii imunizați cu APDT-scăzut (p=0,0001). După imunizare, APDT-ridicat a indus titruri anticorp mai ridicate decât APDT-scăzut (p=0,0001). în contrast, titruri pre-imunizare anti-PT, măsurate prin neutralizarea CHO sau EIA, au fost similare în cele două grupuri. Paradoxal, în ciuda conținutului antigenic dublu, titruri anti-PT au fost mai scăzute după imunizare cu APDT-ridicat decât APDT-scăzut (p=0,038). Similar, anticorpii anti-FIM și postimunizarea aglutinină au fost mai ridicate în grupul APDT-scăzut (p=0,01 și respectiv, p=0,04) în ciuda cantităților identice de antigen fimbrial în ambele formulări de vaccin.

înainte de imunizare, au existat câteva diferențe în anticorpii antagonist-pertussis între grupul randomizat pentru a primi PRPT combinat cu APDT ca o singură injecție ori primit ca injecții separate în aceeași zi sau în zile separate (tabelul 10). Datele sunt prezentate separat pentru primitori de APDT-ridicat sau APDT-scăzut; totuși, din cauza numărului mic de copii din grupul APDT-scăzut, aceste rezultate nu vor fi discutate suplimentar. Grupul randomizat pentru a primi separat injecții în aceeași zi a avut anticorpi anti-PT mai ridicați prin neutralizare CHO decât grupul care a fost aproape de a primi cele două injecții în zile separate (6,14 față de 4,80 unități; p<0,05). Nivelurile anticorp postimunizare au fost de

RO 120819 Β1 asemenea mai ridicate în acest grup (176 unități) decât injecția separată în grupul pe zile se- 1 parate (122 unități; p<0,01), deși niveluri similare mai ridicate s-au găsit în grupul care a primit imunizarea singură combinată (171 unități; p<0,01). Răspunsul anticorp anti-69K s-a 3 detectat în acest grup postimunizare, deși copiii imunizați cu două injecții în aceeași zi au avut un răspuns anticorp mai ridicat decât copiii imunizați cu un singur vaccin combinat și co- 5 piii imunizați cu două injecții în aceeași zi au avut răspuns anticorp mai ridicat decât copiii imunizați în zile separate (243 față de 190 unități; p<0,001) decât copiii imunizați cu două 7 injecții în zile separate.

Nivelurile anticorp anti-PRP au fost similare între cele trei grupuri înainte de imu- 9 nizare. Titrurile postimunizare au fost mai ridicate la copiii imunizați cu injecții separate în aceeași zi (66,0 pg/ml) decât la copii imunizați în zile separate (28,4 pg/ml; p<0,001 sau la 11 copiii care au primit o singură imunizare combinată (47,1; p<0,05). Imunizarea combinată a provocat de asemenea niveluri de anticorpi semnificativ mai ridicate decât vaccinurile primite 13 în zile separate (p<0,05). Nu s-a detectat nici o diferență între grupuri, în procentajul care atinge niveluri de protecție; toți participanții au avut titruri postimunizare în exces, de 15 0,15 pg/ml și numai 4 participanți (0,7%) au eșuat în atingerea unui titru în exces de 1 pg/ml (3 în grupul care a primit injecții separate sau zile separate și unul în grupul care a primit o 17 singură injecție combinată). Peste 82% dintre copiii din fiecare grup au depășit un nivel de anticorp anti-PRP de 10 pg/ml. 19

Un răspuns anticorp puternic a fost provocat, de asemenea, împotriva toxoizilor difteric și tetanic. Comparat cu grupul care a primit imunizarea în zile separate (2,1 lU/ml), niveluri 21 anticorp antidifteric semnificativ mai ridicate au provocat la copiii imunizați cu două injecții în aceeași zi (3,1; p<0,01 lU/ml) sau singura injecție combinată (3,3 lU/ml; p<0,001). Anticorpii 23 antitetanic au fost mai ridicați la primitorii celor două injecții în aceeași zi (6,7 lU/ml) decât la copiii imunizați în zile separate (5,2 lU/ml; p<0,01) sau copiii care au primit singura injecție 25 combinată (4,8 lU/ml; p<0,001). Toți copiii au avut titruri anticorp postimunizare antidifteric și antitetanic în exces de 0,1 lU/ml, un nivel de 10 ori față de nivelul protector susținut. Peste 27 96% de titruri antitetanic și peste 74% de titruri antidifteric au depășit un nivel de 1,0 lU/ml;

nu a existat nici o diferență între grupurile de imunizare.29

Exemplul 8. Acest exemplu descrie formularea și imunogenicitatea unui vaccin combinat multivalent, care conține vaccin polio inactivat.31 (a) Prepararea poliovirusului inactivat (i) Creșterea pe celule MRC-533

Virusul polio inactivat, crescut pe celule MRC 5, s-a produs după cum urmează.

Celulele au fost din celule de rinichi de maimuță verde (Cerapithacus aethiope).35

Vaccinul poliovirus trivalent, inactivat, a conținut, componente Tip I (Mahiney), Tip II (MEF) și Tip III (Saukett), care a crescut pe celule MRC-5 pe bile micropurtător, produse și 37 inactivate separat înainte de combinarea într-un vaccin trivalent virus polio.

O suspensie de celule MRC-4 s-a adăugat la mediul de creștere celule într-un fer-39 mentator la pH 7,2 (6,9 până la 7,6) și temperatură de 37°C + 0,5°C. Mediul de creștere al celulelor a avut compoziția următoare:41

Mediul CMRL 1969;

Bicarbonat de sodiu ...........................................0,15%;43

Ser bovin adult ............................................5,00...7%;

Sulfat de neomicină (pg activitate)..............................10 lU/ml; 45

Polimyxin B............................................... 200 lU/ml.

RO 120819 Β1

Mediul CMRL a avut compoziția următoare:

PUDRĂ USCATĂ

Ingredienți aminoacidmg/l

L-alanină 25,0;

L-arginină (bază liberă) 58,0;

Acid L-aspartic 30,0;

L-cisteină · HCI 0,1;

L-cisteină disodică 24,0;

Acid L-glutamic H₂O 67,0;

L-glutamină ................................................. 200,0;

L-glicină 50,0;

L-histidină (bază liberă) 16,2;

L-hidroxiprolină 10,0;

L-izoleucină 20,0;

L-leucină 60,0;

L-lizină · HCI 70,0;

L-metiohină 15,0;

L-fenilalanină 25,0;

L-prolină 40,0;

L-serină 25,0;

L-treonină 30,0;

L-triptofan 10,0;

L-tirozină 40,0;

L-valină 25,0.

Vitamine

Acid p-aminobenzoic 0,05;

Acid ascorbic 0,05;

d-biotină 1,00;

Pantotenat de calciu 1,00;

Citrat de colină diacid 2,12;

Acid folie 1,00;

Glutation 0,05;

i-inozitol 2,00;

Nicotinamidă 1,00;

Piridoxal HCI 1,00;

Riboflavin-5-fosfat 0,10;

Tiamină HCI..................................................1,00.

Ingrediente

Componentmg/l

Clorură de sodiu............................................. 8000,0;

Clorură de potasiu ............................................ 400,0;

Clorură de calciu (anhidru)...................................... 149,0;

Sulfat de magneziu · 7H₂O...................................... 200,0;

Fosfat de sodiu, dibazic anhidru ................................. 180,0;

Fosfat de sodiu, nebazic ........................................ 70,0;

D-glucoză (anhidru).......................................... 1000,0;

Roșu fenol ................................................... 20,0.

10.852 g rezultă 1 I mediu CMRL 1969.

RO 120819 Β1

Mediul s-a preparat după cum urmează: 1

450 I apă distilată fără sulf s-au adăugat la 905 ml acid clorhidric. La acest amestec s-a adăugat 5426,5 g CMRL 1969 pulbere uscată, cu agitare continuă, până când s-a dizol- 3 vat la soluție limpede. Următoarele substanțe chimice s-au adăugat în ordinea dată, cu agitare continuă, așteptând ca fiecare substanță chimică să se dizolve înainte de adăugarea 5 următoarei:

Neomicină............................................... 10mcg/ml;7

Polymyxin B ........................................... 200 unități/ml;

Soluție tampon TES ........................................ 5000,0 ml;9

Bicarbonat de sodiu .......................................... 750,0 g;

Ser de bovine................................................ 30,01.11

Volumul a fost adus la 500 I cu apă proaspăt distilată și s-a agitat până când s-a amestecat uniform.13

S-a urmărit creșterea celulelor și când celulele s-au determinat a fi în faza logaritmică, mediul de creștere epuizat s-a îndepărtat și s-a înlocuit cu mediu de creștere virus. Mediul 15 de creștere virus a avut compoziția următoare:

Substanțele chimice ale mediului 199 cu săruri Earle17

Bicarbonat de sodiu ...........................................0,26%;

Tween 80 .................................................. 20 ppm; 19

Sulfat de neomicină (pg activitate).............................. 10 lU/ml;

Polymyxin B .............................................. 200 lU/ml; 21

L-glutamină................................................100mg/l;

L-arginină ..................................................29 mg/l;23

L-leucină...................................................30mg/l;

L-izoleucină.................................................10 mg/l;25

L-metionină................................................ 7,5mg/l;

L-serină.................................................. 12,5 mg/l;27

L-treonină..................................................15mg/l;

L-cisteină ..................................................19 mg/l;29

Citrat de colină diH..........................................107mg/l.

Mediu CMRL 199 a avut următoarea compoziție:31

PULBERE USCATĂ

Ingredienți mg/l33

L-alanină 25,0;

L-arfinină (bază liberă) .......................................... 58,0;35

Acid L-aspartic 30,0;

L-cisteină HCI · H₂O ............................................ 0,1;37

L-cisteină disodică 24,0;

Acid L-glutamic H₂O............................................67,0;39

L-glutamină.................................................. 100,0;

Glicină....................................................... 50,0;41

L-histidină (bază liberă) 16,2;

L-hidroxiprolină................................................ 10,0;43

L-izoleucină 20,0;

L-leucină..................................................... 60,0;45

L-lizină 70,0;

L-metionină................................................... 15,0.47

RO 120819 Β1

Ingrediențimg/l

L-fenilalanină 25,0;

L-prolină 40,0;

L-serină 25,0;

L-treonină 30,0;

L-triptofan 10,0;

L-tirozină 40,0;

L-valină 25,0;

Acid L-aminobenzoic.......................................... 0,050;

Acid ascorbic................................................ 0,050;

d-Biotină.................................................... 0,010;

Pantotenat de calciu........................................... 0,010;

Citrat de colină diacid.......................................... 1,060;

Acid folie.................................................... 0,010;

Glutation.................................................... 0,010;

i-inositol .................................................... 0,050;

Menadionă.................................................. 0,010;

Nicotinamidă (niacinamidă) ..................................... 0,025;

Acid nicotinic (niacin).......................................... 0,025;

Piridoxal · HCI ............................................... 0,025;

Piridoxină HCI .............................................. 0,025;

Riboflavin-5-fosfat ............................................ 0,010;

Tiamină HCI................................................. 0,010;

Vitamina A acetat............................................. 0,100;

Vitamina D (Calciferol)......................................... 0,100;

Vitamina E (-tocoferol fosfat).................................... 0,010;

Sulfat de adenină............................................ 10,000;

Adenozin trifosfat............................................. 1,000;

Acid adenozin-5-fosforic........................................ 0,200;

Deoxi-2-riboză ............................................... 0,500;

d-riboză .................................................... 0,500.

Ingredienți mg/l

Colesterol................................................... 0,200;

Guanină.................................................... 0,300;

Hipoxantină ................................................. 0,300.

Cultura s-a infectat cu spori corespunzători de virus, la o multiplicare a infecției. Infectarea s-a realizat la 36°C ± 1 °C. Când virusul C.P.E. a fost complet, cultura s-a răcit la 2 până la 15°C.

Recolta de virus s-a limpezit prin filtrare. Volumul-recoltat de virus s-a redus prin ultrafiltrare pe membrană, cu o limită de greutate moleculară nominală de 100.000 până la un volum potrivit pentru diafiltrare contra 0,04 M tampon fosfat. După diafiltrare, volumul s-a concentrat suplimentar până la un volum corespunzător pentru filtrare pe gel. Concentratul de virus viu s-a comparat și s-a depozitat la 2 până la 8°C.

Concentratul de virus viu s-a aplicat la o coloană de filtrare pe gel și s-a eluat din coloană cu tampon fosfat 0,04 M. Fracția de virus s-a colectat prin observarea densității optice a eluatului de coloană la 254 și 280 nm.

A doua etapă de purificare s-a realizat folosind un mediu DEAE-schimbător de ion, cu fosfat 0,04M ca tampon de eluare. Această etapă se poate repeta de două ori, dacă cantitatea de mediu schimbător de ioni a fost insufiecintă, așa cum s-a determinat prin observare la 254 și 280 nm.

RO 120819 Β1

Fracția de virus colectat s-a concentrat și s-a dializat împotriva mediului special Hank1 pentru a reduce conținutul de fosfat. Mediul special Hank a avut următoarea compoziție:

AMINOACIZI mg/l3

D,L-alanină.................................................. 25,00;

L-arginină · Hcl ............................................... 58,00;5

Acid D,L-aspartic ............................................. 30,00;

L-cisteină HCI H₂O ............................................. 0,10;7

L-cistină 2HCI................................................ 26,00;

Acid D,L-glutamic............................................. 67,00;9

L-glutamină................................................. 100,00;

Glicină...................................................... 50,00;11

L-hisditină HCI H₂O............................................ 16,20;

L-hidroxiprolină............................................... 10,00;13

D,L-izoleucină................................................ 20,00;

D,L-leucină.................................................. 60,00;15

L-lizină HCI................................................. 70,00;

D,L-metionină................................................ 15,00;17

D,L-fenilalanină............................................... 25,00;

L-prolină.................................................... 40,00;19

D,L-serină................................................... 25,00;

D,L-treonină ................................................. 30,00;21

D,L-triptofan ................................................. 10,00;

L-tirozină (sare disodică) ....................................... 40,00;23

D,L-valină................................................... 25,00.

VITAMINE25

Acid ascorbic ................................................ 0,050;

d-biotină .................................................... 0,010;27

Vitamina D (celciferol).......................................... 0,100;

D-pantotenat de calciu .........................................0,010;29

Clorură de colină.............................................. 1,060;

Acid folie.................................................... 0,010;31 i-inozitol..................................................... 0,050.

Săruri minerale mg/l33

Clorură de calciu (anhidru)...................................... 40,00;

Azotat feric · 9H₂O ............................................. 0,10;35

Clorură de potasiu ........................................... 400,00;

Clorură de sodiu............................................ 8000,00.37

VITAMINE

Sulfat de magneziu 7H₂O..................................... 200,00.39

Alți ingredienți

Sulfat de adenină ............................................ 10,000;41

Adenozin trifosfat (sare disodică)................................. 1,000;

Acid adenilic................................................. 0,200;43

Acid fosforic a tocoferol (sare de sodiu)............................ 0,010;

Colesterol................................................... 0,200;45

Deoxiriboză.................................................. 0,500;

Glucoza.................................................. 1000,000;47

Glutation.................................................... 0,050;

RO 120819 Β1

Guanină - HCI................................................ 0,300;

Hipoxantină (sare de sodiu)..................................... 0,300;

Riboză ..................................................... 0,500;

Acetat de sodiu · H₂O......................................... 81,500;

Timină ..................................................... 0,300;

Tween 80 .................................................. 20,000;

Uracil ...................................................... 0,300;

Xantină (sare de sodiu) ........................................ 0,300;

Menadionă.................................................. 0,010;

Acid nicotinic ................................................ 0,025;

Nicotinamidă ................................................ 0,025;

Acid p-aminobenzoic.......................................... 0,050;

Piridoxal · HCI ............................................... 0,025;

Piridoxină HCI .............................................. 0,025;

Roboflavin-5-fosfat............................................ 0,010;

Tiamină · HCI................................................ 0,010;

Vitamina A (acetat)............................................ 0,040.

Fracția virus purificat s-a filtrat printr-un filtru cu o porozitate de 0,2 μ.

Una sau mai multe fracții de virus concentrat purificate pot fi colectate pentru inactivare. Bazat pe rezultatele testului ELISA, virusul monovalent colectat s-a diluat la:

Țipi:............................................. 1750 ± 250 DU/ml;

Tipii: ........................................... 1500 ±250 DU/ml și

Tip III:.......................... 1250 ± 250 DU/ml cu mediu special Hank.

Depozitul monovalent s-a încălzit până la 37°C ± 1 °C, apoi s-a filtrat printr-un filtru cu porozitate 0,2 μ.

S-a adăugat cantitatea necesară de formalină, pentru a atinge concentrația de 1:4000. Virusul colectat și formalina s-au amestecat și s-au agitat continuu la 37°C ± 1°C. Depozitul virus monovalent s-a testat pentru viabilitate. în ziua 6, depozitul virus inactivat s-a filtrat printr-un filtru 0,2 μ și s-a menținut la 37°C ± 1 °C. în ziua 13 a inactivării, virusul colectat s-a filtrat printr-un filtru 0,2 μ.

Unul sau mai multe componente monovalente inactivate s-au selectat și s-au conectat aseptic la un tanc de colectare. Depozitul monovalent s-a concentrat suplimentar prin ultrafiltrare pe membrană cu o limită de greutate moleculară nominală de 100.000. Dializa contra diluant RIV-PBS:

Fosfat acid disodic (Na₂HPO₄), 0,346 g/CCml

Fosfat diacid de potasiu (KH₂PO₄), 0,187 g/CCml cu Tween s-a realizat pentru a obține uniformitatea produsului final.

S-a adăugat albumină (umană) pentru a obține o concentrație finală de 0,5%. Concentratul monovalent colectat s-a filtrat apoi printr-un filtru 0,2 μ. S-a adăugat diluant RIV-PBS cu Tween pentru a obține o concentrație estimată (prin calculare) de 10 până la 15 doze per 0,5 ml. Concentratul colectat s-a depozitat la 2 până la 8”C până când este necesar.

Volumele corespunzătoare de componente monovalente Tip I, II și II s-au calculat și combinat. Vaccinul trivalent a fost orientat să conțină:

Tip I:.............................................40 DU/0,5 ml doză;

Tip II: .............................................8 DU/0,5 ml doză;

Tip III:............................................32 DU/0,5 ml doză.

RO 120819 Β1

Concentratul trivalent s-a depozitat la 2 până la 8°C până la folosire. S-au adăugat 1 formaldehidă și 2-fenoxietanol și s-au amestecat. S-a adăugat albumină (umană), prin calculare, pentru a da o concentrație finală de 0,5%. 3 (ii) Creștere pe celule Vero

Fiole din banca de celule Vero de lucru s-au subcultivat până la nivelul trecerii 5 celulare alese. Fiolele cu celule s-au conservat în azot lichid. Celulele s-au crescut folosind ca microsuport perle sferice cu un diametru mediu de aproximativ 100 pm, constituite din 7 polimeri Dextran având radicali de DEAE grefați pe suprafața lor (dietilaminoetil), dându-le o sarcină pozitivă. 9

Mediul bazic pentru creștere celulară a fost mediu minim esențial (MEM) Eagle în soluții saline Earle îmbogățite cu 0,2% hidrolizat de lactalbumină, 0,1 % dextroză, 5% ser de 11 vițel. Fiecare ml de mediu conține următoarele antibiotice:

Streptomicină ........................................75 unități per ml; 13

Neomicină...........................................14 unități per ml;

Polymyxin B sulfat ....................................35 unități per ml. 15

Celulele Vero s-au subcultivat progresiv în biogeneratoare de mărime crescută. Apoi, mediul de cultură și un volum suficient de perle microsuport per litru de mediu s-au introdus 17 în biogeneratorul industrial. Temperatura s-a stabilizat la +37C. S-au adăugat celule colectate prin tripsinizare și s-au plasat sub agitare. Cultura a continuat pe durata a 4 până 19 la 7 zile la +37”C, agitarea fiind crescută progresiv. De obicei, la sfârșitul culturii, s-a observat o creștere de 6 până la 20 ori în creșterea celulară. Mediul folosit pentru creșterea virusului 21 a fost mediu 199 (Parker) în soluție salină Earle, îmbogățit cu 0,1% dextroză. Acest mediu conține aceleași antibiotice, la aceeași concentrație ca mediul pentru creștere celulară, dar 23 nu conține ser de vițel. în ziua a 4/7-a de creștere celulară, biogeneratorul cu agitare la scară industrială s-a stopat; perlele s-au stabilizat la fundul tancului, mediul vechi s-a îndepărtat. 25 Apoi în fiecare biogenerator s-a introdus mediu 199 fără ser și s-a agitat. Apoi, mediul a fost decantat, efectuând o spălare a perlelor și celulelor. Același mediu 199 fără ser s-a transferat 27 în biogenerator, împreună cu volumul necesar lotului de însămânțare. Virusul s-a absorbit în celule prin agitare blândă. La sfârșitul culturii de virus, agitarea s-a stopat. Suspensia de 29 virus s-a decantat, s-a colectat și perlele s-au reținut prin filtrare. Suspensia de virus s-a omogenizat. Recolta filtrată printr-o membrană organică cu pori de mărime medie la 0,20 mm 31 s-a depozitat la +4°C. Virusul s-a concentrat prin ultrafiltrare.

Virusul s-a purificat suplimentar prin cromatografie schimbătoare de ioni, folosind 33 suport DEAE-dextran-Spherosil echilibrat cu tampon fosfat 0,04 M, pH 7,00. Virusul s-a purificat suplimentar prin cromatografie cu filtrare pe gel, folosind o coloană care conține un 35 gel agaroză Sepharosis CL-6B, tamponat cu fosfat 0,04 M, pH 7,00. Cât mai curând după ce purificarea s-a realizat, suspensia de virus s-a ajustat la volumul necesar cu același mediu 37 M-199, pH 7,0 fără fosfat, concentrat de 10 ori în EDTA 5 mm, glicină la 0,5% și Tween 80 la o concentrație finală de 50 mg/l (mediu de inactivare). Acest amestec constituie amestec 39 de virus concentrat și s-a filtrat pe o membrană de 0,2 pm, Suspensia de virus concentrată s-a depozitat la +4°C în cursul inactivării. 41

Unul sau câteva loturi de amestec de virus concentrat de același tip s-au amestecat și posibil diluat sau ajustat cu același mediu de inactivare într-un tanc corespunzător. Diluția43 s-a ajustat până la volumul conform tipurilor, în scopul obținerii unui titru de antigen D între:

- 1500 și 2000 unități D în tip 1;45

- 800 și 1000 unități D în tip 2;

- 1000 și 1500 unități D în tip 3;47

RO 120819 Β1 și un raport de proteină de:

- <; 40 pg/ml în tip 1;

- 70 pg/ml în tip 2;

- 30 pg/ml în tip 3.

Suspensia de virus concentrată, purificată, ajustată, s-a filtrat pe o membrană 0,22 um cu cel mult 72 h înainte de începerea inactivării. Suspensia s-a încălzit apoi din nou la +37’C. Pentru inactivare, s-a adăugat soluția de formaldehidă pentru a obține o concentrație la 1/4000. în scopul urmăririi cineticelor de inactivare după 24, 48, 72 și 96 h, probele s-au prelevat pe durata primelor patru zile. O probă de 10 ml s-a efectuat cu neutralizare imediată a formaldehidei prin acțiunea bisulfitului de sodiu și s-a depozitat direct la -20°C, așteptând titrarea.

în ziua 6, suspensia virusului pe durata inactivării s-a filtrat folosind un filtru 0,22 pm. După filtrare, incubarea lichidului s-a realizat la +37’0, timp de peste 6 zile, cu o agitare constantă. în ziua a 9-a de inactivare, s-au scos de 3 ori volumul corespunzător la 3000 doze umane și 500 ml minim de recoltă individuală brută. Acest volum s-a calculat conform titrului în antigen D al amestecului de virus concentrat. Proba s-a neutralizat direct cu bisulfit de sodiu pentru a stopa acțiunea formaldehidei reziduale. Suspensia de virus omogenizată și inactivată s-a luat apoi din incubator la 37’C după a 12-a zi de inactivare. Volumul s-a neutralizat direct cu ceva bisulfit de sodiu și s-a depozitat la +4°C.

Pentru a prepara un lot trivalent concentrat de IPV, preparatele monovalente s-au combinat pentru a asigura:

Tip 1 (Mahoney) ................................ 400 unități D antigen;

Tip 2 (MEF-1) ................................... 80 unități D antigen;

Tip 3 (Saukett).................................. 320 unități D antigen;

Mediu 199-pH 7,2 q.s. până la.....................................1 ml.

Amestecul s-a agitat până la omogenizatul filtrat pe o membrană de porozitate 0,22 p. Produsul de volum final s-a obținut din loturile de volum trivalent concentrate, cum ar fi cele descrise, prin diluarea cu mediu 199, pH 7,2, fără roșu fenol, astfel încât doza unitară conține per 0,5 ml:

unități antigen D pentru tip 1;

unități antigen D pentru tip 2;

unități antigen D pentru tip 3.

(b) Formulări

O formulare vaccin multivalent (APDT) a conținut cinci antigeni pertussis (10 pg PT, 5 pg FHA, 5 pg FIM 2 și 3, 3 pg 69K), 15 Lf toxoid difteric, 5 Lf toxoid tetanic, 1,5 mg fosfat de aluminiu ca adjuvant și 0,6% 2-fenoxietanol drept conservant per 0,5 ml (CLASSIC). Vaccinul s-a utilizat singur sau în combinație fie cu IPV produs pe celule MRC-5 (mlPV) preparat cum s-a descris mai sus, IPV produs pe celule Vero (vIPV), preparat cum s-a descris mai sus, fie cu OPV (Connaught Laboratories Limited). în scopul de nu întrerupe schema lor obișnuită de imunizare, vaccinul conjugat Haemophilus influenzae toxoid n-tetanic s-a administrat în timpul vizitei următoare.

Populația

S-au recrutat în studiu copii sănătoși în vârstă de 17 până la 19 luni, care au fost imunizați cu trei doze de DTP și 2 doze OPV, sau 3 doze DTP-IPV, înainte de vârsta de 8 luni. Conform consimțământului scris de informare de la părinți sau îngrijitori, copiii s-au distribuit printr-o listă bloc echilibrată, generată pe computer, a numerelor random, pentru a primi unul din cinci regimuri de vaccin (tabelul 10). Vaccinurile combinate conținând A3DT s-au dat pe cale intramusculară cu un ac de 25 mm în mușchiul deltoid al brațului sau mușchiul vastus

RO 120819 Β1 lateral al coapsei dacă deltoidul nu a avut masă suficientă. Când s-a primit singur, IPV 1 (0,5 ml; mlPV sau vIPV) s-a administrat pe cale subcutanată, folosind un ac H până la 5/8 inch (12,5 până la 16 mm) în lungime, vaccinurile conținând APDT s-au administrat în 3 membrul stâng; membrul drept s-a folosit pentru vaccinuri poliovirus inactivat când s-a dat separat și pentru toate vaccinurile Haemophilus influenzae b-conjugate la vizita a doua. 5

Supraveghere clinică și de laborator

S-au colectat probe de sânge prin venipunctură sau prin înțepătură în deget înainte 7 și la 28 zile după imunizare. Anticorpii IgG la PT s-au măsurat prin imunotest de enzimă și anticorp care neutralizează PT prin neutralizare CHO. IgG anti-FHA, anti-FIM și anticorpii 9 anti-69K s-au măsurat prin imunotest de enzimă; unitățile s-au calculat folosind antiser (#3) de referință US FHA. De asemenea, s-au măsurat aglutinine pertussis. Antitoxina difterică 11 s-a măsurat prin test de microneutralizare și antitoxina tetanică prin imunotest. Anticorpii anticorp-polivirus tip 1,2 și 3 s-au măsurat prin neutralizare virală. Titrurile de anticorp s-au 13 exprimat ca titruri medii geometrice; probe de ser cu titruri mai mici decât testul limitei de detecție au desemnat o valoare de jumătate din limita de detecție scăzută în vederea 15 calculelor statistice.

Titrurile anticorp medii geometrice și 95% intervale de încredere s-au calculat pentru 17 titrul anticorp la fiecare antigen vaccin pre- și postimunizare. Titrurile log medii și creșterile titrului anticorp mediu multiplicat cu log s-au comparat prin analiză de profil și analiza 19 variantei. Proporția subiecților care ating niveluri pre-specifice în fiecare grup s-a comparat prin regresie logaritmică. Comparările s-au făcut între fiecare vaccin poliovirus dat separat 21 sau ca o injecție combinată, între mlPV și vIPV (ambele izolate și combinate) și între vaccinurile IPV combinate și OPV. Nu s-au făcut ajustări pentru comparații multiple. 23

Un total de 425 copii (52% feminin) s-au înscris în studiu și au primit imunizare rapel (tabelul 10). Vârsta medie a înscrierii a fost de 17,8 luni (interval 17,0 până la 20,0). S-au 25 obținut specimene de ser postimunizare de la 422 (99,3%) de participanți, o medie de 29,2 zile după imunizare (interval 28 până la 41 zile). Evenimente adverse, clasificate ca grave, 27 nu au fost obișnuite în studiu.

înainte de imunizare, nivelurile de anticorp au fost echivalente contra grupărilor pentru 29 mulți antigeni. Diferența a fost că participanții repartizați să primească APDT și mlPV ca injecții separate au avut niveluri de anticorp anti-FIM, aglutinină, antidifteric și antitetanic 31 semnificativ mai scăzute decât grupul repartizat să primească vaccinul combinat APDT-mIPV. în mod similar, grupul randomizat să primească injecții separate de APDT și 33 vIPV a avut niveluri de anticorp antitetanic mai scăzute decât grupul disponibil să primească APDT-vIPV combinat. 35

După imunizare, a existat o creștere semnificativă de anticorp în toate grupurile de vaccin împotriva tuturor antigenilor incluși în vaccinuri. Au existat câteva diferențe în 37 răspunsul anticorp la antigeni pertussis, în funcție de grupul vaccin polio. Nu au existat diferențe în anticorpi anti-PT prin imunotest de enzimă sau neutralizare CHO sau în anticorpii 39 anti-FHA. Anticorpi anti-69K au fost semnificativ mai ridicați în grupul care a primit vaccinul mlPV combinat cu APDT (77,7 unități) decât grupul care a primit mlPV ca o injecție separată 41 (37,9 unități; p<0,001) sau grupul care a primit OPV (47,7; p<0,05). Anticorpi anti-FIM și aglutinine au fost, de asemenea, mai ridicați în grupul care a primit grupul combinat 43 APDT-mIPV decât grupul care a primit injecții separat; cu toate acestea, aceleași diferențe s-au detectat de asemenea în serurile pre-imunizante. 45

S-au detectat diferențe în răspunsurile anticorp antipoliovirus. Atât APDT-mIPV, cât și APDT-vIPV au provocat anticorpi mai ridicați antipoliovirus tip 1 și tip 3 (P<0,001 pentru 47 toate comparațiile). Nivelurile antipoliovirus anticorp tip 2 au fost, de asemenea, mai ridicate

RO 120819 Β1 după APDT-mIPV (diluție reciprocă 10.633) și APDT-vIPV (10.256) decât 7185); totuși, aceasta a îmbogățit numai semnificația statistică pentru APDT-mIPV (p<0,05). Titrurile de anticorp antipoliovirus, atinse cu APDT-MIPV, au fost de asemenea mai ridicate decât când mlPV s-a primit ca o injecție separată (6620-1 p<0,05).

Titrurile de anticorp antitetanic au fost mai ridicate la primitorii de OPV decât fiecare din combinațiile IPV (p<0,05). Titrurile antidifteric au fost, de asemenea, mai ridicate la primitori OPV, dar aceasta îmbogățește numai semnificația statistică comparativ la grupul APDT-vIPV (p<0,05). După imunizare, toți copiii au avut niveluri de anticorp împotriva difteriei și tetanicului în exces de 0,01 lU/ml și toți, cu excepția unui copil, au avut niveluri în exces de 0,1 lU/ml.

Rezultatele acestui studiu demonstrează că un vaccin cu component pertussis, care conține PT, FHA, 69K și FIM combinat cu toxoizi difteric și tetanic, poate fi combinat cu vaccin poliovirus inactivat, fără nici o creștere semnificativă în reactogenicitatea sau pierderea imunogenicității. Spre deosebire de rezultatele cu DTP cu celulă întreagă, nu a existat o diminuare a răspunsului anticorp la antigeni Bordetella pertussis. Nu au existat diferențe substanțiale între vaccinurile IPV preparate fie pe linii de celule MRC-5, fie pe linii de celule Vero; ambele vaccinuri induc niveluri de ser anticorp antipoliovirus mai ridicate decât OPV. Demonstrarea echivalenței mlPV și vIPV ușurează aplicarea vaccinului acelular pertussis în jurisdicții, cu o preferință pentru un IPV derivat dintr-o linie celulară specială.

în concluzia experimentului raportat în acest exemplu, acesta demonstrează că un vaccin cu component acelular pertussis poate fi combinat în siguranță cu fiecare dintre vaccinurile IPV pentru a patra doză de vaccin, la vârsta între 17 și 19 luni.

Prezenta invenție asigură noi preparate de antigeni Bordetella și non-Bordetella pentru a produce vaccinuri multicomponent pertussis. Astfel de vaccinuri sunt sigure, nereactogenice, imunogenice și protectoare pentru oameni. Modificări sunt posibile în cuprinsul acestei invenții.

Tabelul 1

Vaccinuri acelulare pertussis

Vaccin	PT	Agent de toxoilare	FHA	P.69	AGQ	AGG	Referință
AMVC	+	H2O2 a	-	-	-	-	62
Mass PHLb	+	TMNC	-	-	-	-	63
Institut Merieux	+	Gld	+	-	-	-	64
Smith-Kline	+	Fie/GI FI/GI	+	+	-	-	32 32
CAMRf	+	FI	+	-	+	+	65
Lederle/Takeda	+	FI	+	+	4-	-	66
Connaught	+	Gl	+	-	+	+	32
	+	Gl	+	+	+	+	67

“ Apă oxigenată inactivată.

^b Laboratoare de de Sănătate -Publică Massachusetts. ^c TIM, tetranitrometan-inactivat.

^d Gl, glutaraldehidă-inactivată.

^e FI, formalină-inactivată ' Centrul pentru Microbiologie Aplicată și Cercetare.

co	m	b-	o	X	CO	Ui	b-	CD	x—	CO
				S“	T~	S	v-	v-	CM	CM

I

	603,83	Oi O) co*	ui cd O co	o> co* co
m	3		Ui i	co	CM	co	CM
iii	co	T—	co’ st	00	x—	b*
co'	co	00	ιη_	st	co	o
o	Ui	O)	CD	CM	CD		l<
co	X”	CM	*”		Ui	X“	ui
	b-						st
	co		CD		Oi		o
	o-		st		0)
	o>		CD*		r^·		st
CM	T		b*		b*
CO	co	CO	CM	CM	st	co	o>
v-’	00	o	00_	Ui	b-*	x—	Ui
CM	Oi	o	χ—	y-	CM	O	st
CM	CD		T“	CO	y~	(O	CM
					Ui
	O				b-		CO
	co*		,93		62,		CM CD*
IO	CM 1		t	Tf	I
’t	o	co	CO	CM	CO	co	O
id	ic)	oo	o	O)	cd	st	ui
	oo*	CO*	co*	CM		O)	Ui
	o
	o				ui
	33,		CO		cm'		co 00
	x—				y		ui
X-	CD			CM	54-
r-	CM	X—	y—		,54	CD
co	s£	Oi	o_	co'	co'
st		CM	y—	CM		CO	cm’
					ui		b-
	CD				‘68		CD
	O		st			st
	CD		T		o		st
	-78		-14	O	2-4		00
b-	T~	r*-	ui	O	CD	co
	O)	co	o	o	ui	X™	St
Ui	co*	N?	co	st	CM	ui	CD*
χ—	•st	x—	st	00	o	ui	Oi
st	CM	CO	CM	CM	x- Ui		00
					00
	CM		CD		b-		b-
	CM		s~_		b-*		00
	O		CO		st		Ui
co	CO 1	CD	CM 1		b-		SȚ
Ui	co	CO	x—	O	CO	co	y—
<D*	o	co		r-	ui	St	Ui
	O)	x-	CM*	CM	χ”	b-*	co
	co		CD		x~
	co		co		CM		ui
	CM-		id		b-*		Ui
	V		CO		CD		o
co		Oi	CD	st	O		CM
b-	T-	Ui	ui	CD	CM	st	χ—
CM	CM	co	Ui	00	cm'	y—	st
CM		CM		CM		y~	CD’
			o
	CM		CD		CO		<O
	CD		cm		cm		Ui
	00		CM		b-~		ui
ui	CM	st	00	CD	co
st	CO	CM	CM	CM	st	o>	o
co	st	id	o	χ—		o	o
	CD			CM	cm'	N-’	St
</)
co <n o		ină	>co
Έ		c	(Λ	cz
Φ Q.		Ξ5	ro o +—·	Φ CD o		ină
Ό		O) o	c. Φ	C		O
O X		E	E	3		cu •c
O		Φ	CU	CD		Φ
H		I	uz	<		CL

ιο st

c <o

CQ <d oo o CV

O

Oi

Dip	CO Tt o O '	C0 τζ O O	xT v- CN CO 0* 0 o	0,33 0,38	0,53 0,27
O t-	00 o -“II r- in	CO CV	cq T- oq T~ T—	0 00 CV	CD
Aglutinare	IO CO CM tJ T- r~. rt oo	1 1		307,0 219,2		in co 00 CO CD S t— r- r—
Neutralizare celule CHO	o o „ o v- <- w CM	29.6 2.6	32,7 62,4 4,0	Z‘89 6‘99	109,6 6,0	§ 3 Ș
Aglutinogeni fimbriali	CD o C0 cv H cd CM CM V-	239,8 603,2	Tt CO CD~ V-* cn co T— 0 CD T- CV co	350.6 220.6	601.9 906.9
69 kDa	CO T- ° ° 3	29,9 6,4	40,6 37,1 6,8	71,1 87,6	106,3 16,8	0 co (- co in Tt
FHA	O O) ί ω	50,2 4,7	45,2 95,0 8,9	82,5 163,9	83,4 11,7	3 fc CO CV
PT	00 (D O S CO CO CM CD	50,2 4,7	58.4 133,3 10.4	105,1 101,6	212,7 101,4	CM CD λ. O CO 04 v-
Nr. participanți	» co io CM ° v- T- T- T- 05 CO	315 101	CM CO O CO CO CO	42 250	0 00 in in	OOOO 00 00 00 00
Studiu	US NIAIDstudiu comparativ multicentru (Ciclu 1)	Faza II Canada	Faza II Canada	Faza II Canada	Studiu fezabilitate Montreal	US NIAIDstudiu comparativ multicentru (Ciclu I)
Produs	Φ « -S ™ Φ >03 ’CO CD CD co ra L_ Φ Φ 1 ' 1— t_ Q Q g£ <E co m în în ’Φ ’Φ ă § Ξ) O Q_ Q_ φ φ o o o o	CP10/5/5/3DT Celulă întreagă (CLL)	_l —1 0 >Φ CD . 1— Η Φ 0 Q 1—1 m r- δ § *ro δ δ —ι τ- CM —* Q_ Q_ Φ O O 0	o 9, £? δ £> δ in cm δ δ *- CM 0- 0. 0 0	ω ’φ CD , ro t ro Q 4= i? C in <— 8 >05 8 => 0. Φ O O	ro 7 φ H 735 —1 φ O Jj ’Φ ’Φ CD CD . Φ Φ l_ Η Φ Φ h O ±5 -t £ δ <- <m ti δ (μ ’Φ ’Φ δ δ -ț -j 0. CL Φ Φ OOOO
clinic	-	CM	co	xt	in	CD

CD

CD

Cil - Connaught Laboratories Incorporated, Swiftwater, Pennsylvania. CIL - Connaught Laboratories Limited, Willowdale, Ontario. Mass - Massachusetts Public Laboratories. Lederle - Lederle Laboratories Inc.

CO CM

in	r-	CD
CM	CM	CM

r- cn co in

CM

RO 120819 Β1

Tabelul 4

Eficiența vaccinurilor acelulare pertussis

Vaccin	Eficiență %
A	B
{-'F’10/5/5/3DT	84,7 (80,3 -88,5)1	77
pt25.fha25dt	58 (49,8 -64,8)1
dpt2	47,9 (37,1 -56,9)1

A: definiție de caz: 21 zile tuse spasmodică și cultură pozitivă. B: definiție de caz: tuse pertussis blândă de cel puțin o zi.

Nota 1: limite de încredere.

Nota 2: vaccin celulă întreagă pertussis.

RO 120819 Β1

ο Λ	88,4	84,5	6*88	O 00
ιη
ο	σι		o	T-
	b~	CO	O	r-’
Λ	CD	σ>	*—	CD
	ο	CD	o	r-
ο	m	o	CD	o_
55	ΙΌ I	LO 1	7	ΙΌ 1
ΙΟ	CM		in	o
σ>	τ—	b~	o	CD
		co’	co’	Cm’
I-		s—*	s—
	CD	b-	co
0	b-	CO	co	°°-
•sf	Mt	co’	co
	b-	CM	00	in
ζ	CM	CM	o	o
	CO	CO	T““
		H
		X
		X
		0-		H
		'5	·	Ol OC
ζ		-4—* ω	05 L—	CL
ο ο		c	05	__
TD	o o	Q. φ	Σ3
<	JZ	Φ	cn	(/)
>	O	*—	H	C
	;—,	05	o
	l·- 1	tru	X X	rec
	X	c	CL	05
	X	φ
	X	Q_	(/>	Σ3
	t > X	> CL	IPV	C Φ
	>	E	E	Q_
	f	1	1 H	>
	H	1-	CL
	Q	Q	Q
	CL	CL	CL	h-
	O	O	O	CL
	X	X	X	Q

			b-	m
	CD	CD	b~	CM
	CM	CM	^r	m
CO	CM	CM	<N	co
O	0	O	CM	00
_1 O	3	rt CD	CD CO	o T“
x		**-**
	co	00	b-	<0
	co	CO	CO	CM
	CM	CD	00	b-
	V*			CM
	•Μ-	O	o	C0
	▼—	b-	CD	h-
	00	m	CO	co
CM	CM	CM	co	co
o	CO	b-	in	o
		co	o	o
—J	o	00	o	o
o	CM		CM	CM
CL
b-	co	in	b-
	CD	b~	CD	<J)
	co		m	in
	CM	CM	CM	CM
	CM	m	O	m
	co	b-	CD	m
	b-	00	CD	CM
O	co	t CD	1 CO	1
ț	co	00		O
o	m	m	m	CO
			<D
0.		co	CM	σΓ
	CM	T—	o	00
	CD	b-	b-	00
	CD	co	00	m
z	CM	CM	O	o
	CO	CO		v~
		H
		X
		X
		CL		H
				X
z		-4—«	-+—·	X
Q		4-· Φ	05 L_	X
o		c	05	__
	o	Q.	ZJ
<c	Ό	o	Φ
>	JZ	Φ	ω	(/)
o	ro	H	c o
	I- 1	=5 1—	CL X	rec
	CL	C	CL	05
	X	Φ
	0.	CL
	1 > n	IPV	IPV	C Φ
				Q_
	>	t	t	> Q_
	1 H	I h-	1 1—
	Q	Q	Q
	CL	X	X	R
	O	O	O	X
	X	X	X	Q

oo Μ

RO 120819 Β1 co m

hσ>

co io

DPT-mIPV pentru a reconstitui PRP-T (n = 105)	15,2 (17,3-19,0)	31,4 (27,2-36,2)	332,3 (264,6-417,3)	8,9 (6,8-11,7)	0,29 (0,22-0,38)	0,63 (0,51-0,78)
HCPDT-mIPV și PRP-T (separat) (n = 108)	102,6 (90,5-116,4)	165,3 (148,4-154,3)	355,0 (279,4-451,1)	40,5 (33,0-49,7)	0,36 (0,28-0,46)	1,61 (1,40-1,66)
HCPDT-mIPV pentru a reconstitui PRP-T (n = 322)	89,1 (82,5-96,1)	152,5 (143,6-162,0)	244,5 (211,4-292,7)	56,0 (49,4-63,4)	0,28 (0,24-0,33)	0,88 (0,80-0,96)
HCPDT-vIPV-PRP-T (lichid) (n = 324)	86,7 (10,9-93,0)	155,7 (147,2-164,7)	276,2 (242,2-315,1)	55,2 (48,7-62,5)	0,29 (0,25-0,33)	1,09 (1,00-1,19)
ANTIGEN	id	FHA	FIM	Pertactin	DIPH	I— LU 1-

σ>

RO 120819 Β1

HCPDT+OPV HIBRID+OPV (n = 85)	6,19	4,02	8*98	120,9	rrT	1215	1532	2110	7185	5363
HCPDT+mIPV 2 injecții (n = 81)	3,8 9	3,31	65,2	117,8	CD K CO	753,3	O o 1	8784	6620	8541
HCPDT-mIPV 1 injecție (n = 87)	4,99	3,25	80,5	112,8	L'LL	1210	1606	10242	10633	6798
HCPDT+vIPV 2 injecții (n = 84)	4,57	3,13	68,2	58,1	45,1	809,1	1285	5681	7861	7781
HCPDT-vIPV 1 injecție (n = 85)		3,17	73,9	92,9	63,8 I	922,7	1278	6677	10256	5771
ANTIGEN	Difteric	Tetanic	ΙΟ.	FHA	Pertactină	FIM	Aglutinine	Polio tip 1	Polio tip 2	Polio tip 3

CD

O in

co

in

O oi

o I—

I Q. CC CL (D e <D ,C -Q

E o O co O Q.

KQ C 3

(2 <ra

θ' $

QQ ΐ

O (Ό o

ιη t^.

Clasic/hibrid & PRP-T injecție separată în zile separate (n = 181)	32,4	’M’ CM	5,3	*r- CD σ>	136	87,5	168	315	682
Clasic/hibrid & PRP-T injecție separată în aceeași zi (n = 181)	00 o co	CO CO	6,6	κΓ	189	co σΐ CD	223	434	1033
Clasic/hibrid pentru a reconstitui PRP-T o singură injecție (n = 181)	59,3	N- CO	5,6	120	195	102	b- 00	430	1004
ANTIGEN	anti-PRP	Difteric	Tetanic	PT	CHO	FHA	Pertactină	FIM	Aglutinine

Φ CD

Claims (19)

1. Compoziție imunogenă multivalentă, pentru conferirea protecției la o gazdă împotriva bolii cauzate de infecția cu Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphteriae și poliovirus, compoziția cuprinzând:

a) toxoid pertussis, hemaglutinină filamentoasă, pertactină și aglutinogeni în formă purificată,

b) toxoid tetanic,

c) toxoid difteric și

d) poliovirus inactivat, care este formulată ca un vaccin pentru administrare in vivo la o gazdă, și în care, pentru fiecare doză unică umană, toxoidul pertussis menționat este prezent într-o cantitate de 5 până la 30 pg azot, hemaglutinina filamentoasă menționată este prezentă într-o cantitate de 5 până la 30 pg azot, pertactina menționată este prezentă într-o cantitate de 3 până la 15 pg azot și aglutinogenii menționați sunt prezenți într-o cantitate de 1 până la 10 pg azot.

2. Compoziție conform revendicării 1, care include un adjuvant.

3. Compoziție conform revendicării 2, în care adjuvantul este hidroxid de aluminiu sau fosfat de aluminiu.

4. Compoziție conform oricăreia dintre revendicările 1 la 3 și conținând 20 pg azot de toxoid pertussis, 20 pg azot de hemaglutinină filamentoasă, 5 pg azot de pertactină și 3 pg azot de aglutinogeni, într-o doză unică umană.

5. Compoziție conform revendicării 1, în care toxoidul difteric menționat este prezent într-o cantitate de 10 până la 20 Lf și toxoidul tetanic menționat este prezent într-o cantitate de 1 până la 10 Lf.

6. Compoziție conform oricăreia dintre revendicările 1 la 4, în care toxoidul difteric menționat este prezent într-o cantitate de 15 Lf și toxoidul tetanic este prezent într-o cantitate de 5 Lf.

7. Compoziție conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care poliovirusul inactivat menționat cuprinde un amestec de polioviruși tipurile 1, 2 și 3, inactivați.

8. Compoziție conform revendicării 7, în care amestecul menționat de polioviruși tipurile 1, 2 și 3, inactivați, este prezent în proporțiile:

20 până la 50 unități D antigen de poliovirus tip 1,

5 până la 10 unități D antigen de poliovirus tip 2,

20 până la 50 unități D antigen de poliovirus tip 3, într-o doză unică umană.

9. Compoziție conform revendicării 8, în care amestecul menționat de polioviruși tipurile 1, 2 și 3, inactivați, este utilizat în proporțiile:

40 unități D antigen de poliovirus tip 1,

8 unități D antigen de poliovirus tip 2,

32 unități D antigen de poliovirus tip 3, într-o doză unică umană.

10. Compoziție conform oricăreia dintre revendicările precedente, care mai conferă, în utilizare, protecție împotriva bolii cauzată prin infecția cu Haemophilus influenzae, compoziția menționată incluzând un conjugat al unei molecule purtătoare selectată dintre toxoidul tetanic și toxoidul difteric și o polizaharidă capsulară a Haemophilus influenzae tip b.

11. Compoziție conform revendicării 10, în care conjugatul menționat cuprinde un conjugat al toxoidului tetanic sau al toxoidului difteric și ribitol fosfat de poliriboză (PRP) a Haemophilus influenzae tip b.

12. Compoziție conform revendicării 10 sau 11, în care conjugatul menționat este prevăzut într-o formă liofilizată și este reconstituit pentru administrare în compoziția imunogenă menționată de componentele compoziției.

RO 120819 Β1

13. Compoziție conform oricăreia dintre revendicările 10 la 12, în care compoziția 1 imunogenă menționată conține conjugatul într-o cantitate de 5 până la 15 pg PRP conjugat la 15 până la 35 pg de toxoid tetanic, într-o doză unică umană. 3

14. Compoziție conform revendicării 13, în care compoziția imunogenă menționată conține conjugatul într-o cantitate de 10 pg PRP conjugat la 20 pg de toxoid tetanic, într-o 5 doză unică umană.

15. Compoziție de vaccin multivalent, conform revendicării 1, și care cuprinde, per 7 doza de 0,5 ml, următoarele:

20 pg de toxoid pertussis,9

20 pg hemaglutinină filamentoasă,

5 pg fimbrii 2 și 3,11

3 pg proteină membranară pertactină,

15 Lf toxoid difteric,13

5 Lf toxoid tetanic,

40 unități D antigen poliovirus tip 1,15

8 unități D antigen poliovirus tip 2,

15 pg fosfat de aluminiu.17

16. Compoziție conform revendicării 15, și care include, per doza de 0,5 ml, următoarele:19

10 pg polizaharidă capsulară ribitol fosfat de poliriboză (PRP) purificată a Haemophilus influenzae tip b, legată covalent la 20 pg de toxoid tetanic.21

17. Compoziție conform revendicării 15 sau 16, și care include, per doza de 0,5 ml, următoarele:23

0,6% 2-fenoxietanol.

18. Compoziție din oricare dintre revendicările precedente, pentru utilizarea ca 25 medicament.

19. Compoziție conform oricăreia dintre revendicările 1 la 17, pentru utilizarea la 27 fabricarea unui medicament pentru imunizarea unei gazde împotriva bolii.