PT95789B - Metodo para isolamento e purificacao de factores antigenicos da bordetella pertussis - Google Patents
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Classifications
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
O presente invento proporciona métodos aperfeiçoados para a sxtrscção e purificação a partir de uni caldo de fermsntsção ou sobrenadante da cultura de g. pertussis de um ou ambos os factores antiqênicos da toxina da tosse convulsa (PT5 e/ou do antigênio hemaglutinina filamentosa <FHA>„ São também proporcionados antiqénios PT e FHA purificados.
presente invento rslsciona-ss geralments com componentes para uma vacina contra a tosse convulsa. Mais específicamente;. o invento proporciona um processo para o isolamento e purificação de factores antigénicos da BordetelIa pertussis com um elevado rendimento e sob uma forma pura e estável» dos facto— rss purificados e suas ioisturas.
Fm.^m§Dlai_Ja_isxgiito
A tosse convulsa., ou pertussis» é uma doença altsmente infecciosa que afscta princioalmente as crianças» Para além de causar complicações respiratórias,, a tosse convulsa pode dar origem & lesões nervosas e a uma elevada mortalidade., particularmente em crianças pertencsntss a grupos socioecon«micos desfavorecidos s em recém-nascidos sem anticorpos anti-pertussis maternos» 0 agente etiológíco da tosse convulsa é o coccofcaci1lus gram negativo Bordetella pertussis» Pensa-se que a bactéria invade o tracto respiratório e induz um estdo tónico que permanece mesmo após a desaparição da bactéria»
Embora as organizações mundiais de saúde recomendem prssentemente a imunização das crianças a fim de evitar a incidência e a disseminação do pertussis, tem surgido grande preocupação em relação aos efeitos negativas de várias formas de vacina» A toxicidade das formulações de vacina convencional B» pertussis dá origem a efeitos secundários que variam desde o corar atê è. lesão neurológica permanente e/ou morte» Consequentemente» a utilização reduzida das vacinas com B„___gerlussis covencionsl resultou num aumento no número de casos de pertussis»
A vacina mais amplamsnte usada contss! organismos B = pertussis totais» que são inactivados após tratamento a 56*0 durante 30 minutos» Como as bastarias não são submetidas a qualquer outro tratamento de destoxificação, qualquer substancia tóxica que possa suportar a temperatura elevada é incluída na vacina & contribui para a ocorrência de efeitos secundários.. Uma outra consequência deste tipo de vacina é a formação tíe um amplo espectro ds anticorpos como uma resposta após a administração.. Os soros induzidos por essas vacinas não apresentam elevada especificidade e elevado potencial protsctor para utilização como tratamentos preventivos ou terapêuticos» e não têm qualquer valer como materiais de diagnóstico»
São preparadas outras vacinas pertussis a partir da produto flutuante na cultura ds 6» pertussis» Contudo,, variabilidades na cultura permitem que -a composição final do microorqanis— mo varie5 e os agentes de inactivação? glutaraldeido ou formaldeido., levam ocasionalmente a materiais agregados sujeitos a conversão em substâncias tóxicas activas após armazenamento» vacinas a1iernstivss são preparadas a partir de estirpes avirulentas ou com toxina deficiente» Contudo,, estas vacinas revelaram ser muito menos protectoras do que as preparadas a partir de estirpes virulentas» ver Wardla& et als 3» Meti» mero,, Eicl . ,, 9s89--100 C197Ó)»
Para evitar os efeitos secundários causados pelas
Q vacinas de células totais5 a pesquisa voltou—se para a investigação dos componentes tóxicos das bactérias B» pertussis para utilização em vacinas acelulares» Um componente importante é a toxina pertussis CPT)? uma sxotoxina proteica qus desempenha um papel principal na patogenese da tosse convulsa e que se pensa
ser o principal antigénio protector ds k, pertussis. Eft. A= Weiss st als Ann» Rev» Hicrobiol», 4ôs66i (1986)3,
Um outro componente de interesse para uma vacina de B» pertussis acelular é o antigénia„ haroaglutinina filamentosa CFHA), Este antigénio» isoladamente ou em combinação com PT3 revelou ter uma certa capacidade protsctora» Ver, por exemplo» Patente dos E.U.A» No» 4.563»303 e requerimento da Patente Europeia Mo» 231=083»
Í3s processos de purificação para isolar os antigénios PT e FHA a partir da célula total de B» pertussis foram publicados s dsrsffi origem a vários rendimentos, e a várias purezas dos componentes. Por exempla» a Patente dos Ε,ϋ,Α» Mo, 4,563=303 refere-se a purificação de FHA a partir da Bordatella adsorvendo™c num sulfato de celulose,, gel polissacarido ligado a sulfato de dextrsno ou um gel polissacarido de ligação cruzada, e facendo-se a eluição de FHA a partir deles,
J=J = Munes et al., Xnf» Xroroun», 32s243-250 C19S3) e o requerimento publicado Japonês No, 59,175439A referem-se a processos de fermentação separados para cada um dos dois factores PT e FHA s um meio de cultura para a produção ds FHA» Os métodos de separação e purificação descritos nestes documentos envolvem sxtracçSsSs precipitações, centrifugaçSes e diálises laboriosas e demoradas3 seguindo-se uma purificação cromatoqráfica, Esses processos exigem pelo menos uma semana para o isolamento de um único factor e são claramente não satisfatórios para a produção de antigénio ou vacina á escala comercial»
M» Chazono et al3 J» Bíol» Stand,, i 6 s 63-89 Cl988) e o requerimento da Patente Europeia No, 121,249 referem-se a PT e a FHAj coroo substancias principais da fracção de heroaglutinina λ
A.
total Sícrstads por B. pertussis par» ufcilisaçSc numa formulação ds? vacina na ossiãs proporção que ocorrem no caldo ds -fermentação. Para a extraeção e purificação da heroaglutinina o caldo da fermentação foi centrifuqado a fim de separar a massa celular, seguindo-ss precipitação a partir do produto flutuante mediada com sulfato ds amónio. □ precipitado foi purificado após redisse— loção por fi-jeio ds centrifugação de densidade da socross, seguindo-se separação e diálise» As técnicas utilizadas neste método envolvem manipulações de grandes volu/nes requerendo aparelhos complexos s sofisticados» tais como centrifugação continua para evitar exposição prolongada ao ar livre e manipulações laboriosas s frequentes. Isto dá origem a variações de lote para lote da composição antigénica do produto. Finalmente a pureza dos sntigê™ nios resultantes pode ainda ssr insuficiente devido a endotoxinas residuais s è. piroganicidada causada pala prolongada exposição ao ar livre.
¥= Ssto et al», Infect»__Immun.„ 415315-329 C19S3) descrevem um método tíe purificação utilizando principalmsnte cromatografia de afinidade» Neste sistema o caldo de fermentação é feito passar sobre hidroxipatite ssferoidal com um pH de cerca de 8, pelo que a maior parte do FHA s adsorvido, enquanto que o PT é eluido» A centrifugação antes da filtração sobre o adsor-vente evita o bloqueio do adsorvente por células e por detritos» que dão origem a um comportamento ds fluxo inferior, uma recuperação inferior, operação lenta e contaminação indesejável para os passas subsequentes» 0 produto eluido contendo a fraeção PT e ent§o ajustado para um pH de cerca de 6 e feito passar sobre uma outra coluna ds hidroxiapatite, em que o PT é retido» Ambos os factores são então posteriormente tratados sm sistemas completamente separados» Neste processo ambos os factores, após eluição a partir do seu veículo hidroxiapatite com uma solução apropriada tíe tampão/sal e reunião, são feitos passar sobre um suporte
X modificado com um ligando de afinidade tal como ssfarose de haptoglobina ou fetuina-sefarose, ao qual o Pt se liga selectivamente enquanto que o FHA permanece não afectado» A purifica·cão é então completada por precipitação» e/ou outro íraccionamsrvfco cromatográfico simples e/ou diãlise.
R„ D= Sekura et al, J „ Biol. Chem».; 25B s í 4647- í 465 1 <19835 descreve um método análogo, restrito apenas ao PT» Neste processo a extracção a partir do produto flutuante obtido por centrifugação do caldo de fermentação de B=_psrtussis é real içada adicionando resina azul Affi—Gel num lote so produto flutuante com um pH de 6, separando-α da fase liquida após um tempo de contactes de cerca de dois dias, fazendo-se a eluição do PT que se ligou especificamente ao corante Cibacron (devido à sua estrutura semelhante a NftD), com uma solução apropriada de tampão/sal e reunindo as fracções aclives» Para a primeira purificação é usada fetuina-sgarcse como suporte de afinidade para unir PT selectivaffients; após eluição a purificação é completada com uma cromatografia de fraccionamento simples s separação por salinização.
Embora os métodos cromatograficos de Sato et al e Sekura evitem a centrifugação zonal de esforço muito intenso e prolongado» eles requerem ainda a separação das células s dos detritos do caldo de fermentação» A adsorção do produto flutuante no lote, sem passagem da totalidade do liquido sobre uma coluna cromatográf ic-a tal como foi descrito por Sekura et al, constitui uma s-impl if icação no aspecto prático» Contudo, neste método existe apenas um componente alvo a ser isolado.
Um outro método de purificação cromatografica de apenas o PT foi referido por rk Svoboda et al, Anal. Biochem., 159s 402-411 < 198/=5=, 0 PT foi adsorvido a partir da cultura flutuante adicionando Seíarose Azul < um equivalente para outros suportes modificados ds Cibacron) num lote durante cerca ds 12 horas com pH ds 6s05 -filtrando o adsorvsnts e colocando-o numa coluna croínstográfics= Após & eluição s reunião a fracção PT foi imediatamente carregada nua veículo de Fenil-Sefarose, ao qual se ligou PT5 devido so seu carácter hidrofóbico5 s devido à elevada força iónica do meio» A eluição foi realizada com unia mistura de tampão/glicsrol com pH 1© com uma concentração salina relativamente baixs= As fracçSas reunidas foram diluídas e acidificadas atê pH S;:©3 carregadas em hidroxiapatite com HPT» e separadas dos fragmentos de PT restantes por eluiçao a reunião»
M= Christodoulides et al 5 Vaccine^ 5s199-2Θ7 Í19Q7) refere-se á extracçSo de PT e FHA da cultura de B» pertussis usando cromatografia do corante—1igando tendo como bs.se o processo de Sekura et al» 0 pH do fluido da cultura foi ajustado para 6=© s adicionou-se gel de Ssfarose Azul, 0 gel foi lavado com Tris-HClg sendo o tampão com pH 8S0S e o material ligado eluidos com o tampão contendo NaCl ls@I«fs pH 85©O
Y» Sato et al» Lancei, pp» 122-126 CJan„ 21» 1984) referem-se a uma vacina do componente pertussis preparada separando por salinizaçSo o antigênio FHA e o antigênio LPF-HA numa cultura de B. pertussis por precipitação ffaccionada» extracçSo em fosfatoj fraccionamento por ultracentrifugaçãos reunião das fraoçSes HA§ tíestoxificação com formalinas e adição ds adjuvante.
Ainda outras técnicas de purificação utilizam suportes para a adsorção selectiva de PT a partir tio produto flutuante da cultura ds B. pertussis, D Requerimento da Patente EuropeiaNo» 14©,38&A refere-se à utilização de ceruloplasmina humana ou animal desnaturada corno um ligando de afinidade que pode ser ligado à sefarose acticvada CN8r3 agarose» celulose ou dextrano.
A disponibilidade da suportas de afinidade em maiores quantidades e com uma qualidade constante e certificada constitui contudo uma desvantagem importante para a utilização comercial eni alta escala dos métodos de purificação presentemente disponíveis» Este tipo de suporte não pode ser estéril apresentando assim sempre o risco inerente de contaminação, especialmente com vírus, facto inaceitável na produção de produtos médicos humanos»
Continua assim a existir uma necessidade constante nesta técnica de se encontrar vacinas eficazes e inócuas contra a tosse convulsa» assim como instrumentos diagnósticos convenientes para uma detecção precoce da infecção pela B» pertussis»
Resumo do Invento
Num aspecto o presente invento proporciona um processo aperfeiçoado para uma extracção rápida» simples s inócua de factores sntígênicos de B» pertussis altemente purificados a partir de um caldo ds fermentação ds 8, pertussis» Desejávelmente os factores extraídos são a toxina de pertussis (PT) s/ou hsmaylutinina filamentosa (FHA)»
Este processo envolve fazer contactar um caldo de fermentação total ou um produto flutuante da cultura sem células contendo um ou ambos estes antigênios de B. pertussis com um absorvente contendo hidroxiapatite capaz de adsorver ambos as antigénios» Este adsorvente, após u® período de contacto apropriado com o caldo» é então separado do caldo» Uma solução contendo PT e/ou FHA parcialmente purificadoCs) e em seguida -elui-da a partir do adsorvente em condiçSes apropriadas de pHs força tónica e temperatura»
Este procssso produz estes fsctares com bons rendimentos s sob uma forma concentrada ε parcialmente purificada a qual pode ser fâcilmente esterilizada pior filtração através de membranas microporosss» Quando aplicado ao caldo de fermentação total,, o processe evita a necessidade de centrifugação piara efectuar & remoção de células bacterianas a fim de se obter um produto flutuante sem células.
Um outro aspecto do presente invento envolve uma modificação do método anteriormente referido,, permitindo posterior purificação da solução contendo PT s/ou FHA. Além do método descrito anteriormente5 passos adicionais a seguir aos processos de extraeçao do invento permitem uma purificação posterior de um ou mais factores antigénicos. Estes passos adicionais envolve·?? a exposição da solução descrita anteriormente a dois processos sequenciais de cromatográfia de coluna. Uma das cromatográfias utiliza uma coluna cromatográf ica de ligando apoiar,, De preferencia a cromatográfia do ligando apoiar é o primeiro dos dois processos,, A eluição da mistura de PT e FHA parcialmente purificada a partir destas duas colunas produz uma mistura purificada dos antigénios sob uma forma essencialmente livre de endotoxinas e de outros materiais proteináceos=
Ainda num outro aspecto deste invento os factores PT s FHA na mistura resultante dos passos de purificação anteriorments referidos podem ser facilmente separados um do outro sem contaminação mútua pela aplicação de um passo de cromatográfia de exclusão de tamanhos convencional„
Este método modificado do invento permite que os factores PT ou FHA sejam produzidos com um bom rendimento com um nível de qualidade aceitável para utilização corno factores imunogénicos ou precursores para administração a seres humanos,.
Adieionslínsntsg o procsssa pode ssr rapidamente adaptada á produção industrial em grande escala=
Ainda num outro aspecto5 o presente invento proporciona factores antigénicos da B, pertussis altamente purificados, mais sspscificsmente PT s FHA5 em grandes quantidades produzidas pelos processos do presente invento. Estes factores permitem o desenvolvimento de vacinas coo componentes inócuos e potentes contra a
B„........pertossis* quer os factores sejam utilizados individualmente quer como misturas juntemente coo vacinas contra outros organisíbosj virus ou doenças. Estes factores purificados proporcionam os materiais básicos para a produção de soros anti-B,___oertussis* úteis na prevenção» diagnóstico ou terapêutica da infecçSo por B» ag£-ty.ssis =
Outros aspectos e vantagens do presente invento são descritos posteriorments nas descrições detalhadas que se seguem de apresentações preferidas do presente invento»
Descricão Breve dos desenhos ã Fig, 1 representa t® perfil de eluição registado a 28® nm do pico proteico obtido após realização do método do invento tal como foi descrito no Exemplo 1=
A Fig, 2 representa um perfil de eluição registada a 2S® nm do pico proteico a partir do primeiro de dois passos cromafcográficos do método deste invento tal como foi descrito no exemplo 2=
A Fig, 3 representa um perfil de eluição registado a 2Θ® nm da pico proteico a partir do segundo passo croínatográfico do método deste invento tal como foi descrito no Exemplo 2=
A Fig» 4 representa um psrfil ds sluição registada &. 28® n® dos factorss sntigénicos PT e FHA separados por cromatografia de exclusão de tamanhos tal como foi descrito no Exemplo ^sco.cto_yetalhãdA^.._íllvento
Q presente invento proporciona métodos aperfeiçoados para a extracção e purificação a partir de um caldo de fermentação ou. cultura de B» pertussis de uss ou mais factarss antigérsicos. São particularments proporcionados por este invento métodos de purificação para os factorss PT e/ou FHA» São também propcsrcionsdos por este invento misturas de antigénios PT e FHA purificados» s formas purificadas dos antigénios individuais»
Um método do presente invento proporciona a extracçao de PT e/ou FHA de um caldo de fermentação ou de cultura ds Bordetel1a pertussis» várias estirpes de B» pertussis para utilicsção nos métodos deste invento são descritos e encontram—ss rapidamente disponíveis a partir de colecçSes comerciais» tais como a American Type Culture Collection, Rockvills,, Maryland» Qualquer uma destas estirpes disponíveis pode ser usada nos processos do presente invento, contanto que sejam capazes de produzir pelo menos um, e de preferencia ambos, dos factorss sntigénicos desejados5 PT e FHA, em quantidades adequadas num saio de cultura liquido»
Exemplos de estirpes que podem ser utilizadas no presente invento incluem» sem limitação» S =_pertussis fase I» B» pertussis fase II» B» pertussis fase I CS, B» pertussis Tohama, S.i_psrtussis estirpe Ítí5—a®, B= pertussis estirpe 18-323, B» pertussis estirpe 134, B»_pertussis estirpe 5®9, B»_pertussis estirpe Wellcome 28, e Office of Siologics B» pertussis estirpe
165. Uma estirpe preferida para utilização no presente invento é
B,____pertussis fase 1, Tohama, que se apresenta disponível a partir do Institute of Fermentation5 Osaka. uapan. sob o número ds acesso IFD-14073»
Para utilização no presente invento a estirpe de B pertussis pode crescer por uma série de meios conhecidos pelos especialistas nesta técnica,São conhecidos vários métodos de cultura que utilizam diferentes passos de cultura, e meios líquidos e sólidos, dependendo da quantidade e da origem ou método de conservação da sementeira em meio de cultura. Contudo, é suficiente qualquer método conhecido para utilização no presente invento que proporcione um inóculo de um tamanha convencionalmente aceitável para produção em larga escala,,
Um meio apropriado para o crescimento de um inóculo de B. pertussis pode ser selsccionado por qualquer especialista nesta técnica, sem limitação, meio Gengou LEPA 82/303465.53ρ os meios descritos em N. Andorn st al, Appl. Microbiol. Biotechnal., 2Ss356-360 <19885 e referências alí citadas§ meio verway CPatente dos E.U.A. Nd. 4.784.5893? meio sintético B2 CP. Van Hsmsrt, in Prog. índust. Microbiol., (Buli, M„J„, sd), vol. 13, p. 151, Elssvier Sei., Amstsrdam <1977)3 ou suas modificaçSes descritas.
Para o crescimento da cultura de B. pertussis., que é o material de partida do presente invento, adiciona-se um inóculo a um meio líquido apropriado s a fermentação é realizada utilizando métodos de fermentação e fsrmentadorss convencionais conhecidos na técnica. Os especialistas nesta técnica apsrscsbsr-se—ão de que podem ssr obtidos resultados diferentes dependendo da seleccão de uma determinada combinação de fermentador, meio tís fermentação, método e parâmetros convencionais. As combinaçSes preferidas para utilização no presente invento são as apropriadas para utilização soí produção soí grande escala, fa.xemplos dessas combinações de métodos,, aparelhos e meios são exemplificados em EPA Ste. ©77.646? EPA 121.249? EPA 239.S©4? Andorn et al;i Sato st ai C1933>? Sekura et al and Svoboda et al5 todos citados anteriormente, s aqui incorporados como referência. Os métodos descritos sm EPA 121.249= Andorn et al? citados anteriormente,; e EPA
239.. 504 são os mais preferidos.
Na prática deste invento, depois da fermentação ficar completa, o caldo ds fermentação de B, oertussis é mantido numa condição estéril para evitar a desnaturação e/ou degradação dos factores PT ou FHA desejados. Os dois antigénios sSa extraídos a uma temperatura variando entre 1 e 25*C„ Numa apresentação preferida do invento o caldo ê arrefecido atê Í-1©°C e mantido a esta temperatura, 0 pH é ajustado para menos de 7=,0, De preferência o pK á ajustado para um valor variando entre cerca de 6=,® s
6.. 4 com ácido fosfórico ou acético. Pode facultativamente ser adicionado ao caldo um agente preservativo. Por exemplo,! fcimero-sal pode ser adicionado ao caldo até uma concentração final de até ©=,2 g/1 ou pode-se adicionar ao caldo 2-fsnoxi-etanol atê uma concentração final variando entre 0,,37= e 1a„ Se desejado, pode-se adicionar também um agente preservativo às soluçSss de tampão usadas no processo deste invento.
Como um primeiro passo facultativo no método do invento. o caldo ds fermentação pode ser feito passar sobre um filtro a fim de dele remover partículas s bolinhas pequenas, contanto que se evite o contacto com riscos de contaminaçao a partir do meio ambiente.
De acordo com o método5 adiciona-ss ao caldo de fermentação hidroxiapatite CHO-apa) sob uma forma apropriada para sedimentar mais facilmente do que as células ou partículas celulares pequenas no caldo* Numa apresentação preferida,, o método do invento utiliza meios fisicos ou passos do processo adicionais a fim de facilitar a separação da HO-apa do liquido total da cultura e a fim ds minimizar o tempo ds contacto entre o liquide s o adsorvente* Por exemplo, o adsorvente pode ser introduzido no caldo de cultura num suporte ou veiculo ssmi-permeável* Numa dessas apresentações preferidas a HO-apa apresenta-se sob forma crstalina ou è ligada, adsorvida ou fixada num material cie suporte que proporciona as partículas de HO-apa com uma densidade especifica suficientemente diferente da densidade da maior parte tías partículas no caldo ds cultura* Formas preferidas do adsorvente HO-apa íâm uma densidade aparente igual ou superior a 1,15 para facilitar a separação do PT e do FHA adsorvidos na HO-apa a partir do liquido por meios convencionais*
Numa outra apresentação preferida do invento o adsorvente HO-apa ê realizada num suporte que aumenta a granulometria, porosidade e propriedades mecânicas do adsorvente* Os suportes preferidos tâm um tamanho granular de 60 um ou maior* e um tamanho de poro que permita a difusão de ambos os antigénios, correspondendo a um limite de exclusão de 30© KDa ou maior* Esses adsorventes podem ser obtidos fixando HO-apa no interior, ou ligando ou adsorvendo HO-apa sobre estruturas suficientemente porosas e rígidas compatíveis com o meio de cultura* Esses suportes incluem, sem limite, sílica, alumina e outros suportes porosos inorgânicos, ou resinas orgânicas, ou suportes de gelificação bio-orgãnicos, tais como acrílico, vinilico, agarose, celulose ou uma mistura* Estes suportes podem ser eventual-mente estruturados ou endurecidos por ligação cruzada* Encontram-se comsrcialmente disponíveis vários suportes desejáveis* tais como HA-Utrogel EBF, Francel ou HA-TSK-Bel, HA Type CTOYD 50© Mfg* Co** áapanl* Estes suportes permitem boas caracteristicas de fluxo e suficiente poder de separação, com uma capacidade de adsorção máxima para gs factores biológicos desejados» fí utilização de HO-apa transportada nsstss suportas -facilita a embalagem e lavagem do suporte numa coluna cromatográfica3 e a subsequente sluição dos Tactores desejados» É também preferido que o absorvente seja estéril para utilização no presente invento»
V
De acordo com a prática do presente invento o absorvente HO-apa é adicionado ao caldo de cultura de B,.- nertussis numa quantidade minima de pelo menos ô;;5 gramas de HO-apa por litro do liquido de cultura» Orna quantidade preferida de HO-apa varia entre ©»5~2»© gramas de HO~-apa por litro do liquido de cultura» absorvente é então deixado em contacto com o liquido de cultura durante um período de tempo suficiente para permitir uma adsorção quase completa dos componentes desejados no adsorvente» Beralmente» o tempo necessário para adsorção completa pode variar entre 5 minutos s 3© horas» Com maior preferência o tempo de absorção varia entre 6 e 24 horas9 usualmente durante a noite» Durante o tempo de adsorção5 o caldo tíe cultura é de preferência agitado suavemsnte» Os meios mecânicos tais como agitação ou bombeamento podem também ser utilizados durante o tempo ds adsorçãog permitindo um contacto mais intenso do líquido de cultura com o adsorvente»
Depois da reacção ficar completay o adsorvente ê separado da massa do líquido de cultura» gsralmsnte por sedimentação no fundo do recipiente que contem o caldo de cultura» 0 liquido da culturs pode facultativamsnte ser transferido do fsrmentador para um outro tanque ou recipiente com capacidade aumentada para a separação do adsorvente» Por exemplo^ um recipiente com um fundo cónico permite a separação após sedimentação do adsorvente» Alternativamsntes pode ser utilizado um recipiente permitindo a decantação do liquido de culturs a partir do adsorvente depois da maior parte dos factores desejados terem sido adsorvidos no HO~aps= A retenção selectiva do adsorvente pode ser melhorada por meio de técnicas tais como filtração, fluidização ou centrifugação»
Após separação da massa do liquido de cultura5 o absorvente é lavado extensivamente com uma solução tamponada com força iónica baixa entre 5 s 2@ô mM» 0 tampão tem desejavelmente um pH entre 5 e 8» 0 passo de lavagem pode ser realizado a uma temperatura variando entre aproximadamente 1 e S^C» Este passo de lavagem remove a maior parte das restantes células e dos restantes constituintes indesejáveis do caldo de fermentação original» De preferência, o passo de lavagem utiliza um tampão tendo um pH variando entre cerca de 5,3 e 7 e uma força iónica inferior a 130= Uma temperatura particularments desejável para esta lavagem varia entre aproximadamente 4 e 8°C»
Os sistemas tampão usados no presente invento podem ser quaisquer uns dos utilizados habitualmente para o tratamento de factores biológicos e que são bem conhecidos pelos especialistas nesta técnica» Limitações nos sistemas tampão convencionais úteis são constituirias simplesmente pelo facto do tampão seleccionado dever actuar com as variações desejadas do pH e da força iónica e tíe não interactuar negativamente com os factores antigénicos desejados, com a HO—apa ou com o seu material de suporte» Exemplos de tampões para utilização neste invento incluem, sem limitação» fosfato» borato, acetato» carbonato» Tris» e tampões ds amónio» absorvente è subsequentemente colocado numa coluna s os factores antigènicos nele adsorvidos são eluidos a partir do suporte com um pH quase neutro e numa solução salina tamponada com uma força iónica elevada superior a 20© mM» Desejávelmente a
eluição é realizada a tinia temperatura vsrisnds sntrs 1 a 15*C= A eluição ê de preferencia realizada com um pH variando entre cerca de 6,0 s 9,0 com uma solução salina tamponada, é também preferida tuna temperatura cie aproximadamente 4 a S°C= A solução salina pode ser composta por qualquer um dos sais usualmente aplicáveis neste campo, e bem conhecidos por qualquer especialista nesta técnica,, Exemplos da sais incluem, sem limitação, sais de Ma, Ca, K, Mg, amEnio sob uma forma solúvel a partir dos seus cloretos ou sulfatos.
Nas apresentações mais preferidas do invento tampões fosfato com apenas dois níveis de pH e apenas duas diiuiçSes por pH são usados como um conjunto padrão, aplicável para os passos ds lavagem e de eluição, assim como quaisquer passos adicionais no método de purificação e separação do presente invento,, A utilização deste tampão simples resulta numa menor preparação e manipulação e permite uma rápida performance dos passos do método, reduzindo considerávelmente os riscos de dssestabilização dos factores e contaminação, Além disso, os tampSss fosfato são muito compatíveis com a HO-apa, que também contem grupos fosfato.
Assim, numa apresentação preferida do invento, o suporte HO-apa no qual os factores antigénicos foram absorvidos õ extensivamente lavado primeiramsnte com tampão A1 (fosfato 1Θ-15 mH, pH 5,5-7,0) e depois com tampão A,? C fosfato 50-300 mM, pH
3,5-7,0) com maior força iónicar Os factores antigénicos são então eluidos em conjunto aplicando tampão b2 (fosfato 100-500 oiMj pH 7,2-3,0) suplementado com NaCl (Θ-7Θ0 mM) s os factores proteicos activos são reunidos.
Numa apresentação deste invento só ê armazenado o primeiro pico de proteína para evitar contaminação grave com sndotoxinas, Para evitar contaminação a partir das restantes
células de 6.___pertussis após eluição, ss fracçSss reunidas são submetidas a uma filtração estéril convencional» método do presente invento resulta assim numa mistura dois dois factores antigénicos desejados numa solução» Estes factores em solução são caracterizados por um nível de pureza de pelo menos 3©x» Tipicamente o nível de pureza è superior a 5©%»
Na solução, os factores t®'m uma concentração específica superior a 5© mg/1 para PT e/ou superior a 20© mg/1 para FHfi tal como é determinado por imunoenssio especifico utilizando anticorpos preparados em cabras s em coelhos imunizados com os factores antigénicos purificados» Para as técnicas envolvidas nestes imuno ensaios, ver V» Sato et al, Infect. Immun», citados anteriormente» 0 nível das sndotoxinas residuais na solução contendo os factores isolados pelo método do presente invento è inferior a A
ΡίΠ©·~ unidades de endotoxxna por mg tíe proteína, tal como é determinado pelos testes convencionais de lisado de amosbocito limulus » Estes testes são conhecidos pelos especialistas desta técnica e encontram-se comercializados» ft pureza destes factores parcialmente purificados e os rendimentos obtidos oferecem vantagens importantes em relação a misturas destes antigénios resultantes de outros processos de purificação conhecidos nesta técnica» Partieularmente, esta mistura contem PT e/ou FHA parcialmente purificado(s) sem fragmentos mais pequenos resultantes de fenómenos proteolíticos» também de acordo om a prática do presente invento, os factores antigénicos na solução anteriormente descrita podem ainda ser purificados a partir das proteínas, lípidos e outros contaminantes restantes» Passos de purificação adicionais do presente invento incluem dois passos cromatograficos passos
subsequentes. Estes passes pedem ser realizados,, sem necessidade de separar as deis factores a partir da solução.
Embora os passos cromatográficos possam ser realiçados em qualquer sequência seguindo as condiçSes aqui indicadas. é descrita mais abaixo uma apresentação preferida deste invento. Esta apresentação preferida evita passos consumidores de tempoy tais como dessalinização,, diálise ou concentração, e reduz o risco de contaminação residual a partir do sistema solvente da primeira cromatografia.
De acordo com este invento,, um dos passos cromatoqráficos. de preferência o primeiro na sequência, envolve a carga dos antiqénios parcialmente purificados na solução anteriormente referida, com um pH neutro ou ligeirsmente alacalino variando entre cerca de 6„ô e 9?@? e força iónica elevada5 de preferência entre ô?2 e 1.5 Ms num suporte comum.
Exemplos de suportes para utilização neste passo do invento incluem,, sem limitaçSo? celulose. acarose. dextranos acrílico e outros polihidratos de carbono e os seus derivados com 1 inação cruzada ou de qualquer outro modo modificados ou resinas porosas ou suportes inorgânicos aos quais estão ligados ligsndos apoiares numa quantidade suficiente para conferir ao veiculo um caracter hidrofóbico. Os liqandos apoiares podem ser quaisquer compostos aromáticos ou lineares. ramificados ou cíclicos não contendo outro grupo polar ou reactivo^ tais como o envolvido na ligação com o suporte.
Tornar-se-á claro para qualquer especialista nesta técnica que o tipo de grupo apoiar seleccionado·, s o volume s o grau de substituição no suporte constituem parâmetros que
determinam a capacidade ds cada suporte final para absorver os antigénios desejados»
Numa apresentação preferida do invento o suporte para o primeiro passo ds purificação é uma matriz polimérica comum à qual estão unidos os ligandos apoiares sob a forma de fenilo, alquilfsnilo, ou grupos alifáticos lineares, substituídos ou não substituídos, contendo de 2 s 26 átomos de carbono» Alguns veículos comercializados para este fim são, por exemplo, Butyl-TSK, ou Octyl-TSK (Merck)» ou Phenyl ssphsrose (Pharmacia Fins? Chemicals), ou Butyl Sepharose (pharmacia Fine Chemicals)»
Numa apresentação mais preferida do invento o suporte para este primeiro passo de purificação e seleccionada a partir dos que se caractsrizam por maior rigidez ou ligação cn.í2sds5 por exemplo, TSK» o que permite uma purificação mais rápida devido a melhores características de fluxo» Numa apresentação mais preferida, a presença de ligandos alifáticos, tais como bufcilo ou octilo, sobre o suporte permite a mais eficiente ligação e purificação dos factores antigènicos»
Este suporte έ ainda earacterizado por uma para ligar simultâneamente e completamsnts os dois após exposição a uma força iónica elevada» Em condiçSes ds força iónica elevada, por exemplo superior a 0,2 fi, os antigénios aparecem numa forma mais polar» capacidade antigénios
Os sistemas tampão usados nos passos cromatograficos indicados mais abaixo podem ser quaisquer uns dos habitualments usados para o tratamento de factores biológicos, contanto qus apresentem as desejadas variações indicadas do pH s da força iónica e que não apresente??? ínteracçSes negativas com os desejados factores antigènicos nem com o adsorvente» Exemplos de
tampões para ssts finalidade incluem, sem limitação» sistemas tampão de fosfato» acetato, carbonato» trisetanolaminomstano e amónio» Para força iónica baixa» as concentrações do sal tampão são mantidas haixasg para força iónica elevada, as concentrações do sal tampão são elevadas, ou, de preferência, são adicionados ao sistema sais não tampões extra» Estes sais podem ser qualquer uns dos usualmente aplicáveis neste campo, sendo bem conhecidos dos especialistas nesta técnica, por exemplo sais de Na, Ca, K, mg, amónio sob a forma solúvel dos seus cloretos ou sulfatos» Na apresentação deste invento mais preferida, os tampões fosfato com apenas dois níveis de pH e apenas duas diluições por pH são usados como um conjunto, tal como foi descrito anteriormente e no Exemplo 2=
Os antiqénios adsorvidos neste veiculo são então lavados a fim de remover a ínaior parte das endotoxinas e restantes impurezas menos importantes com uma solução de sal tamponada (pH 7,@ a 9,0) ligeiramente alcalina» De preferência a solução de sal temporada B2 ê usada para a lavagem do suporte»
Os dois antigénios são eluidos juntamente utilizando tampão acidico (variação do pH de 5,@ a 7,0) com uma força iónica de baixa a média, por exemplo» i© mn a 30© mM, suplementado com um detergente» De preferência, o tampão A2 suplementado com detergente é usado para a sluição dos dois antiqénios» 0 detergente pode ser qualquer detergente não iónico solúvel na água» Numa apresentação preferida o detergente não iónico é um álcool de ácido gordo etoxilado, por exemplo, Twssn series CICI, UK), Triton-X—series CHohm and Haas» USA/» Berol series CBerol» Denmark), ou Harlipal series CHuls, Bermany), e é adicionado ao tampão numa proporção de ©,5 a 25ΐί» Os detergentes mais preferidos são Berol 185 CBerol) e Marlipal 24/8© CHuls), que permitem uma sluição rápida com apenas @,5 a 5»©X de detergente» Após este passo ds eluição» as fracções contendo os antigénios são reunidas.
outro passo cromatográfico útil neste método envolve a carga da solução antigénics do passo de extracção3 ou de preferência,, a fracção antigsnica reunida a partir do primeiro passo cromatográf ico com pH ligeiramente acídico CpH S5® a 7,,0) e com força iónica baixa Cl® roM a 2®® mfv!) num segundo veículo capaz de reter ambos os antigénios. Este passo permite a remoção do detergente a partir do passo anterior.
segundo veiculo capaz de reter ambos os factores antigénicos & de preferância um veículo hidroxiapatite» Exemplos ds veículos para esta utilização incluem hidroxiapatite,, pura,, apoiada sobre,, ou fixada em» outro material veículo,, ou um suporte gel modificado Cibacron--azul habitual mente usado no campo biológico s bioquímico» Outros veículos descritos anteriormente que são capazes de absorver ambos os factores antigénicos desejados com um pH que varia desde ligeiramente acídico a neutro (pH a 7,®) e com uma força iónica baixa Ci® mM a 2@® mM) são úteis neste invento. 0 suporte preferido é um adsorvente comercializado com boas características de fluxo e resistência ínecãnica» que retem ambos os antigénios quando contactados com um pH de õ5® a 7=,® com força iónica baixa. Exemplos desses veículos sao5 sem limitação» HA Ultrsgsl (IBF,, France)» Trisacry1-Blue (IBFg France). Blue sspharose gel <Pharmaoia? S^sden)5 Affigel Blue CBioRad» USA) e seus equivalentes» Para este passo de purificação
Trisacryl Blue é o adsorvente mais preferido»
Os antiqénios suportados são então lavados com uma solução tamponada com força iónica baixa,, e sluidos em conjunto com uma solução tamponada 1igeiramente alcalina CpH 6.® a 9»®> com força iónica elevada superior a 2@® mM. De preferência a •V solução tamponada A2 é usada para a lavagem e a solução salina tsmponad-a B2 ê usada para a sluiçao dos antigénios» AIternativamente, os dois antigénios são eluidos som um gradiente linear de NaCI em tampão fosfato. As fracçSes activas são idsntifiçadas por imunosnssios específicos ívsr Sato et al, citados anteriormente J s reunidas»
Neste estádio as fracções antiqénicas desejadas são obtidas sob a forma de uma mistura de dois antigénios altsmsnte purificados numa única solução» Típicamente, apenas ss 5 suhunidades proteicas que constituem a toxina pertussis e 220 espécies de KDs FHfi são detecfadas por electroforese com gel BDB» D FHft é f requeri temente obtido por meio de outros métodos de purificação sob a forma ds uma mistura de espécies proteicas mais pequenas, que correspondem aos produtos de degradação das espécies 22© kd» Ver, por exemplo, T = L = Cowell et sl, em ‘‘Bactsrial Vaccinss, Vol Ivs371.---3795 Eoboins, Hill» Sadoff eds» » Thienne-Sratton, Meta York (1782)= Assim, uma vantagem adicional deste invento è a purificação ds espécies de FHA intactas a partir de outros produtos ds degradação» 0 conteúdo de endotoxina dos antigénios purificados, medido pelo teste de amoebocito limulus, é inferior a í© unidades de endotoxina por mg tíe proteína.
Nesta forma os antigénios podem ser usados numa reaeção tíe toxoidação, isto és usando formalina, glutaraldeido, perôxido de hidrogénio, tstranitromstano ou outras agentes de inactivação» Esta mistura pode também ser usada como uma solução de cultura com antigénios purificados a partir da massa para a preparação de vacinas utilizando técnicas normalmente aplicadas na técnica das vacinas» Por exemplo, a mistura pode ser submetida a processos convencionais para filtração estéril, destoxificação» correcção de concentrações e adição de adjuvantes normalmente usados na administração de vacinas, tais como hidróxido de alumínio» fosfates ds alumínio ou cálcio» AIternstivamenis a solução pods ser utilizada para vacinas em combinação com outros antigénios ou toxoidss contra a mesma ou outras doenças»
Se» contudo» se desejarem relaçSes entre os dois antigénios B» pertussis diferentes ds relação existente na solução da mistura resultante ou se se desejar apenas um único antigénio para utilização como cins-a vacina, agente diagnóstico» etc»» os dois factores podem ser rapidamente separados um do outro sem contaminação cruzada tendo como base os seus pesos moleculares» Técnicas convencionais para a separação do PT do FHA na mistura incluem cromatografia de exclusão num suporte ds gel típico» uma técnica bem conhecida dos especialistas desta técnica» Esses geles de axclusão cromatografics são geralments comercializados, por exemplo Sephacryl gel (Pharmacia)» Por exemplo» se se desejar a separação dos dois factores puros,, a reunião final ds sniigênio pode ser carregada num gel Sephacryl S200--HR» após corrscções em relação à concentração proteica,, sendo os antigénios subssqusntsmente eluidos a partir deste gel usando o sistema solvente BI (tampão fosfate mM, pH 5,5-8,5 contendo 30Ô-70® mH de RsCl> =
Assim o método do presente invento aqui descrito é carac terizado por uma série ds vantagens e<n contraste com os métodos da técnica» Por exemplo» diferentemente dos métodos anteriores de purificação de qualquer um destes dois antigénios, o método do presente invento permite inesperadaments a extrscção sslecfciva ds ambos os antigénios PT e FHA da cultura de B» pertussis por meio de um único passo de adsorção» e sem prévia remoção de células e de detritos da centrifugação» 0 método deste invento evita assim a utilização de suportes modificados de ligsndos de afinidade humanos ou animais, específicos, e não
rapidamente disponíveis, usados frsquantsfflsnts nos métodos das técnicas anteriores, método deste invento é também realizado fácilmsnte s rápidamente devido ao facto de não serem necessários grandes v volumes de culturas de fermentação, 0 método do presente invento contribui também para a qualidade s pureza dos factores antigéni-cos finais pelo facto de poder ser realizado rápidamente e, se desejado, em condições completamente estéreis, A contaminação externa pelo contacto com a atmosfera ou por material biológico estranho, tal como liqandos de afinidade,, e a contaminação inferna a partir de desnaturação ou degradação térmica sao máximamente evitadas por este processo, έ também surpreendente o facto ds? em contradição com as expectativas de qualquer pessoa especializada neste campo,s & com as observações de Svoboda st al e Sato st al, citadas antsriormsnte, este processo eliminar as dificuldades de impedimento de fluxo por células aderentes ou por fraca resistência mecânica ou interferência de monitorização com UV pelos ácidos nuclsicos absorvidos. Pensa-se que a utilização de hidroxiapatite como o primeiro passo ns purificação total sem prévia centrifugação do líquido de cultura constitui a principal vantagem deste processo.
Uma outra vantagem do método do invento é constituída pela utilização de suportes cromatoqráficos sintéticos comercializados, Esses suportes sintéticos proporcionam ao método e aos v factores antigénicos purificados resultantes as vantagens de esterilização s inocuidade melhoradas e segurança para utilização humana, Surpreendentemenie* alguns suportes cromatograficos préviamente descritos para a purificação de PT e de FHA? ou para a adsorção selectiva de um dos dois antigénios sem grande retenção tío segundo factor,, revelaram ser satisfatórios no método
deste invento para adsorverem e eluirem os dois factores desejados síb conjunto ao actuar com uma variação especifica do pH s da força íónica proporcionada por este método.
Os métodos do presente invento também reduzem a manipulação das fracçSes activas após reunião5 reduzindo desse modo o risco ds contaminação, Devido às suas numerosas vantagens. o processo do presente invento é útil no isolamento s purificação ds cada um dos factores, PT ou FHA? separadamente ou eni combinação ,
Os exemplos que se seguem sao apenas ilustrativos e nao limitam o âmbito do presente invento.
EXEMPLO is Método de Extracção
Uma cultura de B, aertussis fase Σ, Tohania é fermentada em meio de Stainer-Scholte modificado de acordo com o método s condiçSes descritos em EPA 239=504, que & aqui incorporada como referencia.
Depois da fermentação ficar completa, o caldo de cultura é arrefecido ate entre 1-10*0, e o pH é ajustado para cerca de 6,2 com ácido fosfórico, 0 preservativo, timerosal de sódio, é adicionado ao caldo numa concentração final de 0,1 g/1, g (3% v/v) de suporte HA-Ultrogel são adicionados ao caldo e deixados em contacta com o caldo durante a noite com agitação suave, Depois de se deixar o antígênio absorvido no suporte sedimentar, ele é separado da massa do caldo de cultura e lavado repetidaments com tampão fosfato CpH 6,2, 1® mM),
Depois de uma primeira lavagem, o adsorvsnte é aplicado a uma coluna de Amicon (tipo 69® > , é então aplicada uma segunda lavagem com tampão fosfato (10® mM, pH 6,2) e os factores antigênicos são eluidos em conjunto aplicando tampão fosfato CpH 7,6, 20® mM), suplementado com NaCl (500 mM), pico proteico activo é reunido. Um perfil de eluição típico é ilustrado na Fig, 1 (monitorização com Uv a 280 na).
Este processo resulta assim numa solução contendo uma mistura ds PT e de FHft numa forma parcialmente purificada. Esta solução á então submetida a filtração estéril.
Os factores aníigénicos parei lamente purificados ds solução do Exemplo 15 dissolvidos em tampão fosfato (pH 7 = 63 2@© mn)» suplementado com NaCl (5©® mH) são carregados sem qualquer ouiro tratamento num veiculo Butyl-TSK equilibrado préviaments com o mesmo tampão»
Os antigénios adsorvidos são lavados com o mesmo tampão que foi utilizado anteriormente3 sendo assini o nível de endotoxina ainda diminuído por um factor ds cerca de 5® s cerca de i=©©©» Os antigénios são co-eluidos com tampão fosfato (20® mil5 pH 6P2) ao qual sa adiciona 2?2a de detergente Berol 185 (Berol ;= Dsnmark)3 e as fraeçoes activas são reunidas» Um perfil de eluição típico é proporcionado na Fig» 2 Cmonitorização com LkV» a 2S0 nm)»
A reunião a partir deste primeiro passo de purificação oromatoqrâfica é então diluida com água sem agentes piroqêriicos até uma concentração inferior a i@® mM» e carregada em Trisacryl Blue equilibrado com tampão fosfato (5® mMs pH 6;!2>» Este adsorvente é lavado com o mesmo tampão para remover todos os vestígios tíe detergente» Os antigénios desejados são em seguida sluidos conjuntamente com um gradiente linear í© a o©© mM) ds NaCl em tampão fosfato íi®0 rnM? pH 7S6) e as íracç:Ses activas são reunidas» Um perfil de eluição típico s proporcionado pela Fig» 3 (monitorização com U=V= a 28® nm)»
A solução resultante contem os dois factores biológicos desejados5 PT e FHA,: em forma muito pura»
EXEMPLO......õ,s.......Separação de Antigénios
Quando a separação dos dois antigénios na solução do exemplo 2 é desejada, é realizada uma cromatografia de exclusão de tamanhos em Sephacryl 3--20© KR usando um tampão fosfato (5© mM, pH 7,6) suplementado com NaCl Í5©© mM). Uma concentração proteica tíe 1,5 a 3,® mg/ol nas fracções reunidas è preferida para um separação fácil de antigénios no gel Sephacryl S2@©--HR =
A partir deste gel, PT tem uma eluição inferior a ©,1 kd e FKft tem uma eluição superior a 0,3 kd» Um perfil de eluição típico é proporcionado na Fig» 4 (monitorização com LkV» a 28© nm)» □s antigénios altainente purificados obtidos podem agora ser CGmplstafsents tratados sspsradamerste para a preparação de toxoides e/ou para o posterior desenvolvimento de preparações imunogènicas, ou ser misturados em qualquer proporção um com o outro ou com outros antigénios, toxoides ou factores imunogénicos antes da utilização»
EXEMPLO 4g Preparação da vacina
Os antigénios purificados podem ser submetidos a inactivação por agentes químicos, isto é formalina, glutaral·-deido, peróxido de hidrogénio, tstranitrometano ou outros agentes de inactivação. a fim ds eliminar propriedades tóxicas de PT» Facultatcvamsnte, FHA, que não tem propriedades tóxicas por si. próprio e que ss apresenta substancialmente livre de contaminação com PT3 pode ser usado sem tratamento ds inactivação» Assim, PT e rriA xnactivados ou FHA tratada são então processados ds modo a remover agentes de inactivação e são combinados até às proporções
X* desejadas e misturados com o adjuvante, isto é hidróxido de alumínio, fosfato ds alumínio ou de cálcio.
Assim, os produtos s processos do presente invento são caractsrizados pela vantagem da simplicidade dos passos do processo e das técnicas envolvidas, disponibilidade habitual dos materiais e dos aparelhos usados, processamento rápido (por exemplo, inferior a dois dias desde o fim da fermentação até se obter os antigenios puros finais? e facilidade de produção a níveis industriais, proporcionando entretanto bons rendimentos, protecção contra a contaminação externa, e puresa por selectividade específica para os sntioénios em vec de substancias indesejáveis a partir do caldo de fermentação.
Numerosas modificações e variações do presente invento são incluídas na descrição detalhada identificada anteriormente esperando-se que elas sejam óbvias para qualquer especialista nesta técnica. Pensa-se que essas modificações s alterações das composições e processos do presente invento possam ser incluídas no âmbito das reivindicações aqui apensas.
Claims (14)
- lã* - Método para a purificação da toxina da tosse convulsa (PT) e/ou do antigénio hemaglutinina filamentosa (FHA) a partir ds um caldo tíe fermentação de B*______pertussis ou de um soforenadante da cultura sem células contendo pelo menos um dos referidos toxina e antigénio, caracterizado por compreender:o contacto do referido caldo ou sofarenadante com um adsorvente contendo hidroxi-apatite durante um período de tempo suficiente para adsorver os referidos toxina e/ou antigénio? e a eluição de uma primeira mistura, contendo pelo menos um dos referidos toxina e/ou antigénio adsorvidos* a partir do referido adsorvente*
- 2ã,= - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido adsorvente ter uma densidade especifica ds pelo menos 1,15*
- 3â* - Método de acordo com a reivindicação i ou 2, caracterizado por o referido adsorvente compreender hidraxispatite ou um veiculo poroso ou semí-permeável*
- 4â* - Método de scorda com s reivindicação 3* caracterizado por o referido veículo ser seleccionado d© entre o grupo consistindo em sílica? aluminas outros suportes porosos inorgânicos? resinas orgânicas e suportes bio-gelificadores, incluindo resinas acrílicas* resinas vinílicas* agarose* s celuloses e suas misturas, e ser facultativamente estruturado ou endurecido' por msio ds ligação cruzada*
- 5â* ~ Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o referido adsorvente ser adicionado ao referido caldo numa quantidade de pelo senos ©,5 grama tíe hidroxiapatite por litro do referido caldo»
- 6â» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o referido tempo de adsorção variar entre 5 minutos e 3© horas»
- 7à» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda o lavagem do referido adsorvente com o<s) referidoCs) antigénioCs) a ele aderiooCs) com uma solução tamponads com um força iónica inferior a 2©© mM»
- 8â= - Método ds acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o referido passo ds eluição ssr realizado com um tampão sob condições de pH variando entre 6»© e 9,©, e com uma força iónica de mais de 2©© mM»
- 9ã» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida primeira mistura compreender fracções reunidas correspondendo ao pico da primeira proteína a eluir» i©ã» - Método as acordo co«t qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida primeira mistura conter os referidos toxina e/ou antigénio numa quantidade de pelo menos 3©X= lis» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender ainda os passos de submeter a referida primeira mistura a duas colunas cromatogrãficas sequenciais, compreendendo uma das referidas colunas uma coluna de cromatografia com ligando apoiar, e eluindo a partir da segunda coluna de cromatografia uma segunda mistura compreendendo PT e/ou FHA substancialmente livre de endotoxinas e de outros materiais proteináceos,
- 12ê. - Método de acordo com a reivindicação ií5 caracterizado por a referida coluna da cromatografia com ligando apoiar compreender um suporte ao qual os liqandos apoiares estão ligados numa quantidade suficiente para proporcionar ao suporte um carácter hidrofóbico.
- 13a, - Método de acordo com a reivindicação 12g caracterizado por o referido ligando apoiar compreender um composto alifático aromático ou linear? ramificado ou cíclico não contendo qualquer grupo capaz de reagir com a ligação entre o ligando e o suporte,Í4ã„ - Método de acordo com a reivindicação 13s caracterizado por o referido suporte com ligando apoiar compreender uma matriz polimérica á qual esta ligado fenilo substituído ou não substituído^ alquilfenilo, ou grupos alifáticos lineares consistindo em 2 a 26 átomos de carbono,ISâ, - Método de acordo com a reivindicação 12 s 13 ou 14,, csrscterizado por o referido suporte ser seleccionado de entre o grupo consistindo em celulose5 agarose5 dextranoP poli Chidrates de carbono) acrílicos, seus derivados oom ligação cruzada s modifiçadosΡ resinas -porosas,. e suportes inorgânicos.
- 16ê, - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações ií a 153 caracterizado por o passo ds cromatografia ds ligando apoiar compreender (a) carregar a coluna com um pH superior a e com uma força iónica superior a ©,2M. e/ou (b) lavar a coluna carregada em condições de pH superiores a 7=;® e/ou <cl fazer a eluição do<s) antigénio(s) a partir da coluna juntamente nuiií tampão acidico em condiçSes de pH inferiores a 7.0 e força iónica inferior a 3§fl mM na presença de um detergente solúvel na água, não iónico.Í7ã= - Método de acorda com qualquer uma das reivindicações 11 a ló» caracterizado por a referida coluna de cromatografía de ligando apoiar ser a primeira das duas colunas.
- 18â» ~ Método de acordo com qualquer uma das reivindicações ít a 17, caracterizado por o referido segundo passo de cromatografia compreender carregar a mistura eluida da primeira coluna com um pH inferior a 7,© e uma força iónica inferior a 2©0 mM num suporte capaz de ligar ambos os PT e FHA» e se fszsr a eluição a partir do referido suporte em condiçSes de pH superior a 6»© e de força iónica superior a 20® mM de uma mistura dos referidos PT e/ou FHA substancialrnente livre de sndsfcoxins e de outros materiais proteinácsos»
- 19ã» - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores» caracterizado por compreender ainda a separação de PT de FHA por cromatografia de exclusão de dimensões»Lisboa, 5 de Novembro de 1999
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