DE2650921A1

DE2650921A1 - Verfahren zur herstellung von mit liganden gekuppelten ultrafiltrationsmembranen

Info

Publication number: DE2650921A1
Application number: DE19762650921
Authority: DE
Inventors: Harry P Dr Gregor
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-11-07
Filing date: 1976-11-06
Publication date: 1977-05-18
Also published as: JPS5284185A; GB1519650A; CA1082625A; FR2330694A1; FR2330694B3; US4163714A; IT1066729B

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT, DIPLOMCHEMIKER

5 KÖLN 51. OBERLÄNDER UFER 90

Köln, den 5. November 1976 Nr. 188/Eg/Ax

Dr. Harry P. Gregor, 15o Lakeview Avenue, Leonia, New Jersey o76o5, USA

Verfahren zur Herstellung von mit Liganden gekuppelten ültraf i1trationsmembranen.

Die Erfindung betrifft die Herstellung einer Klasse von Membranfiltern, an die Liganden, d.h. Substanzen, die spezielle Komplexe mit gewissen in einem Gemisch vorhandenen Spezies zu bilden vermögen, gebunden sind. Die speziellen Mittel oder Liganden werden durch chemische Bindungen an die innere Porenfläche der Membran unter Druckbedingungen gebunden. Der Porenmesser dieser Membranen und ihre chemischen Eigenschaften sind derart, daß die Liganden in hoher Konzentration an die inneren Porenoberflächen gebunden werden können, während die Poren für die Moleküle des gelösten Stoffs, deren Abtrennung und Reinigung gewünscht wird, zugänglich sind. Diese Poren müssen genügend groß sein, um die Komplexbindung dieser löslichen Substanzen ohne übermäßige sterische Hinderung zu ermöglichen. Ferner müssen diese Membranen so beschaffen sein, daß der Überschuss und unerwünschte Komponenten des Gemisches leicht unter Druckanwendung aus der Membran herausgewaschen werden können und dann der Komplex abgetrennt und die gewünschte Substanz in reiner und konzentrierter Form entfernt werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind neue und vorteilhafte Verfahren und Mittel zur Durchführung von Trennungen für Analysenzwecke, präparative Zwecke im Laboratoriums-

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maßstab und für Zwecke der industriellen Produktion. Das Verfahren kann mit den üblichen Verfahren der Affinitätschromatographie verglichen werden, die von mehreren Forschern, insbesondere P.Cuatrecasas ( J.Biol.Chem. 245 (1970) 3059) beschrieben werden. Dieses wichtige Verfahren wird in der Biologie und Medizin angewendet, wobei im allgemeinen unlösliche gelartige Perlen von Agarose, Polyacrylamiden oder anderen Polymerisaten verwendet werden, an die Liganden, die an verschiedene Moleküle in spezifischer Weise gekuppelt werden können, gebunden sind. Die Liganden können unmittelbar an die Gelmatrix gebunden sein, jedoch findet die Bindung gewöhnlich über verlängerte Molekül— oder Kohlenwasserstoff ketten statt, die den Liganden in unterschiedlichen Abständen von der Gelmatrix-Hauptkette halten. Dies hat vermutlich den Zweck, den Liganden in unmittelbare Nähe der aktiven Stelle des abzutrennenden Moleküls kommen zu lassen. Es wird angenommen, daß der Ligand in den "Spalt" eines Moleküls, z.B. eines Enzyms, eintreten muß, so daß die Kette eine notwendige Voraussetzung ist.

Diese feinen Perlen werden als spezielle Adsorptionsmittel verwendet, wobei komplexe Gemische durch ein Bett solcher Perlen geleitet und Komplexe zwischen dem Liganden und gewissen Molekülarten, die im Gemisch vorhanden sind, gebildet werden. Dann werden die anderen vorhandenen, nicht gekuppelten löslichen Stoffe von der Säule mit Wasser oder einer geeigneten Lösung so verdrängt, daß der Komplex ungestört bleibt. In dieser Weise wird die Abtrennung der gewünschten Molekülart von den anderen erreicht. Nach dieser Wäsche wird der Komplex durch Durchleiten eines löslichen Liganden als Verdrängungsmittel durch die Säule oder durch eine Lösung mit geeignetem pH-Wert, geeigneter Salzkonzentration oder Zusammensetzung des gelösten Stoffs, z.B. unter Verwendung von Harnstoff oder Guanidinnitrat, gespalten.

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Alle diese Verfahren sind aus der Fachliteratur allgemein bekannt.

Dieses klassische Verfahren der Affinitätschromatographie erwies sich als sehr vorteilhaft für die Abtrennung sehr geringer Mengen von speziellen Substanzen, die in komplexen Gemischen vorhanden sind. Es hat jedoch eine Anzahl von Nachteilen. Hierzu gehört der Nachteil, daß das Verfahren langsam ist und eine äußerst geringe Kapazität hat. Beispielsweise ist die Beladung der Perlen mit dem Liganden gewöhnlich gering, und im allgemeinen wird nur ein geringer Bruchteil der theoretischen Kapazität der Ligandenmoleküle erreicht. Da ferner alle diese Verfahren diffusionsbeherrscht sind und die Dif— fusionsgeschwlndigkeit von Proteinen (den üblichen abzutrennenden Substanzen) in den Poren sehr niedrig ist, kann der gesamte Vorgang der Beladung mehrere Stunden erfordern. Das anschließende Waschen verläuft ebenfalls sehr langsam, weil es notwendig ist, hochmolekulare Verunreinigungen zu desorbieren und aus dem Bett der Perlen mit sehr geringem Porendurchmesser herauszuwaschen. Anschließend kann die Verwendung einer Verdrängungslösung häufig das Abschwellen der Perlen bewirken, und hierdurch wird die Elutionsgeschwindigkeit weiter erniedrigt. Die üblichen Verfahren sind somit durch eine Zyklusdauer von vielen Stunden oder Tagen gekennzeichnet, und dort, wo die zu isolierenden Mengen in der * Größenordnung von mg liegen, führt der langsame Ablauf des Prozesses zu äußerst labilen Molekülen, die während des Verlaufs der Sorption, des Waschens und der Elution teilweise öder weitgehend zersetzt werden.

Bei der üblichen Affinitätschromatographie werden für die Reinigung eine Reihe von Proteinen, Enzymen und anderen biologisch wichtigen Molekülen verwendet. Zu den verwendeten Liganden gehören spezielle konkurrierende Inhibitoren, Antienzyme und Enzyminhibitoren. Viele

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Forscher nehmen an, daß es wichtig ist, daß der Ligand in einem angemessenen und genügenden Abstand von der Gelmatrix—Hauptkette gebunden ist, um ihn in spezifischer Weise binden zu können. In den letzten Jahren wurde jedoch gefunden, daß die Funktion des Kettenmoleküls mehr darin liegt, hydrophobe Adsorptionsprozesse bei der Schaffung des angemessenen Abstandes von der Matrix zu steigern. In jüngster Zeit wurde festgestellt, daß Kohlenwasserstoffketten von unterschiedlicher Länge allein als Liganden dienen können. Sie haben nicht das hohe Maß von selektiver Affinität beispielsweise der Enzyminhibitoren, bewirken jedoch die Trennung verwandter Gruppen oder Klassen von Molekülen von biologischer Natur, und diese hydrophoben Liganden werden auch für Zwecke der Affinitätschromatographie verwendet.

Die Erfindung ist auf ein neues Verfahren zur Herstellung dieser Affinitätssorptionssysteme, die für diese Zwecke verwendeten Membranen und auf eine Reihe von Anwendungen gerichtet. Diese unter Druck eingesetzten Systeme können für praktisch alle Zwecke verwendet werden, für die bisher Affinitätschromatographie-Gelsysteme verwendet wurden. Sie können auch für mit hoher Geschwindigkeit verlaufende Trennungen von analytischer Natur, für die Trennung von Materialien, die instabil sind, so daß ihre Isolierung schnell verlaufen muß, und für großtechnische Trennungen verwendet werden, wo es auf hohe Kapazität und hohe Umsatzgeschwindigkeit ankommt.

Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß wesentlich verbesserte spezifische Ligandensysteme für Zwecke der Trennung und Reinigung in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt werden können. Zunächst wird eine polymere Matrixmembran mit annehmbar einheitlichen Poren und geeigneter Porosität (d.h. Volumenanteil der Poren) und geeignetem Porendurchmesser hergestellt. Die spezielle Wahl eines bestimmten Polymerisats oder von bestimmten

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Polymerisaten, die Porosität der Membran und der Porendurchmesser sind durch die Anwendungszwecke, für die das System eingesetzt werden soll, bestimmt. Es ist ferner wichtig, daß die Porenoberflächen dieser Membranen Ligandengruppen in angemessen hoher Konzentration enthalten. Diese Ligandengruppen können nach verschiedenen präparativen Verfahren eingeführt werden. Einmal können sie Teil des ursprünglichen Matrixpolymeren oder Interpolymergemisches sein, das zur Her- stellung der Membranen verwendet wird. Sie können aber auch in die Porenauskleidungen als Folge einer geeigneten Aktivierungs— und Kupplungsreaktion eingeführt werden, die, wenn sie unter Druck durchgeführt wird, zahlreiche Vorteile aufweist. Schließlich wird die Affinitätssorptionsmembran verwendet, indem das zu trennende Gemisch unter geeignetem Druck durch die Membranporen gepreßt wird. Wenn das Aufnahmevermögen der Membran erreicht ist, werden überschüssige Lösung und gelöste Stoffe mit Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung ebenfalls unter' Druck von der Membran verdrängt, worau'f die Verdrängungslösung unter Druck zur Spaltung der' Komplexe, zur Verdrängung der gewünschten Moleküle und zu ihrer Konzentrierung im Ablauf eingeführt wird. Hierauf wird das Verdrängungsreagens aus der Membran ausgewaschen und der Zyklus wiederholt.

Die Membranen gemäß der Erfindung können in zahlreichen verschiedenen Formen hergestellt werden. Sie können in flächiger Form gestützt oder ungestützt, in Form von Schläuchen, kleinen Rohren oder Hohlfasern, in Form von gerahmten Platten oder in gewundener Form und praktisch in allen beliebigen Formen, die auf dem Gebiet der Ultrafiltrationsmembran-Technik verwendet werden, hergestellt und eingesetzt werden. Die Verfahren zur Herstellung dieser neuen Membransysteme sind von allgemeiner Natur und auf eine Anzahl verschiedener Matrix-

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membranen, verschiedene Liganden und die Trennung eines weiten Bereichs von Stoffen einschließlich solcher, die in de.r Biologie und Medizin wichtig sind, anwendbar. Der praktische Wirkungsgrad dieser Art von Systemen kann mit dem der üblichen Gelsysteme verglichen werden. Beispielsweise kann mit einer Säule von 25 ml, die einen typischen Protein-Inhibitor mit einem Molekulargewicht von 25.000 enthält, der durch ein Kettenmolekül an das Gel gebunden ist, die Reinigung von etwa 100 mg des gewünschten Proteins in 24 Stunden erreicht werden. Im Gegensatz hierzu kann eine einzige Affinitätssorptionsmembran, die gemäß den Lehren der Erfindung hergestellt worden ist und ein Volumen von 0,03 ml hat, etwa 2 mg des Protein-Inhibitors enthalten und etwa 1,5 mg des Proteins in reiner Form alle 15 Minuten aus einem Komplexgemisch entfernen. Die relativen Kapazitäten der beiden Systeme unterscheiden sich somit durch einen Faktor von etwa 1000. Eine neue Art der Durchführung von Affinitätssorptionsverfahren wurde erfindungsgemäß gefunden, bei der die üblichen, langsam ablaufenden Diffusionsstufen, die stets die Gesamtgeschwindigkeit der Kupplungsreaktion beherrschen, ausgeschaltet werden und ebenso die lange "Auswaschzeit" ausgeschaltet wird. Die neuen Systeme gemäß der Erfindung haben eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit, hohen Umsatz und eine hohe Kapazität, so daß Gramm- oder Kilogrammengen von Materialien in kurzer Zeit und mit mininaler Zersetzung abgetrennt und gereinigt werden können.

Die Erfindung ist auf ein neues Verfahren und auf die dabei hergestellten Produkte und die Verwendung der erhaltenen Produkte gerichtet. Sie umfaßt die Herstellung von Membranfiltern, deren Dicke, Porendurchmesser, Porosität, Form (Flächengebilde, Fasern usw.) auf die verwendeten Liganden und auf das Enzym oder Molekül, dessen Abtrennung und Reinigung beabsichtigt ist, abgestimmt

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sind. Die Erfindung ist demgemäß auf die verschiedensten Systeme anwendbar, die viele verschiedene Kombinationen von Matrixpolymermembranen, Liganden, Methoden der Bindung des Liganden an die Matrixmembran und Substanzen, deren Abtrennung und Reinigung gewünscht wird, verkörpern. Die Erfindung wird nachstehend ausführlich nur in Verbindung mit gewissen Beispielen dieser Systeme beschrieben. Die Anwendung der Lehren der Erfindung auf andere Systeme ist für den Fachmann offensichtlich.

Die wesentlichen Merkmale der Erfindung umfassen ein poröses Matrixmembranfilter mit geeigneter Porosität und Struktur, einen oder mehrere Liganden, die spezifisch an andere Substanzen, die in dem zu trennenden Gemisch vorhanden sind, gebunden oder mit diesen Substanzen komplexgebunden werden können, wobei diese Liganden durch chemische Bindung an die inneren Porenoberflächen der Membranfilter gebunden werden können; die Behandlung des Matrixmembranfilters (falls erforderlich) zur Bindung des speziellen Liganden an seine innere Porenoberflächen gewöhnlich unter Druckeinwirkung; die Verwendung dieses Systems unter Druckanwendung für die Sorption der gewünschten Substanz, deren Abtrennung und Reinigung gewünscht wird; die Elution oder das Auswaschen der im ursprünglichen Gemisch vorhandenen Verunreinigungen aus der Membran; die Elution der gewünschten Substanz durch ein Verdrängungsmittel oder andere Mittel, die den starren Komplex von Ligand und gelöstem Stoff zu spalten vermögen; das Auswaschen der Verdrängungslösung und die Wiederholung dieses Arbeitsablaufs.

Die Matrixmembran oder das Matrixfilter muß Eigenschaften aufweisen, die dem Verwendungszweck angepaßt sind. Die Poren der Membran müssen einen solchen Durchmesser haben, daß Liganden in hoher Konzentration an die Innere Porenoberflächen gebunden oder, anders ausgedrückt, "die Poren ausgekleidet" werden können. Ferner müssen diese

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Poren einen solchen Durchmesser haben, daß die zu reinigende Substanz Komplexe mit den Liganden auf den inneren Porenoberflächen ohne sterische Hinderung bilden kann. Da zahlreiche zu trennende Substanzen verhältnismäßig empfindlich sind, müssen die Poren einen solchen Durchmesser haben, daß eine Denaturierung durch Scherwirkung während der Sorption, des Waschens oder der Elution nicht stattfindet.

Die Matrixmembran oder das Matrixfilter muss genügend mechanische Festigkeit aufweisen, um mechanisch so abgestützt werden zu können,daß die Membran den Druckgradienten, die während der Herstellungs-, Sorptionsund sonstigen Gebrauchsbedingungen, die auf sie zur Einwirkung kommen, widersteht.

Die speziellen Liganden, die verwendet werden können, und. die Chemie der Prozesse der Bindung dieser Liganden an die Porenoberflächen der Membranen sind nicht neu, jedoch ist die Art der Verwendung, d.h. unter Druckbedingungen, neu. Es ist ferner ein wichtiges Merkmal der Erfindung, daß nicht unbedingt ein Kettenmolekül erforderlich ist, um den Liganden an die Matrix zu binden. Somit werden das Verfahren und die Mittel zur Herstellung der Membranfilter ebenso wie die Gebrauchsbedingungen vereinfacht. Das Verfahren zur Verwendung der Membranen gemäß der Erfindung für Zwecke der Abtrennung und Reinigung, d.h. die Durchführung dieser Maßnahmen unter Druck, ist Gegenstand der Erfindung.

Da Kapazität und Geschwindigkeit einer der wichtigen Vorteile der Erfindung sind, ist es wesentlich, daß die Matrixmembranen oder —filter eine große innere Porenoberfläche haben. Dies bedeutet, daß sie einen hohen Lösungsgehalt und ein Porenvolumen von wenigstens 50%, vorzugsweise von 75 bis 90% aufweisen müssen. Ihre Poren müssen Molekülabmessungen haben, wobei die effektiven Porendurchmesser wenigstens ebenso groß, aber nicht

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größer sind als etwa das 10—fache des Durchmessers des größten in Frage kommenden Moleküls, d.h. des Komplexes des Liganden mit der abzutrennenden Substanz. Im allgemeinen werden Porendurchmesser, die etwa dem 3- bis 5-fachen Porendurchmesser der in Frage kommenden Komplexe entsprechen, bevorzugt. Der Porendurchmesser liegt somit im allgemeinen zwischen etwa 15 und 200 A. Es wurde gefunden, daß unter diesen Bedingungen das höchste Fassungsvermögen der Vorrichtung erreicht wird, ein wesentlicher Faktor für ihren Nutzen.

Die verfügbaren Methoden zur Bestimmung des Porendurchmessers von Membranen, deren Poren Molekülabmessungen aufweisen, sind bekanntlich unzulänglich, jedoch wurde im Rahmen der Erfindung der Porendurchmesser nach der Methode von Kawabe u.Mitarb. (J.Kolloid & Interface Science 21 (1966) 79) bestimmt. Hierbei werden Moleküle von unterschiedlicher Größe durch die Membran geführt, und aus den relativen Leitfähigkeiten, dem Diffusionsvermögen oder den Ultrafiltrationsindices können die effektiven mittleren Porendurchmesser berechnet werden. Die Porendurchmesser für den gelösten Stoff werden in ähnlicher Weise aus Messungen der Überführungsparameter nach bekannten Methoden ermittelt.

Es wurde festgestellt, daß es bei der Verwendung der Membranfilter gemäß der Erfindung erforderlich sein kann, daß die zu behandelnden Lösungen frei von großen kolloidalen Teilchen sind, die eine solche Größe haben, daß sie die Membranfilter gemäß der Erfindung verstopfen oder verschmutzen würden· Ferner wurde gefunden, daß die nicht verschmutzenden Ultrafiltrationsmembranen mit fester Beladung (fixed-charge), die in der US-PS 3 808 305 der Anmelderin beschrieben werden, für die Vorbehandlung dieser Lösungen vor ihrer Trennung und Reinigung besonder gut geeignet sind. Durch vorherige Ultrafiltration unter diesen Bedingungen werden die vorhandenen kolloi—

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dalen Verunreinigungen entfernt, die die Matrixmembran verschmutzen oder durch Adsorption in der Membran zu Denaturierung empfindlicher Liganden oder komplexgebundener Enzyme oder Proteine innerhalb der Membran durch Scherwirkung führen können.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Eine Matrixmembran wurde aus einer Lösung von Celluloseacetat (39,4% Acetylgruppen) in einem Gemisch von Aceton und Dimethylformamid (Gewichtsverhältnis 1:3) auf einer Glasplatte mit einer üblichen Rakel gegossen. Das Lösungsmittel ließ man 2 Minuten in trockener Luft verdampfen, worauf die Folie 2 Stunden ohne Verlust von Lösungsmittel in einem geschlossenen Behälter gehalten und dann 30 Minuten bei 3O°C der Einwirkung von Wasserdampf überlassen wurde, worauf die Membran schnell in Eiswasser getaucht und lösungsmittelfrei gewaschen wurde. Diese Membran wurde dann durch übliche Hydrolyse in einem Puffer von pH 9,9 für 24 Stunden bei 65°C regeneriert, wobei eine Folie, die im nassen Zustand eine Dicke von 25 u, einen Wassergehalt von 88% und eine hydraulische Permeabilität von 3,5 1/Std. unter einem

2 Druck von 3,5 atü bei einer Folienfläche von 11,3 cm hatte, erhalten wurde. Die Folie wurde dann mit Cyanbromid (40 mg/100 ml) behandelt, wobei der pH-Wert bei 11 gehalten und die aktivierende Lösung bei 3,5 atü durch die Membran umgewälzt wurde. Anschließend wurde das gesamte überschüssige Reagens aus der Membran schnell mit Wasser in einer Minute unter Druck (3,5 atü) herausgewaschen, worauf eine Lösung von 50 mg Trypsin in 100 ml 0,1-molarem Puffer bei pH 6 unter einem Druck von 4,9 atü durch die Membran gepumpt wurde. Die Membran wurde dann 24 Stunden bei 4⁰C in diesem Trypsinablauf gehalten und anschließend mit destilliertem Wasser

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gewaschen. Das Enzym machte 30% des Trockengewichts der endgültigen Membran aus. Die Poren dieser Membran hatten vor und nach der Kupplung einen Durchmesser von etwa 200 8.

Anschliepend wurde die Abtrennung von Sojabohnen- und Pankreas-Trypsin-Inhibitoren durch Affinitätsadsorption unter Druck durchgeführt. Zunächst wurde ein rohes Gemisch, das etwa 100 mg Gesamttrypsin enthielt, das zu etwa 15% aus Sojabohnentrypsin-Inhibitor bestand, in 50 ml eines Puffers von pH 8,1 gelöst. Die Lösung wurde unter einem Druck von 3,5 atü durch die Membran gepreßt. Hierzu waren etwa 10 Minuten erforderlich. Die Lösung wurde dann mit 20 ml des gleichen Puffers aus der Membran herausgewaschen. Es wurde festgestellt, daß die Proteinkonzentration im Ablauf schnell auf praktisch Null fiel, während dieses Volumen durchgeleitet wurde, ein Zeichen, daß praktisch kein "toter Raum" in der Membran vorhanden war. Anschließend wurde der Schlauch mit 10 ml aliquoten Teilen einer 6-molaren Harnstofflösung bei pH 2 mit Salzsäure eluiert. Das scharfe Extinktionsmaximum im Ablauf zeigte, daß ein Proteineluiert wurde. Nachdem 10 ml dieser Verdrängungslösung durchgelaufen waren, fiel die Extinktion auf Null, ein Zeichen, daß alle komplexgebundenen Moleküle, vermutlich der Sojabohnen-Inhibitor mit einem Molekulargewicht von etwa 21.500, verdrängt waren. Aus der bekannten Extinktion dieses Proteins wurde berechnet, daß pro mg des ursprünglich an die Membran gebundenen Ligandentrypsins 0,56 mg Sojabohnen-Inhibitor konzentriert und gereinigt wurden. Da 1 mg Sojabohnen-Inhibitor mit 1,4 mg Trypsin reagiert, ergibt sich hieraus, daß ein ungefähr stöchiometrisches Verhältnis von Inhibitor zu gekuppeltem Trypsin (etwa 80%) erreicht worden war. Dies ist angesichts der Tatsache, daß das Ligandentrypsin ohne Vermittlung eines Kettenmoleküls unmittelbar an die Matrix gebunden

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worden war, völlig überraschend.

Anschließend wurde eine Lösung behandelt, die etwa 60 mg/100 ml Protein enthielt, wobei Trypsin-Inhibitor des Rinder-Pankreas mit einem Molekulargewicht von etwa 6500 in einer Menge von 5% dieses Proteins vorhanden war. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8 eingestellt, worauf die Lösung durch die Membran, an die das Trypsin gebunden war, geleitet wurde. Das Gemisch wurde dann mit einem Puffer von pH 8 aus der Membran herausgewaschen, worauf der Komplex unter Verwendung einer Elutionslösung, die 6-molar an Harnstoff war und einen pH-Wert von 2 hatte, gespalten wurde. Unmittelbar darauf wurde ein scharfes Adsorbans-Maximum beobachtet und festgestellt, daß das eluierte Material aus Pankreas-Trypsininhibitor mit einer Reinheit von wenigstens 90% bestand. Wie vorher wurde eine hohe Ausbeute festgestellt. Etwa 0,8 Mol Inhibitor wurden pro Mol des an die Membran gebundenen Trypsinliganden gewonnen.

Beispiel 2

Die Reinigung des Protein-Antikörpers für menschliches Serumalbumin wurde wie folgt durchgeführt: Zunächst wurde eine Cellulosemembran auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aus einer Matrixmembran hergestellt, die einen mittleren Porendurchmesser von 225 S hatte und zu 86% ihres Volumens aus wässriger Lösung bestand. Diese Membran wurde dann mit Cyanbromid bei pH 11 und 4,9 atü aktiviert, worauf die Lösung in einer Minute aus der Membran herausgewaschen wurde. Anschließend wurde eine Lösung von menschlichem Serumalbumin mit einer Konzentration von 50 mg Protein in 100 ml eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers bei pH 7,4 bei 4,9 atü durchgeleitet. Nach dem Waschen dieser Membran wurde die Affinitätssorption wie folgt durchgeführt: Eine Lösung, die in 100 ml 50 mg Protein in Form eines rohen Gemisches enthielt, das zu 5% aus Antikörper von menschlichem Serum-

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albumin bestand, wurde mit einem Phosphatpuffer auf pH 7,5 eingestellt und dann unter einem Druck von 1,4 atü durch die Membran gepreßt. Die Extinktion des Ablaufs bei 280 nm wurde gemessen und eine Anzahl von Proben des Ablaufs von je 20 ml aufgefangen. Die Extinktion des Ablaufs unmittelbar nach dem Durchgang des rohen Gemisches betrug 0,02. Dieser Wert fiel schnell auf 0,001, nachdem etwa 10 Raumteile Wasser verwendet worden waren, um das rohe Gemisch zu verdrängen. Anschließend wurde eine 2-molare Natriumchloridlösung durch die Membran geleitet. Die Extinktion im 10.Glas betrug 0,001, im 11.Glas 0,030, im 12.Glas 0,017 und im 13.Glas 0,001, ein Zeichen, daß der gesamte Antikörper des menschlichen Serumalbumins schnell verdrängt worden war. Aus den Extinktionsmessungen wurde berechnet, daß die Reinheit des Antikörpers wenigstens 85% des vorhandenen Proteins gegenüber einer R inheit von 5% im rohen Gemisch betrug. Die Zeitdauer für die Durchführung dieses Zyklus betrug weniger als 30 Minuten bei dieser Arbeitsweise. Dieses Verfahren wurde mehrmals mit gleichen Ergebnissen wiederholt.

Beispiel 3

Eine Membran wurde aus einem Interpolymergemisch aus einem Copolymerisat von lauroyliertem Styrol und Äthylen im Verhältnis von 1:1 und 1 Teil Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt Co.) in einem Gemisch von Dichloräthan und Dimethylformamid gegossen. Die Membran wurde teilweise getrocknet und dann mit Methanoldämpfen und abschließend mit Wasser koaguliert, wobei eineFolie mit Poren mit einem Durchmesser von 150 A erhalten wurde. Das lauroylierte Styrol-Äthylen-Copolymerisat wurde nach dem von H.P.Gregor und Mitarbeitern in J.Am.Chem.Soc. (1965) 5525 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die gewaschene Folie wurde dann für die Affinitätssorption unter Verwendung eines rohen Gemisches von Proteinen

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verwendet. Hierbei wurden die Proteine mit einem höheren Grad der hydrophoben Bindung selektiv sorbiert und konnten dann eluiert werden. Die Selektivität dieser Membran konnte durch Änderung der Länge der Kohlenwasserstoff kette am verwendeten Acylchlorid verändert werden.

Beispiel 4

Carbohydrasen können durch unter Druck durchgeführte Affinitätssorptionsprozesse unter Verwendung eines konkurrierenden Inhibitors als Ligand gereinigt werden. Eine Membran wurde aus einer Lösung von 2 Teilen PoIyvinylbenzylchlorid und 1 Teil Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt) in einem Gemisch von Äthylenchlorid und Dimethylformamid gegossen. Die Membran wurde teilweise getrocknet und dann unter Einwirkung von Methanoldämpfen und dann von Wasserdampf koaguliert. Die Membran hatte dann einen Porendurchmesser von etwa 350 2. Dann wurde die Kupplung unmittelbar mit einer Lösung von p-Aminophenyl-ß-D-thiogalactopyranosid vorgenommen. Dieser konkurrierende Inhibitor bildet Komplexe mit einer Anzahl von Carbohydrasen einschließlich ß-Galactosidase. Eine Lösung, die eine von E-coli stammende ß-Galactosidase mit einer Aktivität von 10 Einheiten/mg enthielt, wurde dann durch die Membran geleitet. Nach der Spaltung des Komplexes wurde das Enzym mit wesentlich verbesserter Aktivität von 300 Einheiten/mg zurückgewonnen.

Beispiel 5

Ein unter Druck betriebenes Affinitätssorptionssystem wurde wie folgt hergestellt: 1 Teil Cellulose und 1 Teil Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt) wurde in einem Gemisch von Dimethylsulfoxyd und Formaldehyd gelöst. Aus der Lösung wurde eine Folie gegossen, die mit Wasser in der Dampfphase koaguliert wurde. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Membran, die einen mittleren Porendurchmesser von 275 Ä hatte, mit Cyanbromid bei pH 11

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in üblicher Weise unter einem Druck von 3,5 atü behandelt, worauf das succinylierte 3,3'-Diaminodipropylamindarivat von p-Aminophenyl-ß-D-thiogalactopyranosid gekuppelt wurde. Nach dem Kuppeln des Liganden wurde die Membran in Wasser bei pH 6 gewaschen, worauf ein rohes Gemisch, das eine Aktivität der von E.coli stammenden ß-Galactosidase von 2 Einheiten/mg hatte, durch die Säule geleitet wurde. Die Säule wurde dann gewaschen und eluiert. Die Aktivität des erhaltenen Enzyms wurde hierdurch auf 400 Einheiten/mg gesteigert.

Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen sowie allgemein in der Praxis der Erfindung kann unter beliebigen Überdrücken gearbeitet werden, um den Durchgang der aktivierenden Flüssigkeit, des Liganden und/oder der zu trennenden Substanz durch die Membran zu beschleunigen, jedoch werden mit einem Druck von wenigstens etwa 0,7 atü, insbesondere etwa 2,1 bis 8,4 atü (außer bei empfindlichen Liganden und/oder Substanzen, die gegen Scherwirkung empfindlich sein können) besonders gute Ergebnisse erhalten. Der Druck oder das Potential kann anstatt pneumatisch oder hydraulisch auch von elektrischer Natur sein, wie es bei der bekannten Erscheinung der Elektroosmose und/oder Elektrophorese der Fall ist, wo ein elektrisches Potential an eine Membran oder ein Filter gelegt wird. In dieser Weise können Kombinationen der Aktivierung und Kupplung einerseits und der Anwendungen andererseits verwirklicht werden. Beispielsweise wird nach der Kupplung von Trypsin an die Membran mit anschließender Aktivierung mit Cyanbromid durch einen Strom, der einen Lösungsstrom durch die Membran erzeugt, der einem Druckgradienten von 4,9 atü entspricht, ein System ausgebildet, dessen enzymatische Aktivität nahezu die gleiche ist wie die Aktivität einer unter einem Druck von 4,9 atü ausgebildeten Systems.

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von mit Liganden gekuppelten Ultrafiltrationsmembranen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des Liganden unter einem Druck von wenigstens etwa 0,7 atü durch die zur Kupplung mit dem Liganden fähige Membran preßt und überschüssige Flüssigkeit entfernt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines Gemisches von Stoffen, von denen wenigstens einer, jedoch nicht alle Affinität zum Liganden haben, unter einem Druck von wenigstens etwa 0,7 atü durch die mit dem Liganden gekuppelte Membran preßt und hierdurch einen Stoff selektiv aus dem Gemisch extrahiert und als Komplex mit dem Liganden zurückhält, die Membran wäscht und den Stoff aus der Membran eluiert.

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran verwendet, deren Poren eine mittlere Größe haben, die ungefähr dem 3- bis 10-fachen Durchmesser des Komplexes von Ligand und Stoff entspricht·

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Membran für den Liganden aufnahmefähig macht, indem man ein Aktivierungsmittel unter einem Druck von etwa 4,9 bis 8,4 atü durch die Membran preßt und anschließend den Liganden unter einem Druck von etwa 2,1 bis 8,4 atü durch die Membran preßt.

5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Membranen aus Cellulose, als Aktivierungsmittel Cyanbromid und als Ligand Trypsin verwendet.

6) Mit einem Liganden gekuppelte Ultrafiltrationsmembranen mit Poren, die eine mittlere Größe von etwa 15 bis 200 A haben und mit dem daran gekuppelten Liganden besetzt sind.

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7) Membranen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden außerdem komplexgebunden sind und die Poren eine mittlere Größe haben, die dem 3— bis 10—fachen Durchmesser des Ligandenkomplexes entspricht.

8) Membran nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Cellulose besteht und Trypsin als Ligand an die Membran gebunden ist.