DE2323422A1

DE2323422A1 - Verfahren zur isolierung von biologisch aktiven verbindungen durch affinitaetschromatographie

Info

Publication number: DE2323422A1
Application number: DE2323422A
Authority: DE
Inventors: Olga Dipl Ing Hubalkowa; Miroslava Dipl In Krschivakova; Viktor Dipl Ing Mansfeld; Jirschi Dipl Ing Tschoupek; Jaroslava Dipl Ing Turkowa
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1972-05-10
Filing date: 1973-05-09
Publication date: 1973-11-29
Also published as: CA1027491A; SE7306531L; NL7306355A; CH597892A5; JPS4962194A; DE2323422C2; JPS5646828B2; CS162953B1; FR2184054A1; FR2184054B1; GB1414848A

Description

PatentanwStte Dip!. inr% Π. Ώ TTZ

β Manchen £2, Siomsciodeir. It

233-20.684p 9. 5. 1973

Ceskoslovenskä akademie ved, PRAG 1, (CSSR)

Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen durch Affinitätschromatographie

Sie Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von aktiven Verbindungen, wie beispielsweise Enzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Hormonen u.a., unter Anwendung der Affinitätschromatographie an selektiven Sorbentien.

Zu den modernsten Irennmethoden in der Biochemie gehurt ein Verfahren, bei dem die Fähigkeit einer ganzen Reihe von biologisch wirksamen Verbindungen zur Bildung von Sorptionskempleien mit anderen biologisch aktiven Stoffen ausgenutzt wird, wobei der Charakter der Wechselwirkung sehr spezifisch und reversibel ist. Wenn nun eine der Komponenten des Sorptionskomplexes mittels einer kovalenten Bindung an einen festen Träger gebunden ist und der so präparierte Träger unter ge-

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eigneten Bedingungen mit der Lösung eines noch so komplizierten Verbindungsgemisches in Kontakt kommt, dann werden aus dem Gemisch lediglich Verbindungen mit einer spezifischen Affinität zur gebundenen Substanz selektiv an der Oberfläche sorbiert.

Bei Änderung der Bedingungen, wie beispielsweise des pH, der Ionenstärke des Lösungsmittels, der !Temperatur usw., erfolgt eine Dissoziation des Sorptionskomplexes und Abtrennung der lösliehen Komponente von der an den Träger chemisch gebundenen Komponente. Besondere brauchbar erscheint dieses Verfahren für die Reinigung von Enzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Nucleinsäuren, Proteinen mit einem gebundenen Kofaktor oder Vitamin, Proteinen mit gebundenen Giftrezeptoren oder Hormonen, represser!sehen Proteinen, SuIfhydrylgruppen enthaltenden Proteinen, synthetisch bereiteten Peptiden u.a.m. Ferner ist die Affinitätschromatographie zur Konzentrierung verdünnter Proteinlösungen, zur Entfernung der denaturierten Formen aus gereinigten Proteinen und zur !Trennung und Unterscheidung der durch spezifische chemische Modifikation gebildeten Protein- und Peptidkomponenten anwendbar.

Als Träger der biologisch aktiven Verbindungen wurden bei der Affinitätschromatographie eine ganze Reihe von Materialien angewandt, wie z.B. Copolymere des Äthylens mit Maleinsäureanhydrid, modifizierte Copolymere von Styrol mit Divinylbenzol, Copolymere von Acrylamid mit Bisacrylamid, Polysaccharide, poröses Glas u.a. Einige !Typen sind ungeeignet, weil sie gebundene ionogene funktioneile Gruppen enthalten und sieh, durch erhebliche unspezifische Sorption von Eiweißstoffen auszeichnen. Andere !Trägermaterialien weisen eine unzureichende mechanische, hydrolytische, mikrobielle oder thermische Stabilität oder eine

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ungeeignete Verteilung der Porengröße auf, wodurch ihr Anwendungsbereich erheblich eingeengt wird. Sie im Handel erhältlichen Gele dürfen in den meisten fällen nicht austrocknen, wodurch ihre Lagerung und ihr Transport erschwert werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen durch Affinität schromatographie auf der Basis der Bildung eines Sorptionskomplexes zwischen der zu isolierenden löslichen Verbindung und einer biologisch aktiven Verbindung, die durch eine kovalente Bindung an den festen Träger gebunden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Träger hydrophile makroporöse Copolymere von hydrophilen Monomeren wie Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethaerylaten, Oligo- oder Polyglykolacrylaten, Oligo- oder Polyglykolmethacrylaten, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamiden, Methacrylamiden, Aminoalkylacry-Iaten, Aminoalkylmethacrylaten, Acrylsäure, Methacrylsäure oder Methylolacrylamid mit Divinyl- oder Polyvinyl-Gomonomeren, wie Alkylendiacrylaten, Alkylendiaethacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldiacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldimethacrylaten, Alkyl- oder Glykol-tri- und -polyacrylaten und -methacrylaten, Alkylenbiaacrylamiden und -methacrylamiden und Divinylbenzol verwendet.

Sie so präparierten Gele werden in der ersten Phase mit der Lösung des zu trennenden Verbindungsgemisches in Berührung gebracht, wobei es unter den herrschenden Bedingungen zur selektiven Sorption der Stoffe kommt, die am gegebenen modifizierten $*J. zur Bildung eines Sorptionskomplexes fähig sind. In der fweiten Phase vollzieht sich dann durch Änderung der physikalischen oder chemischen Bedingungen die Desorption dieser

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Stoffe und ihre Abtrennung vom Gel, das die gebundene biologisch aktive Verbindung trägt, ohne daß durch diesen Eingriff die Aktivität der gebundenen oder der desorbierten Komponente beeinträchtigt wird. Der Zyklus der spezifischen Sorption und der physikalisch-chemisch bedingten Desorption wird so oft wiederholt bzw. ist so oft wiederholbar, wie die biologische Aktivität der an das Trägergel gebundenen Verbindungen anhält.

Die Gele auf Grundlage der hydrophilen Acrylsäure- und Methacrylsäureester kann man zweckdienlich in Form von diskreten !Teilchen, am besten mit kugelförmiger Gestalt, oder in Form von Blöcken, Membranen, "Saiten" bzw. Fäden oder Bändern anwenden. Die Trennung kann diskontinuierlich nach einem chargenweisen Verfahren oder in wiederholten Zyklen an einer Säule erfolgen. Bei der kontinuierlichen Durchführung wird das Trägergel, z.B. in Form eines endlosen Bandes oder auf einem Transporteur bewegt und die Lösungen sind stationär oder fließen im Gegenstrom zur Bewegungsrichtung des Gels.

Ein großer Vorteil des beschriebenen affinitätschromatographischen Trennverfahrens ist die rasche Trennung der isolierten biologisch aktiven Verbindungen von Inhibitoren und destruktiv wirkenden Verunreinigungen.

Die isolierten biologisch aktiven Verbindungen sind vor Denaturierung durch Stabilisierung ihrer tertiären Struktur infolge der Bindung der Liganden im aktiven Zentrum geschützt. Das gesamte Verfahren ist sehr schonend, relativ rasch und ermöglicht die Gewinnung von hochaktiven Produkten in einer einzigen Operation. Die große mechanische und hydrolytische Stabilität der hydrophilen makroporösen Träger gestattet ihre Anwendung in einer solchen Form, die für die gegebene Appli-

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kation am günstigsten ist.

Das Verfahren zur Trennung von biologisch aktiven Verbindungen Bitteis der Affinitätschromatographie wird nachfolgend an einigen Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Die affinitätschromatographische Isolierung von hochaktivem Chymotrypsin an Hydroxyäthylmethacrylat-Gel mit kovalent gebundenem Trypsininhibitor wurde, wie folgt, ausgeführt. 0,02 Gewichtsteile kristallisiertes Chymotrypsin wurden in 1 Gewichtsteil 0,05 m Tris-HCl-Puffer, pH 8, gelöst und diese Lösung auf eine Säule (10 ζ 80 mm) aus Hydroxyäthylmethacrylat-Grel gegeben, das durch Suspensionspolymerisation von 2-Hydroxyäthylmethacrylat mit Äthylendimethaerylat in Gegenwart inerter Lösungsmittel erhalten worden war und eine Molekulargewichts-Aussehlußgrenze von 300.000 hatte. Vor der Aufgabe der Chymotrypsinlösung wurde Pankreas-Trypsininhibitor an das Gel kovalent gebunden und dann das Gel mit 0,05 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, äquilibriert.

Hach Einziehen der Probe wurde die Säule mit dem gleichen Puffer mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 30 ml/h eluiert und die !Fraktionen in Intervallen von jeweils 10 Minuten gesammelt. Sobald diese keine im ultravioletten Spektralbereich bei 280 nm absorbierenden Verbindungen enthielten, wurde die Slution mit -^ 0,05 m Tris-HCl-Puffer abgebrochen und die Gelsäule dann mit etwa 0,1 m Essigsäure, pH 3,0, •luiert. Infolge der Änderung des pH-Wertes des jälutionsmittels erfolgt eine Dissoziation des Sorptionskomplexes, und aus der Säule wird Chymotrypsin eluiert, das sich nach

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lyophilisierung durch hohe Aktivität auszeichnet. Die proteolytische Aktivität wurde an Hämoglobin, pH 8,0, und die Bsterase-Aktivität an Aeetyltyrosinäthylester, pH 8,0, gemessen und auf 1 mg Chymotrypsin bezogen. Die Chy motrypsinkonzentration wurde photometrisch durch Messung der Absorption der Chymotrypsinlösung in 0,001 m HCl bei 280nm bestimmt.

Beispiel 2

Die Isolierung von hochaktivem !Trypsin durch Affinitätschromatographie an Hydroxyäthylmethacrylat-Gel mit kovalent gebundenem Irypsin-Inhibitor wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren vorgenommen, mit dem Unterschied, daß die Molekulargewichts-Ausschlußgrenze des Trägergels im vorliegenden Fall bei 350.000 lag und die iästeraseaktivität des affinitatachromatographisch gereinigten enzymatisehen Präparats (Trypsin) mittel Benzoylarginin-äthylester bestimmt wurde.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird die Isolierung von Antikörpern gegen Insulin mit Hilfe von kovalent gebundenem Antigen (des Insulins) an Äthylenglykolacrylat-Gel mit einer Ausschlußgrenze von 300.000 beschrieben. 2 Gewichtsteile Antiinsulinserum mit 3 1· Albumin wurden in 0,1 m Natriumbarbital-Puffer, pH 8, auf eine mit einem Copolymeren aus Äthylenglykolacrylat und Äthylendiacrylat gepackte Säule (8 χ 40 mm), an dem Insulin kovalent gebunden war, gegeben. Das Gel wurde durch Waschen alt 50 Gewichtsteilen 0,05 ■ Phosphatpuffer, pH 8, der 0,08 α HaCl enthielt, äquilibriert. Nach Einziehen der Probe in die

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Geleäule wurde sie mit dem gleichen Puffer eluiert. Die reinen Antikörper gegen Insulin wurden dann ähnlich wie in Beispiel 1 durch Elution mit 3 η HCl aua der Säule verdrängt.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die Isolierung der Papain-3H-Protease durch Affinitätschromatographie an Hydroxyäthylaethaerylat-Gel (Ausschlußgrenze 300.000) mit kovalent gebundenem p-Aminophenylmercuriacetat besehrieben. 50 &ewichtsteile gequollenes Gel wurden nach Aktivierung mit Bromcyan in 20 Gewicht steilen 10 $> igem Dimethylsulfoxid suspendiert. 1 Gewichtsteil p-Aminophenylmercuriacetat wurde in 20 Gewiehtsteilen Dimethylsulfoxid gelöst und langsam zur Suspension hinzugefügt. Nach Zusatz der letzten !Teile der p-Aminophenylmercuriaeetat-Lösung wurde die Suspension mit einem Magnetrührer 24 Stunden bei 4⁰G gerührt. Dann wurde die Suspension auf 30⁰C erhitzt und das Gel fünfmal mit 150 Gewichtsteilen 20 #iger wässriger Dimethylsulfoxid-Lösung (aufgeschlämmt und) dekantiert. Schließlich wurde die Gelsuspension in die Säule gefüllt und mit 500 Gewichtsteilen 20 £iger wässriger Dimethylsulfoxid-Lösung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/h eluiert. Das in dieser Weise gründlich gewaschene QeI diente zur Bereitung einer 10 χ 60 mm Säule, in die eine 5 ^ige Papainlösung in einem Standardpuffer (0,5 Gew.-^ Butanol, 10 Gew.-j* Dimethylsulfoxid, 0,1 m KCl, 0,5 m Hatriuaacetat, pH 5,0), den man auf einen Gehalt von 0,001 m ÄDIA und 0,01 a Na₃SO₅ modifiziert hatte, solange eingeleitet wurde, bis die Absorption A₂₈Q der aus der Säule eluierten Lösung gleich der Absorption A₂₈₀ °er in die Säule eingeleiteten Lösung war. Dann wurde die oäule mit dem Standardpuffer eluiert, bis das Eluat bei der Wellenlänge 280 nm nicht mehr absorbierte. Das

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am G-el sorbierte aktive Papain mirde mit dem auf einen Gehalt von 0,5.10 m HgCl« modifizierten Standardpuffer freigesetzt. Nach Entsalzen des iäluats an dephadex G 25 bzw. nach der Dialyse wurde hoehaktives Papain erhalten.

Beispiel 5

Aus Kartoffeln wurde Ghymotrypsin-Inhibitor an mit Äthyl end imethacrylat vernetztem Hydroxymethacrylat-G-el, das kovalent gebundenes Chymotrypsin enthielt, affinitätschromatographi3Ch isoliert, 1500 GewichtstsiIe Kartoffeln wurden im Mischapparat homogenisiert und mit 2000 Gewichtsteilen eines Semisches einer 0*0 ^igsn KaOl-LSsung una einer 0,03 j»igen Ha«SO-:-Lösung, die aas. im Verhältnis 1i1 vermischte, extrahiert, Das Ecmügeiaisat mirde 2 Stunden im Kühl schrank bei 4⁰C celasseE. nna daaa ssiitri fug Ie^t₅ Bis überstehende Flüssigkeit ν?\ιτ&$ 'SürGh eine O₉5 22. starke M-eselgurseiiicht filtriert t:;ä aaim !^.pliiliirlsrt. Is wurden 33 Gewichtateile rcher Is't^akt von fcsiib2*siiner larbs srhslten» 13 Sewicfctsteile roher lyopMlisierter Kartoffelsst^akt 7;urösn in 75 Gewiehtsteilsn O₅2 s 2ris-HGl-2yff®rj pH S₅0_s gelöst/ und nach Lösen der gesamtes Einwaage ^ητα& sit 1 si ITaGH der pH-Wert auf 8,0 eingestellt, SIs j?robe wai-üe msäer äi^rcn eine Kieselgurachioiit filt^isr-S "iaä aiii eise sit G₅2 ie !Eris-HCl auf pH 8 äquilisrieris Säule (IA :: 455 ms) aas Äthylenglykolmethacrylat-G-el alt ärcYalent gebundenem Ciiyaotsypsin aufgegeben. Hach linsiehsn ά®2· iös^iig wuräe di© Sänlo mit 0,2 m Sris-HOl, pH 8_?0| mit eiaer DusahilMBg&BGimliiüigkelt von 3,5 ml/h eluiert und stündlich als ablaufan-äen Fraktionen gesammelt. Wenn die "Fraktionen keine SiwsiSrto^is za-slar enthielten, wurde die Säule mit O₅ 2 m KOl-HGl-Lb'svü-ig Y^n pH 2,0 aluiert. Durch die pH^lndarung übt- Saal« erfolg'%s öle linie-

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rung des Inhibitors in einer engen Zone. Durch eine einzige Operation war die Inhibitionsalctivität des isolierten Inhibitors auf mehr als das Dreizehnfache angestiegen.

Beispiel 6

Hühner-Ovoinhibitor wurde aus rohem Ovomucoid durch Affinitätschromatographie an Diäthylenglykolacrylat-Gel mit !covalent gebundenem Trypsin isoliert. Aus dem aus Eiweiß vom Hühnerei nach Lineweaver und Murray (J. Biol. Ghem. 171 (1947) 565) mit Hilfe von Trichloressigsäure und Aceton gewonnenen rohen Htihner-Ovomucoid wurde nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren der Ghymotrypsin-Ovoinhibitor isoliert. Durch eine einzige Operation stieg die inhibierende Aktivität des Inhibitors auf das Dreißigfache an.

Beispiel 7

Die Affninitätschromatographie von handelsüblichem Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen an einer Säule aus Hydroxyäthylmethacrylat-öel (Molekulargewichts-Ausschlußgrenze 300.000) mit !covalent gebundenem Trypsin wurde nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

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Claims

Patentansprüche

2 3 2 3 k22

Verfahren zur Isolierung von biologisch aktiven Verbindungen durch Affinitätschromatographie auf der Basis der Bildung γοη Sorptionskomplexen zwischen der zu isolierenden löslichen Verbindung und einer biologisch aktiven Verbindung, die durch eine kovalente Bindung ari de« festen Träger gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger hydrophile makroporöse Copolymere von hydrophilen Monomeren wie Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Oligo- oder Poiyglykolacrylaten, Oligo- oder PoIyglykolmethacrylaten, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamiden, Methacrylamiden, Aminoalkylacrylaten, Aminoalkylmethaerylaten, Acrylsäure, Methacrylsäure oder Methylol&crylamid mit Divinyl- oder Polyvinyl-Oomonomeren, wie Alkylendiacrylaten, Alkylendi'Sfethacrylaten, Oligo- oder Polyglykoläiacrylaten, Oligo- oder Polyglykoldimethacrylaten, Alkyl- oder Glykol-tri- und -polyacrylaten und -methacrylate^ Alkylenbisacrylamiden und -methacrylamiden und Divinylbenzol verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile makroporöse Gel mit den gebundenen biologisch aktiven Substanzen, wie z.B. Enzymen, Enzyminhibitoren, Antikörpern, Antigenen, Hormonen usw., in Berührung mit der lösung der zu trennenden Verbindungen bringt und nach Gleichgewichtseinstellung und Abtrennung des Trägers mit dem gebundenen Sorptionskomplex von der ursprünglichen Lösung den Sorptionskomplex durch Änderung der physikalischen oder chemischen Bedingungen dissoziiert und die reinen isolierten Verbindungen vom Gel abgetrennt, wobei das gesamte Verfahren zyklisch oder kontinuierlich durchgeführt wird.

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3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus diskreten, vorzugsweise kugelförmigen Teilchen besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein 'frägergel in Porm von Blöcken, Polien Stäben, Saiten, Seilen oder Bändern verwendet wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß sich das Gel während der Isolierung in einer stationären Lage befindet, zum Beispiel in einer Schicht oder in einer Säule, und dia Lösung der au trennenden Verbindungen und das Elutionsmittel auf das Gel geleitet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Trägergel bewegt und die lösung des zu trennenden Gemisches und das Blutionss.ittel stationär sind, wobei sich das Gel fest auf einem endlosen Band befindet oder die Porm eines sich bewegenden Bäcies oder Seils besitzt ηη,ύ der Kontakt mit der Lösung der au trennenden .Substanzen und mit des SIutionsmittel an verschiedenen Stellen entlang der Bahn des sich bewegenden Gels erfolgt,
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Lösung des au trennenden Genrisches und das Elutionsmittel im Gegenstroa zu oder gleichsinnig mit dem Gel bewegen.

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