DE60019333T2

DE60019333T2 - Molekular geprägte polymere hergestellt durch polymerisation in gegenwart von einem matrix

Info

Publication number: DE60019333T2
Application number: DE60019333T
Authority: DE
Inventors: Sergiy Anatoliyovich Cranfield PILETSKY; Olena Volodimirivna Cranfield Piletska; Ganna Valentinivna Elska; Sven Hakan ANDERSSON; Alan Ian NICHOLLS; Anthony Peter Francis North Crawley Turner
Original assignee: Cranfield University
Current assignee: Cranfield University
Priority date: 1999-10-23
Filing date: 2000-10-23
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-10-24
Also published as: AU1039701A; DE60019333D1; ES2240185T3; GB9925056D0; WO2001030856A1; ATE292642T1; JP5026649B2; EP1237936B1; CA2388130A1; US6852818B1; AU773252B2; JP2003513112A; EP1237936A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft molekular geprägte Polymere ("MIPs"), Matrizenpolymerisationverfahren zu ihrer Herstellung und Verwendungen davon. In bevorzugten Ausführungsformen sind die MIPs biologisch aktiv, z.B. in Form von Arzneimitteln, Effektoren, Modulatoren oder Inhibitoren. Sofern es der Zusammenhang nicht anders erfordert, schließt die Bezeichnung "Polymer" Dimere, Oligomere und höhere Polymere sowie Gemische ein.
Hintergrund der Erfindung
Bei Matrizenpolymerisation erfolgt die Bildung eines polymeren Rezeptors (Kopie oder MIP) in Gegenwart eines anderen Polymers oder einer niedermolekularen organischen Substanz (Matrize). Vor der Initiierung der Polymerisation und während der Polymerisation verteilen sich die Komponenten (im Allgemeinen Monomere) räumlich selbst (Selbst-Anordnungs-Prozess) gemäß der Größe, Polarität und Funktionalität der Matrize rund um die Matrizenmoleküle. Die Monomere werden entweder zu linearen Ketten oder zu starren dreidimensionalen Netzwerken polymerisiert.
Das erste Beispiel von Kieselsäure-Polykondensation in Gegenwart von organischen Matrizen wurde von Polyakov und Mitarbeitern vorgestellt (siehe Verweise 10–12, 19). Kieselgele, die in deren Experimenten hergestellt wurden, behielten Strukturen bei, die für jene der Matrizenmoleküle spezifisch waren.
Spätere Experimente mit Matrizen oder molekularer Prägungspolymerisation, basierend auf Vinyl- oder Acryl-Monomeren, wurden in den Gruppen von Wulff und Mosbach durchgeführt (siehe Verweise 2, 5, 13, 16–18). Mehrere Patente, die die Herstellung von Sorbenzien, Katalysatoren und Sensoren auf der Grundlage von geprägten Polymeren beschreiben, wurden erst jüngst ausgegeben (siehe die US-Patente 5.110.833, 5.630.978, 5.728.296, 5.756.717 und die WO 9.641.173).
Ein anderer Ansatz schließt die Modifikation von Proteinen wie beispielsweise Enzymen in Gegenwart von Matrizenmolekülen ein, um Veränderungen ihrer Eigenschaften, z.B. Spezifität und Aktivität, zu erwirken (siehe Verweis 1 und das deutsche Patent DE 19.627.162 ).
Der herkömmliche Ansatz bindet die Produktion von stark vernetzten geprägten Polymeren ein, die in Wasser und organischen Lösungsmitteln unlöslich sind. Aufgrund ihrer inhärenten Unlöslichkeit sind die Möglichkeiten, diese Materialien zu pharmakologischen und medizinischen Zwecken einzusetzen, eingeschränkt. Hintergrundinformation können in den folgenden Verweisen gefunden werden.

1. Dabulis, K., et al., "Molecular Imprinting of Proteins and other Macromolecules Resulting in New Adsorbents," Biotechnol. Bioeng., 39(2):176–185 (1992).
2. Haupt, K., Dzgoev A., and K. Mosbach. Assay System for the Herbicide 2,4-D Using a Molecularly-Imprinted Polymer as an Artificial Recognition Element. Anal. Chem. 70, 628–631 (1998).
3. Holliger, P., et al., "Artificial Antibodies and Enzymes: Mimicking Nature and Beyond," Trends in Biotechnology, 13(1):7–9 (1995).
4. Illman, D., "Polymer Mimics Antibody in Drug Assay," Chemical & Engineering News, 71(9):30–31 (1993).
5. Mosbach, K., "Molecular Imprinting," Trends in Biochem. Sci., 19(1):9–14 (Jan. 1994).
6. Noronha-Blob, L. et al., "Uptake and Fate of Water-Soluble, Nondegradable Polymers with Antiviral Activity in Cells and Animals," J. Med. Chem., 20(3):356–359 (1977).
7. Ottenbrite, R.M., et al., "Macrophage Activation by a Series of Unique Polyanionic Polymers," J. Macromol. Sci. Chem., H. K. Frensdorff, ed., A25(5–7):873–893 (1988).
8. Ottenbrite, R.M., "Introduction to Polymers in Biology and Medicine," in Anionic Polymeric Drugs (Polym. Biol. Med.), L.G. Donaruma, R.M. Ottenbrite, and O. Vogl, eds., John Wiley & Sons, New York, vol. 1, pp. 1–20 (1980).
9. Piletsky, S.A., et al. Optical detection system for triazine based on molecularly-imprinted polymers. Anal. Lett . 30, 99 5–4 55 (1997).
10. Polyakov, NIV. Adsorption properties and structure of silica gel. Zhur. Fiz. Khim. 2, p.799. (1931).
11. Polyakov, M.V., L.P. Kuleshina, and I.E. Neimark. On the dependence of silica gel adsorption properties on the character of its porosity. Zhur. Fiz. Khim.10:100-112 (1937).
12. Polyakov, M.V., P.M. Stadnik, M.W. Paryckij, I.M. Malkin, and F.S. Duchina. On the structure of silica. Zhur. Fiz. Khim. 4, p. 959 (1933).
13. Ramström, O., Ye L., and Mosbach K. Artificial Antibodies to Corticosteroids Prepared by Molecular Imprinting. Chem. & Biol. 3 (6):471–977 (1996).
14. Shea, K.J., et al., "Molecular Recognition on Synthetic Amorphous Surfaces. The Influence of Functional Group Positioning on the Effectiveness of Molecular Recognition, " J. Am. Chem. Soc., 108 (5):1091-1093 (1986).
15. Tahmassebi, D.C., et al., "Molecular Imprinting Synthesis of a 3-Helix Bundle Proteins on Modified Silica Gel," Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., vol. 204, No. 1–2:319, 204th American Chemical Society National Meeting, Washington, D.C. (Aug. 23–28; 1992).
16. Vlatakis, G., et al., "Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting," Nature, 361(18):645–647 (1993).
17. Wulff, G., "Molecular Imprinting in Synthetic Polymers; Models for the Receptor Site in Enzymes," Makromol. Chem, Macromol. Symp., 70/71:285–288 (1993).
18. Wulff, G., et al., "Enzyme-Analogue Built Polymers, 26: Enantioselective Synthesis of Amino Acids Using Polymers Possessing Chiral Cavities Obtained by an Imprinting Procedure with Template Molecules," Makromol. Chem , H.-G. Elias, T. Tsuruta, eds., 190(7):1727–1735 (1989).
19. Vysotskii, Z.Z., and M.V. Polyakov. The preparation of specific adsorbents. Zhur. Fiz. Khim. 30:1901–1902 (1956).

Offenbarung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines Gemischs aus unterschiedlichen funktionellen Monomeren, die aus Vinylmonomeren, Allylmonomeren, Acetylenen, Acrylaten, Methacrylaten, Aminosäuren, Nucleosiden, Nucleotiden, Kohlenhydraten, Heterozyklen sowie Derivaten davon ausgewählt sind;
b) Durchführen einer matrizengerichteten Polymerisation von funktionellen Monomeren in Gegenwart einer molekularen Matrize, wodurch ein lineares Polymer erzeugt wird, das aus einer Sequenz der Monomere gebildet wird, wovon zumindest ein Teil zu zumindest einem Teil der Matrize komplementär ist; mit der Maßgabe, dass, wenn die Matrize eine Nucleinsäure ist, die Monomere andere Spezies als Nucleotide umfassen; und
c) Herstellen einer Lösung eines löslichen Polymers, das ein komplementäres Polymer ist oder vom komplementären Polymer abgeleitet ist und zumindest einen Teil umfasst, der zumindest zu einem Teil der Matrize komplementär ist.

Die resultierende Lösung enthält eine oder mehrere Spezies, die von Polymeren, Oligomeren und Dimeren ausgewählt ist/sind und die so adaptiert werden kann/können, dass sie sich an das Matrizenmolekül bindet/binden.
Die Matrize kann ein Molekül oder ein größeres, im Allgemeinen biologisches System sein. Vorzugsweise ist sie ein biologischer Rezeptor, eine Nucleinsäure, Zelle, ein Virus, Mikroorganismus, eine Gewebeprobe, ein Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Polysaccharid, Nucleoprotein, Mucoprotein, Lipoprotein, synthetisches Protein, Glykoprotein, Glucosaminoglycan, Enzym, Steroid, Immunosuppressor, Hormon, Heparin, Antibiotikum, Vitamin oder Arzneimittel. Die Matrize weist geeigneterweise ein absolutes Molekulargewicht von 200 bis 3.000.000 auf.
Vorzugsweise weist das lösliche Polymer aus Schritt (c) biologische Aktivität auf, z.B. in Form eines Arzneimittels, Effektors, Modulators oder Inhibitors. Vorzugsweise ist das Polymer wasserlöslich, z.B. zu einem ausreichend Grad, sodass es in einem wässrigen Medium biologische Aktivität aufweist.
Bevorzugte Monomere sind wasserlöslich.
Polymerisation kann unter Verwendung von für die Monomere geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von radikalischen Initiatoren für ethylenisch ungesättigte Monomere; von Kondensationsmittel wie beispielsweise Carbodiimiden für Aminosäuren; von Polymeraseenzymen für Nucleoside und Nucleotide. Sofern geeignet, können Vernetzer verwendet werden.
Schritt (c) kann (i) das Abtrennen eines Komplexes, der das Matrizenmolekül und das komplementäre Polymer umfasst, vom Polymerisationssystem; und (ii) das Entfernen des Matrizenmoleküls umfassen. Das Abtrennen des Komplexes kann durch Ändern des pHs der Lösung, durch Ändern der Ionenstärke der Lösung und/oder durch Zusetzen von Harnstoff, Guanidin oder einer Substanz, die mit der Matrize stärker wechselwirkt als das Polymer, erfolgen.
Das Entfernen der Matrize kann durch Filtration, Elektrophorese, chromatographische Trennung, Waschen oder Zentrifugation erfolgen.
Die Herstellung der Lösung kann geeignete Lösung und Trennen der Lösung von unlöslichen Teilchen einbinden. Hiernach können die solubilisierten, synthetisierten Moleküle fraktioniert und/oder gereinigt werden, z.B. durch Zentrifugation, Chromatographie, Elektrophorese oder Dialyse.
Das MIP ist ein lineares Polymer, das aus einer Reihe verschiedener funktioneller Monomere, z.B. Aminosäuren oder Nucleosiden oder Nucleotiden, gebildet ist. Die Beschaffenheit des MIP kann durch seine Sequenz bestimmt werden. Den Schritten (a) bis (c) kann ein Schritt (d) der Sequenzbestimmung und gegebenenfalls ein Schritt (e) der Synthese von MIPs, die entweder die gesamte bestimmte Sequenz oder einen Teil der bestimmten Sequenz aufweisen, und/oder von Varianten davon folgen.
Ein MIP der vorliegenden Erfindung kann als ein Arzneimittel zu pharmakologischen und medizinischen Zwecken, als ein rezeptorspezifischer Ligand in der analytischen Chemie oder in der Durchführung von biotechnologischen Trennungen oder aber in der Pharma- und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Synthese von biologisch aktiven Molekülen (Arzneimitteln, Effektoren, Modulatoren, Inhibitoren) unter Verwendung von Matrizenpolymerisation und deren Anwendung in den Bereichen der analytischen Chemie, der Pharmakologie, der Medizin und der Nahrungsmittel-, Biotechnologie- und Pharmaindustrie bereit. Insbesondere können biologisch aktive Moleküle durch: a) Polymerisation funktioneller Monomere rund um einen biologischen Rezeptor, ein Enzym, eine Nucleinsäure, eine Zelle, ein Virus, einen Mikroorganismus, eine Gewebeprobe oder einen Wirkstoff; b) Abtrennen des gebildeten Polymer-Matrizen-Komplexes und Entfernen des Matrizenmoleküls; c) sofern erforderlich, Solubilisierung der synthetisierten Kopie synthetisiert werden. Dieser Ansatz unterscheidet sich von dem Verfahren, das in der WO-A-9.640.822 und der US-A-5.630.978 beschrieben wird, worin biologisch aktive Moleküle in Gegenwart von Matrizen-geprägtem Polymer gebildet wurden, das in Gegenwart einer anderen Matrize hergestellt worden war, normalerweise in Gegenwart eines Arzneimittels wie beispielsweise Heparin. Die resultierende Kopie gleicht der Struktur des ursprünglichen Arzneimittelmoleküls. Es kann jedoch kaum erwartet werden, dass die Aktivität der auf diese Weise synthetisierten Moleküle stärker ausgeprägt sein kann als jene der ursprünglichen Matrize.
Im hierin beschriebenen Verfahren weisen die synthetisierten Moleküle eine Struktur auf, die zu jener der ursprünglichen Matrize komplementär ist, und weisen die Fähigkeit auf, sich mit annehmbar hoher Affinität an sie zu binden. Diese synthetischen Moleküle, insbesondere Polymere, weisen vorbestimmte Affinitäten und Spezifitäten auf, die jenen von zufällig synthetisierten Polymeren überlegen sind, und können viel leichter hergestellt werden als spezifisch entworfene verschiedene organische Strukturen (siehe Verweis 6–8). Moleküle, die wie in dieser Erfindung synthetisiert wurden (Dimere, Oligomere, Polymere oder Gemische davon), können als Arzneimittel im Bereich der Pharmakologie und der Medizin, als rezeptorspezifische Liganden in der analytischen Chemie (Sensoren, Tests) und für Trennungen in der Biotechnologie, Pharma- und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden. Frühere Versuche des Arzneimitteldesigns basierten typischerweise auf der aufwendigen Untersuchung von Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität von zahlreichen chemischen Strukturen. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein einfacheres und direkteres Verfahren zum Design einer biologisch aktiven Substanz, das im Vergleich zu herkömmlichen Arzneimitteldesign- und -entdeckungsverfahren große Vorteile birgt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1 zeigt ein Schema der Matrizenpolymerisation in Gegenwart eines Matrizenrezeptors. Matrizenspezifisches Polymer-MIP wird in drei Schritten gebildet: 1) Selbstanordnung von Monomeren rund um die Rezeptoroberfläche; 2) Polymerisation von Monomeren durch radikalische Polymerisation, Anionen- oder Kationenpolymerisation oder Polykondensation; 3) Trennen von Matrizen-Polymer-Komplex und Solubilisierung der Kopie (nicht dargestellt).
2(a), (b) und (c) sind Oberflächen-Plasmonresonanzspektren, die die Bindung von MIP-Peptiden an glykosyliertes und unglykosyliertes Hämoglobin bzw. BSA zeigen.
3 ist ein Diagramm optischer Dichte über die Zeit, das das Wachstum einer Hefe in Gegenwart eines Blindproben-Peptids oder eines Peptid-MIP, das zu Hefemembranen komplementär ist, zeigt.
4 ist ein Diagramm, das Trypsinaktivität zeigt, wenn sie durch fraktionierte MIP-Peptide beeinflusst ist.
Ausführungsformen der Erfindung
Herkömmliche Matrizenpolymerisation bindet die Bildung eines starren Polymernetzwerks rund um kleine organische Substanzen wie beispielsweise Arzneimittel ein. Molekular geprägte Polymere (MIPs), die auf diese Weise hergestellt werden, gleichen synthetischen Mimetika von natürlichen Rezeptoren, die für das Arzneimittelmolekül, das als Matrize verwendet wird, spezifisch sind. Unter Verwendung dieses Ansatzes ergeben die aus der Verwendung von großen Molekülen, wie beispielsweise Proteinen und Enzymen, resultierenden Polymere auch unlösliche Polymerprodukte ohne biologische Aktivität.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Bildung von löslichen MIPs, die in Gegenwart einer Matrize hergestellt werden, insbesondere in Gegenwart von großen Molekülen wie beispielsweise Rezeptoren, Enzymen oder Nucleinsäuren. Im Gegensatz zum herkömmlichen Ansatz der MIP-Herstellung gleichen Polymere, die auf diese Art hergestellt werden, Effektoren (Aktivator, Inhibitor oder Substrat) der Matrize und können biologische Aktivität aufweisen. Solche Polymere können beispielsweise als Arzneimittel zu pharmakologischen und medizinischen Zwecken verwendet werden. Im Text, der die vorliegende Erfindung beschreibt, haben die Bezeichnungen "biologisch aktive Substanzen", "Kopie-Moleküle" und "MIPs" dieselbe Bedeutung.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Herstellung der biologisch aktiven Moleküle (MIPs) in Gegenwart einer Matrize, die ein biologischer Rezeptor, eine Nucleinsäure, eine Zelle, ein Virus, ein Mikroorganismus, eine Gewebeprobe, ein Kohlenhydrat, Oligosaccharid, Polysaccharid, Nucleoprotein, Mucoprotein, Lipoprotein, syntheti sches Protein, Glykoprotein, Glucosaminoglycan, Steroid, Immunosuppressor, Hormon, Heparin, Antibiotikum, Vitamin oder Arzneimittel ist.
Normalerweise wird eine Matrize, die in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Wasser, löslich ist, mit einem Gemisch unterschiedlicher funktioneller Monomere und einem Initiator vermischt. Polymerisation kann durch Erhitzen oder durch UV-Bestrahlung initiiert werden und benötigt üblicherweise 1–24 h.
Monomere, die zur MIP-Herstellung verwendet werden können, umfassen: Vinylmonomere, Allylmonomere, Acetylene, Acrylate, Methacrylate, Aminosäuren, Nucleoside, Nucleotide, Kohlenhydrate, Heterozyklen und Derivate davon.
Das Abtrennen des Komplexes, der zwischen der Matrize und den Kopiemolekülen gebildet wurde, und das Solubilisieren der synthetisierten, biologisch aktiven Polymermoleküle kann durch Polymerzerkleinerung, durch Änderung des Lösungs-pHs, der Ionenstärke oder durch Zusatz von Harnstoff, Guanidin oder Substanzen, die mit der Matrize stärker wechselwirken als die Kopie, durch Filtration, Elektrophorese, chromatographische Trennung, Waschen, Zentrifugation oder Dialyse erreicht werden. Dieser Schritt ist erforderlich, um eine wasserlösliche oder in organischem Lösungsmittel lösliche Fraktion von MIP herzustellen, die hohe Affinität zur Matrize aufweist und die mit der Matrize so wechselwirken kann, dass sie deren Wechselwirkung mit anderen Molekülen in vitro oder in vivo aktiviert oder hemmt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Anwendung der synthetisierten, biologisch aktiven Moleküle als Arzneimittel im Bereich der Pharmakologie und der Medizin, als rezeptorspezifische Liganden in der analytischen Chemie (zur Verwendung als Erkennungskomponenten in Sensoren, oder in Tests) oder zu biotechnologischen Trennungen und Trennungen in der Pharma- und der Nahrungsmittelindustrie. Die vorliegende Erfindung wird nun unter Verweis auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher beschrieben.
1. Synthese und Untersuchung von für glykosyliertes Hämoglobin spezifischen Peptidliganden.
Gereinigtes glykosyliertes Hämoglobin (HbA_1c, 4 mg) in 2 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde mit 2,5 ml Lösung von 20 natürlichen Aminosäuren (2 mM jeweils) vermischt. 0,5 ml einer 220 mM Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) wurden dem Reaktionsbehälter zugesetzt. Die Aminosäurepolymerisation in Gegenwart einer Matrize wurde 4 Stunden lang durchgeführt. Zur Herstellung des Blindproben-Polymers wurde dieselbe Reaktion in Abwesenheit von Hämoglobin durchgeführt. Um EDC, nicht umgesetzte Aminosäuren und Peptide mit geringer Affinität zu entfernen, wurde das Reaktionsgemisch durch durchlässige 50-kDa-Amicon-Membranen (Centriplus YM-50, Millipore) filtriert. Das Hämoglobin, das nun auf dem Filter konzentriert war, wurde zweimal mit 50 mM Natriumphosphatpuffer gewaschen.
Salzsäure wurde verwendet, um Peptide vom geprägten Hämoglobin zu entfernen. 10 μl 5 M HCl wurden 2 ml Hämoglobinlösung zugesetzt, was den pH auf pH 3,0 verschob. Das Gemisch wurde 10 min lang beschallt und noch einmal durch eine 50-kDa-Amicon-Membran filtriert. Peptide, die durch die Membran hindurchdrangen, wurden dieses Mal gesammelt. Die Lösung wurde mit 5 μl 4 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt.
Die Affinität der synthetisierten Peptide wurde unter Verwendung des Oberflächen-Plasmonresonanzverfahrens (Surface Plasmon Resonance, SPR) gemessen. HbA_1c und HbA₀ wurden über eine Peptidkondensation unter Verwendung von EDC/NHS-Chemie mit CM5-Biacore-Chip (Biacore, Uppsala, Schweden) gebunden. Der Grad an Hämoglobinimmobilisierung betrug 1.000 RU bzw. 7.000 RU. Trotz des signifikannten Unterschieds in Bezug auf den Immobilisierungsgrad wurde gezeigt, dass MIPs leicht stärkere Affinität zu HbA_1c-Oberfläche aufweisen (Daten nicht dargestellt).
Um die Spezifität der MIPs für glykosyliertes Hämoglobin zu verbessern, wurden 3 mg NbA₀ zu 2 ml Peptidlösung in 50 mM Natriumphosphatpufter, pH 7,5, zugesetzt und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das HbA₀ mit gebundenen Peptiden wurde durch Filtration unter Verwendung einer 50-kDa-Amicon-Membran entfernt, um die Peptide, die für NbA_1c nicht-spezifisch waren, zu eliminieren. Die Fraktion, die Peptide mit Affinität nur zu HbA_1c enthielt, wurde unter Verwendung des Biacore analysiert. HbA_1c, HbA₀ und BSA wurden auf CM5-Biacore-Chip mit möglicherweise gleichem Immobilisierungsgrad (1.100 RU, 1.050 RU bzw. 1.020 RU) immobilisiert, um die Selektivität der extrahierten MIP-Peptide zu schätzen. Die Bindungsanalyse zeigt eindeutig, dass die Affinität von danach gescreenter Fraktion für HbA_1c im Vergleich zur davor gescreenten Fraktion erhöht war (siehe 2). Die Bindung mit der HbA_1c Oberfläche wurde auf 12,5 RU geschätzt, jene mit HbA₀ auf –5,9 RU und jene mit BSA auf 0.
Die Resultate weisen darauf hin, dass Aminosäuren als Monomere zur Prägungspolymerisation verwendet werden können. Synthetisierte MIPs weisen im Vergleich zu zufällig synthetisierten (Blindproben-) Polymeren gesteigerte Spezifität und Affinität zur Matrize auf.
2. Synthese und Untersuchung von für Hefe spezifische Peptidliganden
4 mg gereinigte Hefemembranen (Sporobolomyces roseus) in 2 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurden mit 2,5 ml Lösung von 20 natürlichen Aminosäuren (2 mM jeweils) vermischt. 0,5 ml von 220 mM Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) wurden dem Reaktionsbehälter zugesetzt. Die Aminosäurepolymerisation in Gegenwart einer Matrize wurde 4 Stunden lang durchgeführt. Zur Herstellung des Blindproben-Polymers wurde dieselbe Reaktion in Abwesenheit einer Matrize durchgeführt. Um EDC, nicht umgesetzte Aminosäuren und Peptide mit geringer Affinität zu entfernen, wurde das Reaktionsgemisch durch durchlässige 50-kDa-Amicon-Membranen (Centriplus YM-50, Millipore) filtriert. Die Zellmembra nen, die nun auf dem Filter konzentriert waren, wurden zweimal mit 50 mM Natriumphosphatpuffer gewaschen.
Salzsäure wurde verwendet, um Peptide, die an der Hefemembran adsorbiert waren, zu entfernen. 10 μl 5 M HCl wurden zu 2 ml Hefemembranlösung zugesetzt, wodurch der pH auf pH 3,0 verschoben wurde. Das Gemisch wurde 10 min lang beschallt und noch einmal durch eine 50-kDa-Amicon-Membran filtriert. Peptide, die durch die Membran hindurchdrangen, wurden dieses Mal gesammelt, Die Lösung wurde mit 5 μl 4 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt.
Synthetisierte Peptide wurden dem Medium mit Hefe in Konzentrationen von 0,6, 6, 25, 50 und 100 μg/ml zugesetzt. Das Hefewachstum wurde durch Messen der optischen Dichte der Kultur bei 405 nm beobachtet. Der Einfluss der synthetisierten Peptide auf den Wachstumsprozess ist in 3 dargestellt. Die Hemmung, die bei MIP-Peptiden beobachtet wurde, ist ein klarer Hinweis auf ihre biologische Aktivität. Die Natur dieses Phänomens könnte durch spezifische Hemmung der Rezeptoren, die an der Membranoberfläche frei liegen, durch MIP-Peptide erklärt werden. Es ist wichtig, dass diese Wirkung im Fall von Hefemembranen im Vergleich zu E.-Coli- oder Bacillus-Spezies viel stärker ausgeprägt war, was auf ihre Spezifität hinweist. Keine Veränderung des Hefewachstums wurde in Gegenwart von Blindproben-Peptiden festgestellt.
3. Synthese und Untersuchung von Peptidliganden, die in Gegenwart von Trypsin hergestellt wurden.
4 mg Trypsin in 2 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurden mit 2,5 ml Lösung von 20 natürlichen Aminosäuren (2 mM jeweils) vermischt. 0,5 ml 220 mM Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) wurden dem Reaktionsbehälter zugesetzt. Die Aminosäurepolymerisation in Gegenwart einer Matrize wurde 4 Stunden lang durchgeführt. Zur Herstellung des Blindproben-Polymers wurde dieselbe Reaktion in Abwesenheit einer Matrize durchgeführt. Um EDC, nicht um gesetzte Aminosäuren und Peptide mit geringer Affinität zu entfernen, wurde der pH des Reaktionsgemischs durch Zusatz von Salzsäurealiquote auf 3,0 eingestellt. Das Gemisch wurde sofort in HPLC injiziiert und unter Verwendung von Superdex-Peptid-Säule in 10 mM Natriumphosphat-Salzlösungspufter, pH 7,4, getrennt. Der Einfluss von Peptidfraktionen auf Trypsinaktivität wurde analysiert (4). Es ist wichtig, dass nur die ersten drei Fraktionen enzymatische Aktivität aufwiesen, die aus den Restmengen an Trypsin entstand, die in der Lösung vorhanden waren. Die restlichen Fraktionen wiesen selbst keine Trypsin-enzymatische Wirkung auf, sie waren jedoch in der Lage, das ihnen zugesetzte Trypsin im Wesentlichen zu aktivieren. Die Wirkung konnte durch teilweise Stabilisierung der Trypsinstruktur in Gegenwart von geprägten Peptiden erklärt werden.

Claims

Verfahren, folgende Schritte umfassend: a) Bereitstellen eines Gemischs aus unterschiedlichen funktionellen Monomeren, die aus Vinylmonomeren, Allylmonomeren, Acetylenen, Acrylaten, Methacrylaten, Aminosäuren, Nucleosiden, Nucleotiden, Kohlenhydraten, Heterozyklen, sowie Derivaten davon ausgewählt sind, b) Durchführen einer matrizengerichteten Polymerisation von funktionellen Monomeren des Gemischs in Gegenwart einer molekularen Matrize, wodurch ein lineares Polymer erzeugt wird, das aus einer Sequenz der Monomere gebildet wird, wovon zumindest ein Teil zu zumindest einem Teil der Matrize komplementär ist; mit der Maßgabe, dass, wenn die Matrize eine Nucleinsäure ist, die Monomere andere Spezies als Nucleotide umfassen; und c) Herstellen einer Lösung eines löslichen Polymers, das ein komplementäres Polymer ist oder vom komplementären Polymer abgeleitet ist und zumindest einen Teil umfasst, der zumindest zu einem Teil der Matrize komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Matrize ein biologischer Rezeptor, Nucleinsäure, eine Zelle, ein Virus, ein Mikroorganismus, eine Gewebeprobe, ein Kohlenhydrat, ein Oligosaccharid, ein Polysaccharid, ein Nucleoprotein, ein Mucoprotein, ein Lipoprotein, ein synthetisches Protein, ein Glykoprotein, Glykosaminoglykan, ein Enzym, ein Steroid, ein Immunsuppressor, ein Hormon, ein Heparin, ein Antibiotikum, ein Vitamin oder ein Arzneimittel ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Matrize eine Molekülspezies mit einem Molekulargewicht von 200 – 3.000.000 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Monomere aus Aminosäuren, Nucleosiden und Nucleotiden ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die funktionellen Monomere Aminosäuren umfassen und die Polymerisation mithilfe eines amidbildenden Kondensationsmittels durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Schritt (c) Folgendes umfasst: (i) das Trennen eines Komplexes, der das Matrizenmolekül und ein komplementäres Polymer umfasst, vom Polymerisationssystem; und (ii) das Entfernen des Matrizenmoleküls.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Entfernen der Matrize das Trennen der Matrize vom Polymer mithilfe. eines oder mehreren aus Änderung des pHs der Lösung, Änderung der Ionenstärke der Lösung und/oder Zusatz von Harnstoff, Guanidin oder einer Substanz, die mit der Matrize stärker wechselwirkt als das Polymer, ausgewählter Vorgängen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin das Entfernen der Matrize die Durchführung eines oder mehrerer aus Filtration, Elektrophorese, chromatographischer Trennung, Waschung oder Zentrifugation ausgewählter Vorgänge umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin auf Schritt (c) als Schritt (d) Sequenzbestimmung folgt.
Verfahren nach Anspruch 9, worin auf Schritt (d) als Schritt (e) Synthese von Polymeren mit der gesamten oder einem Teil der bestimmten Sequenz und/oder Varianten davon folgt.
Polymer, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wovon zumindest ein Teil zu zumindest einem Teil einer Matrize komplementär ist.
Verwendung eines Polymers, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, als Arzneimittel, als rezeptorspezifischer Ligand in der analytischen Chemie oder zur Verwendung bei der Durchführung von biotechnologischen Trennungen oder in der Pharma- oder Nahrungsmittelindustrie.