DE19902724A1 - Mikrokapseln aus Sporopollenin, Verfahren zu ihrer Herstellung und Anwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft makroporöse, mechanisch stabile und gut filtrierbare Mikrokapseln, ihre Herstellung, Modifikation und Anwendung. Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln besitzen als formgebende Struktur eine Wand aus Sporopollenin, die durch das intakte gereinigte Sporoderm oder die intakte gereinigte Exine pflanzlicher Sporen oder Pollen repräsentiert wird und die mechanische Festigkeit der Kapseln bestimmt. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren der Füllung dieser Kapseln mit verschiedenen Stoffen, ihre Beschichtung mit kolloidal aufgebauten Membranen und vorteilhaft anwendbare Dispersionen dieser Kapseln. Beschreibung

Description

Mikrokapseln mit poröser und dünner Wand besitzen eine große Zahl potentieller Anwendungen in der Biotechnologie, u. a. auf dem Gebiet der Chromatographie, Biokatalyse und Wirkstoffapplikation. Derartige Kapseln besitzen die Vorteile einer großen Oberfläche und eines schnellen Diffusionsaustausches für permeable Stoffe. Falls sie mechanisch ausreichend stabil für die Gewährleistung einer guten Filtrierbarkeit sind, eignen sie sich für die Säulenchromatographie und die Stoffwandlung im Flüssigkeitsstrom durch eine feste Packung. Die Verfügbarkeit von filtrierbaren Mikrokapseln mit Wänden aus porösem biokompatiblem organischem Material und einer einheitlichen Größe unterhalb von 200 µm ist begrenzt.

Mikrokapseln lassen sich auf verschiedene Weise, z. B. aus geschmolzenem Glas, durch Membranbildung aus zuvor löslichen Polymeren, oder aus Pflanzenzellen durch Extraktion des Protoplasten, wobei Zellwandkapseln erhalten bleiben, gewinnen. Bisher wurden Zellwandkapseln aus Zellulose und anderen hydrophilen quellfähigen Kohlenhydraten präpariert (Ehwald und Fuhr 1984, Patent DE 33 47 512). Zellwandkapseln können kostengünstig aus nachwachsenden Rohstoffen hergestellt werden, sind ernährungsphysiologisch unbedenklich und haben den Vorteil einer gut definierten und einheitlichen Größenausschlußgrenze ihrer Membran. Die bisher bekannten Zellwandkapseln sind aber mechanisch deformierbar und in alkalischen oder stark sauren wäßrigen Medien unbeständig (Ehwald et al. 1992, Phytochemistry 31, 3033-3038).

Eine Teilaufgabe der Erfindung besteht darin, aus nachwachsenden pflanzlichen Rohstoffen vielseitig einsetzbare, druckfeste und lösungsmittelresistente Mikrokapseln mit einheitlicher Größe im Bereich von 5 bis 50 µm und makroporöser Wand bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Sporopollenin- Hüllen von Pollenzellen oder Sporen von den übrigen Bestandteilen der Zelle durch Hydrolyse in verdünnter Säure und bekannte Extraktionsschritte ohne mechanischen Aufschluß isoliert werden. Es hat sich gezeigt, daß die für die Reinigung des Sporopollenins übliche Azetolyse oder die mechanische Zerkleinerung der Zellwand umgangen werden können, wenn eine Kombination aus bekannten Verfahren der Lipidextraktion, des hydrolytischen Abbaus und der Solubilisierung von Polysacchariden sowie der Entproteinierung eingesetzt wird. Es wurde außerdem gefunden, daß die Sporopolleninkapseln beim Trocknen aus organischen Lösungsmitteln wie Aceton und Alkoholen schrumpfen, während sie beim Trocknen aus Wasser ihre Größe und konvexe Form behalten. Die Sporopolleninkapseln unterscheiden sich in dieser Hinsicht grundsätzlich von anderen Zellwandkapseln, die beim Trocknen aus Wasser oder wasserhaltigen Lösungsmitteln viel stärker schrumpfen als beim Trocknen aus wasserfreien organischen Lösungsmitteln. Dieser Befund deutet auf ein sehr geringes Quellvermögen des Sporopollenins in Wasser hin.

Bekanntlich ist auf die zellulosehaltige Zellwand bei den Sporen der Moose und Pterididophyten sowie bei den Pollen der Blütenpflanzen eine äußerst säure- und laugenfeste, mechanisch stabile und oberflächenreiche Wandschicht, das Sporoderm bzw. die Pollenexine, aufgelagert. Diese Schicht besteht aus Sporopollenin, einem speziellen, gegen Hydrolyse in Säuren und gegen Solubilisierung in alkalischen Lösungsmitteln sehr resistentem Kondensationsprodukt von sauerstoffhaltigen, terpenartigen, aliphatischen und aromatischen pflanzlichen Ausgangsstoffen, das außer Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff keine weiteren Elemente in nennenswerter Konzentration enthält (Stanley und Linskens 1985, Pollen-Biologie, Biochemie, Gewinnung und Verwendung, Urs Freund Verlag Greifenberg). Über die Permeabilität der Pollenexine für makromolekulare Stoffe gibt es in der Literatur keine Angaben. Wir haben festgestellt, daß die Exine des Pollens verschiedener Pflanzen makroporös ist bzw. eine unerwartet große Ausschlußgrenze besitzt. Sie ist für große Proteinmoleküle und Dextranmoleküle mit einem Stokesschen Durchmesser bis über 20 nm hochpermeabel.

Der Einsatz von gereinigten Sporopolleninpartikeln als gut filtrierbares und chromatographiefähiges Trägermaterial mit günstigen mechanischen Eigenschaften ist bekannt. Das gereinigte Sporoderm der Bärlappsporen (Lycopodium clavatum) wird als partikuläre Festphase für die Immobilisierung von Peptiden bei der chemischen Peptidsynthese und als Chromatographiepartikel für die kovalente Verankerung verschiedener Liganden genutzt (Brook and Shaw 1968, Nature 220, 678; Mackenzie and Shaw 1980,/nt. J. Pept. Proein Res., 15, 298, Pehlivian et al. 1994, Separation Science and Technology 29,1757). Um Sporopollenin für diese Anwendungen zu isolieren, wird eine Entfettung der Bärlappsporen mit organischen Lösungsmitteln und ein Aufschluß mit konzentrierter Mineralsäure (Azetolyse) durchgeführt. Nach der Azetolyse und den anschließenden Extraktionsschritten bleibt das Sporopollenin erhalten, ist aber chemisch modifiziert und z. T. gefaltet, wodurch das Lumen der Kapsel stark verringert ist. Durch die Azetolyse mit Phosphorsäue oder Schwefelsäure werden vermutlich Säuregruppen in das Sporopollenin einbracht, wodurch seine Löslichkeit in Aminoethanol verloren geht (C. Jungferman et al. 1997, J. Plant Physiol. 151, 513). Bei den genannten Anwendungen des Sporopollenins werden die mechanische Festigkeit, die günstige und relativ einheitliche Partikelgröße und die außerordentlich hohe chemische Stabilität des Sporopollenins in stark sauren und stark alkalischen wäßrigen Medien ausgenutzt. Die Mikrokapsel-Struktur spielt für die bisher bekannten Anwendungen des Sporopollenins keine Rolle, auf die Erhaltung der ungefalteten konvexen Kapselform des Exine bzw. des Sporoderms wurde bislang bei der Herstellung der Partikeln kein Wert gelegt.

Die erfindungsgemäßen Sporopollenin-Mikrokapseln und ihre Anwendung als mechanische Stützphase für die Verkapselung von Stoffen und Zellen sind vorteilhaft. Das Sporoderm und die Pollenexine sind makroporös, druckfest, in Wasser nicht quellfähig, fast monodispers, und besitzen eine für die Filtration und Chromatographie günstige Größe von 5 bis 50 µm. Sie können mit stark alkalischen und stark sauren wäßrigen Lösungen gereinigt und pyrogenfrei gemacht werden. Durch Verwendung der Pollen der Hasel, Erle, Birke und weiterer mono-bis polyporater Pollen sind Kapselstrukturen mit einzelnen relativ großen definierten Perforationen verfügbar, die beim Trocknen aus Wasser nicht kollabieren und die mit Kolloiden aller Größen oder kleinen Partikeln und Mikroorganismen beladen werden können.

Da Membranen mit scharfem Cut-off im Ultrafiltrationsbereich (Porenweite für Stokessche Radien von 1 bis 20 nm) aus quellfähigem kolloidalem Material aufgebaut sind, waren kleine, und gleichzeitig gut filtrierbare Mikrokapseln mit definiertem Größenausschluß in diesem Molekülgrößenbereich bisher nicht verfügbar. Um sie zu gewinnen, werden erfindungsgemäße makroporöse, druckfeste Sporopollenin- Mikrokapseln mit geeigneter Größe, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 50 µm, mit kolloidalen Stoffen homogen beschichtet: Für die Beschichtung können ähnliche kolloidale Stoffe eingesetzt werden wie bei Bildung von Mikrokapseln durch Membranbildung aus zuvor löslichen Kolloiden. Die beschichteten Sporopollenin- Mikrokapseln verbinden die Vorteile der mechanischen Festigkeit mit dem Vorteil eines scharfen Größenausschlusses im Ultrafiltrationsbereich und stehen für die Größenausschlußchromatographie zur Verfügung. Bei dem Beschichtungsprozeß können, ähnlich wie bei anderen Verkapselungsverfahren Enzyme, Rezeptoren oder Wirkstoffe immobilisiert werden, wobei diese Art der Immobilisierung den Vorteil hat, daß die Immobilisate gut filtrierbar sind.

Die Einführung von Stoffen in perforierte Mikrokapseln, die aus der Exine von mono- oder polyporaten Pollen bestehen, ist besonders einfach. Sie erfordert nur das Trocknen einer Dispersion der Mikrokapseln aus entsprechenden Lösungen. Weil das Eindringen der Flüssigkeitsmenisken in die Perforation wegen der Oberflächenbeschaffenheit und der Größe der Perforation ohne starken Unterdruck möglich ist, können derartige Kapseln aus Wasser oder wäßrigen Lösungen und geeigneten anderen das Sporopollenin nicht quellenden Flüssigkeiten getrocknet werden, ohne daß die Exine sich deformiert und der Hohlraum kollabiert. Danach liegt der gelöste Stoff konzentriert oder getrocknet im Hohlraum vor. Werden die Sporopolleninkapseln mit einem kolloidalen Stoff beschichtet, z. B. durch Aufsprühen einer acetonischen Lösung von Kollodium im Wirbelbett, entstehen Mikrokapseln mit einer permselektiven Membran. Durch Überziehen der makroporösen Kapseln mit einer kolloidalen Membran können makromolekulare Wirkstoffe oder eingeschlossene feine Partikeln, z. B. Latices mit adsorbierten Antikörpern oder kleine Zellen, stabil eingeschlossen werden.

Die Erfindung soll an den nachfolgend dargestellten Beispielen erläutert werden.

A. Mechanisch vorgereinigte Haselnußpollen werden über Nacht in 1%iger Schwefelsäure bei 90°C inkubiert, anschließend mit Wasser gewaschen und in einer Soxhlet-Apparatur mit Ethanol und Petroläther entfettet. Das so behandelte Material wird mit Ethanol und Wasser gewaschen, wobei sorgfältig darauf geachtet wird, daß die Pollenkörner stets mit der organischen Phase bedeckt sind. Das wassergesättigte Material wird 24 h lang in einer schwach sauren wäßrigen Lösung (pH 4,5) von 1% Cellulase Onozuka R-10 und 1% Macerozym (Serva) zur Auflösung der Intine drei Tage und danach weitere 24 h in einer neutralen Pufferlösung mit dem Pankreas-Enzymgemisch "Trypsin zur Zellzucht" (Firma Bernd Belger, Kleinmachnow) zur Solubilisierung von Proteinen und Nukleinsäuren inkubiert. Anschließend wird mit Wasser und 1%iger Natriumcarbonatlösung gewaschen. Zuletzt werden die Kapseln mit 4% KOH und 0,2% Natriumdithionit 4 h lang bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend mit einer 0,1%iger Lösung von Natriumdodecylsulfat in Wasser gewaschen. Zur Entfernung von Restlipiden erfolgen nochmals Waschbehandlungen mit Aceton, Isopropanol und Wasser.

Danach sind die Exine-Kapseln vollständig von den Bestandteilen der Intine und des Protoplasten befreit, haben die Form und Größe der Ausgangszellen, und können an der Luft getrocknet werden, ohne zu schrumpfen. Die Elementaranalyse ergibt die Elemente Kohlenstoff und Wasserstoff in dem für Sporopollenin charakteristischen Verhältnis von etwa 7,5. Der Stickstoffgehalt liegt unter 0,2% und ist niedriger als der von Sporopollenin, das aus Haselnußpollen durch Azetolyse gereinigt wurde (0,63%). Werden aus Wasser getrocknete Sporopolleninkapseln in Ethanol, Aceton oder eine vergleichbare organische Flüssigkeit überführt, füllt sich der Inhalt sehr schnell mit der Flüssigkeit und die Kapseln sinken zu Boden. Werden sie aus der organischen Flüssigkeit anschließend getrocknet, kollabiert die Exine und krümmt sich konkav nach innen, so daß ein großer Teil des Kapsellumens verloren geht. Diese Veränderung ist nur bei einem Teil der Kapseln nach Quellung in Ethanol reversibel.

B. Eine Säulenpackung (1 cm × 15 cm) der nach A hergestellten Sporopolleninkapseln in Wasser wird mit unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten durchströmt. Es zeigt sich in dem angewendeten Druckbereich (bis 2 bar) eine lineare Beziehung zwischen Fließgeschwindigkeit und Druck, ohne daß eine merkliche Veränderung des Packungsvolumens eintritt. Zur Feststellung Permeabilität der Exine wurden Zucker, Serumalbumin und Dextrane verschiedener Molekülgröße mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm/min eluiert und die Peaks mit einem Perkin-Elmer-Polarimeter aufgezeichnet. Dextranmoleküle mit einer mittleren Molmasse von 0,5 × 10⁶. Da werden ebenso wie Serumalbumin und Zucker mit einem Elutionsvolumen von nahe 100% des Packungsvolumens eluiert. Damit ist gezeigt, daß die Sporopolleninexinen mechanisch stabil und makroporös in dem Sinne sind, daß Moleküle mit einem Stokesschen Durchmesser von etwa 20 nm während des Stromes durch das chromatographische Bett mit dem Innenraum der Kapseln einen Konzentrationsausgleich erreichen.

C. Eine Suspension von 10 ml trockener Sporopolleninkapseln (entsprechend A) wird mit 20 ml 5% Serumalbumin in Wasser (pH 7) gemischt. Anschließend werden die Partikeln im Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt. Die Serumalbumin enthaltenden Kapseln werden anschließend in 60% Ethanol überführt. Dabei quillt das Serumalbumin im Kapselinnenraum ohne sich aufzulösen. Die bekannte chirale Wirksamkeit des Serumalbumins (Allenmark 1994, in: Subrmanian (Herausg.) A practical approach to chiral separations by liquid chromatography, S. 183, VCH Weinheim) kann bei der so hergestellten Dispersion für die chromatographische Trennung polarer Enantiomeren eingesetzt werden.

D. Eine Suspension von 10 ml trockener Sporopolleninkapseln (entsprechend A) in 15 ml einer Mischung aus Olivenöl und Petroläther oder Diethyläther (Mischungsverhältnis 1/1) wird im Rotationsverdampfer durch Verdampfen des Äthers getrocknet. Nach Überführen der Kapseln in eine Lösung von 10% Ethanol in Wasser sind die Öltröpfchen im Kapselhohlraum immobilisiert. In analoger Weise können höhersiedende hydrophobe Wirkstoffe bzw. höhersiedende Stoffe mit einem hohen Öl/Wasser-Verteilungskoeffizienten in den Sporopolleninkapseln in austauschfähiger Form konzentriert werden. Die entsprechenden Stoffe können entweder in Öl gelöst oder in reiner Form in das Kapselinnere gebracht werden. Zur besseren Benetzung der Sporopolleninwand bei der Herstellung der Dispersion können neben Ethanol dem Wasser auch andere Alkohole in geringer Konzentration oder oberflächenaktive Stoffe wie Eiweiße oder Detergentien hinzugefügt werden.

E. 10 ml von entsprechend D hergestellten ölbeladenen Sporopolleninkapseln werden mit 10 g einer Lösung von 0,5% Zellulosesulfat (Natriumsalz) gebracht und bei 60°C im Rotationsverdampfer solange getrocknet, bis 90% der Zellulosesulfatlösung verdunstet sind (gravimetrische Kontrolle). Hierbei zieht sich die Zellulosesulfatlösung in das Innere der Kapseln und konzentriert sich an der Oberfläche des Öltropfens bis zu einer Konzentration von etwa 5%. Die so mit Zellulosesulfat beladenen Kapseln werden in 50 ml einer scharf gerührten Lösung von 3% Poly[dimethyldiallylammoniumchlorid] überführt und in dieser Lösung 30 min lang belassen. Die so hergestellte Suspension besteht aus ölgefüllten Sporopollenin- Mikrokapseln, die mit einer Polyelektrolytkomplexmembran beschichtet sind.

Anschließend wird diese Suspension in ein großes Volumen von 1%iger Kochsalzlösung gerührt. Die beschichteten Kapseln werden filtriert und mit Kochsalzlösung gewaschen.

Nach Entwässerung in Ethanol und Extraktion des Öls mit Aceton oder einem anderen geeigneten Fettlösungsmittel können die Kapseln rehydriert werden. Auf diese Weise entstehen leere Kapseln mit dem für die Polyelektrolytkomplexmembranen typischen Größenausschluß im Ultrafiltrationsbereich (vergl. Dautzenberg et al. 1999, J. Membrane Science 162, 965-971).

Claims (10)

1. Mikrokapseln, deren Größe, Form und mechanische Festigkeit durch eine intakte, gereinigte makroporöse Pollenexine aus Sporopollenin oder ein intaktes makroporöses Sporoderm aus Sporopollenin bestimmt werden.

2. Mikrokapseln nach Anspruch 1, deren Sporopollenin nicht mit Mineralsäuren verestert ist.

3. Mikrokapseln nach Anspruch 1 oder 2, deren Sporopolleninstruktur eine oder mehrere Perforationen mit einer Größe von mehr als 1 µm enthält.

4. Mikrokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine permselektive Gelschicht mit Größenausschlußeigenschaften im Bereich Stokesscher Durchmesser unter 20 nm mit der makroporösen Sporopolleninhülle verbunden ist.

5. Dispersion aus Mikrokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einer Flüssigkeit.

6. Dispersion nach Anspruch 4, wobei der Innenraum der Mikrokapseln einen in die Kapseln eingeführten Stoff enthält, der sich in der Dispersionsflüssigkeit nicht oder nur sehr langsam auflöst oder nicht durch die aufgelagerte Gelschicht diffundieren kann.

7. Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln nach Anspruch 1 bis 4, bei welchem Sporen oder Pollen ohne mechanischen Aufschluß und ohne Azetolyse in einer konzentrierten Säure einer Kombination bekannter Verfahren zur Hydrolyse von Kohlenhydraten, zur Lipid- und Fettextraktion und zur Solubilisierung von aggregierten Komplexen aus Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und Nukleinsäuren unterworfen werden, und bei welchem die sporopolleninhaltigen Partikeln nach den Schritten der Hydrolyse und Fettextraktion nicht aus Alkohol, Aceton oder einem anderen flüchtigen flüssigen Quellmittel für Sporopollenin getrocknet werden.

8. Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln nach Anspruch 4, wobei auf die Mikrokapseln die kolloidale Lösung einer flüchtigen Flüssigkeit im Wirbelbett aufgesprüht wird.

9. Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln nach Anspruch 4, wobei an die Mikrokapseln ein Polyelectrolyt durch Absorption gebunden und anschließend eine Polyelektrolytkomplexmembran gebildet wird.

10. Verfahren zur Herstellung einer Dispersion nach Anspruch 5 oder 6, wobei eine Dispersion der Mikrokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in der Lösung des einzuführenden Stoffes in einer flüchtigen Flüssigkeit hergestellt wird, diese Lösung durch Evaporation des Lösungsmittels bis zur Entfernung der Lösung aus dem interpartikulären Zwischenraum eingeengt wird, und die Mikrokapseln in eine Flüssigkeit, in welcher der so absorbierte Stoff unlöslich ist, überführt werden.