JP4900221B2

JP4900221B2 - 細胞分離装置、培養装置及び細胞分離方法

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Publication number: JP4900221B2
Application number: JP2007318597A
Authority: JP
Inventors: 良一芳賀; 啓介渋谷; 勝難波
Original assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2012-03-21
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Description

本発明は、生体細胞の培養液から細胞を分離する細胞分離装置、及び当該分離装置を有する培養装置並びに細胞培養液から細胞を分離する細胞分離方法に関する。

生体の細胞の培養では、目的生産物の生産性向上のために生体細胞を高密度で培養することが望まれており、これを達成する培養手法として連続培養法がある。動物細胞の連続培養では、培養液中の細胞を分離して液成分のみを培養槽から抜き出し、新たな培地を供給する操作が必須であり、これまでに種々の細胞分離手段が開発されている。

非特許文献１及び特許文献１には、重力沈降法を用いた連続培養装置に関する記載がある。特許文献２及び特許文献３には、遠心分離により細胞を沈降分離する手法が記載されている。特許文献４には、培養槽内に細胞の通過を阻止するろ過材で囲った培養領域を設け、培養領域外に通過してきたろ過液を引き抜くことを特徴とする培養装置が記載されている。特許文献５には、ろ過膜として多孔質中空糸膜を使用し、培地を用いて逆洗することが記載されている。特許文献６には、二対のろ過膜を設置し、一方を通気手段、残る一方をろ過手段として使用し、これを交互に切り替えることによってろ過と逆洗を繰り返し行なうことが記載されている。特許文献７には培養槽内に回転するろ過膜を設けた培養装置が述べられている。特許文献８には培養槽外に回転するろ過膜を設置する培養装置が記載されている。

しかし、これら従来の手法にはそれぞれ大きな課題がある。すなわち、重力沈降法は、細胞の沈降速度が小さいために静置領域を大きくする必要があり、大型培養装置への適用がきわめて困難である。遠心分離装置は装置構成が複雑であり、大型化が難しい。ろ過分離装置は装置構成が簡単であってスケールアップも容易であるが、ろ過膜の目詰まりが実質的に不可避であり、分離操作を長期間実施することは困難である。

さらに、従来の手法を実プラント規模にて実施する場合、使用できるポンプや流量調節弁がないという問題がある。培養プラントに適用するためには、微生物の侵入を防止するための高度な密閉性を有し、強アルカリ又は強酸を主成分とする洗浄液を使用した洗浄操作に耐え、更に１３０℃、０．２ＭＰａの蒸気を通じることで内部の完全殺菌を行える構造と素材から構成されていることが要求される。上記条件を満たすポンプとしてはチューブローラーポンプが挙げられる。しかしながら、チューブローラーポンプは、卓上規模の装置に多用されているが、チューブ破損の恐れがあり、高度な信頼性が要求される医薬品製造用プラント等に適用することは困難であった。また、培養プラントに使用される弁としては、ダイヤフラム弁のように全開及び全閉の２段階で作動するものがほとんどであり、とくに小流量範囲で流量調節弁として機能するものは実質的に存在しない。

組織培養第15巻第8号283頁〜287頁（1989年発行）特開平6-209761号公報特開平5-192607号公報特開平6-90737号公報特開平5-95778号公報特開平1-281072号公報特開平6-98758号公報特表平03-505041号公報特開平06-237754号公報

そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、非常に簡便な構成によって培養液から細胞を分離して目的生産物の生産収率を向上することができる細胞分離装置及び当該分離装置を供えた培養装置並びに細胞分離方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
すなわち、本発明にかかる細胞分離装置は、細胞を含む培養液から当該細胞を分離するための分離手段と、上記分離手段と第１の管路を介して接続された緩衝槽と、上記緩衝槽と第２の管路を介して接続された少なくとも１以上の液貯槽と、上記第１の管路上に配設され、上記分離手段と上記緩衝槽との連通を制御する第１の弁と、上記第２の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記液貯槽との連通を制御する第２の弁とを備えている。本発明にかかる細胞分離装置においては、上記第１の弁により上記第１の管路を解放して上記分離手段と上記緩衝槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって培養液を上記分離手段に吸引し、上記第１の弁により上記第１の管路を閉塞するとともに上記第２の弁により上記第２の管路を解放して上記緩衝槽と上記液貯槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記液貯槽との内圧差によって細胞を分離した後の培養液を上記液貯槽に移送することができる。

また、本発明にかかる細胞分離装置は、上記緩衝槽と第３の管路を介して接続された逆洗用液貯槽と、上記第３の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記逆洗用液貯槽との連通を制御する第３の弁とを更に備えることが好ましい。この場合、本発明にかかる細胞分離装置においては、上記第３の弁により上記第３の管路を解放して上記緩衝槽と上記逆洗用液貯槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記逆洗用液貯槽との内圧差によって逆洗用溶液を上記緩衝槽に供給し、上記第３の弁により上記第３の管路を閉塞するとともに上記第１の弁により上記第１の流路を解放して上記緩衝槽と上記分離手段とを連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって上記緩衝槽内の逆洗用溶液を上記分離手段に供給することができる。

さらに、本発明にかかる細胞分離装置において上記分離手段としては、培養液流入口と培養液排出口とを備える容器内に、円筒型回転体の外周面に細胞の通過を阻止するフィルタとを有する回転フィルタを収容したものを使用することができる。

さらにまた、本発明にかかる細胞分離装置において上記分離手段は、細胞を培養する培地が注入される培養槽内に配設されていることが好ましい。

一方、本発明にかかる培養装置は、上述した本発明にかかる細胞分離装置と、生体細胞の培養液を充填する培養槽とを備える物である。本発明にかかる培養装置において、上記細胞分離装置における分離手段は、上記培養槽に充填された細胞を含む培養液から細胞を含まないろ過液を分離することができる。

また、本発明にかかる細胞分離方法は、細胞を含む培養液から当該細胞を分離するための分離手段と、上記分離手段と第１の管路を介して接続された緩衝槽と、上記緩衝槽と第２の管路を介して接続された少なくとも１以上の液貯槽と、上記第１の管路上に配設され、上記分離手段と上記緩衝槽との連通を制御する第１の弁と、上記第２の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記液貯槽との連通を制御する第２の弁とを備える細胞分離装置を用い、上記第１の弁により上記第１の管路を解放して上記分離手段と上記緩衝槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって培養液を上記分離手段に吸引し、上記第１の弁により上記第１の管路を閉塞するとともに上記第２の弁により上記第２の管路を解放して上記緩衝槽と上記液貯槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記液貯槽との内圧差によって細胞を分離した後の培養液を上記液貯槽に移送するものである。

さらに、本発明にかかる細胞分離方法において、上記緩衝槽と第３の管路を介して接続された逆洗用液貯槽と、上記第３の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記逆洗用液貯槽との連通を制御する第３の弁とを更に備える細胞分離装置を使用し、上記第３の弁により上記第３の管路を解放して上記緩衝槽と上記逆洗用液貯槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記逆洗用液貯槽との内圧差によって逆洗用溶液を上記緩衝槽に供給し、上記第３の弁により上記第３の管路を閉塞するとともに上記第１の弁により上記第１の流路を解放して上記緩衝槽と上記分離手段とを連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって上記緩衝槽内の逆洗用溶液を上記分離手段に供給することが好ましい。

さらにまた、本発明にかかる細胞分離方法において、上記細胞分離装置における分離手段は、上記流入口と上記排出口とを備える容器内に、円筒型回転体の外周面に細胞の通過を阻止するフィルタとを有する回転フィルタを収容したものを使用することが好ましい。

さらにまた、本発明にかかる細胞分離方法において上記細胞分離装置における分離手段は、上記培養槽内に配設されていることが好ましい。

本発明に係る分離装置、培養装置及び分離方法によれば、非常に簡便な構成によって細胞を培養液から分離することができる。これにより、効率的な培養を達成し、目的生産物の生産収率を向上させることができる。

以下、本発明に係る生体細胞の分離装置、分離方法及び培養装置を図面を参照して詳細に説明する。本発明に係る生体細胞の分離装置、分離方法及び培養装置は、医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞を培養する際に適用することができる。本発明において、生産対象の物質としては、何ら限定されるものではなく、例えば抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物及び高分子化合物等の生理活性物質を挙げることができる。また、培養対象の細胞としては、何ら限定されるものではなく、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができる。特に、本発明に係る生体細胞の分離装置、分離方法及び培養装置は、抗体や酵素等のタンパク質を生産する動物細胞を培養対象とすることが好ましい。

本発明を適用した細胞分離装置の一例を図１に模式的に示す。本発明を適用した細胞分離装置は、培養液と接触する一端面に細胞の通過を阻止するフィルタ４を設けたろ過フィルタ３と、ろ過フィルタ３を収容するろ過フィルタ収容容器1と、ろ過フィルタ３と接続された緩衝槽５と、緩衝槽５と接続されたろ過液貯槽７と、緩衝槽５と接続された培地槽８とを備えている。ろ過フィルタ３と緩衝槽５はろ過液移送管路６ａ（第１の管路）によって連通され、緩衝槽５とろ過液貯槽７はろ過液移送管路６ｂ（第２の管路）によって、及び緩衝槽５と培地槽８は培地移送管路９（第３の管路）によってそれぞれ連通されている。それぞれの移送管路には弁１１（第１の弁）、弁１２（第２の弁）及び弁１３（第３の弁）が設けられている。ここで弁１１、１２及び１３としては、全開又は全閉の二段階の動作を行なうものを使用することが好ましい。

また、ろ過フィルタ３と緩衝槽５を連通するろ過液移送管路６ａは、管路内の圧力を検出するための圧力計２０を備えている。ろ過フィルタ収容容器１は、内部の圧力を検出するための圧力計２１を備えている。緩衝槽５は、その内部の圧力を検出するための圧力計２２を備えている。ろ過液貯槽７は、内部の圧力を検出するための圧力計２３を備えている。培地槽８は、内部の圧力を検出するための圧力計２４を備えている。

さらに、緩衝槽５には、外部から空気を導入するための弁１４及び内部の圧力を調整するための弁１７（圧力調整弁１７と称する場合もある）が配設されている。緩衝槽５は、内部に充填された培地等の液面を測定するための液面レベル計２５が配設されている。ろ過液貯槽７には、外部から空気を導入するための弁１５及び内部の圧力を調整するための弁１８（圧力調整弁１８と称する場合もある）が配設されている。培地槽８には、外部から空気を導入するための弁１６及び内部の圧力を調整するための弁１９（圧力調整弁１９と称する場合もある）が配設されている。なお、これら弁１４〜１９にて供給する空気は、空気はあらかじめ細菌等の微粒子を除去した無菌空気を使用することが好ましい。

上述した分離装置は、図示しない連通手段によって、ろ過フィルタ収容容器１内部に培養液２が供給されるような構成を有している。よって圧力計２１で測定されるろ過フィルタ収容容器１の内部の圧力は、培養槽と同一である。ここで図示しない連通手段によれば、ろ過フィルタ収容容器１内部の培養液２は培養槽との間で循環することができる。これにより、ろ過によってろ過液が抜き出されたとしても、細胞の部分的な高密度化や長時間滞留による環境の悪化で生じる培養への悪影響を防止することができる。なお、本発明にかかる分離装置は、図示しない連通手段を有するような構成に限定されず、ろ過フィルタ収容容器１或いはろ過フィルタ３を培養槽内部に充填された培地内に浸漬するような構成であってもよい。ろ過フィルタ収容容器１或いはろ過フィルタ３を培地に浸漬する場合には、培養槽内における培地の撹拌によって、上述した細胞の部分的な高密度化や長時間滞留による環境の悪化を防止することができる。なお、ろ過フィルタ３を培養槽内部に充填された培地内に浸漬する場合には、ろ過フィルタ収容容器１は培養槽と同義となる。

以上のように構成された分離装置を用いることによって、培地に含まれる細胞を分離して、細胞を分離した後の培地を回収することができる。以下、分離装置を用いたろ過工程、ろ過液排出工程、培地移送工程及び逆洗工程についてこの順で説明する。

（１）ろ過工程
ろ過工程とは、培養中（或いは培養終了後の）培地から細胞を分離して、細胞を含まない培地を緩衝槽５に回収する工程である。先ず、ろ過フィルタ収容容器１に培養液を循環させる。圧力計２１でろ過フィルタ収容容器１の圧力、及び圧力計２２で緩衝槽５内部の圧力を計測する。ろ過フィルタ収容容器の圧力は培養槽の圧力と同一であり、通常は０．０１〜０．０５ＭＰａに加圧されている。ろ過工程開始時の緩衝槽５内部の圧力はろ過フィルタ収容容器の圧力と同じにする。通常は、後述する逆洗工程で緩衝槽５から、ろ過フィルタ３に空気を圧入する操作によって両槽の内圧は同一となっている。両槽の内圧が異なる場合は、弁１４の開放による空気注入と圧力調整弁１７の調整によって同一とする。

ろ過液貯槽７は弁１５の開放による空気注入と圧力調整弁１８の調整によって通常は０．０１〜０．０５ＭＰａに加圧されているが、培養槽の圧力よりは低い内圧となるように調整される。ろ過工程を行なうにあたっては、まず、緩衝槽５に設けられた弁１１、弁１２、弁１３、弁１４及び弁１７を閉じる。次に、ろ過液移送管路６ｂに設けられた弁１２を短時間開放して直ちに閉じ、緩衝槽５内部の液または空気もしくはこれらの混合物をろ過液貯槽７に排出する。この操作によって緩衝槽５の内圧はわずかに低下し、ろ過フィルタ収容容器１及び培養槽の内圧よりも低くなる。次に、ろ過液移送管路６ａに設けられた弁１１を短時間開放して直ちに閉じ、ろ過液移送管路６ａ内部の液または空気もしくはこれらの混合物を緩衝槽５に排出する。この操作によってろ過液移送管路６ａ内部の圧力がわずかに低下する結果、ろ過液移送管路６ａに連通しているろ過フィルタ３の内部の圧力がろ過フィルタ収容容器１の圧力よりわずかに低下し、フィルタ４の細孔を通じて培養液がろ過フィルタ３の内部に流入する。このとき、フィルタ４の細孔より大きな生体の細胞は通過を阻止されることから、ろ過フィルタ３に流入した液、すなわちろ過液には細胞が除かれている。すなわち、弁１１及び弁１２の開閉動作を繰り返すことによって培養液から細胞を除いたろ過液を得ることが可能となる。

緩衝槽５の形状は特に限定されるものではなく、球形、円筒形いずれでも良い。また、弁１１及び弁１２の間の管路の管径を拡大して緩衝槽５としても良い。緩衝槽５へのろ過液移送管路６ａ及びろ過液移送管路６ｂの取付け方法、取付け位置は限定するものではないが、緩衝槽５内の液を排出する際に残留液がなきよう、槽底部に配置することが好ましい。また、ろ過液移送管路６ａ及びろ過液移送管路６ｂはそれぞれ個別に緩衝槽５に接続することが好ましいが、両者を結合させた上で弁１１と弁１２の中間と緩衝槽５とを１本の管路で連通させる構造をとることもできる。緩衝槽５と弁１１及び弁１２との距離は極力小さくすることが望ましい。とくに弁１２については緩衝槽５との距離が最小になるように配慮することが好ましい。緩衝槽５の容積は、適用する培養装置の規模に基づいて決定される。

弁１１及び弁１２の開閉は、交互に行なわれることが好ましく、ろ過工程においては両弁が同時に開放されることがないよう留意する。両弁が同時に開放されると緩衝槽５の圧力変動緩衝作用が得られなくなり、ろ過フィルタ収容容器１とろ過液貯槽７の圧力差がフィルタ４に直にかかって、ろ過液への生体の細胞の漏出や細孔への目詰りを起こす原因となる。

ろ過速度の調節は弁１１及び弁１２の開閉頻度を調節することにより行なうこととし、各弁の開放時間は基本的に一定にして運用する。弁の開放時間を大きくすることは必然的に圧力変動を大きくすることになり、目詰まりを促進させるため、好ましくない。

（２）ろ過液排出工程
ろ液排出工程とは、緩衝槽５に回収された、細胞を除去した後の培養液をろ過液貯槽７に移送する工程である。この工程では、先ず、弁１４を開放して空気を緩衝槽５に注入して緩衝槽５内部の圧力をろ過液貯槽７の内圧よりも高める。緩衝槽５の内圧が所定値に達した段階で、弁１２を開けることによって緩衝槽５内に回収した培養液を、ろ過液移送管路６ｂを介してろ過液貯槽７へ移送することができる。なお、本工程における弁１４及び弁１２の開放時間は、緩衝槽５の容積とろ過液移送管路６ｂの仕様によって決定されるものであり、通常は事前に通液テストを実施して決定されることが好ましい。

（３）培地移送工程
培地移送工程とは、培地槽８に充填されている培地を緩衝槽５に供給する工程である。本工程では、先ず、圧力調整弁１７により緩衝槽５の内圧を培地槽８の内圧より低く調節する。なお、培地槽８の内圧は通常、０．０１〜０．０５ＭＰａに加圧されている。次に、弁１３を開放することによって培地槽８内の培地は緩衝槽５に流入する。緩衝槽５に設けてある液面レベル計２５によって培地の液面位置を計測し、所定位置になった時点で弁１３を閉じ、培地の供給を終了する。なお圧力の設定に当たっては、培地槽８と緩衝槽５の液面高さについて考慮する必要がある。すなわち、培地槽８の液面位置が緩衝槽５の液面位置より高い場合には培地の移送速度が大きくならないように圧力差を小さく設定することが好ましい。培地槽８の液面位置が緩衝槽５の液面位置より低い場合には、培地が移送されるように圧力差を大きくすることが好ましい。培地の移送速度を調節する必要がある場合には、弁１３の開閉を断続的に行い、開放時間の長さを調節することにより行なうことができる。

（４）逆洗工程
逆洗工程とは、フィルタ４に対して上記ろ過工程における培地の流動方向と反対方向に培養液、逆洗用液体、空気又はこれらの混合物を流動させることによってフィルタ４を洗浄する工程である。具体的に逆洗工程は、上記培地移送工程で緩衝槽５に注入された培地をろ過フィルタ３に供給することによって行うことができる。本工程では、先ず、弁１４を開けて緩衝槽５に空気を注入し、緩衝槽５の内圧をろ過フィルタ収容容器１の内圧より高く設定する。次に、弁１１を開放することによって緩衝槽５内に注入された培地がろ過液移送管路６ａを通ってろ過フィルタ３に注入され、フィルタ４の細孔をろ過工程とは逆方向に通過する。フィルタ４を通過した培地は、ろ過フィルタ収容容器１に流入することによって培養槽に供給される。すなわち、培地は培養槽に供給される際に、フィルタ４の逆洗液としての役割を果たす。

また、逆洗工程では、弁１１を開放し続けることによって緩衝槽５内の全ての培地を空気の圧力で押し出すことにより、緩衝槽５、ろ過液移送管路６ａ及びろ過フィルタ３の内部空間内の培地をすべてろ過フィルタ収容容器１に排出できる。すなわち、高価な培地を無駄にすることなくそのすべてを培養に供することが可能となる。培地がすべて排出された後は、加圧に用いられた空気がフィルタ４の細孔を通過することによって空気によるフィルタの逆洗が行なわれる。ろ過フィルタ収容容器１に吹き込まれた空気は培養槽との連通管路を経て培養槽内に供給される。培養槽内に多量の空気が供給されることによって液面が激しく擾乱され、これに伴って培養液上面の泡沫層も擾乱されることによって泡沫の破泡を促進する作用が得られる。

あらかじめ定めた時間、空気供給による逆洗を行なった後、弁１４を閉じ、逆洗工程を終了する。このとき、弁１４の閉動作から弁１１の閉動作までの時間をあけることによって、ろ過フィルタ収容容器１と緩衝槽５の内圧を実質的に同一にすることができる。弁１４と弁１１の閉動作の時間差は、フィルタ４の細孔径、面積、材質等の性状に大きく左右されるため、事前にテストを実施して決定される。

以上で説明した（１）〜（４）の操作を繰り返すことによって生体細胞の分離操作を継続することが可能となる。特に、本発明にかかる分離装置によれば、ポンプ装置などの複雑な構成を必要とせず、非常に簡便な装置構成によって上記（１）ろ過工程及び（２）ろ過液排出工程、並びに上記（３）培地移送工程及び（４）逆洗工程を実行することができる。

なお、本分離装置においてフィルタ４としては一般的に用いられるろ布、メンブランフィルタなど、細胞の通過を阻止できるものであれば特に限定するものではない。特に、ろ過フィルタ３内部に蒸気を吹き込んでの殺菌や洗浄の際の洗浄液注入に耐えられる機械的強度と耐熱性及び耐腐食性を有するものを選定することが好ましい。また、培養液中には死んだ細胞が崩壊して生じる微細な細胞断片が多数存在することから、健全な生細胞の通過を阻止し、微細な細胞断片を通過させるろ過特性を有するフィルタが特に好ましい。

液面レベル計２５としては特に限定するものではないが、蒸気を吹き込んでの殺菌や洗浄の際の洗浄液注入に耐えられる機械的強度と耐熱性及び耐腐食性を有するものを選定することが好ましい。また、培養液中には細胞や細胞が崩壊して生じた微細な細胞断片が多数存在し、液面には泡沫が滞留する恐れがあることから、センサの汚れによって誤動作を起こす恐れないものを選定することが好ましい。このような観点から、液面レベル計２５としては静電容量式のレベルセンサを使用することが好ましい。

また、本発明にかかる分離装置は、生体細胞の培養液を充填する培養槽を備える培養装置に適用することができる。すなわち、本発明にかかる培養装置の概略構成図を図２に示す。なお、図２に示す培養装置において、図１に示した分離装置と同一部材及び同一構成については同一の符号を付することによりその詳細な説明は省略する。

図２に示した培養装置は、培養槽３１、緩衝槽５、培地槽８及びろ過液槽７とを備えている。培養槽３１には、ろ過フィルタ３が内蔵されている。ろ過フィルタ３と緩衝槽５はろ過液移送管路６ａによって、緩衝槽５とろ過液貯槽７はろ過液移送管路６ｂによって、及び緩衝槽５と培地槽８は培地移送管路９によってそれぞれ連通されている。それぞれの移送管路には弁１１、弁１２及び弁１３が設けられている。

図２中には図示していないが、空気、酸素、窒素及び炭酸ガス等のガス供給設備、温水冷水供給設備、蒸気供給設備及び給排水設備を具備している。

培養槽３１は断面で表わしている。培養槽３１内に張り込まれた培養液３２は、駆動用モータ３５により駆動される攪拌機３６で撹拌され、均一に混合される。培養に必要な酸素は、酸素含有ガスを槽底部に配置された散気手段３３から液中に供給する液中通気法と槽上部気相部に通気する上面通気法の二つの方法により供給される。

培養槽３１は、培養液３２の性状を計測する計測手段４１を具備しており、溶存酸素濃度、溶存炭酸ガス濃度、pH、温度、アンモニア濃度、乳酸濃度及びグルタミン濃度の計測値４２を得る。なお、計測手段４１については、実装置では検出項目毎または制御項目毎に１つの検出手段が用いているが、図２中には簡略化のため１つのみ記載した。

また、培養槽３１は、液中及び上面への通気系統はそれぞれの供給ガスを制御する個別操作手段４０及び３９を具備している。個別操作手段３９及び４０はそれぞれに空気、酸素、炭酸ガスの各ガスについての流量制御機能と供給量計測機能を具備している。上面への通気は、供給ガスを制御する個別操作手段３９によりその組成及び通気量を制御する。本実施形態では空気を一定量で通気し、培養液のｐＨに対応して炭酸ガスを混合した。炭酸ガス濃度の制御はｐＨを制御量とし、炭酸ガス流量を操作因子とする通常の比例制御で実施した。散気手段３７より培養液中への通気は、供給ガスを制御する個別操作手段４０によりその組成及び通気量を制御する。本実施形態では培養液の溶存酸素濃度を制御量とし、酸素通気量を操作因子とした。

培養槽３１は圧力計３７の計測結果をもとに、圧力調整弁３８によって一定の圧力に保持されている。通常は外部からの細菌等の侵入を防ぐため、０．０１〜０．０５ＭＰａに加圧されている。

培養槽３１には培養液から細胞を分離するためのろ過フィルタ手段が設けられている。本実施例におけるろ過フィルタ手段としては、特に限定されないが、駆動モータ２７で回転させる回転軸２８と同軸の円筒型回転体の外周面に細胞の通過を阻止するフィルタ４を設けた回転ろ過フィルタ１０を用いることができる。回転ろ過フィルタ１０は、回転軸２８に円筒状のフィルタ４をとりつけ、上端と下端を封止部材で封じた構造となっており、内部の圧力を外部より低くすることによってろ過が行なわれ、フィルタ４の細孔を通過したろ過液が得られる。フィルタ４としては、ステンレス細線を所定の間隔をあけて円筒状に巻きつけてスリット状の開口部を形成させた金属フィルタを使用することができる。このような金属フィルタには、上記スリット以外の細孔は実質的に存在しない。これにより、本フィルタでは細胞の通過を阻止し、細胞より小さい細胞断片等の微細な粒子は通過させることができる。スリット幅は培養する細胞の大きさによって決定されるものであり、通常は５〜３０μｍとする。なお、本フィルタを使用するに当たっては、ろ過差圧を適正に管理することが好ましい。スリット幅が細胞の直径よりも大きい場合であっても、大きなろ過差圧が加わると細胞が変形してスリットを通過したり、目詰りを引き起こすおそれがあるからである。

ろ過工程にあたって、回転ろ過フィルタ１０を培養槽３１内部で回転させるとフィルタ４表面に平行な培養液の流れが生じ、いわゆる直交流ろ過の状態となる。フィルタ４表面での流れを乱流状態とすれば、ろ過液が抜き出されることによって形成される細胞や微細粒子の高密度化層を拡散させることができる。これによって、フィルタの目詰りを抑制でき、より高速でより多量のろ過液を得ることが可能となる。回転ろ過フィルタ１０の回転速度は、培養する生体の細胞の物理的な外力に対する耐性と、分離装置の形状とによって決定される。通常は１００〜１０００ｒｐｍにて運用される。

回転ろ過フィルタ１０を回転させるためには、培養液の流出を防ぐことと外部からの雑菌等の侵入を防ぐ機能を有することが好ましい。このため、培養槽３１にはメカニカルシールを使用した軸シール２６が設けられている。メカニカルシールは、回転軸２８に固定されて回転する摺動部材と軸シール２６に固定された摺動部材とを密着させて摺動させることにより気体や液体の漏洩を阻止するものである。本培養装置においては、回転ろ過フィルタ１０内の培養液の流出を防ぐためのメカニカルシールと、外部からの侵入を防止するためのメカニカルシールの二つのメカニカルシールを用い、二つのメカニカルシールの間にろ過液移送管路６ａが接続されている。また、回転軸２８は中空構造をなしており、一端がろ過液移送管路６ａに相対する位置に開口し、他の一端を回転ろ過フィルタ１０内部に開口させることによって、回転ろ過フィルタ１０の内部とろ過液移送管路６ａとを連結する流路ともなっている。なお、本培養装置においてはメカニカルシールとして特に限定するものではなく、通常の培養装置に使用されるシール水を供給するタイプのメカニカルシールやドライタイプのメカニカルシールなど気密性を保持できるものであれば用いることができる。また、メカニカルシールの使用方法及び配置等については何ら限定されるものではない。

ろ過液貯槽７は、回転ろ過フィルタ１０で分離した生産目的とした物質を溶解しているろ過液を保管するタンクであり、撹拌機５２及び撹拌機駆動用モータ５１を備えるものであっても良い。また、ろ過液貯槽７は、保管中に目的物質が変質するのを防ぐため、５℃〜１０℃に冷却することができる冷却装置を具備することが好ましい。培地槽８は培養槽３１に供給する培地を保管するタンクであり、撹拌機５４及び撹拌機駆動用モータ５３を備えるものであっても良い。また、培地槽８は、培地の保管中の変質を防ぐため、５℃〜１０℃に冷却することができる冷却装置を具備することが好ましい。

以上のように構成された本培養装置では、前記の生体細胞の分離手法である（１）ろ過工程、（２）ろ過液排出工程、（３）培地移送工程及び（４）逆洗工程の４工程を繰り返し反復することによって連続培養を行うことができる。なお、本培養装置においては、逆洗操作時の回転ろ過フィルタ１０の回転数をろ過工程での回転数より大きくすることが好ましい。回転ろ過フィルタ１を高速で回転させる中で逆洗を行なうことにより、フィルタ４内面全面に逆洗液を均一に行き渡らせることができる。また、回転によって生じる遠心力による洗浄作用も加わることによってより大きな逆洗効果が得られる。本発明にかかる培養装置では、フィルタ４の目詰りを起こすことなく長期間の連続培養を継続することが可能である。また、逆洗工程に付随して行なわれる培養槽３１内への空気の急速吹き込みによって液面上に形成されていた泡沫層を破壊することができる。その結果、本発明にかかる培養装置によれば、目的生産物の生産性の更なる向上を図ることができる。

本発明を適用した細胞分離装置の一例を模式的に示す概略構成図である。本発明を適用した細胞分離装置を備える培養装置の一例を模式的に示す概略構成図である。

符号の説明

１…ろ過フィルタ収容容器、２…培養液、３…ろ過フィルタ、４…フィルタ、５…緩衝槽、６ａ及び６ｂ…ろ過液移送管路、７…ろ過液貯槽、８…培地槽、９…培地移送管路

Claims

細胞を含む培養液から当該細胞を分離するための分離手段と、
上記分離手段と第１の管路を介して接続された緩衝槽と、
上記緩衝槽と第２の管路を介して接続され、細胞を分離した後の培養液を貯留する少なくとも１以上の液貯槽と、
上記緩衝槽と第３の管路を介して接続され、培養液及び/又は逆洗用液体を貯留する培地槽と、
上記第１の管路上に配設され、上記分離手段と上記緩衝槽との連通を制御する第１の弁と、
上記第２の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記液貯槽との連通を制御する第２の弁と、
上記第３の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記培地槽との連通を制御する第３の弁とを備え、
上記第１の弁により上記第１の管路を解放して上記分離手段と上記緩衝槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって培養液を上記分離手段に吸引するとともに細胞を分離した後の培養液を上記緩衝槽に移送し、上記第１の弁により上記第１の管路を閉塞するとともに上記第２の弁により上記第２の管路を解放して上記緩衝槽と上記液貯槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記液貯槽との内圧差によって細胞を分離した後の培養液を上記液貯槽に移送し、
上記第３の弁により上記第３の管路を解放して上記緩衝槽と上記培地槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記培地槽との内圧差によって培養液、逆洗用液体、空気又はこれらの混合物を上記緩衝槽に供給し、上記第３の弁により上記第３の管路を閉塞するとともに上記第１の弁により上記第１の流路を解放して上記緩衝槽と上記分離手段とを連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって上記緩衝槽内の培養液、逆洗用液体、空気又はこれらの混合物を上記分離手段に供給することを特徴とする細胞分離装置。
上記分離手段は、培養液流入口と培養液排出口とを備える容器内に、円筒型回転体の外周面に細胞の通過を阻止するフィルタとを有する回転フィルタを収容したものであることを特徴とする請求項１記載の細胞分離装置。
上記分離手段は、細胞を培養する培地が注入される培養槽内に配設されていることを特徴とする請求項１記載の細胞分離装置。
請求項１乃至３いずれか一項記載の細胞分離装置と、
生体細胞の培養液を充填する培養槽とを備え、
上記細胞分離装置における分離手段は、上記培養槽に充填された細胞を含む培養液から細胞を含まないろ過液を分離することを特徴とする培養装置。
細胞を含む培養液から当該細胞を分離するための分離手段と、上記分離手段と第１の管路を介して接続された緩衝槽と、上記緩衝槽と第２の管路を介して接続され、細胞を分離した後の培養液を貯留する少なくとも１以上の液貯槽と、上記緩衝槽と第３の管路を介して接続され、培養液及び/又は逆洗用液体を貯留する培地槽と、上記第１の管路上に配設され、上記分離手段と上記緩衝槽との連通を制御する第１の弁と、上記第２の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記液貯槽との連通を制御する第２の弁と、上記第３の管路上に配設され、上記緩衝槽と上記培地槽との連通を制御する第３の弁とを備える細胞分離装置を用い、
上記第１の弁により上記第１の管路を解放して上記分離手段と上記緩衝槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって培養液を上記分離手段に吸引するとともに細胞を分離した後の培養液を上記緩衝槽に移送し、上記第１の弁により上記第１の管路を閉塞するとともに上記第２の弁により上記第２の管路を解放して上記緩衝槽と上記液貯槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記液貯槽との内圧差によって細胞を分離した後の培養液を上記液貯槽に移送し、
上記第３の弁により上記第３の管路を解放して上記緩衝槽と上記培地槽との間を連通させ、上記緩衝槽と上記培地槽との内圧差によって培養液、逆洗用液体、空気又はこれらの混合物を上記緩衝槽に供給し、上記第３の弁により上記第３の管路を閉塞するとともに上記第１の弁により上記第１の流路を解放して上記緩衝槽と上記分離手段とを連通させ、上記緩衝槽と上記分離手段との内圧差によって上記緩衝槽内の培養液、逆洗用液体、空気又はこれらの混合物を上記分離手段に供給することを特徴とする細胞分離方法。
上記細胞分離装置における分離手段は、培養液流入口と培養液排出口とを備える容器内に、円筒型回転体の外周面に細胞の通過を阻止するフィルタとを有する回転フィルタを収容したものであることを特徴とする請求項５記載の細胞分離方法。
上記細胞分離装置における分離手段は、上記培養槽内に配設されていることを特徴とする請求項５記載の細胞分離方法。