JPH084490B2

JPH084490B2 - 生物学的試料の処理装置

Info

Publication number: JPH084490B2
Application number: JP19170488A
Authority: JP
Inventors: 達夫山本; 正桔梗谷
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1988-07-30
Filing date: 1988-07-30
Publication date: 1996-01-24
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: JPH0242969A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は，生物学的試料の処理装置，特に複数の試料
を同時かつ連続的に処理し得る自動化された試料の処理
装置に関する。

（従来の技術）生物学的試料から所望の物質を単離・精製する場合に
は，該物質の種類に応じて種々の方法が採用される。例
えば，バイオテクノロジーの分野において，菌体や細胞
からのDNAの分離・精製には，ボイリング法，アルカリ
法などが採用されている。これらの方法によれば，比較
的大きな規模でのDNAの分離・精製ができ,DNAを100μｇ
以上の量で得ることが可能である。しかし，これらの方
法は，いずれも複雑な工程を必要とする手作業であり自
動化されにくい。手作業であるためDNAの回収率や純度
などにバラツキが生じ，技術差による個人間の格差も大
きい。さらに，このような方法で得られたDNAには,RNA,
各種蛋白質，多糖類などが混入しており，そのままでは
DNAの配列分析，プラスミドDNAからの断片の精製などの
各種実験が正しくなされ得ない。

生物学的試料を自動的に処理し，高純度で目的とする
物質を単離・精製し得る装置としては，一般に高性能液
体クロマトグラフィー（HPLC）が，高性能であり，しか
も再現性に優れていることから，広範囲に利用されてい
る。しかし，例えば菌体からDNAの分離を目的として，
このHPLC装置に菌体溶解物を試料として供給するときに
は，該試料中の多量の不純物（セルデブリスなど）によ
る分離カラムの損傷などを防ぐため，試料の前処理を行
う必要がある。さらに，カラムの再生などの操作が煩雑
であり，完全に自動的な分離・精製操作を行なうことが
できない。

他方，分離分析技術の進歩により,HPLCのような高価
な装置を用いず，ミニカラムを用いた簡単なカラム操作
によって，比較的精度よく分析を行う方法の開発が進め
られている。ミニカラムとは，プラスチック製のカラム
に充填剤が充填された小型のオープンカラムであり，デ
ィスポーザブルカラムとして市販されている。しかし，
このミニカラムによる分析は，いずれもバッチ法による
手作業でなされている。従って，複数の試料を分析する
場合，各試料，洗浄液，溶離液などの一定量を計量した
後，順序よく供給しなければならず，煩雑である。ミニ
カラムを利用して自動的に生物学的試料の処理を行な
い，目的とする成分を簡便かつ高純度で単離・精製し得
る装置の開発が望まれる。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上記従来の問題を解決するものであり，その
目的とするところは，複数の試料を同時かつ連続的に処
理し，試料中の目的とする成分を簡単な操作で大量に単
離・精製し得る生物学的試料の処理装置を提供すること
にある。本発明の他の目的は，比較的大量の菌体を連続
的に処理し，該菌体中のDNAを簡便かつ高純度で単離・
精製することの可能な生物学的試料の処理装置を提供す
ることにある。

（課題を解決するための手段）本発明の生物学的試料の処理装置は，少なくともその
一部に吸着剤が充填されたカラムであって，カラム振盪
手段と連結されたカラム；該カラムに供給されるべき前
処理試料を収容するための槽であって，該前処理試料を
濾過するためのフィルターを備えた前処理試料槽；該カ
ラムに連結され，カラム処理を行うためのカラム処理用
媒質を収容する媒質収容容器；該前処理試料槽から該カ
ラムに該前処理試料を供給するための供給手段A;該媒質
収容容器から該カラムに該処理用媒質を供給するための
供給手段B;および該カラム振盪手段および該供給手段Ａ
およびＢを制御するための制御手段；を有し，そのこと
により上記目的が達成される。

本発明の生物学的試料の処理装置は，少なくともその
一部に吸着剤が充填されたカラムであって，カラム振盪
手段と連結されたカラム；該カラムに供給されるべき前
処理試料または前処理されるべき試料を収容するための
槽であって，該前処理試料または該槽内で前処理された
試料を濾過するためのフィルターを備え，かつ前処理試
料槽振盪手段と連結された前処理試料槽；該カラムおよ
び／または該前処理試料槽に連結され，試料の前処理を
行うための試料処理用媒質，カラム処理を行なうための
カラム処理用媒質および／または試料を個別に収容する
試料・媒質収容容器；該試料・媒質収容容器から該前処
理試料槽に該試料処理用媒質および／または試料を供給
するための供給手段C;該前処理試料槽から該カラムに該
前処理試料または該槽内で前処理された試料を供給する
ための供給手段A;該試料・媒質収容容器から該カラムに
該カラム処理用媒質を供給するための供給手段B;および
該カラム振盪手段，該前処理試料槽振盪手段，および供
給手段A,BおよびＣを制御するための制御手段；を有
し，そのことにより上記目的が達成される。

本発明の生物学的試料の処理装置は，例えば，第１図
に示すように，カラム1,前処理試料槽2,複数の媒質収容
容器31,供給手段A4,供給手段B5,および供給手段Ａおよ
びＢを制御する制御手段7,を有する。

カラム１は，例えば，第１図に示すように，カラムの
一方の空間に充填された吸着剤でなる吸着剤層10と，該
カラムの他方の部分に形成された空間でなるリザーバー
部分11とを有する。リザーバー部分11において前処理試
料やカラム処理用媒質の保持がなされ得る。吸着剤層10
において試料中の成分が吸着される。この吸着剤層10と
リザーバー部分11との間，および吸着剤層10とカラム端
部との間には，フィルター13および12が装着されてい
る。カラム１の底部（吸着剤層側の端部を意味する）に
は，下方へ突出する溶出液の流出口14,およびこの流出
口14と接続された回収用チューブ15およびバルブ16が配
設されている。カラム１の上端部には，カラム１内を気
密に密閉し得るカラム栓17が装着され，かつチューブ18
およびバルブ19が装着されている。チューブ18およびバ
ルブ19により，カラム１内の媒質の交換時に残留した媒
質を系外に除去すること，およびカラム１内を開放系に
することが可能である。カラム１には，前処理試料，カ
ラム処理用媒質などを供給するためのチューブ41および
51が連結されている。

カラム１は，カラム保持台100に保持される。カラム
保持台100は，カラム１を垂直状態に保持する一対の保
持具101および101と，各保持具101をその片面に取付け
た固定板102を有する。このカラム保持台100は，振盪手
段８と連結されている。振盪手段８は，例えば，このカ
ラム保持台100の固定板102を中央部に取付けた回転軸84
と，該回転軸84の両端部を回動可能に支持する支持体85
とを有する。このカラム保持台100および振盪手段８に
おいて，各保持具101は，固定板102および回転軸84を介
して，支持体85に回動可能に支持されている。それゆ
え，この振盪手段８では，回転軸84の回動により，カラ
ム１が振盪（回動）され得る。カラム１は，回動軸84の
まわりに180°まで回動可能である。カラム１が回動す
ることにより，リザーバー部に注入された前処理試料を
攪拌することが可能であり，さらに,90°以上に回動さ
せることによりリザーバー部に残留したカラム処理用媒
質などを，系外に速やかに除去することができる。

前処理試料槽２は，前処理試料を収容するための槽で
あって，前処理容器20およびフィルター21を有する。前
処理試料槽２は，第１図に示すように，チューブ41（供
給手段A4に包含される）を介してカラム１に連結されて
いる。前処理容器20の上端部には，該容器内を気密に密
閉し得る前処理容器栓22が装着され，かつ該容器内を開
放系にするためのチューブ23およびバルブ24が装着され
る。フィルター21は，前処理試料中の細胞殻など，カラ
ム操作中にカラムの吸着剤の目詰まりを引き起こすよう
な物質を濾過する働きを有し，その形状および設置箇所
は特に限定されない。ここでは，フィルター21は，有底
円筒状であり，前処理容器20内に前処理容器栓22を挿通
して延びるチューブ41の先端部に取りつけられている。
このほか，例えば，球状のフィルターが用いられる。フ
ィルターの孔径は,0.05〜1mm,好ましくは0.1〜0.5mmの
範囲とされる。0.05mmを下まわると，目詰まりを起こし
やすくなり,1mmを越えると固形分を有効に除去できな
い。フィルターの素材は特に限定されないが，金属，プ
ラスチック，またはセラミックスなどの焼結材が好適で
ある。後述の試料の処理操作において，フィルター21が
存在しない場合には，前処理された試料に含まれる固形
成分はカラム１のフィルター13により捕捉される。しか
しこの場合には，次にカラム処理用媒質がカラム１に送
られたときに，捕捉された固形成分が溶解して溶出液中
に混入する恐れがある。本発明においては，カラム外の
前処理試料槽２にフィルターが設けられているので，こ
のような混入が回避される。

カラム処理用媒質を収容する複数の媒質収容容器31
は，いずれもチューブ51（供給手段B5に包含される）を
介してカラム１のリザーバー部分11に接続されている。
これら複数の媒質収容容器，例えば，容器311,312,313,
314,315には，それぞれに洗浄液，溶離液，再生液など
が収容される。これらの溶液は，試料のカラム処理を行
なうためのカラム処理用媒質である。

供給手段A4は，前処理試料槽２内の前処理試料をカラ
ム１に供給するために設けられる。この供給手段A4は，
例えば，チューブ41およびポンプ42で構成される。チュ
ーブ41の一端はカラム１のカラム栓17を挿通してリザー
バー部11に接続され，他端は，前処理容器栓22を挿通し
て前処理容器20内に開口している。供給手段B5は，媒質
収容容器31内の媒質をカラム１に供給するために設けら
れる。この供給手段B5は，例えば，チューブ51および51
1〜515,ポンプ53,およびバルブ52で構成される。チュー
ブ51の一端は，カラム１のカラム栓17を挿通してリザー
バー部11に接続され，他端は，バルブ52を介してチュー
ブ511〜515に接続されている。チューブ511〜515は，そ
れぞれ容器311〜315と接続されている。ポンプ53はチュ
ーブ５の任意の箇所に設けられる。容器内のカラム処理
用媒質（洗浄液，溶離液，再生液など）は，上記ポンプ
の動力によりこのチューブ511〜515および51内を通って
容器31からカラム１に供給される。バルブ52は，複数の
容器31のうちの所定の容器をカラム１に連通させるため
の切り換えバルブである。ポンプ53は,HPLCに用いられ
るような高級なポンプでなくてもよく，通常の多連式の
チューブポンプでかまわない。バルブ52は，カラム１に
チューブ511〜515および51を介して連結された複数の容
器31のうちから，いずれかの容器を試料処理目的に応じ
てカラムに選択的に連通させる機能を有する。このバル
ブとしては，通常，切り換えバルブが用いられる。

制御手段７は，例えばコンピュータでなり，ポンプ4
2,53,バルブ16,19,24,52,およびカラム振盪装置８や後
述のフラクションコレクター70に接続されている。この
制御手段７は，ポンプの流量調整，バルブの切換え，カ
ラム１の振盪およびフラクションコレクターなどを制御
するために設けられる。この制御手段７により，ポンプ
によるカラム処理用媒質の供給量，およびバルブによる
容器とカラムとの選択的連通が，自動的になされる。例
えば，コンピュータでなる制御手段は，あらかじめイン
プットされた情報に基づいて，複数の容器31から所定の
容器を選択し，この容器内のカラム処理用媒質の所定量
をカラム１に供給する。また，フラクションコレクター
により複数のカラムを使って複数の試料を分析する場合
にも，制御手段７により，所望の回収容器700（後述）
が選択され得る。

第２図は，第１図の装置と同様であるが，供給手段Ａ
およびＢの連結状態が異なる。第２図の装置において
は，チューブ51の一端がカラム１に直接連結されずにチ
ューブ41（供給手段Ａに包含される）に，ポンプ42の上
流側（前処理試料槽側）においてバルブ54を介して接続
されている。チューブ41とバルブ54よりも下流の部分
が，供給手段ＡとＢとで共用されている。バルブ54を切
り換えることにより前処理試料槽２からの前処理試料ま
たは媒質収容容器31からの媒質がポンプ42を介してカラ
ム１へ供給され得る。

本発明の装置の他の実施態様を第３図に示す。この装
置においては，前処理試料槽２で未処理の試料を処理
し，これを自動的にカラム１に供給し，カラム処理を行
なうことが可能である。この装置の前処理試料槽２は，
前処理試料槽保持台200に保持される。前処理試料槽保
持台200は，前処理試料槽を垂直状態に保持する一対の
保持具201および201と，各保持具をその片面に取付けた
固定板202とを有する。この前処理試料槽保持台200は，
振盪手段９と連結される。振盪手段９は，例えば，この
前処理試料槽保持台200の固定板202を中央部に取付けた
回転軸91と該回転軸91の両端部を回動可能に支持する支
持体92とを有する。この前処理試料槽保持台200および
振盪手段９において，各保持具201は，固定板202および
回転軸91を介して支持体92に回動可能に支持されてい
る。それゆえ，この振盪手段９では回転軸91の回動によ
り前処理試料槽２が振盪（回動）され得る。この前処理
試料槽２には，後述の試料・媒質収容容器からの試料や
試料処理用媒質が供給され，前処理試料槽が回動するこ
とにより供給された試料や媒質が攪拌され，試料の前処
理がなされる。

さらに第３図の装置においては，試料の前処理を行な
うための試料処理用媒質および／または試料を個別に収
容するための複数の試料・媒質収容容器32が設けられ
る。これら複数の容器，例えば,321,322,323,324,325に
は，それぞれに試料，試料処理用媒質，さらに必要に応
じて洗浄液などが収容される。これらの試料や試料処理
用媒質は，供給手段C6により前処理試料槽２に供給され
る。供給手段C6は，例えば，チューブ61および611〜61
5,ポンプ63およびバルブ62により構成される。チューブ
61の一端は前処理試料槽２の前処理容器栓22を挿通して
前処理容器20内に開口し，他端は，バルブ62を介してチ
ューブ611〜615に接続されている。チューブ611〜615は
それぞれ，容器321〜325と接続されている。容器32内の
試料や試料処理用媒質は，ポンプ63の動力により，この
チューブ611〜615および61内を通って，前処理試料槽２
に供給される。バルブ62は，複数の容器32のうちの所定
の容器を前処理試料槽２に連通させるための切換えバル
ブである。ポンプ63としては，上記ポンプ53と同様，例
えば，多連式のチューブポンプなどが使用される。

この第３図の装置においては，制御手段７は，さらに
上記振盪手段９および供給手段C6に接続されており，ポ
ンプの流量調整，バルブの切換え，前処理試料槽２の振
盪などを制御する。

第４図の装置は，第３図の装置と実質的に同様である
が，供給手段A,B,Cや媒質収容用の容器の接続形態が異
なる。第４図の装置においては，チューブ51の一端がカ
ラム１に直接連結されずに，チューブ41（供給手段Ａに
包含される）のポンプ42の上流側にバルブ54を介して接
続されている。この装置においては，チューブ41のバル
ブ54よりも下流の部分が供給手段ＡとＢとで共用されて
いる。バルブ54を切り換えることにより前処理試料槽２
からの前処理試料，または媒質収容容器31からの媒質が
ポンプ42を介してカラム１へ供給される。

第５図の装置では，第３図および第４図の媒質収容容
器31および試料・媒質収容容器32の代わりに，複数の試
料・媒質収容容器３が設けられる。この複数の容器3,例
えば331,332,333,334および335には，それぞれ個別に，
試料，試料処理用媒質（例えば溶菌剤），洗浄液，溶離
液，再生液などが収容されている。これらの容器３は，
供給手段Ｃにより前処理試料槽２に接続される。供給手
段Ｃは，ここでは，チューブ601,602,603,604,605およ
び610,バルブ600,およびポンプ63を包含する。ポンプ63
はチューブ610の任意の場所に設けられており，ポンプ6
3とバルブ600との間にバルブ55を介してチューブ51が接
続されている。バルブ600および55を適宜切り換えるこ
とにより，例えば容器331〜335内の試料や試料処理用媒
質を前処理試料槽２へ供給すること；および該容器内の
カラム処理用媒質をカラム１内へ供給することが可能で
ある。

第６図の装置においては，第５図のチューブ51の一端
がカラム１に直接連結されずにチューブ41のポンプ42の
上流側にバルブ56を介して接続される。バルブ600およ
び55を操作することにより，容器３の試料および試料処
理用媒質を前処理試料槽２に供給すること；バルブ55お
よび56を操作することにより，前処理された試料を前処
理試料槽２からカラム１へ供給すること；およびバルブ
600,55および56を切り換えることにより容器３のカラム
処理用媒質をカラム１へ供給することが可能である。

本発明の装置は，カラム１および前処理試料槽２を複
数個設けて複数個の試料を同時に処理し得る装置とする
ことも可能である。カラム１と前処理試料槽２とを複数
個有し，フラクションコレクターが配置された装置の例
を第７図に示す。第７図の装置においては，複数のチュ
ーブ610が，バルブ600からポンプ63を経て複数の前処理
試料槽２に接続され，さらに複数のチューブ41が該前処
理試料槽２からポンプ42を経て複数のカラム１に接続さ
れている。チューブ610および41は，それぞれ複数のチ
ューブ51により連結されている。複数のカラム１の下流
にフラクションコレクター70が，該カラム１とこのフラ
クションコレクター70の受け部710の回収容器700とが相
対応するように配置される。第７図における複数の前処
理試料槽２の部分断面平面図を第８図に示す。

本発明の装置および方法は，各種生体由来の試料の分
析，該試料からの目的とする成分の単離などに用いられ
る。本発明装置は，フィルターを備えた前処理試料槽を
有するため，試料の分析，単離などが効果的に行われ
る。ここで，試料の前処理工程とは，微生物菌体などの
細胞の溶解工程，タンパク溶解工程，抽出工程などをさ
していう。本発明の装置は,DNAを含む試料，特に菌体な
ど細胞を含む試料からのDNAの単離に好適に用いられ
る。特に大腸菌細胞からのプラスミドDNA（10⁶ダルトン
オーダー）およびさらに高分子量のDNA（10⁸ダルトンオ
ーダー）の単離に適している。本装置は，大腸菌細胞以
外の細胞，例えば真核細胞に対しても使用され得る。

上記装置において，使用されるカラムに充填されるべ
き吸着剤，カラム処理用媒質（例えば，洗浄液，溶離
液）などの種類は，装置の使用目的によって異なり，そ
の目的に応じて適宜選択される。カラム１の吸着剤とし
ては，例えば，イオン交換ゲル，逆相系ゲル，順相系ゲ
ルがある。イオン交換ゲルには,DEAEセファロース,QAE
セファロース,CMセファロース,SPセファロースなどがあ
る。逆相系ゲルとしては，C₁₈シリカゲル，フェニルシ
リカゲルなどが挙げられる。順相系ゲルにはシリカゲル
などがある。他に使用可能な吸着剤としては，例えば，
ヒドロキシアパタイト，デンプン，セルロース，活性炭
がある。例えば,DNAを含む試料の二本鎖DNA（dsDNA）の
みを選択的に吸着させる場合には，ヒドロキシアパタイ
トが好適に用いられる。

試料の前処理（溶菌，タンパク溶解，抽出など）に用
いる前処理液（試料をあらかじめ処理するときに，ある
いは試料処理用媒質として用いられる）には，例えば，
洗剤，塩，溶解酵素，アルカリ剤，キレート剤，カオト
ロピック剤，尿素などを含む溶液が使用され得る。キレ
ート剤または溶解酵素は，例えば，細胞からDNAを単離
する方法では，細胞溶解に際して，細胞壁を弱めるため
に用いられる。キレート剤には,EDTA,8−ヒドロキシキ
ノリンなどがある。溶解酵素としてはリゾチーム，プロ
テイナーゼＫなどが挙げられる。洗剤は，溶解酵素また
はキレート剤により弱められた細胞壁を溶解させるため
に用いられる。洗剤には，例えば，ドデシルベンゼンス
ルホン酸ナトリウム（SDS），トリトンＸ−100,Nonide
t,ラウロイルサルコシンがある。例えばSDSの濃度は,0,
1〜２％の範囲で使用され,0.5〜１％の範囲が好適であ
る。尿素は，通常,2〜8Mの濃度で用いられる。8M尿素は
ほぼ飽和濃度に対応する。処理されるべき試料が大腸菌
の場合に，好ましい前処理液の組み合わせは,0.2M NaO
H,1％SDS,50mMトリス・HCl（pH8.0）,10mM EDTA,1mg/ml
リゾチームである。試料が真核細胞であれば,1M NaCl,1
％SDS,50mMトリス−HCl（pH8.0）,10mM EDTA,1mg/mlプ
ロテイナーゼＫである。

カラム処理用の媒質として用いられる溶離液として
は，例えば吸着剤を構成する成分（アニオンおよびカチ
オン）の少なくとも一方，好ましくは両方と強い相互作
用を有する溶媒が使用され得る。例えばヒドロキシアパ
タイト（その主成分はリン酸カルシウムである）を用い
てDNAを単離・精製する場合には，該リン酸カルシウム
のリン酸成分およびカルシウム成分の少なくとも一方，
好ましくは両方と強い相互作用を有する溶媒，ことに，
難溶性の塩を形成しうる塩溶液が使用され得る。そのよ
うな塩溶液のなかでは，解離定数が小さい塩の溶液であ
り，かつDNAなどの核酸との親和性が高いものが好適で
ある。さらに水やアルコール系溶媒に可溶であり，エタ
ノール沈澱により析出することのない塩が選択される。
例えばヒドロキシアパタイトを吸着剤とする場合に，使
用される塩のアニオン成分としては炭酸；および蟻酸，
酢酸，プロピオン酸などの有機酸が好適である。カチオ
ン成分としては，アンモニア；ジエチルアミン，トリエ
チルアミンなどのアルキルアミン類；エタノールアミ
ン，プロパノールアミンなどのアルカノールアミン類；
およびピリジン，アニリンなどの芳香族アミン類が好適
である。このような成分でなる塩を含む溶離液として
は，特にトリエチルアミン炭酸緩衝液が好適である。ト
リエチルアミン炭酸緩衝液は揮発性であるため,DNAを含
む溶出液の溶媒を留去したり凍結乾燥することによりDN
Aのみを高純度で回収することが可能となる。

溶離液の濃度は，使用する溶離液の種類により異なる
が，例えばトリエチルアミン炭酸緩衝液を使用する場合
には,10mM以上，好ましくは50mM〜2M,さらに好ましくは
100mM〜1Mの範囲である。このように,50mM以下の低濃度
であってもDNAを溶離することが可能である。

吸着剤層の洗浄に用いられる洗浄液には，一般に，キ
レート剤，カオトロピック剤が含有される。これらキレ
ート剤，カオトロピック剤としては，前処理液に使用し
た試薬がいずれも用いられ得る。

本発明の装置を用いた生物学的試料の処理を，第１図
に示す装置および第６図に示す装置を用いて説明する。
まず，溶菌，抽出などの試料の前処理をあらかじめ系外
で行ない，第１図の装置の前処理試料槽２にこの前処理
された試料を入れる。前処理試料は供給手段A4を介して
カラム１に供給される。次いで，吸着剤層10に送られ，
前処理試料中の所望の成分が吸着剤に効果的に吸着され
る。次に，必要に応じて容器311から洗浄液を供給手段B
5を介してカラム１に供給して洗浄を行なう。さらに，
バルブ52を切り換えて，容器312から溶離液をカラム１
に供給する。これにより吸着剤層10に吸着されていた目
的とする成分が溶出する。これを適当な測定装置に導い
て測定するか，溶出画分を集めて目的とする成分を得
る。溶出後，カラムを再生して再利用する場合には，再
びバルブ52を切り換えて容器313から再生液をカラム１
に供給する。洗浄液から溶離液，溶離液から再生液に切
り換える際に，あるいは，洗浄液や溶離液の種類を変え
る場合には，カラム振盪手段８によりカラム１を約180
°回動させ，カラム内の媒質をチューブ18を通じて除去
すれば，媒質の交換が速やかになされ得る。

第６図に示す装置は，試料の前処理をあわせて行なう
場合に使用される。まず，菌体懸濁液などの試料を容器
331からチューブ601および610を介してポンプ63により
前処理試料槽２に供給する。次にバルブ600を切り換
え，容器332から試料処理用媒質（例えば，溶菌剤）を
前処理試料槽２に供給する。振盪手段９により前処理試
料槽内の試料と媒質とを混合し，試料の前処理を行な
う。さらに，必要に応じてバルブ600を切り換え，容器3
33から別の試料処理用媒質（例えば，中和剤）を前処理
試料槽２へ供給し，振盪して混合する。このようにして
調製された前処理試料は，フィルター21で濾過され，チ
ューブ41を介してポンプ42によりカラム１へ供給され
る。カラム１では，第１図に示す装置で行なわれるのと
同様の処理がなされる。カラム処理用媒質（洗浄液，溶
離液など）は，バルブ600,55および56を切り換えること
により，容器334,335などからチューブ610,51,41を介し
てカラム１内へ供給される。

カラム１から溶出された溶離液を適当な手段で処理す
ることにより所望の物質の単離・精製などが行なわれ
る。

例えば，上記装置により，菌体から,DNAを単離する場
合には，試料として菌体を含む懸濁液を用い，前処理液
として溶解酵素（リゾチーム，プロテイナーゼＫな
ど），キレート剤（EDTAなど），洗剤（ドデシル硫酸ナ
トリウムなど）などを含む溶液が用いられる。このよう
な前処理液を供給することにより，前処理試料槽２で菌
体の溶菌処理がなされる。つまり，菌体の細胞壁はキレ
ート剤や溶解酵素により弱められ，洗剤により溶解され
る。得られた溶菌液はカラム１の吸着剤層に供給され，
吸着剤層の吸着剤と接触する。吸着剤としてはヒドロキ
シアパタイトなどが好適に利用され，例えば0.15〜0.25
Mの燐酸緩衝液を溶媒として通液することにより，溶菌
液中のdsDNAが選択的に吸着される。溶菌液中のRNA,蛋
白質，多糖類などは吸着されずにカラム１外へ排出され
る。次に,DNAを吸着・担持した吸着剤に，容器３から溶
離液を供給してこれを接触させる。例えば,DNAを吸着・
担持するヒドロキシアパタイトにトリエチルアミン炭酸
緩衝液を接触させると，炭酸イオンがヒドロキシアパタ
イトのカルシウムと結合して難溶性の炭酸カルシウムを
生成し，一方トリエチルアミンはヒドロキシアパタイト
の燐酸部分と塩を形成し，その結果,DNAはヒドロキシア
パタイトから脱着する。例えば，ヒドロキシアパタイト
カラムのベッド容量の２倍量のトリエチルアミン炭酸緩
衝液を通液することにより，吸着されているDNAのほぼ
全量を回収することができる。このようにして回収され
る溶出液を通常のエタノール沈澱処理に付すことにより
精製DNAが得られる。溶出液中のトリエチルアミン炭酸
塩はエタノールに溶解するため,DNAに混入してその純度
を低下させることがない。エタノール沈澱処理の代わり
に溶媒の減圧留去や凍結乾燥を行うことによってもトリ
エチルアミン炭酸塩が揮発・除去され（脱塩が達成さ
れ）て高純度のDNAが得られる。

本発明の試料の処理装置は，上記のようなDNAの単離
・精製の他に，タンパクの溶解・抽出にも用いられる。

実施例以下に本発明を実施例につき説明する。

第６図に示す装置であって，かつ複数のカラムと前処
理試料槽とを有する装置（カラムおよび前処理試料槽の
数はそれぞれ10個である）を用い，大腸菌からのプラス
ミドDNAの単離を以下のようにして行なった。

（Ａ）菌体の培養：プラスミドpBR322を含有する大腸菌HB101株を,200mlL
B培地にて一晩培養した。この培養液を600rpmにて10分
間遠心分離し，菌体を沈澱させた。

（Ｂ）菌体の溶菌およびプラスミドDNAの単離第６図に示す上記装置を準備した。カラム１には,8M
尿素−0.20Mリン酸緩衝液（pH6.8）で平衡化したヒドロ
キシアパタイトを充填した（ベッドボリューム5ml;直径
2.5cm×1cm）。前処理試料槽２のフィルター21として
は，メタルファイバーチューブエレメントFA03（孔径0.
4mm,富士フィルター（株）製）を用いた。試料・媒質容
器３のうち，容器331には,0.2N NaOH−0.1％Tween80（T
ween80は半井化学薬品（株）製）水溶液を；容器332に
は,075M酢酸カリウム水溶液を；容器333には,8M尿素−
0.24Mリン酸緩衝液（pH6.8）を；容器334には,10mMトリ
ス・塩酸緩衝液（pH6.8）を収容した。各容器331〜335
に連結するチューブ601〜605に加えて，カラム１内に空
気を送るためのチューブ（図外）が設けられている。そ
の一端はバルブ600に連結され，他端は外気に開放され
ている。

（Ａ）項で得られた菌体をGTEL緩衝液5mlに懸濁させ
た。この懸濁液にリゾチームを最終濃度が2mg/mlとなる
ように加え,37℃にて15分間保持した。これに，プラス
ミドDNAの単離収率を測定する目的で，³Hでインビトロ
標識されたプラスミドDNA（³H−pBR322）を１μCiに相
当する量だけ添加した。この混合物を上記装置の前処理
容器20内に入れ，前処理容器栓22を閉じた。バルブ24を
開放し，バルブ55および600を操作して，容器331を前処
理試料槽２に連通するようにした。該容器331から,0.2N
NaOH−0.1％ Tween80水溶液10mlをポンプ63により前処
理試料槽２へ供給した。バルブ24を閉じ，振盪装置９に
より固定板202を10回回動させ，前処理試料槽２内の混
合物の攪拌を行なった。さらに室温にて10分間放置し，
菌体を完全に溶解させた。次に，バルブ24を開放し，バ
ルブ600を切り換えて容器332が前処理試料槽２に連通す
るようにした。ポンプ63により容器332から0.75M酢酸カ
リウム水溶液300mlを前処理試料槽２に供給した。バル
ブ24を閉じ，振盪装置９により固定板202を10回回動さ
せ，前処理試料槽２内の溶液の攪拌を行なった。

次に，バルブ24を開け，バルブ55を容器３と前処理試
料槽２とが連通しないように切り換え，さらにバルブ56
を前処理試料槽２とカラム１とが連通するように切り換
えた。バルブ19を開放し，バルブ16を閉じた後，ポンプ
42により前処理試料槽２内の上記前処理された試料をチ
ューブ41を介してカラム１へ供給した。前処理された試
料はフィルター21により濾過されてカラム１のリザーバ
ー部分に導入された。次にバルブ55,56および600を操作
し，カラム１がチューブ41,51,610および図外のチュー
ブを介して外気に開放されるようにした。カラム１のバ
ルブ19を閉じ，バルブ16を開放し，ポンプ42によりカラ
ム１内に空気を送り込み，リザーバー部分の前処理試料
を40ml/hrの速度で吸着剤層10に導入した。（以上，チ
ャージ操作）。これにより前処理試料中のプラスミドDN
Aが吸着剤層10に吸着される。

次にバルブ600を操作し，容器333がカラム１に連通す
るようにし，該容器333内の8M尿素−0.24Mリン酸緩衝液
（pH6.8）をカラム１へポンプ42により供給した。該緩
衝液は40ml/hrの流速で200ml供給された。これにより吸
着剤に吸着しなかったタンパク,RNAなどが洗浄・除去さ
れた。続いて，カラム１のバルブ16を閉じ，バルブ19を
開放し，バルブ600を図外のチューブを介してカラム１
が外気に連通するように切り換えて，ポンプ42によりカ
ラム１内に空気を導入した。振盪手段８によりカラム１
を約180°回動し，リザーバー部分11に残留している上
記緩衝液をチューブ18から系外へ除去した。ポンプ42を
停止した後，カラム１をもとの位置に戻した。（以上，
洗浄操作１）。

次に，バルブ600を操作し，容器334とカラム１とが連
通するようにし，バルブ19を閉じ，バルブ16を開放した
後，該容器334内の10mMトリス・塩酸緩衝液（pH6.8）を
カラム１へポンプ42により供給した。該緩衝液は40ml/h
rの流速で15ml供給された。続いて，上記と同様の要領
でカラムを回動し，リザーバー11内に残留した緩衝液を
チューブ18から系外へ除去した。（以上，洗浄操作
２）。

カラム１をもとの位置に戻した後，バルブ600を操作
し，容器335とカラム１とが連通するようにした。バル
ブ19を閉じ，バルブ16を開放とした後，ポンプ42により
該容器335内の0.2Mトリエチルアミン−炭酸緩衝液（pH
8.0）をカラム１に供給した。該緩衝液は40ml/hrの流速
で20ml供給された。チューブ15から流出する溶出液の最
初の5mlを廃棄し，次の15mlを回収した。（以上，溶出
操作）。

以上の工程において，各バルブの切換操作および開閉
操作，ポンプの運転，および振盪手段の操作はすべて制
御手段７であるコンピューターにより制御された。

上記各工程において，カラム１のチューブ15から溶出
する溶出液を260nmの紫外線吸光度（UV吸収スペクト
ル）および放射活性（³Hのカウント数）によりモニター
した。その結果を第９図に示す。第９図から明らかなよ
うに，溶出操作開始後，紫外線吸収および放射活性が上
昇し，プラスミドDNAが溶出されているのがわかる。チ
ャージ操作時および洗浄操作時における紫外線吸収の増
大は，主として吸着剤に吸着されなかったRNAおよびタ
ンパクに起因する。

（Ｃ）プラスミドDNAの回収：（Ｂ）項で得られた溶出液約15mlに3M酢酸ナトリウム
を1.5mlを加えた後,2倍量のエタノールでエタノール沈
澱を行い，プラスミドDNA（pBR322）約100μｇを回収し
た。

（発明の効果）本発明の装置は，このように，カラムに，前処理試料
槽および試料・媒質収容容器が供給手段を介して連結さ
れ，それらの働きが制御手段によりコントロールされる
ため，生物学的試料の処理が効果的に行なわれる。前処
理試料槽内にはフィルターが設けられるため，前処理さ
れた試料が濾過され，カラムの目詰まりが回避され，そ
の結果，カラム寿命が延びるとともに，目的成分への不
純成分の混入の可能性が低くなる。本発明装置のうち，
特に，前処理試料槽に試料・媒質収容容器を接続し，該
前処理試料槽を振盪手段に連結した装置を用いると，試
料の前処理，および試料からの所定成分の精製・単離が
繁雑な操作を必要とすることなく，連続して短時間のう
ちに行なわれ得る。カラムおよび前処理試料槽を複数個
並列に配した装置を利用すれば，複数の試料を同時にか
つ連続的に大量に処理することが可能である。本装置
は，特に菌体からのDNAの単離・精製に好適に用いられ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第７図は，本発明の生物学的試料の処理装置の
例を示す模式図，第８図は，第７図の装置における前処
理試料槽付近の接続状態を示す部分断面平面図，そして
第９図は，実施例における溶出液の溶出量と，プラスミ
ドDNAに起因する紫外線吸光度および放射活性（³Hカウ
ント）との関係を示すグラフである。１…カラム,2…前処理試料槽,3,32…試料・媒質収容容
器,4…供給手段A,5…供給手段B,6…供給手段C,7…制御
手段,8…カラム振盪手段,9…振盪手段,21…フィルター,
31…媒質収容容器,70…フラクションコレクター,100…
カラム保持台,200…前処理試料槽保持台。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともその一部に吸着剤が充填された
カラムであって，カラム振盪手段と連結されたカラム；該カラムに供給されるべき前処理試料を収容するための
槽であって，該前処理試料を濾過するためのフィルター
を備えた前処理試料槽；該カラムに連結され，カラム処理を行うためのカラム処
理用媒質を収容する媒質収容容器；該前処理試料槽から該カラムに該前処理試料を供給する
ための供給手段A; 該媒質収容容器から該カラムに該処理用媒質を供給する
ための供給手段B;および該カラム振盪手段，および該供給手段ＡおよびＢを制御
するための制御手段；を有する生物学的試料の処理装置。
【請求項２】少なくともその一部に吸着剤が充填された
カラムであって，カラム振盪手段と連結されたカラム；該カラムに供給されるべき前処理試料または前処理され
るべき試料を収容するための槽であって，該前処理試料
または該槽内で前処理された試料を濾過するためのフィ
ルターを備え，かつ前処理試料槽振盪手段と連結された
前処理試料槽；該カラムおよび／または該前処理試料槽に連結され，試
料の前処理を行うための試料処理用媒質，カラム処理を
行なうためのカラム処理用媒質および／または試料を個
別に収容する試料・媒質収容容器；該試料・媒質収容容器から該前処理試料槽に該試料処理
用媒質および／または試料を供給するための供給手段C; 該前処理試料槽から該カラムに該前処理試料または該槽
内で前処理された試料を供給するための供給手段A; 該試料・媒質収容容器から該カラムに該カラム処理用媒
質を供給するための供給手段B;および該カラム振盪手段，該前処理試料槽振盪手段，および供
給手段A,BおよびＣを制御するための制御手段；を有する生物学的試料の処理装置。