JP3115324B2 - 核酸を単離する装置及び方法 - Google Patents

核酸を単離する装置及び方法

Info

Publication number
JP3115324B2
JP3115324B2 JP05509824A JP50982493A JP3115324B2 JP 3115324 B2 JP3115324 B2 JP 3115324B2 JP 05509824 A JP05509824 A JP 05509824A JP 50982493 A JP50982493 A JP 50982493A JP 3115324 B2 JP3115324 B2 JP 3115324B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
silica gel
nucleic acids
ethanol
ionic strength
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP05509824A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH07501223A (ja
Inventor
コルパン・メチン
Original Assignee
クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6446064&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3115324(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング filed Critical クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Publication of JPH07501223A publication Critical patent/JPH07501223A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3115324B2 publication Critical patent/JP3115324B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D39/00—Filtering material for liquid or gaseous fluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Filtering Materials (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミド又はゲノムDNAのような核酸を細
胞及び他の原料から単離及び精製する方法、並びに請求
項16のプレアンブルに記載の方法を実施するための装置
に関する。
核酸の調製においては、例えばプロテイナーゼＫ及び
リゾチームのような酵素;SDS、Brij、トライトン−Ｘ−
100、トゥイーン20、及びDOCのような洗剤；並びに水酸
化ナトリウム、塩酸グアニジン、及びグアニジンイソチ
オシアネートのような化学物質を用いて最初に細胞を消
化（digestion）しなければならない。実験者は、核酸
を精製する前に細胞の破片を除去して、その後細胞溶解
物から核酸又は核酸分画を単離するという問題に直面す
る。さらに、プラスミドDNA又はゲノムDNAを調製する際
に、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）のような使用頻度
の高い洗剤は除去する必要がある。SDSを使用する場合
のほとんどにおいて、SDSカリウム塩が水溶性に乏しい
ことから酢酸カリウムでの沈殿によりこの除去が行われ
る。その後、細胞の破片が沈殿したSDSと共に遠心分離
される。該溶解物中の成分が非常に大量かつ泥状のゲル
様ペレットを作りだすために、当該破片の除去は高速遠
心分離においても困難である。通常、細胞破片の除去は
5,000g〜20,000gで15〜60分間遠心分離をすることによ
り行われる。この方法は、非常に多くの時間と労力の投
入を必要とし、自動化できないという欠点を持つ。
DE−Ａ−36 39 949は、長鎖核酸でない体液の成分と
同様に、体液だけでなく、バクテリア、ウィルス、動物
及び植物の組織及び細胞からその他の物質、特に細胞成
分及び／又はそれらの分解産物からの長鎖核酸の単離及
び精製の方法を開示している。ここでは、緩やかな消化
並びに細胞破片及び他の不溶性成分の除去に次いで、長
鎖核酸が陰イオン交換体に固定され、一方分離すべき物
質は洗い出される。その後、固定された核酸を高イオン
強度のバッファーを用いてマトリックスから除去する。
DE−A 37 17 211から、核酸のような生体ポリマーの
分離及び精製の方法が知られており、それにおいて核酸
は特殊な装置中に配置されたマトリックスに吸着され
る。ここでは、バッファー条件は核酸が優先的に吸着さ
れ、蛋白、低分子量物質又は細胞破片のような邪魔な物
質は結合しないように調整される。
“核酸の単離、分画化及びハイブリダイゼーション；
概論及び方法解説（ウイリッヒ・ボビス（Ulrich Wobi
s）編、フェルラーク・ケミエ、1980年）に、核酸の単
離方法が記載されている。それによると、高分子量のリ
ボ核酸は＞1.5M塩化ナトリウムの塩溶液には不溶性であ
り沈殿する。しかしながら、そのような沈殿では有効と
考えられないために、この研究論文では高い塩濃度を用
いた沈殿処理を複数回反復することが勧められている。
DNA制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物の
両方の効果的な分離が、J.Chromatogr.,512巻,433−444
頁,1990年、に述べられている。クロマトグラフィー部
材として、2.5μｍサイズの非多孔質粒子を有するイオ
ン交換体DEAD NPR部材が使用されている。
Biochemistry,4848頁,1972年、により、酵母からの核
酸がポリ−Ｌ−リジンでコーティングされた珪藻土で分
離されている。同様に、ミトコンドリアDNAがこのよう
なクロマトグラフィー部材で分離されている。
Chromatographia,19巻,236−９頁,1984年、に、予備
スケールでの合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの単
離における多次元クロマトグラフィーの使用が述べられ
ている。ここでは、最初の処理としてセファデックスＧ
−15によるサイズ排除（size exclusion）クロマトグラ
フィーを行い、次いでHPLCイオン交換体カラム（パーテ
ィシル−10 SAX）を用いたサイズ排除クロマトグラフィ
ーを行う。この後、HPLC（ヌクレオシルC18）を用いた
疎水性クロマトグラフィーを行う。
J.Biochem.,94巻,163−169頁,1983年、は核酸の吸着
クロマトグラフィー精製を行うための疎水性コーティン
グされたガラス粒子の適合性について報告している。
従来のこの代用技術の欠点は、細胞溶解物からの細胞
断片及び不溶性成分を除去するために遠心分離処理が必
要であるという事実にある。もう一つの問題は、高イオ
ン強度のバッファーで溶出するために高濃度に存在する
塩類から核酸を回収して同時に濃縮しなければならない
ことである。ほとんどの場合、こうして得られた核酸の
その後の処理操作は低イオン強度のバッファー条件での
み可能である。バッファー中に高濃度に溶解している塩
類の除去は透析によって行うこともできるが、この処理
は対応する試料中の核酸の著しい分解を招く。透析に続
いて、脱塩した核酸を凍結乾燥によって濃縮しなければ
ならない。濃縮の他の方法はエタノール、イソプロパノ
ール、ポリ（エチレングリコール）（PEG）で核酸を沈
殿させることによる。核酸はこの系に不溶性であり沈殿
する。しかしながら、沈殿した核酸を遠心分離処理によ
ってペレット化しなければならない。核酸ペレットは一
旦乾燥させた後、非常に低塩濃度の低容量バッファーに
溶解して無塩濃縮核酸試料を得る。このような遠心分離
及び沈殿方法では、核酸の簡単且つ迅速な回収は不可能
であり、自動化も達成困難である。一方、いずれの場合
も大量の試料を処理しなければならない臨床診断術及び
ヒトゲノム配列決定における分子生物学の進歩によっ
て、核酸を調製するための簡単且つ自動的な処理の必要
性が増大しつつある。
本発明が基本とする技術的課題は、細胞溶解物中の細
胞断片又は不溶性成分を除去するための遠心分離処理の
必要性がなく、さらにその後に核酸を脱塩及び濃縮処理
しなければならないような高塩濃度のバッファー系中に
核酸を得ることなく、核酸を単離及び精製できる方法を
提供することにある。実質的には、提供される方法によ
りその後の処理に直接かけることができる条件にある核
酸が供給される。上記の技術的課題の他の重要な一面
は、該方法を特に有利な様式で該方法を実施することが
できる装置を製造することである。
本発明が基本とする技術的課題は請求項１に記載の構
成を特徴とする方法により驚くほど簡単な様式で解決さ
れる。方法に関する後続の請求項は本発明の方法の好ま
しい態様に関するものである。
特に有利な様式で本発明の方法を実施することができ
る装置は、請求項17に記載の構成を特徴とする。それに
関連した従属請求項は、本発明の装置のさらに好ましい
態様に関するものである。
最初に、それから核酸を単離する細胞を通常の様式で
消化し、細胞の破片を除去する。これは濾過又は遠心分
離によって行ってもよい。好ましくは、回収は段階的な
アシンメトリーに作られたフィルター層で濾過すること
により行う。核酸を含む濾液を直ちに陰イオン交換体で
処理してもよい。陰イオン交換体としては、単離すべき
核酸が各々の調製条件下で結合できるような市販の部材
を選択してもよい。好ましくは、例えばDEAEセファロー
ス 、Ｑセファロース 、DEAEセファデックス 、DEAE
トヨパール 、アンバーライト 、ヌクレオゲン 、キ
アゲン のような、好ましくはアガロース、デキストラ
ン、セルロース、アクリルアミド、ポリ（ビニルアルコ
ール）、ポリスチレン、ガラス、酸化アルミニウム、二
酸化チタン、二酸化ジルコニウム、又はシリカゲルから
成るマトリックスでできている表面改質された担体であ
る。該陰イオン交換体は、相互作用に適した高容量内部
表面を持つ多孔質担体部材であるか、又は混合物と相互
作用して外部表面上でのみ分離する非多孔質担体部材で
もよい。特に好ましくは、該陰イオン交換体はシリカゲ
ルを基材とし、粒子径が１〜250μｍ、好ましくは10〜5
0μｍ、特に好ましくは15〜25μｍであり、ポアの直径
が１〜2,500nm、好ましくは10〜500nm、特に好ましくは
100〜400nmである部材である。特に、陰イオン交換体部
材が高い表面電荷及び核酸に対する高い結合能力を持つ
部材であることが立証されている。好ましくは、シリカ
ゲル改質は、例えばEP−A 83 901 065、DE−Ａ−39 35
098及びUS−Ａ−5,057,426に開示されているように担体
部材をシラン化することにより行われる。EP−A 83 901
065では、例えば、γ−グリシジルオキシプロピルトリ
メトキシシラン及びN,N−ジメチルアミノエタノールが
担体部材の改質に使用される。
核酸の吸着は、一般的に低塩濃度で存在するような条
件下で行われる。好ましくは、これらは核酸をカラムか
ら溶出させるものよりも低い塩濃度である。ここでは、
イオン交換体部材及び使用するpHに応じて、該塩濃度は
0.25〜1.5Mでよい。
陰イオン交換体部材への核酸の吸着に続いて、低イオ
ン強度のバッファーを用いて最低一回の洗浄処理を行っ
てもよい。
ここでは、好ましくは、イオン交換体部材を主に円筒
形の中空体のカラムに入れる。その後、カラムを可能な
限り高いイオン強度の塩溶液で洗浄するが、核酸は溶出
されない。それにより、低分子量及び電荷の弱い不純物
及び蛋白が洗い出される。
収量の不必要な損失を避けるために、吸着処理及び溶
出処理の間に各々の吸着部材の状態調節（conditionin
g）を行うか、又は特に高塩濃度条件下での核酸の吸着
を後に行おうとする領域において、最終の洗浄処理とし
て可能な限り高いイオン強度を実現すると都合がよいで
あろう。特に、この目的において、pHが約５でイオン強
度が約1.5Mの過塩素酸ナトリウムに対応する平衡化及び
状態調節用の溶液を使用してもよい。
対応して、高イオン強度の条件下で核酸を結合させる
部材を、別の主に円筒形の中空体に入れる。イオン交換
部材から脱着されて高塩濃度分画中にある核酸分画を、
高塩濃度条件下で核酸を吸着する部材の入ったカートリ
ッジ又はカラム中に入れる。好ましい態様において、陰
イオン交換体の入った容器が高塩濃度条件下で核酸を吸
着する部材の入った容器の上に配置されるように、各装
置を対応する吸着部材に合わせる。
特に、高イオン強度で核酸を吸着することができる部
材の状態調節は、そのような処理方法により容易に行う
ことができる。高イオン強度で核酸に結合することがで
きる部材を、対応する高濃度の塩溶液で前処理すること
により状態調節を前もって行ってもよい。しかしなが
ら、例えば、核酸を吸着する部材を高イオン強度の塩溶
液で初めに処理し、その結果、水溶液がそれに接触する
と直ちに非常に高い塩濃度が生じて高イオン強度下で該
部材を核酸を吸着させるように、適当に前処理した部材
を使用することも可能である。陰イオン交換体からの核
酸の溶出により該部材から分離する最初の容量が、十分
な強度で次の部材に吸着させるには低すぎる塩濃度とな
ることが実際にあり得るために、状態調節は有利であ
る。そこで、比較的薄い溶出液滴が、上記のように状態
調節した、高イオン強度の条件下で核酸に結合すること
ができる部材に接触するに至った場合、高い塩濃度が即
座に得られ核酸がこの部材に吸着されるであろう。
その後、核酸を高イオン強度の溶出バッファーで無機
質担体に直ちに結合させるために、高イオン強度のバッ
ファーを用いて陰イオン交換体部材から該核酸を脱着さ
せてもよい。ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸ナトリウム
のようなカオトロピック（chaotropic）塩の存在下で
は、微細ガラス又はシリカゲルの懸濁液を核酸に加え、
核酸がシリカゲルに結合できるように長時間インキュベ
ーションを行った場合、核酸が微細粉砕ガラス又はシリ
カゲルに結合することもある（B.フォーゲルステイン及
びD.ギレスピー（B.Vogelstein and D.Gillespia）：ア
ガロースからのDNAの分取及び分析用精製:Proc.Nat.Aca
d.Sci.,U.S.A.,76巻,615−19頁,1979年;R.ヤン、J.リス
及びB.ウ（R.Yang,J.Lis and B.Wu）：ゲル電気泳動後
のアガロースからのDNAの溶出:Methods Enzymol.,65巻,
176−182頁,1979年;M.A.マルコ、R.チッパーフィールド
及びH.C.ビルンボイム（M.A.Marko,R.Chipperfield and
H.C.Birnboim）：アルカリ抽出及びガラスパウダーへ
の結合を用いた高度精製プラスミドDNAの大量単離法:An
al.Biochem.,121巻,382−387頁,1982年）。
驚くべきことに、核酸の無機質担体への吸着は試料に
低級アルコールを加えることによっても行うことができ
る。好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、及びブタノールが可能である。
試料に加えるアルコールの量の好ましい範囲は、１−50
％（v/v）の水に溶ける限りの範囲である。さらに、核
酸の吸着はポリ（エチレングリコール）類を用いて行う
こともできる。使用できるエチレングリコールは1,000
〜100,000、とりわけ6,000〜8,000の分子量を持つもの
である。ポリ（エチレングリコール）の添加は試料の１
−30％の範囲でもよい。
驚くべきことに本発明の方法は、核酸がガラス又はシ
リカゲルの非常に薄い層を通過する際に、滞留時間がわ
ずか１−30s（秒）であるにもかかわらず、効率よく吸
着されることを示している。同様に、結合が高濃度の塩
化ナトリウム及び塩化リチウム中で起きること、及びカ
オトロピック塩は必要でないことが見られる。さらに、
陰イオン交換体が核酸の精製に役立ち、0.25〜1.5Mの塩
濃度で代謝物質、蛋白及びRNAの一部、並びにポリサッ
カライド類のような不純物が除去されて、これらは所定
の条件下では下流のシリカゲル層に吸着することができ
ず、次の段階としてシリカゲル層への核酸の吸着を可能
にする十分に高い塩濃度で核酸が陰イオン交換体から溶
出される際に、該シリカゲル層が脱塩及び濃縮の目的を
果たすような、陰イオン交換体及びシリカゲルの組み合
わせはこれまでに述べられていない。
無機質担体への吸着処理においては、表中に示す濃度
のバッファー塩を用いることができる。 塩 濃度 NaCl ３−5M NaClO4 ５−7M Gu−HCl ５−7M NaI ３−5M 塩溶液での処理は、フィルター上への滴下及び吸水に
よって簡単に行ってもよい。好ましい態様においては、
該シリカゲル層をpH6.5〜8.5、とりわけpH7〜８の過塩
素酸溶液で処理する。便宜的には、これをピペッティン
グ及び吸水によって行う。特にこの目的において好まし
いのは、４〜8MのNaClO4、５〜20mMのTris−HCl、pH7−
８、及び0.5〜2mMのEDTAを含む溶液の使用である。カオ
トロピック溶液、とりわけ過塩素酸ナトリウム溶液の除
去に続いて、再洗浄を好ましくはエタノール、例えば50
−90％エタノールを用いて行う。
フィルターが一旦乾燥すれば、溶出は、例えばAnal.B
iochem.,101巻,339−341頁,1980年，に述べられている
ような塩の希釈水溶液を用いて通常の様式で行われる。
好ましい溶出液は、0.05〜0.2mMのEDTAを含む0.5−2mM
Tris−HCl,pH7−8,であり、以後TEと呼ぶ。それ以外の
適当な溶出液として、例えば、0.1％SDSのような洗剤の
希釈溶液があるが、TEほど好ましくはない。
シリカゲル以外に、他の無機質担体も核酸の吸着に適
当であることが見出された。しかしながら、好ましい態
様においては、１〜250μｍ、好ましくは１〜50μｍ、
特に１〜５μｍの粒子径のシリカゲルが使用される。脱
塩層を、二個のPEフリットの間に挟まれた粗く充填され
た層として抽出カラム中に使用してもよい。別の態様に
は、EP−0 323 055（12/07/1988、3M、コンポジション
・クロマトグラフィック・アーティクル）による膜の形
態の無機質担体の適用が含まれる。
本発明の方法を用いて、非常に多様な由来の核酸を、
該核酸がバクテリア、細胞培養物、血液、組織、尿、ウ
ィルスに由来するものであるかどうか、又はPCR（ポリ
メラーゼ連鎖反応）、SSSR（自立配列複製）、リガーゼ
連鎖反応、及び類似の反応のような増幅反応に由来する
ものであるかどうかにかかわらず、或いはビオチンラベ
ル、蛍光ラベル、放射性ラベル等のラベル化核酸が関係
するかどうかにかかわらず、分離及び調製することがで
きる。該核酸が10ヌクレオチドから200,000ヌクレオチ
ドの範囲のサイズであれば可能である。本発明で意味す
る核酸とは、10〜100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチ
ド、50〜25,000ヌクレオチドのRNA、2,500〜25,000塩基
対のプラスミドDNA、5,000〜60,000塩基対のコスミドDN
A、又は100〜200,000塩基対のゲノムDNAと理解される。
本発明の方法のステップｄ）により得られた核酸分画
は、低塩負荷の溶液として得られる。従って続いて、そ
の後の処理に必要なバッファー条件の調整が可能であ
る。特に便利な様式を取れば、シリカガラスに結合した
核酸はその後の処理用に設定されたバッファー中にすで
に溶出されている。
単離された核酸は非常に多様な用途に用いられる。特
に度々用いられるのは、制限分析、配列決定、放射性物
質又はビオチン、FITC、ジゴキシゲニンのような非放射
性マーカーによるラベル化、並びにPCR、SSSR、及びリ
ガーゼ連鎖反応を用いた増幅を行うための制限酵素、ポ
リメラーゼ、及びリガーゼを用いた酵素反応を行う場合
においてである。
本発明の方法はプラスミドDNA及びゲノムDNAの単離及
び調製において特に適している。
添付の図面は、核酸用の多様な吸着部材が一装置に組
み合わされた、本発明の装置の好ましい態様を図解して
いる。
図１は、本発明の方法を実施するための装置を示して
おり、入口開口部７及び出口開口部８を持つ中空体１か
ら成る。好ましくは、該中空体はポリプロピレン（P
P）、ポリエチレン（PE）、ポリ（メチルメタクリレー
ト）（PMMA）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、
ポリ（エチルテレフタレート）（PET）、又はポリアク
リロニトリル（PAN）から成る。中空体１の中には、固
定具５及び６の間に無機質担体部材である第一の粉末部
材10が配置されている。中空体１の中の、第一の部材10
及び出口開口部８の間に無機質担体部材である第二の粉
末部材11が置かれている。第一及び第二の部材10及び11
は核酸に対して異なる吸着特性を持つ。吸着特性の差
は、それぞれ、高イオン強度及び低イオン強度のバッフ
ァーにおける異なる吸着作用により決定されている。例
えば、低イオン強度の条件下で第一の部材10に核酸が吸
着される場合、第二の部材11は低イオン強度のバッファ
ー条件下では核酸を容易に通過させることができなくて
はならず、一方高イオン強度の条件下では、核酸は第一
の部材10から脱着されて、第二の部材11に吸着されるこ
とになる。
好ましくは、第一の粉末部材10はアガロース、デキス
トラン類、セルロース、アクリルアミド、ポリ（ビニル
アルコール）、ポリスチレン、ガラス、酸化アルミニウ
ム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、又はシリカゲ
ルを基材として表面改質された担体の陰イオン交換体、
特にシリカゲルを基材とする上記の型の陰イオン交換体
から成る。好ましい該塩基性イオン交換体は、10〜40μ
ｍ、とりわけ15〜25μｍ、特に15〜25μｍの粒子径を持
ち、孔の直径が１〜2,500nm、好ましくは10〜500nm、と
りわけ200〜400nmである。
第二の部材11は無機質担体部材であり、とりわけシリ
カゲル、ガラス、ゼオライト、酸化アルミニウム、二酸
化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、珪藻土、好
ましくはシリカガラスから成り、シリカゲル懸濁液の形
態を取ってもよい。第二の部材11は、好ましくは１〜25
0μｍ、とりわけ１〜30μｍの粒子径を持ち、１〜５μ
ｍが好ましい。
好ましくは、装置５及び６は焼結ガラス（フリット
類）；ポリエチレン、PTFE、ポリプロピレン、ガラス、
セラミックス、ナイロンのようなプラスチック膜；又は
ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロンでできた不織
布から成る。好ましくは、装置５及び６の気孔率（poro
sity）は10〜500μｍである。
本発明の装置の別の好ましい態様を、図２に図解す
る。ここでは、第一の部材10及び第二の部材11は中空体
１の中に、部材10及び11が直接隣接し、即ち固定具５及
び６によって一緒に固定されている別々の層となるよう
に配置されている。好ましくは、該部材は分離具13によ
り分離されており、当該分離具13は多孔性の枠であり、
好ましくは焼結ガラス、又はプラスチック膜或いは好ま
しくはナイロン製のティッシュでできている。
図３は本発明の装置の別の好ましい態様を図解するも
ので、第二の部材11がチャンネルを形成する出口開口部
18の中の固定具５及び15の間に固定されている。チャン
ネルを形成する出口開口部18は、中空体１よりも小さな
横断面を持ち、好ましくはチャンネル18aで終わり、チ
ャンネル18aの直径はチャンネル18の直径よりも小さ
い。第一の部材10は中空体１の内部の直径の長い領域に
置かれ、装置６及び16により固定される。ここでは、第
一及び第二の部材10及び11を隣接させると、共通の手段
17だけによって分離できるので都合がよいと考えられる
（図４参照）。
図５は本発明の装置の別の好ましい態様を示してお
り、第一及び第二の部材10及び11の層の他に、第一の部
材10の上に配置された別の層12を中空体の中に持つ。層
12は機械的フィルター手段として設計されている。好ま
しくは、第三の層12は、フィルターポア径が試料の流れ
る方向、即ち供給口７から出口開口部８又は18の方向に
小さくなるアシンメトリーなフィルターである。それに
より、装置を目詰まりさせる恐れもなく試料中の細胞破
片を除去することができる。
本発明の装置の全ての態様において、部材10及び11の
いずれも粉末形態でもよく、又は成形体に設計されてい
てもよい。部材10及び11が粒子の形態で存在する場合
は、該層がUS−PS 4,810,381及びUS−PS 4,699,717によ
る膜であってDE 41 27 276に提示されているような形態
で存在するように、それらを不活性プラスチックのサポ
ーティングネット中に埋封することが勧められるであろ
う。該サポーティングネットはテフロン製でもよい。
図６は本発明の装置の他の好ましい態様を示してお
り、それにおいては８個の独立した別々の図２の装置が
互いに隣接して、８個で１ユニットを形成している。図
１−５に述べた個々の態様のいずれで実現してもよいこ
の態様の利点は、マルチチャンネルピペットを補助器具
とする８試料の同時調製を基本とする。同様に、この設
計は12列形態に製造することもでき、それにより96試料
が処理可能となる。国際標準化微量滴定フォーマットを
用いる場合に非常に有利である。
図７は、入口開口部７及び出口開口部８、並びに二個
の手段６及び５の間に固定された陰イオン交換体部材10
を有する円筒形中空体１を含む装置を示している。その
上に、内部に種々のフィルター層が配置されている別の
円筒形中空体が装着されている。フィルター層20、21、
22は、焼結されたポリエチレン、ポリプロピレン、PTF
E、ガラス、シリカゲル、酸化アルミニウム又は圧縮珪
藻土、例えばセライト又はシリカゲルからできていても
よい。もっとも、その他にポリプロピレン、ポリエステ
ル、ガラス繊維、及びシリカの織フリース又は不織フリ
ースも可能である。好ましくは、個々の層の気孔率は15
〜500μｍで、厚さは0.1〜10mmである。該フィルター層
のポア径は、流れの方向に見て、順に小さくなる。典型
的な態様では、層20におけるポア径はおよそ100〜300μ
ｍで、層21では30〜100μｍ、第三のフィルター層では
５〜30μｍである。
図８は、図７の装置の別の好ましい態様を図解してお
り、流れの方向に見て一番上のフィルター層23として疎
水性の層が挿入されている。該疎水性中間層23は、実際
の濾過が開始される以前のフィルター層中への望ましく
ない粗細胞溶解物の侵入を防ぐ。好ましくは、疎水性中
間層23は、気孔率が10〜500μｍで、好ましくは厚さが
0.1〜5mmの、紡績又は焼結されたポリプロピレン、ポリ
エチレン、ポリエステル又はポリテトラフルオロエチレ
ン（PTFE）繊維から成る。
図９は、図７及び８に述べたものと類似の設計の濾過
装置を示しており、異なる点は、ポア径が小さくなって
いく種々のフィルター層が、連続的にポア径が小さくな
っていく単一のフィルター層12に合わせられていること
にある。好ましくは、該アシンメトリックフィルター層
12の流れの方向に見て上面に疎水性フィルター23が備え
られている。好ましくは、該アシンメトリックフィルタ
ー層12は紡績ポリプロピレン又はポリエステル繊維から
成る。市販のものには、例えば、パル・フィルターテク
ニク社（ドライアイヒ、フランクフルト）の、気孔率の
段階的変化が500から50μｍのもの、100から10μｍのも
の、50から５μｍのもの、及び10から0.1μｍのものが
ある。好ましくは、該アシンメトリックフィルター層の
厚さは１〜10mmがよい。
図10は、本発明で意味するところの核酸の分離を行う
ための濾過装置を示しており、ここでは図９のフィルタ
ー配置が再び使用され、アシンメトリックフィルターに
疎水性フィルター層23が備えられている。陰イオン交換
体10の代わりに、高濃度の塩溶液において核酸を吸着す
ることができる無機質担体11を中空体１の中に置く。
図11は、図９及び10組みを合わせた配置を示す。ここ
では、適当に設計されたカートリッジを挿入するなどに
より、アシンメトリックフィルター12及び疎水性フィル
ター層23から成るフィルターヘッドが図２に示した装置
に単に備えられただけである。
図１から５、及び図７から11により詳しく述べられて
いる個々の装置は全て、８列の単一の装置から成る微量
滴定ストリップに配置してもよい。これは、図12から14
に、もう一度例示してある。
図12は、陰イオン交換体、微量滴定ストリップ、又は
８及び／又は８×12ウェルの微量滴定プレートを含む濾
過装置を図解している。図12の装置においては、装置５
及び６の間に固定された陰イオン交換体層を含む円筒形
中空体１の上の、装着式カートリッジ中にアシンメトリ
ーの濾過装置が置かれている。
図13は、陰イオン交換体部材の代わりに、高塩濃度に
おいて核酸を吸着することができる無機質担体部材を有
する濾過装置に関する。好ましくはシリカゲル層11が、
５及び６の二装置の間に配置されている。
図14は、図２の配置、及び試料が流れる方向に見て中
空体１の上に置かれた疎水フィルター層を伴うアシンメ
トリックフィルター層の組み合わせを図解している。
本発明の装置、特に図３又は４で詳細に検討した装置
は、非常に少量の液体を用いても第二の部材からの核酸
の溶出が確実になされることにおいて特に有利である。
基本的には、試料の本発明の装置中の流動は重力によ
ってなされるが、核酸の精製及び分離を促進するため
に、開口部７を加圧するか、又は開口部８又は18を減圧
してもよい。本発明の装置の他の好ましい態様では、ア
シンメトリックフィルターとして、該中空体の中を試料
が流れる方向にポア径が小さくなる焼結ガラス、又はポ
ア径が小さくなるプラスチック膜の積層からできている
ものを使用する。
細胞及び他の原料からの核酸を、遠心分離、フェノー
ル／クロロホルム抽出、及びアルコール沈殿をすること
なく得ることができ、該処理の終了に際して核酸は水又
は低塩濃度のバッファー中に濃縮された形態で存在し、
従って、直接その後の酵素反応に使用できる。別の利点
は、高価な実験装置の使用を避けられることにある。例
えば、溶出は重力によって行うことができ、いわゆるHP
LC装置により行う必要がない。
好ましくは、シリカゲル陰イオン交換体／シリカゲル
抽出カラムの調製は、50μｍの底部ポリエチレンフリッ
ト（ポリエチレン製の多孔質フィルター層、厚さ1.5m
m）を持つ市販の1.5ml遠心管の中にポリプロピレン管を
ぴったりと封入し、50mgのシリカゲル（リクロスファー
Si 100、16−24μm;メルク、ダームスタット、ドイツ）
を積層させることにより行うことができる。このシリカ
ゲル層を第二の多孔質ポリエチレンフリットでシール
し、第二のフリットに100mgのシリカゲル陰イオン交換
体（キアゲン、ヂアゲン社、デュッセルドルフ、ドイ
ツ）、粒子径16〜23μｍ、を積層させ、最後に第三の多
孔質ポリエチレンフリットでシールする。
好ましくは、アガロース陰イオン交換体／シリカゲル
抽出カラムの調製は、50μｍのポリエチレンフリット
（PE製の多孔質フィルター層、厚さ1.5mm）でポリプロ
ピレン管の底部をシールし、50mgのシリカゲル（リクロ
スファーSi 100、16−24μm;メルク、ダームスタット、
ドイツ）を積層させることにより行うことができる。こ
のシリカゲル層を第二の多孔質ポリエチレンフリットで
シールし、第二のフリットに0.5mlのDEAEセファロースF
F（ファルマシア社、フロイバーグ、ドイツ）、粒子径4
5〜165μｍ、を積層させ、最後に第三の多孔質ポリエチ
レンフリットでシールする。
好ましくは、図３の陰イオン交換体膜／シリカゲル膜
抽出カラムの調製は、ポリプロピレン管の中のポリエチ
レンフリットの上に、厚さが1mmのエムポア シリカゲ
ル膜（３）（3M社、セント・ポール、MN、U.S.A.）、厚
さが0.2mmのポリプロピレンフリース、及び16−23μｍ
のキアゲン陰イオン交換体粒子（ヂアゲン社、デュッセ
ルドルフ、ドイツ）から成る厚さが1mmの陰イオン交換
体膜を置くことにより行うことができる。
陰イオン交換体／シリカゲル微量滴定ストリップ抽出
カラムの調製は、以下のように行うことができる:8又は
96の位置を持つ微量滴定ストリップにDEAEシリカゲル膜
及びシリカゲル膜を装填する。微量滴定ストリップのポ
ーリングの中に、シデント９シリカゲル粒子（デグサ
社、フランクフルト、ドイツ）でできている厚さが0.75
mmのシリカゲル膜、厚さが0.2mmのポリプロピレンフリ
ース層、及び16−23μｍのキアゲン（ヂアゲン社、デュ
ッセルドルフ、ドイツ）でできている厚さが0.8mmの陰
イオン交換体膜を固定させる。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１ プラスミドDNAの調製 pUC 18−形質転換HB 101大腸菌細胞を含むLBアンピシ
リン培地による培養物100mlを5,000gで10分間遠心分離
する。該細胞ペレットを10mlの50mM Tris−HCl,10mM ED
TA,pH8.0,及び100μg/ml RNase Aに再懸濁する。
細胞を溶解するために、10mlの0.2M NaOH及び１％SDS
を細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間室温に置
く。これを、10mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を用いて
中和し、混合して、氷上で15分間インキュベートする。
該溶解物を15,000gで30分間遠心分離し、上清を注意深
く除去する。澄んだ細胞溶解物1mlをピペットでDEAE陰
イオン交換体／シリカゲル遠心分離抽出カラム上に載
せ、該試料を2,500gで１分間遠心分離して陰イオン交換
体層を通過させる。該抽出カラムを、0.8mlの1M NaCl,1
5％エタノール、50mM MOPS,pH7.0、及び15％エタノー
ル、10mM酢酸ナトリウム,pH7.0、及び0.8mlの1M NaClO4
で洗浄してRNA及び蛋白を除去する。DNAを7M NaClO4,15
％エタノール、10mM酢酸ナトリウム,pH7.0で溶出し、そ
れによりシリカゲル層に直接結合させる。該抽出カラム
を、0.8mlの70％エタノール、10mM NaCl,10mM酢酸ナト
リウム,pH7.0、及び0.8mlの90％エタノール／水で洗浄
する。場合により、痕跡量のエタノールをさらに遠心分
離して除去する。続いて、50μｌの10mM Tris−HCl,1mM
EDTA,pH8.0を用いてDNAを遠心分離により溶出し、別の
1.5ml試験管に回収する。溶出されたDNAはその後、例え
ば制限処理、ラベル化、配列決定、又は増幅のような酵
素反応に直接使用することができる。
実施例２ プラスミドDNAの同時調製 8 DAEAシリカゲル膜／シリカゲル抽出カラムを減圧チ
ャンバー上に装着する。プラスミドDNAを含む各々1ml×
８の細胞溶解物を、減圧（20〜750mb）吸引により該抽
出カラムを通過させる。該抽出カラムを0.8mlの1M NaC
l,15％エタノール、50mM MOPS,pH7.0、及び15％エタノ
ール、10mM酢酸ナトリウム,pH7.0、及び0.8mlの1M NaCl
O4で洗浄してRNA及び蛋白を除去する。DNAを7M NaClO4,
15％エタノール、10mM酢酸ナトリウム,pH7.0で該陰イオ
ン交換体層から溶出し、それによりシリカゲル層に直接
結合させる。該抽出カラムを、0.8mlの70％エタノー
ル、100mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0及び0.8mlの
90％エタノール／水で洗浄する。高濃度の塩溶液を除去
するために、該サンプル管を、0.8mlの70％エタノー
ル、100mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0、及び0.8ml
の90％エタノール／水で洗浄する。該抽出層中に残存す
るエタノール/H2Oを、減圧吸引して空気を１−２分間通
すことにより蒸発させる。続いて、該８試料を50μｌの
1mM Tris−HCl,0.1mM EDTA,pH8.0で溶出する。
実施例３ M13一本鎖DNAの調製 1mlのM13ファージ懸濁液に、0.5mlの30％PEG 6000,1.
5M NaClを加え、氷上で10分間インキュベートし、これ
を15,000gで15分間遠心分離する。ファージペレットを
0.5mlの0.5Mグアニジン−HCl,1％トライトンＸ−100に
再懸濁し、70℃で10分間溶解させる。実施例３に従っ
て、減圧チャンバー上の抽出カラム中に該ファージ溶解
物を吸引して通過させ、吸着させる。該抽出カラムを1m
lの0.75M NaCl,15％エタノール、50ml MOPS,pH7.0、及
び1mlの0.75M NaClO4,50mM Tris−HCl,pH7.0で洗浄す
る。DNAを該陰イオン交換体層から7Mグアニジン,15％エ
タノール,50mM酢酸ナトリウム,pH7.0で溶出し、SiO2層
に吸着させる。
実施例４ 血液からのゲノムDNAの調製 1mlのクエン酸安定化ヒト全血に、赤血球を溶解させ
るためにサポニン1mlを加え、混合後直ちに2,500gで５
分間遠心分離する。白血球をPBSバッファー1mlに再懸濁
し、再ペレット化する。洗浄した該白血球を1mlの500mM
グアニジン−HCl,50mM Tris−HCl,10mM EDTA,pH8.0に再
懸濁し、0.1mlのプロテイナーゼＫ（10mg/ml）を加え
て、50℃に２時間置き、細胞を溶解させる。該白血球溶
解物を直ちにピペットで、アガロース／陰イオン交換体
／シリカゲル／抽出カラムに載せ、1mlの0.25M NaCl,10
mM酢酸ナトリウム,pH7.0及び1mlの0.25M NaClO4,10mM酢
酸ナトリウム,pH7.0で洗浄する。1mlのクエン酸安定化
ヒト全血を、陰イオン交換体／シリカゲルカラム中を減
圧吸引して通過させる。それにより、白血球はマトリッ
クス中に取り込まれ、一方実質的により小さな赤血球は
マトリックス中を移動する。該抽出カラムを1mlのPBSバ
ッファーを用いて２回再洗浄する。取り込まれた白血球
を10％トゥイーン10を用いて室温で15分間溶解する。細
胞断片及び蛋白を1mlの1Mグアニジン−HCl,pH7.0を用い
て洗い出し、DNAを7M NaClO4,50mM酢酸ナトリウム,pH7.
0で該カラムから溶出する。
実施例５ 微量滴定フォーマットにおけるDNAの調製、脱塩及び濃
縮 XL 1 Blue大腸菌細胞中のプラスミドpBLUESCRIPTの96
×1mlの培養物を、1.5mlウェルを持つ微量滴定プレート
（ベックマン社、ミュンヘン）中の２×YT培地中で、18
時間、37℃で培養する。細胞を、微量滴定遠心分離機で
2,500gで10分間遠心分離してペレット化する。８チャン
ネルピペット（マトリックス・テクノロジー社、ローウ
ェル、MA、U.S.A.）を用いて、0.25mlの50mM Tris−HC
l,10mM EDTA,100μg/ml RNAg1Aを微量滴定プレートウェ
ル中に注入し、細胞を振動シェイカーで５分間再懸濁さ
せる。
0.25mlの0.2M NaOH、１％SDSを各々に加え、緩く振動
させながら室温に５分間置き、細胞を溶解させる。続い
て、0.25mlの3M酢酸カリウム,2M酢酸,pH5.5−6.0中和用
バッファーを各々に加え、各ウェルに蓋をして密封し混
合する。氷上で10分間インキュベートした後、試料を3,
000gで30分間遠心分離して、細胞断片及びSDS沈殿をペ
レット化する。８チャンネルピペットを用いて上清を注
意深く取り、DEAEシリカゲル膜及びシリカゲル膜を有す
る96穴微量滴定プレート中に入れる。96試料全てを移し
た後、該濾過装置に減圧を加えることにより試料を微量
滴定プレート中に通過させる。それにより、DNAは該陰
イオン交換体層に吸着されるが、一方蛋白、RNA及び代
謝物質はこの条件下では吸着されない。
該抽出カラムを、0.8mlの1M NaCl,15％エタノール、5
0mM MOPS,pH7.0、及び15％エタノール、10mM酢酸ナトリ
ウム,pH7.0、及び0.8mlの1M NaClO4で洗浄してRNA及び
蛋白を除去する。DNAを7M NaClO4,15％エタノール、10m
M酢酸ナトリウム,pH7.0で溶出し、それによりシリカゲ
ル層に直接結合させる。該抽出カラムを、0.8mlの70％
エタノール、100mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0、
及び0.8mlの90％エタノール／水で洗浄する。続いて、
塩を含まない濃縮された形態のDNAを、50μｌの1mM Tri
s−HCl,0.1mM EDTA,pH8.0を用いて該シリカゲル層から
別の微量滴定プレート中に溶出する。
遠心分離の補助が必要な細胞溶解物の調製は時間と費
用のかさむ処理である。主として、日常的に多くの試料
を調製しなければならない場合に制約が生まれる。遠心
分離には自動化できないという欠点がある。
本発明の他の対象物（及び方法）は、該方法を遠心分
離を行わずに自動的に稼働させるための、核酸が実際に
精製されるところよりも上流にある濾過ユニットの形態
を取る装置及び方法である。
ここでは、試料をプロテイナーゼ、洗剤及び／又は温
度又はアルカリを用いて周知の方法により溶解する。こ
の粗溶解物を、濾過ヘッド上に直接注ぐか、移すか、又
はピペットで載せる。該濾過ヘッドのフィルター層は、
細胞破片、沈殿蛋白又は洗剤によるフィルターの目詰ま
りを避けるように設計されている。該細胞溶解物は、ピ
ストン或いは高圧によりフィルター層を加圧通過される
か、又は減圧により吸引されて通過する。それにより、
不活性成分は全て残り、澄んだ溶解物が直接吸着層に滴
下する。適当な吸着条件を選択することにより、核酸が
該吸着層に吸着される。フィルターケーキを含む濾過ユ
ニットは吸着ユニットから取り外して廃棄するか、又は
フィルターケーキを分析するために取っておく。該吸着
ユニットは適当な溶媒又はバッファーで再洗浄して望ま
しくない成分を除去し、最後に、求める試料が適当な溶
出剤を使用して溶出される。
本発明の方法により、例えばプラスミドDNAを、浄化
目的の遠心分離を冷蔵遠心分離機で行うことなく調製す
ることができる。XL1 Blue大腸菌細胞中のプラスミドpB
LUESCRIPTの培養物96×1mlを、1.5mlウェルを持つ微量
滴定プレート（ベックマン社、ミュンヘン）中の２×YT
培地中で、18時間、37℃で培養する。細胞を、微量滴定
遠心分離機で2,500gで10分間遠心分離してペレット化す
る。
８チャンネルピペット（マトリックス・テクノロジー
社、ローウェル、MA、U.S.A.）を用いて、0.25mlの50mM
Tris−HCl,10mM EDTA,100μg/ml RNAg1Aを微量滴定プ
レートウェル中に注入し、振動シェイカーで５分間再懸
濁させる。再懸濁した細胞を濾過ヘッドのサンプルリザ
ーバーに移し、それに0.25mlの0.2m NaOH/1％SDSを加え
る。該試料を振動シェイカー上で５分間振盪するか、又
は栓或いは接着フィルムでシールして混合するか、又は
上下ピペッティングを繰り返して混合する。
室温で５分間インキュベートして溶解させた後、NaOH
を中和しSDSを沈殿させるために、上記の方法のうちの
ひとつに従って、0.25mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を
加えて混合する。次に、減圧チャンバー上で遠心分離す
る代わりに、この粗細胞溶解物を10−800mbの減圧条件
で吸引して濾過層を通過させる。厚さが２−10mmで、20
0から５μｍの範囲のアシンメトリック又はステップワ
イズな多孔性を持つフィルター層が、目詰まりすること
なく細胞断片及び他の不溶性又は沈殿性成分を保持す
る。プラスミドDNAを含有する澄んだ細胞溶解物が該フ
ィルター層を通じて吸着層（陰イオン交換体又はシリカ
ゲル）上に滴下し、DNAが吸着されるが、一方蛋白、RNA
及び他の細胞代謝物は所定の塩条件下では結合しない。
濾過は約10−60秒後に完了する。該フィルターヘッドを
取り外し、フィルターケーキと共に廃棄する。
結合したDNAは1mlの1M NaCl,15％エタノール、50mM T
ris−HCl,pH7.0で１回、さらに1.5M NaClO4,10mM酢酸ナ
トリウム,pH6.5で２回洗浄し、該陰イオン交換体から7M
NaClO4,15％エタノール、50mM Tris−HCl,pH7.0で溶出
し、分離層を通過した後、高塩濃度下で直ちにナイロン
ネット又はPPフリースからシリカゲル層に結合される。
ここにおける１−2M NaClO4では、蛋白及びRNAは該シリ
カゲル層には結合しないで洗い出される。残留する痕跡
量の蛋白を除去するために、該シリカゲル層を1mlの7M
グアニジン−HCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0で洗浄す
る。7M NaClO4の高塩溶液は、1mlの70％EtOH,100mM NaC
l,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0及び1mlの90％エタノール
／水又は1mlの90％アセトン／水で洗浄すると都合がよ
い。乾燥させた後に、プラスミドDNAが、50μｌの1mM T
ris−HCl,0.1mM EDTA,pH8.5により、無塩、且つ濃縮さ
れた形態で溶出される。
この方式により、遠心分離、フェノール／クロロホル
ム抽出及びアルコール沈殿を行うことなく、濃縮された
形態のプラスミドDNAを非常にわずかな時間で単離する
ことができ、収率は50〜80％の範囲である。上記のよう
な微量滴定プレート型を用いると、１−2mlの大腸菌培
養物によるプラスミド少量調製品（miniprep）96個が一
人の操作で60分以内に調製することができ、１〜10μｇ
のDNAが得られる。これまでの周知の方法では、６〜12
時間が必要である。
実施例６ 図７の装置を用いたプラスミド少量調製 LB培地中のpUC18プラスミドDNAを有するXL Blue大腸
菌培養物1.5mlを10,000gで５分間遠心分離して、細胞を
ペレット化する。該細胞ペレットを0.25mlの50mM Tris
−HCl,10mM EDTA,pH8.0,100μg/ml RNase Aに再懸濁す
る。細胞を溶解するために、0.25mlの0.2M NaOH及び１
％SDSを該細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間
室温に静置する。次いで、0.25mlの3M酢酸カリウム及び
2M酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で15分間インキ
ュベートする。該溶解物を図７の濾過装置に移す。該装
置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を20−
800mbで吸引して装置中を通過させる。或いは、該試料
をピストン又は高圧を用いて濾過層中を加圧通過させて
もよい。濾過後、濾過装置を取り外し、フィルターケー
キを細胞断片、変性蛋白及び沈殿SDSと共に破棄する。
該抽出カラムを、0.8mlの1M NaCl,15％エタノール,50
mM MOPS,pH7.0で２回洗浄してRNA及び蛋白を除去する。
DNAを1mlの1.25M NaCl,15％エタノール,50mM Tris−HC
l,pH8.5で溶出する。脱塩及び濃縮するために、溶出さ
れたDNAをアルコールで沈殿させ、該アルコール沈殿物
を遠心分離によりペレット化させる。
実施例７ 図８の装置を用いたプラスミドDNAの調製 LB培地中のpUC18プラスミドDNAを有するXL Blue大腸
菌培養物1.5mlを10,000gで５分間遠心分離して、細胞を
ペレット化する。該細胞ペレットを0.25mlの50mM Tris
−HCl,10mM EDTA,pH8.0,100μg/ml RNase Aに再懸濁
し、濾過装置に移す。細胞を溶解するために、0.25mlの
0.2M NaOH及び１％SDSを図８の濾過装置中の該細胞懸濁
液に加え、該装置を栓又は装着フィルムによりシール
し、注意深く攪拌して、５分間室温に静置する。次い
で、0.25mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を用いて中和
し、混合して、氷上で15分間インキュベートする。該装
置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を20−
800mbで吸引して装置中を通過させる。或いは、該試料
をピストン又は高圧を用いて濾過層中を加圧通過させて
もよい。濾過後、濾過装置を取り外し、フィルターケー
キを細胞断片、変性蛋白及び沈殿SDSと共に破棄する。
該抽出カラムを、0.8mlの1M NaCl,15％エタノール,50mM
MOPS,pH7.0で２回洗浄してRNA及び蛋白を除去する。DN
Aを1mlの1.25M NaCl,15％エタノール,50mM Tris−HCl,p
H8.5で溶出する。脱塩及び濃縮するために、溶出された
DNAをアルコールで沈殿させ、該アルコール沈殿物を遠
心分離によりペレット化させる。
実施例８ 図10の装置を用いたシリカゲル層におけるプラスミドDN
Aの調製 LB培地中のpUC18プラスミドDNAを有するXL Blue大腸
菌培養物1.5mlを10,000gで５分間遠心分離して、細胞を
ペレット化する。該細胞ペレットを0.25mlの50mM Tris
−HCl,10mM EDTA,pH8.0,100μg/ml RNase Aに再懸濁
し、濾過装置に移す。細胞を溶解するために、0.25mlの
0.2M NaOH及び１％SDSを濾過装置中の該細胞懸濁液に加
え、該装置を栓又は装着フィルムによりシールし、注意
深く攪拌して、５分間室温に静置する。次いで、0.5ml
の5.5Mグアニジン−HCl,0.25mM酢酸カリウム,pH5.5を用
いて中和し、混合して、氷上で15分間インキュベートす
る。図10の装置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞
溶解物を20−800mbで吸引して装置中を通過させる。或
いは、該試料をピストン又は高圧を用いて濾過層中を加
圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置を取り外し、フ
ィルターケーキを細胞断片、変性蛋白及び沈殿SDSと共
に破棄する。該抽出カラムを、1mlの7M NaClO4,10mM酢
酸ナトリウム,pH7.0で２回洗浄し、さらに0.8mlの90％
エタノール／水で洗浄し、痕跡量のエタノールを吸引除
去する。最後に、DNAを50μｌの10mM Tris−HCl,1mM ED
TA,pH8.0で溶出し、別の1.5ml試験管に回収する。
溶出されたDNAは、例えば制限処理、ラベル化、配列
決定、又は増幅のような酵素反応に直接使用することが
できる。
実施例９ 微量滴定ストリップによる８×プラスミドDNAの調製 LB培地中のpUC18プラスミドDNAを有するXL Blue大腸
菌培養物８×1.5mlを10,000gで５分間遠心分離して、細
胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25mlの50mM T
ris−HCl,10mM EDTA,pH8.0,100μg/ml RNase Aに再懸濁
し、図14の装置に移す。細胞を溶解するために、0.25ml
の0.2M NaOH及び１％SDSを濾過装置中の該細胞懸濁液に
加え、該装置を栓又は接着フィルムによりシールし、注
意深く攪拌して、５分間室温に静置する。次いで、0.25
mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を加えて中和し、混合し
て、氷上で15分間インキュベートする。該装置全体を減
圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を20−800mbで吸
引して装置中を通過させる。或いは、該試料を高圧によ
り濾過層中を加圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置
を取り外し、フィルターケーキを細胞断片、変性蛋白及
び沈殿SDSと共に破棄する。該抽出カラムを、0.8mlの1M
NaCl,15％エタノール,50mM MOPS,pH7.0、及び0.8mlの1
M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0で
洗浄してRNA及び蛋白を除去する。DNAを7M NaClO4,15％
エタノール,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0を用いて陰イオ
ン交換体層10から溶出し、それにより直接シリカゲル層
11に結合させる。該抽出カラムを、0.8mlの70％エタノ
ール,100ml NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0及び0.8ml
の90％エタノール／水で洗浄する。抽出カラム中に残存
するエタノール/H2Oは減圧吸引して空気を１−２分間通
すことにより蒸発させる。続いて、該８試料を50μｌの
1mM Tris−HCl,0.1mM EDTA,pH8.0で溶出する。
実施例10 図13の装置を用いた８×1mlのM13 DNAの調製 ８×1mlのM13ファージ懸濁液に、0.5mlの30％PEG 600
0,1.5M NaClを加え、これを氷上で10分間インキュベー
トする。該試料を図13の装置に移し、ファージ溶解物を
減圧チャンバー上の図13の装置に直接吸引して通過させ
て濾過する。該ファージペレットを7Mグアニジン−HCl,
pH7.0中を吸引により通過させて溶解し、同時にDNAをシ
リカゲル層11に吸着させる。該抽出カラムを、0.8mlの7
0％エタノール,100mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0
及び0.8mlの70％エタノール,100mM NaCl,100mM酢酸ナト
リウム,pH7.0及び0.8mlの90％エタノール／水で洗浄
し、吸引により空気を１−２分間通す。最後に、DNAを5
0μｌの10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0で溶出し、別の
1.5ml試験管に回収する。
溶出されたDNAはその後、例えば制限処理、ラベル
化、配列決定、又は増幅のような酵素反応に直接使用す
ることができる。
実施例11 図14の装置を用いた８×12プラスミドDNAの調製 LB培地中のpUC18プラスミドDNAを有するXL Blue大腸
菌培養物96×1.5mlを2,500gで５分間遠心分離して、細
胞をペレット化する。該細胞ペレットを0.25mlの50mM T
ris−HCl,10mM EDTA,pH8.0,100μg/ml RNase Aに再懸濁
し、該装置に移して、栓又は接着フィルムによりシール
し、注意深く攪拌して、５分間室温に静置する。次い
で、0.25mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を用いて中和
し、混合して、氷上で15分間インキュベートする。該装
置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を20−
800mbで吸引して装置中を通過させる。或いは、該試料
を高圧により濾過層中を加圧通過させてもよい。濾過
後、濾過装置を取り外し、フィルターケーキを細胞断
片、変性蛋白及び沈殿SDSと共に破棄する。該抽出カラ
ムを、0.8mlの1M NaCl,15％エタノール,50mM MOPS,pH7.
0、及び0.8mlの1M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸ナ
トリウム,pH7.0で洗浄してRNA及び蛋白を除去する。DNA
を7M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸ナトリウム,pH7.
0を用いて陰イオン交換体層10から溶出し、それにより
直接シリカゲル層11に結合させる。該抽出カラムを、0.
8mlの70％エタノール,100mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,
pH7.0及び0.8mlの90％エタノール／水で洗浄する。
抽出層中に残存するエタノール/H2Oは減圧吸引して空
気を１−２分間通すことにより蒸発させる。続いて、該
96試料を各々50μｌの1mM Tris−HCl,0.1mM EDTA,pH8.0
で溶出し、別の1.5ml試験管に回収する。溶出されたDNA
は例えば制限処理、ラベル化、配列決定、又は増幅のよ
うな酵素反応に直接使用することができる。
実施例12 状態調節を行わないプラスミドDNAの調製 pUC18−形質転換HB 101大腸菌細胞を含むLBアンピシ
リン培地による培養物3mlを5,000gで10分間遠心分離す
る。該細胞ペレットを0.25mlの50mM Tris−HCl,10ml ED
TA,pH8.0及び100μg/ml RNase Aに再懸濁する。細胞を
溶解するために、0.25mlの0.2M NaOH及び１％SDSを細胞
懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間室温に置く。こ
れを、0.25mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を用いて中和
し、混合して、氷上で15分間インキュベートする。該溶
解物を10,000gで15分間遠心分離し、上清を注意深く除
去する。澄んだ該細胞溶解物をピペットでDEAE陰イオン
交換体／抽出カラム上に載せ、該試料を吸引してイオン
交換体層を通過させる。該抽出カラムを、0.8mlの1M Na
Cl,15％エタノール,50mM MOPS,pH7.0及び15％エタノー
ル、10mM酢酸ナトリウム,pH7.0で洗浄してRNA及び蛋白
を除去する。DNAを7M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸
ナトリウム,pH7.0を用いて、ガラス繊維膜を有する抽出
カラム上に吸引して載せる。7M NaClO4中の溶出DNA溶液
を吸引してガラス繊維膜を通過させ、それにより直接シ
リカゲル膜に吸着させる。該抽出カラムを、0.8mlの70
％エタノール、100mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.
0、及び0.8mlの90％エタノール／水で洗浄する。場合に
より、吸引して空気を通すことにより痕跡量のエタノー
ルを除去する。最後に、10μｌの10mM Tris−HCl,1mM E
DTA,pH8.0を用いて、DNAを溶出し、別の1.5ml試験管に
回収する。
実施例13 状態調節を行うプラスミドDNAの調製 pUC18−形質転換HB 101大腸菌細胞を含むLBアンピシ
リン培地による培養物3mlを5,000gで10分間遠心分離す
る。該細胞ペレットを0.25mlの50mM Tris−HCl,10mM ED
TA,pH8.0,及び100μg/ml RNase Aに再懸濁する。細胞を
溶解するために、0.25mlの0.2M NaOH及び１％SDSを細胞
懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間室温に置く。こ
れを、0.25mlの3M酢酸カリウム及び2M酢酸を用いて中和
し、混合して、氷上で15分間インキュベートする。該溶
解物を10,000gで15分間遠心分離し、上清を注意深く除
去する。澄んだ該細胞溶解物をピペットでDEAE陰イオン
交換体／抽出カラム上に載せ、該試料を吸引してイオン
交換体層を通過させる。該抽出カラムを、0.8mlの1M Na
Cl,15％エタノール,50mM MOPS,pH7.0で洗浄してRNA及び
蛋白を除去し、0.8mlの1M NaClO4,15％エタノール、10m
M酢酸ナトリウム,pH5.0を用いて状態調節を行う。DNAを
0.7mlの7M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸ナトリウ
ム,pH7.0を用いて、ガラス繊維膜を有する抽出カラム上
に吸引して載せる。このガラス繊維膜は、より良好なDN
A吸着をもたらし最初の滴下中の損失を避けるために、
0.2mlの7M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸ナトリウ
ム,pH7.0を用いて予め状態調節されている。次いで、7M
NaClO4中の溶出DNA溶液を減圧装置上で吸引してガラス
繊維膜を通過させ、それにより直接シリカゲル膜に吸着
させる。該抽出カラムを、0.8mlの70％エタノール、100
mM NaCl,10mM酢酸ナトリウム,pH7.0、及び0.8mlの90％
エタノール／水で洗浄する。場合により、吸引して空気
を通すことにより痕跡量のエタノールを除去する。最後
に、100μｌの10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0を用い
て、DNAを溶出し、別の1.5ml試験管に回収する。
前状態調節は、7M NaClO4,15％エタノール,10mM酢酸
ナトリウム,pH7.0に浸した後乾燥させた膜を使用するこ
とによって行うこともできる。この前状態調節により、
吸着損失が30％から５％以下に減少し、DNAの総収率が5
0−60％から80−90％に増加する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 37/00 Ｇ０１Ｎ 37/00 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12M 1/00 - 3/10 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/50 G01N 37/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (37)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸、特にプラスミド又はゲノムDNAを細
    胞又は他の材料から単離及び精製する方法であって、 ａ）核酸を含む細胞を消化して細胞破片を除去するか、
    又は核酸を含む他の試料を陰イオン交換体で、即ち、低
    イオン強度のバッファー溶液中で処理し、 ｂ）その後、該核酸を高イオン強度のバッファーを用い
    て、該陰イオン交換体から脱着し、続いてそれにより ｃ）該核酸を高イオン強度の当該バッファー中におい
    て、又は低級アルコール類及び／又はポリ（エチレング
    リコール）の存在下で、無機質担体部材で処理して、該
    無機質担体部材の表面に核酸を吸着させ、さらに ｄ）水又は低イオン強度のバッファー溶液を用いて、該
    核酸の脱着を行う方法。
  2. 【請求項２】処理ｂ）及びｃ）が連続して行われること
    を特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】不溶性成分を機械的に除去するために遠心
    分離又は濾過処理を処理ａ）より前に行う、請求項１及
    び／又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】処理ａ）及びｂ）の間に一回以上の洗浄処
    理を低イオン強度のバッファー溶液を用いて、又は洗浄
    回数毎にイオン強度を上げたバッファーを用いて行う、
    請求項１〜３の少なくとも一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】処理ｃ）及びｄ）の間に一回以上の洗浄処
    理を高イオン強度のバッファー溶液を用いて行う、請求
    項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】処理ｃ）及びｄ）の間に最低一回の洗浄処
    理をアルコール水溶液を用いて行う、請求項１〜５の少
    なくとも一項に記載の方法。
  7. 【請求項７】請求項１の処理ｃ）及びｄ）の間に、1.5
    モル過塩素酸ナトリウム溶液に対応する幾分高いイオン
    強度及び相対的に低い５程度のpH値を用いて洗浄処理を
    行う、請求項１〜６の少なくとも一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】高表面電荷を持つ陰イオン交換体を使用す
    る、請求項１〜７の少なくとも一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】該核酸がPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、S
    SSR（自立配列複製）、及びリガーゼ連鎖反応に由来す
    る、請求項１〜８の少なくとも一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】該核酸が10ヌクレオチド〜200,000ヌク
    レオチドを含む、請求項１〜９の少なくとも一項に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】該核酸がバクテリア、細胞培養物、血
    液、組織、尿、ウィルス、又は他の生物原料に由来す
    る、請求項１〜10の少なくとも一項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ラベルされた核酸、より詳しく言えば、
    ビオチンラベル化核酸；フルオレセインイソチオシアネ
    ートトラベル化のような蛍光ラベル化核酸；又は放射性
    ラベル化核酸を使用する、請求項１〜11の少なくとも一
    項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】該無機質担体として、シリカゲル、ガラ
    ス、ゼオライト類、酸化アルミニウム、二酸化チタン、
    二酸化ジルコニウム、カオリン、及び／又は珪藻土を使
    用する、請求項１〜12の少なくとも一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】１〜250μｍの粒子径を持つ多孔質又は
    非多孔質のマトリックスを使用する、請求項１〜13の少
    なくとも一項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】１〜250μｍの粒子径を持つシリカゲル
    懸濁液を使用する、請求項１〜14の少なくとも一項に記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】該陰イオン交換体の粒子径が１〜250μ
    ｍであり、孔の直径が１〜2,500nmである、請求項１〜1
    5の少なくとも一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】入口開口部（７）及び出口開口部（８）
    を有する中空体（１）を設え、該中空体（１）中におい
    て固定具（5,6）の間にシリカゲルを基材とする第一の
    粉末部材（10）が配置されている核酸を単離及び精製す
    る装置であって、第二の部材（11）が第一の部材（10）
    及び出口開口部（８）の間に置かれ、第一及び第二の部
    材（10,11）が核酸に対して異なる吸着特性を有するこ
    とを特徴とする装置。
  18. 【請求項１８】該固定具（5,6）が焼結ガラス或いはセ
    ラミックス（フリット類）の多孔性枠又は、ポリエチレ
    ン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、或
    いはナイロンのようなプラスチック類の膜であることを
    特徴とする、請求項17記載の装置。
  19. 【請求項１９】該部材（10,11）が互いに直接隣接して
    おり、即ち、別々の層であって固定具（5,6）により一
    つに合わされていることを特徴とする、請求項17及び／
    又は18に記載の装置。
  20. 【請求項２０】該部材（10,11）が分離具（13）によっ
    て分離されていることを特徴とする、請求項17〜19の少
    なくとも一項に記載の装置。
  21. 【請求項２１】該分離具（13）が焼結ガラス（フリット
    類）の多孔性枠又は、好ましくはナイロン製の、プラス
    チック膜であることを特徴とする、請求項20記載の装
    置。
  22. 【請求項２２】該第二の部材（11）が、チャンネルを形
    成し中空体（１）よりも小さな横断面を持つ導出管（1
    8）中の固定具（5,15）の間に固定されていることを特
    徴とする、請求項17〜21の少なくとも一項に記載の装
    置。
  23. 【請求項２３】該第二の部材（11）が共通の手段（17）
    だけによって第一の部材（10）から分離されていること
    を特徴とする、請求項22記載の装置。
  24. 【請求項２４】該第一の部材（10）がシリカゲルを基材
    とする陰イオン交換体から成り、他方第二の部材（11）
    がシリカガラスから成ることを特徴とする、請求項17〜
    23の少なくとも一項に記載の装置。
  25. 【請求項２５】該部材類（10,11）が粉末形態及び／又
    は成形体であることを特徴とする、請求項17〜24の少な
    くとも一項に記載の装置。
  26. 【請求項２６】該部材類（10,11）の粒子が不活性プラ
    スチックのサポートネット中に埋封されている、請求項
    17〜24の少なくとも一項に記載の装置。
  27. 【請求項２７】該サポートネットがテフロンから成るこ
    とを特徴とする、請求項26記載の装置。
  28. 【請求項２８】該中空体（１）の中の、入口開口部
    （７）及び第一の部材（10）の間に機械的フィルター装
    置として機能する別の層（12）が配置されていることを
    特徴とする、請求項24〜27の少なくとも一項に記載の装
    置。
  29. 【請求項２９】該第三の層（12）が、流れの方向にフィ
    ルターポア径が小さくなるアシンメトリックフィルター
    であることを特徴とする、請求項28記載の装置。
  30. 【請求項３０】該アシンメトリックフィルターがポア径
    が小さくなる焼結ガラス又はポア径が小さくなるプラス
    チック膜の積層から成る、請求項28及び／又は29のうち
    の一つに記載の装置。
  31. 【請求項３１】核酸を含む試料から、フェノール、フェ
    ノール／クロロホルム又はクロロホルム抽出を行わず蛋
    白を除去するために、請求項17〜30の少なくとも一項に
    記載の装置を使用する請求項１〜15の少なくとも一項に
    記載の方法。
  32. 【請求項３２】１〜7Mの過塩素酸ナトリウム、１〜7Mの
    グアニジン−HCl、１〜5Mの塩化ナトリウム、１〜6Mの
    ヨウ化ナトリウム、1M塩化ナトリウム/20％エタノー
    ル、又はメタノール、エタノール、プロパノール、イソ
    プロパノール、ブタノールのような低級アルコール類及
    び／又はポリ（エチレングリコール）を含む洗浄バッフ
    ァー及び吸着バッファーを使用する請求項１〜16の少な
    くとも一項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】水及びpH値が５〜９のトリス（Tris）を
    含むバッファー系を吸着された核酸を溶出するために使
    用する請求項１〜16の少なくとも一項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】回収された核酸が、制限処理、配列決
    定、増幅、又はラベル化のような酵素反応のうち一つに
    おいて使用される請求項１〜16の少なくとも一項に記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】10〜30μｍの粒子径を持つ多孔質又は非
    多孔質のマトリックスを使用する、請求項１〜13の少な
    くとも一項に記載の方法。
  36. 【請求項３６】１〜５μｍの粒子径を持つシリカゲル懸
    濁液を使用する、請求項１〜14及び35の少なくとも一項
    に記載の方法。
  37. 【請求項３７】該陰イオン交換体の粒子径が10〜100μ
    ｍであり、孔の直径が100〜400nmである、請求項１〜15
    及び35〜36の少なくとも一項に記載の方法。
JP05509824A 1991-12-02 1992-12-01 核酸を単離する装置及び方法 Expired - Lifetime JP3115324B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4139664.2 1991-12-02
DE4139664A DE4139664A1 (de) 1991-12-02 1991-12-02 Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
PCT/EP1992/002775 WO1993011221A1 (de) 1991-12-02 1992-12-01 Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000223370A Division JP3527884B2 (ja) 1991-12-02 2000-07-25 核酸の単離及び精製方法並びにその装置

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH07501223A JPH07501223A (ja) 1995-02-09
JP3115324B2 true JP3115324B2 (ja) 2000-12-04

Family

ID=6446064

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50982393A Expired - Lifetime JP3329813B2 (ja) 1991-12-02 1992-12-01 天然原料から核酸のような細胞成分を単離する方法及び装置
JP05509824A Expired - Lifetime JP3115324B2 (ja) 1991-12-02 1992-12-01 核酸を単離する装置及び方法
JP2000223370A Expired - Lifetime JP3527884B2 (ja) 1991-12-02 2000-07-25 核酸の単離及び精製方法並びにその装置

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50982393A Expired - Lifetime JP3329813B2 (ja) 1991-12-02 1992-12-01 天然原料から核酸のような細胞成分を単離する方法及び装置

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000223370A Expired - Lifetime JP3527884B2 (ja) 1991-12-02 2000-07-25 核酸の単離及び精製方法並びにその装置

Country Status (6)

Country Link
US (3) US6277648B1 (ja)
EP (3) EP0616639B1 (ja)
JP (3) JP3329813B2 (ja)
DE (5) DE4143639C2 (ja)
DK (2) DK0616639T3 (ja)
WO (2) WO1993011218A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101760726B1 (ko) 2015-12-18 2017-07-24 대한민국 (식품의약품안전처장) 미생물 탈리 및 페놀-클로로포름을 이용한 동물성 식품으로부터 메타게놈 dna의 분리방법

Families Citing this family (210)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4143639C2 (de) 1991-12-02 2002-10-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
DE4321904B4 (de) * 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
GB9314249D0 (en) * 1993-07-09 1993-08-18 Proofname Ltd Purification method and apparatus
JP3696238B2 (ja) * 1993-08-30 2005-09-14 プロメガ・コーポレイシヨン 核酸精製用組成物及び方法
WO1995018851A1 (de) * 1994-01-07 1995-07-13 Qiagen Gmbh Verfahren zum zerkleinern von hochmolekularen strukturen
DE59506355D1 (de) * 1994-02-07 1999-08-12 Qiagen Gmbh Chromatographische isolierung von nucleinsäuren
US5747663A (en) * 1994-02-07 1998-05-05 Qiagen Gmbh Process for the depletion or removal of endotoxins
US5990301A (en) * 1994-02-07 1999-11-23 Qiagen Gmbh Process for the separation and purification of nucleic acids from biological sources
DE4432654C2 (de) * 1994-09-14 1998-03-26 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus natürlichen Quellen
DE59511013D1 (de) 1994-02-11 2005-09-22 Qiagen Gmbh Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen
DE4422040A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von PCR-Produkten
DE4422044A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
DE4420732A1 (de) 1994-06-15 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe
DE4420900A1 (de) 1994-06-15 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur mehrmaligen Entnahme von Flüssigkeiten
US5834303A (en) * 1994-11-04 1998-11-10 Tomy Seiko Co., Ltd. Method and device for extraction and purification of DNA
US5660984A (en) * 1994-12-09 1997-08-26 Davis; Thomas E. DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof
US5472600A (en) * 1995-02-01 1995-12-05 Minnesota Mining And Manufacturing Company Gradient density filter
DE19512369A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
WO1997003348A1 (en) * 1995-07-13 1997-01-30 Immunological Associates Of Denver Self-contained device integrating nucleic acid extraction, amplification and detection
US5783686A (en) * 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
DE19610354C1 (de) * 1996-03-15 1997-11-20 Innova Gmbh Vorrichtung, Verfahren und Einrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
EP0814156B1 (en) * 1996-06-18 2003-03-05 The Institute Of Physical & Chemical Research Method for the purification of DNA
US7026468B2 (en) * 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
DE19731670C2 (de) * 1997-07-23 2000-06-29 Dorothea Waschk Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben
US6495195B2 (en) 1997-02-14 2002-12-17 Arcturus Engineering, Inc. Broadband absorbing film for laser capture microdissection
FR2761373B1 (fr) * 1997-03-28 1999-05-28 Univ Angers Procede et kit pour l'extraction d'acides nucleiques d'un echantillon biologique complexe
AU745185B2 (en) * 1997-06-25 2002-03-14 Promega Corporation Method of isolating RNA
JP2002511147A (ja) * 1997-06-27 2002-04-09 ライフ テクノロジーズ インク． 生体分子の濃縮および精製のための一工程装置および方法
US7075640B2 (en) * 1997-10-01 2006-07-11 Arcturus Bioscience, Inc. Consumable for laser capture microdissection
JP4025399B2 (ja) * 1997-10-28 2007-12-19 株式会社日立製作所 核酸の回収方法及び装置
US7473401B1 (en) * 1997-12-04 2009-01-06 Mds Analytical Technologies (Us) Inc. Fluidic extraction of microdissected samples
US6844158B1 (en) * 1997-12-22 2005-01-18 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
CA2319775C (en) * 1998-02-02 2009-05-05 Gentra Systems, Inc. Compositions and methods for using a lysing matrix for isolating dna
EP1053353A1 (en) * 1998-02-02 2000-11-22 Gentra Systems Inc. Eluting reagents, methods and kits for isolating dna
ATE308383T1 (de) * 1998-02-27 2005-11-15 Pall Corp Vorrichtungen zur probevorbereitung
DE29803712U1 (de) 1998-03-04 1998-04-23 Macherey, Nagel GmbH & Co. Handelsgesellschaft, 52355 Düren Vorrichtung zur Behandlung von Biomolekülen
JPH11266864A (ja) * 1998-03-19 1999-10-05 Hitachi Ltd 核酸の精製方法および精製用装置
CN1299413A (zh) * 1998-04-02 2001-06-13 李璟日 玻璃微纤维柱及用其制备和纯化质粒dna的方法
US6177009B1 (en) 1998-04-03 2001-01-23 Macherey, Nagel Gmbh & Co. Apparatus for treating biomolecules
US7078224B1 (en) 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
US6268492B1 (en) 1998-08-10 2001-07-31 Chiron Corporation Methods for purifying non-chromosomal nucleic acid molecules from cells
JP2000166556A (ja) * 1998-12-10 2000-06-20 Hitachi Ltd 核酸の回収方法及び装置
DE19856064C2 (de) 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
US6951762B2 (en) * 1998-12-23 2005-10-04 Zuk Jr Peter Apparatus comprising a disposable device and reusable instrument for synthesizing chemical compounds, and for testing chemical compounds for solubility
DE19900681B4 (de) * 1999-01-04 2007-04-12 Sartorius Ag Verwendung von Anionaustauschermembranen zur Entfernung von Endotoxinen aus Nukleinsäure-haltigen Lösungen
WO2000044928A2 (en) * 1999-01-27 2000-08-03 Halaka Folim G Materials and methods for the purification of polyelectrolytes
DE19903507A1 (de) 1999-01-29 2000-08-10 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung endotoxinfreier oder an Endotoxin abgereicherter Nukleinsäuren und deren Verwendung
US6528248B2 (en) 1999-04-29 2003-03-04 Arcturus Engineering, Inc. Processing technology for LCM samples
DE19937187A1 (de) 1999-08-06 2001-03-01 Qiagen Gmbh Automatisierte Proteinreinigung im Multiwellformat durch Vakuumfiltration
US20080260593A1 (en) * 2000-03-22 2008-10-23 Dewalch Norman Binz Method and apparatus for processing substances in a single container
EP1272628A2 (en) * 2000-04-11 2003-01-08 Alex M. Garvin Method of nucleic acid recovery
US6759233B2 (en) * 2000-04-13 2004-07-06 Millipore Corporation Method of plasmid recovery and apparatus for doing so
WO2001081892A2 (en) 2000-04-26 2001-11-01 Arcturus Engineering, Inc. Laser capture microdissection (lcm) extraction device and device carrier and method for post-lcm fluid processing
JP2001333763A (ja) * 2000-05-30 2001-12-04 Hitachi Koki Co Ltd 自動分離抽出装置及びその抽出方法
NZ523831A (en) * 2000-07-13 2005-10-28 Invitrogen Corp Methods and compositions for rapid protein and peptide extraction and isolation using a lysis matrix
WO2002014560A1 (en) * 2000-08-16 2002-02-21 Whatman, Inc. Transfusion medicine leukodepletion filter devices as a source of genetic material for genotyping studies
AU2001281000A1 (en) * 2000-08-24 2002-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-through system for lysate clarification and nucleic acid binding in a single step
CA2428532C (en) * 2000-11-13 2009-05-19 Promega Corporation Lysate clearance and nucleic acid isolation using silanized silica matrices
US20020127587A1 (en) * 2001-02-13 2002-09-12 Domenica Simms Methods and compositions for isolation of biological macromolecules
JP2002345465A (ja) * 2001-05-24 2002-12-03 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸精製ユニット及び核酸精製方法
US6869532B2 (en) * 2001-06-04 2005-03-22 Cuno Incorporated Nucleic acid binding matrix
US7229595B2 (en) 2001-06-15 2007-06-12 Molecular Devices Corporation Filtration column devices and methods of filtering therewith
US7556733B2 (en) 2001-06-15 2009-07-07 Mds Analytical Technologies (Us) Inc. Low volume filtration column devices and methods of filtering therewith
US7749388B2 (en) 2001-06-15 2010-07-06 Life Technologies Corporation Low volume filtration column devices and methods of filtering therewith
CN100487116C (zh) * 2001-07-09 2009-05-13 旭化成株式会社 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法
SE0102922D0 (sv) * 2001-08-31 2001-08-31 Astrazeneca Ab Method and apparatus for sample preparation
KR100816528B1 (ko) * 2001-09-14 2008-04-10 (주)바이오니아 핵산 분리 정제용 다중층 필터
JP2002191351A (ja) * 2001-10-19 2002-07-09 Hitachi Ltd 核酸の精製用装置および核酸捕捉用チップ
US20030087293A1 (en) * 2001-10-23 2003-05-08 Decode Genetics Ehf. Nucleic acid isolation method and apparatus for performing same
AU2002359522A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Applera Corporation Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
WO2003070898A2 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
DE10207170A1 (de) 2002-02-20 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Grobklärung von Zellaufschlüssen aus Mikroorganismen
US7214348B2 (en) * 2002-07-26 2007-05-08 Applera Corporation Microfluidic size-exclusion devices, systems, and methods
AU2003265289A1 (en) * 2002-07-26 2004-02-16 Applera Corporation Microfluidic size-exclusion devices, systems, and methods
DE10238630A1 (de) * 2002-08-19 2004-03-04 Macherey, Nagel Gmbh & Co. Handelsgesellschaft Verfahren zur Isolierung biologischer Makromoleküle sowie Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens
CA2498518A1 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Valentis, Inc. Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids
JP3644641B2 (ja) * 2003-03-07 2005-05-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法
US8501402B2 (en) 2003-03-24 2013-08-06 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Methods and devices for producing biomolecules
EP1462519A1 (en) * 2003-03-24 2004-09-29 Boehringer Ingelheim Austria GmbH Method and devices for producing biomolecules
CN1813059A (zh) * 2003-05-02 2006-08-02 西格玛-奥尔德利希公司 固相细胞裂解和捕获平台
US20040241656A1 (en) * 2003-05-29 2004-12-02 Ming-Shiung Jan High-performance bio-tube for purifying DNA and method thereof
EP1631668A1 (en) * 2003-06-06 2006-03-08 Applera Corporation Purification device for ribonucleic acid in large volumes, and method
US20050032097A1 (en) * 2003-06-17 2005-02-10 Garvin Alex M. Method for processing samples containing sperm and non-sperm cells for subsequent analysis of the sperm DNA
US8377715B2 (en) * 2003-07-14 2013-02-19 Phynexus, Inc. Method and device for sample preparation
GB0317044D0 (en) * 2003-07-21 2003-08-27 Dna Res Innovations Ltd Nucleic acid isolation
US20050042660A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-24 Hall Gerald Edward Devices and methods for isolating RNA
EP1660631B1 (en) * 2003-08-01 2013-04-24 Life Technologies Corporation Compositions and methods for purifying short rna molecules
US7031802B2 (en) * 2003-08-13 2006-04-18 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Semi-autonomous operation of a robotic device
US20070161491A1 (en) * 2003-09-30 2007-07-12 Kabushiki Kaisha Kitazato Supply Centrifuging settling tube and organic cell collection tube
EP1526176A3 (en) * 2003-10-24 2005-05-11 Agilent Technologies Inc. (a Delaware Corporation) Devices and methods for isolating RNA
EP1529840A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-11 Qiagen GmbH A rapid and low cost method for isolating nucleic acid
JP4076978B2 (ja) * 2003-11-20 2008-04-16 ミリポア・コーポレイション プラスミドｄｎａ清浄化
US7846333B2 (en) 2003-11-24 2010-12-07 Effendorf AG Porous media
US7897378B2 (en) 2004-03-18 2011-03-01 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids
JP4080462B2 (ja) * 2004-07-09 2008-04-23 株式会社日立製作所 核酸の回収方法
DE102004034433A1 (de) 2004-07-15 2006-02-02 Qiagen Gmbh Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren unter Verwendung kationischer Detergentien
DE102004034474A1 (de) * 2004-07-15 2006-02-16 Qiagen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur effizienteren Isolierung von Nukleinsäuren
US20060099605A1 (en) * 2004-11-11 2006-05-11 Hall Gerald E Jr Devices and methods for isolating RNA
WO2006026248A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-09 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations
JP4810164B2 (ja) * 2004-09-03 2011-11-09 富士フイルム株式会社 核酸分離精製方法
US20060057738A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-16 Hall Gerald E Jr Device, method, system and kit, for collecting components from a biological sample
US20060223071A1 (en) * 2005-04-01 2006-10-05 Wisniewski Michele E Methods, compositions, and kits for detecting nucleic acids in a single vessel
US20060270843A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods for isolation of nucleic acids
US20060269929A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods and kits for DNA purification on polymeric membranes at low ionic strength
KR100673393B1 (ko) 2005-06-10 2007-01-24 (주)진올바이오테크놀러지 디옥시리보 핵산 분리 이중 필터
EP1767274B1 (en) 2005-09-26 2015-09-09 QIAGEN GmbH Method for processing a fluid
EP2295982B1 (en) 2005-09-26 2018-09-05 QIAGEN GmbH Apparatus for processing biological material
DE102005051645B4 (de) * 2005-10-26 2018-10-18 Rapid Sampling Technologies Ag Einrichtung zur Fraktionierung von mit Partikeln beladenen Flüssigkeiten
JP4699868B2 (ja) * 2005-11-04 2011-06-15 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸精製方法及び核酸精製器具
DE102005053463A1 (de) * 2005-11-06 2007-05-10 Aj Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus beliebigen komplexen Ausgangsmaterialien
ES2433251T5 (es) 2005-11-14 2020-03-13 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Anticuerpos antagonistas dirigidos contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina y procedimientos que utilizan los mismos
US8030034B2 (en) 2005-12-09 2011-10-04 Promega Corporation Nucleic acid purification with a binding matrix
US7666686B2 (en) * 2006-05-15 2010-02-23 United Chemical Technologies, Inc. Method for sample preparation by solid phase extraction
US20080113357A1 (en) * 2006-06-29 2008-05-15 Millipore Corporation Filter device for the isolation of a nucleic acid
US7858363B2 (en) * 2006-07-22 2010-12-28 Zymo Research Corporation Plasmid DNA isolation
GB2445442A (en) 2006-09-26 2008-07-09 Ge Healthcare Bio Sciences Nucleic acid purification using anion exchange
GB2443505B (en) 2006-09-26 2008-12-31 Ge Healthcare Bio Sciences Nucleic acid purification method
GB2445441B (en) 2006-09-26 2010-06-30 Ge Healthcare Bio Sciences Nucleic acid purification method
WO2008045505A2 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Xenomics, Inc. Compositions, methods and kits for isolating nucleic acids from body fluids using anion exchange media
US20080121591A1 (en) * 2006-11-29 2008-05-29 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device for nucleic acid preparation
DE102007013099A1 (de) 2007-03-14 2008-09-18 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's
JP5680405B2 (ja) * 2007-05-08 2015-03-04 アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ポリアミドチューブを使用した試料調製装置および方法
US20080300397A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Ge Healthcare Uk Limited Modified spin column for simple and rapid plasmid dna extraction
WO2009009113A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Program For Appropriate Technology In Health (Path) Disposable sample processing unit
US20090048438A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Taigen Bioscience Corporation. Method for washing a column and method for extracting membrane-bound target molecules
TW200907066A (en) * 2007-08-13 2009-02-16 Taigen Bioscience Corp Method for washing a column and method for extracting membrane-bound target molecules
JP4097687B2 (ja) * 2007-09-21 2008-06-11 株式会社日立製作所 核酸の回収方法
US8357296B2 (en) 2007-09-24 2013-01-22 Emd Millipore Corporation Centrifugal filter
DE602008001350D1 (de) 2007-10-31 2010-07-08 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren
US7759112B2 (en) * 2007-10-31 2010-07-20 Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids
WO2009100172A1 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Isolation of dna, rna and protein from a single sample
EP2087934A1 (de) 2008-02-07 2009-08-12 Qiagen GmbH Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Prozessierung einer Probe
EP2088196A1 (en) 2008-02-08 2009-08-12 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Methods and devices for producing biomolecules
DE102008009920A1 (de) 2008-02-15 2009-08-20 Aj Innuscreen Gmbh Mobiles Gerät für die Nukleinsäureisolierung
EP2163239A1 (de) 2008-05-27 2010-03-17 Qiagen GmbH Produkte, die Biopartikel enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung
EP2128169A1 (de) 2008-05-30 2009-12-02 Qiagen GmbH Verfahren zur Isolierung von kurzkettigen Nukleinsäuren
KR101005924B1 (ko) 2008-06-27 2011-01-06 포항공과대학교 산학협력단 핵산 추출 장치
CN103657145A (zh) * 2008-08-01 2014-03-26 生物风险公司 用于物质的纯化、分离、脱盐或缓冲液/溶剂交换的装置和方法
EP2163621A1 (de) * 2008-09-03 2010-03-17 Qiagen GmbH Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Nukleinsäuren
DE102008047790A1 (de) * 2008-09-17 2010-04-15 Qiagen Gmbh Verfahren zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe
DE102008055120A1 (de) 2008-12-23 2010-07-01 Qiagen Gmbh Präparation und Amplifikation von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel
WO2010076013A1 (de) 2008-12-30 2010-07-08 Qiagen Gmbh Verfahren zum nachweis methicillin-resistenter staphylococcus aureus (mrsa)-stämme
WO2010111265A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 University Of Chicago Slip chip device and methods
US9447461B2 (en) 2009-03-24 2016-09-20 California Institute Of Technology Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes
US10196700B2 (en) 2009-03-24 2019-02-05 University Of Chicago Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes
US9464319B2 (en) 2009-03-24 2016-10-11 California Institute Of Technology Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
US8222397B2 (en) 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
US20110146418A1 (en) * 2009-10-02 2011-06-23 Brevnov Maxim G Sample Preparation Devices and Methods
WO2011124708A1 (en) * 2010-04-08 2011-10-13 Qiagen Gmbh Method for precipitating anionic surfactant ions in the presence of nucleic acids
EP2395082A1 (en) * 2010-06-14 2011-12-14 QIAGEN GmbH Extraction of nucleic acids from wax-embedded samples
JP6052384B2 (ja) * 2010-07-07 2016-12-27 ソニー株式会社 核酸濃縮回収用カートリッジ、核酸濃縮回収方法、及び該カートリッジの製造方法
JP6161205B2 (ja) * 2010-07-14 2017-07-12 キアゲン ゲーエムベーハー 生体分子の単離および／または精製のためのデバイス
DE102010031404A1 (de) 2010-07-15 2012-01-19 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur schnellen Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben
DE102010031401A1 (de) 2010-07-15 2012-01-19 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Viren sowie Zellen und zur nachfolgenden Nukleinsäureisolierung
WO2012044991A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Phynexus, Inc. Purification of nucleic acids
GB201020095D0 (en) 2010-11-26 2011-01-12 Invitrogen Dynal As Nucleic acid preparation method
US8808552B2 (en) * 2010-12-16 2014-08-19 Zenpure (Hangzhou) Co., Ltd. Stackable filter cup apparatus and method
MX338703B (es) 2011-03-09 2016-04-28 3M Innovative Properties Co Aparato y metodo para procesar una muestra.
KR101193765B1 (ko) * 2011-05-16 2012-10-24 (주)나노헬릭스 초고속 핵산의 정제방법
CN102250876B (zh) 2011-05-18 2014-08-13 李学敬 从生物材料中分离纯化rna的方法
EP2729570B1 (en) 2011-07-04 2017-11-22 Qiagen GmbH Reagent usable for the isolation and/or purification of nucleic acids
US9304070B2 (en) * 2011-07-13 2016-04-05 Emd Millipore Corporation All-in-one sample preparation device and method
DE102011080853B4 (de) 2011-08-11 2014-03-27 Axagarius Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Isolierung von RNA aus Volblutproben
WO2013029691A2 (en) 2011-09-04 2013-03-07 Agilent Technologies, Inc. Debris filter for fluidic measurement with recess size decreasing in fluid flow direction
US9084994B2 (en) * 2011-09-09 2015-07-21 Orochem Technologies, Inc. Apparatus and method for parallel collection and analysis of the proteome and complex compositions
US20130122496A1 (en) * 2011-09-30 2013-05-16 Blood Cell Storage, Inc. Storage of nucleic acid
US9855559B2 (en) * 2011-12-30 2018-01-02 Abbott Molecular Inc. Microorganism nucleic acid purification from host samples
JP2015514561A (ja) * 2012-02-03 2015-05-21 マイクロソニック システムズ インク．Ｍｉｃｒｏｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． 超音波を用いた流体サンプルの処理の自動化のための装置
US9933343B2 (en) * 2012-03-14 2018-04-03 Chromologic Llc Integrated membrane for preservation of biomolecules
US10717022B2 (en) 2012-03-14 2020-07-21 Chromologic Llc Integrated membrane device
US20130264286A1 (en) * 2012-04-06 2013-10-10 Cells Scientific Corporation Biological sample filtering system and method for filtering biological samples
US9428787B2 (en) 2012-06-05 2016-08-30 3M Innovative Properties Company Apparatus and method for processing a sample
US9700887B2 (en) 2012-06-05 2017-07-11 3M Innovative Properties Company Multiwell plate
DE102013209718B4 (de) * 2012-06-22 2015-09-10 Human Med Ag Vorrichtung zum Separieren von adulten Stammzellen
US9677981B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 3M Innovative Properties Company Sample concentrator and method of use
USD717468S1 (en) 2013-06-24 2014-11-11 Bioptic, Inc. Microwell strip
WO2015032464A2 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Merck Patent Gmbh Filter device for filtering complex fluid samples
ES2707506T3 (es) * 2014-03-21 2019-04-03 Biotage Ab Procedimiento y aparato para el equilibrado de una columna de cromatografía empaquetada
EP3133159B1 (en) 2014-04-18 2019-07-17 Toppan Printing Co., Ltd. Method for recovering short-chain nucleic acids
WO2016186737A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Speware Corporation Sample extraction apparatus with micro elution bed design
US9976993B2 (en) * 2014-05-20 2018-05-22 Tecan Sp, Inc. Sample extraction apparatus with micro elution bed design
CN106662571B (zh) * 2014-05-20 2020-04-07 帝肯样品制备股份有限公司 具有微洗脱床设计的样品提取装置
JP6444615B2 (ja) * 2014-05-20 2018-12-26 株式会社ビケンバイオミクス 分離容器およびウイルスの濃縮・精製方法
CN106536056B (zh) * 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
CA2953755C (en) * 2014-07-03 2022-05-03 Abionic Sa Capsule for rapid molecular quantification of a fluid sample such as whole blood
DE102014216016A1 (de) * 2014-08-13 2016-02-18 Axagarius Gmbh & Co. Kg Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
JP6247657B2 (ja) * 2015-04-06 2017-12-13 株式会社メニコン 重合性不飽和モノマーの精製方法及び精製装置
DE102015216558A1 (de) 2015-04-23 2016-10-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur schnellen isolierung von nukleinsäuren mittels rauer oberflächen
US10851368B2 (en) * 2015-04-23 2020-12-01 Aj Innuscreen Gmbh Device and process for automated extraction of nucleic acids
DE102015211394B4 (de) 2015-06-19 2022-07-28 Ist Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren
DE102015211393A1 (de) 2015-06-19 2016-12-22 Aj Innuscreen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren
US10578606B2 (en) 2015-09-01 2020-03-03 Becton, Dickinson And Company Depth filtration device for separating specimen phases
WO2017037480A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 Mccormack Brian James Stool collection device and stool sampling device
EP3372669B1 (en) * 2015-11-03 2020-10-14 Jointechcell, Limited Liability Company (JTC LLC) Device for isolating cell fractions from human and animal tissues and method for the use thereof
RU2620304C2 (ru) * 2015-11-03 2017-05-24 Общество с ограниченной ответственностью "ДжоинТекСэлл" Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения
US20180135040A1 (en) 2016-02-16 2018-05-17 Life Magnetics, Inc. Methods for separating nucleic acids with graphene coated magnetic beads
RU173796U1 (ru) * 2017-03-02 2017-09-11 Общество с ограниченной ответственностью "ДжоинТекСэлл" Устройство для фракционирования жировой ткани и выделения из нее стромально-васкулярной фракции для применения в регенеративной медицине
WO2018165635A1 (en) * 2017-03-10 2018-09-13 Hitachi Chemical Co., Ltd. Filtering device, capturing device, and uses thereof
DE102017204267B4 (de) 2017-03-14 2021-05-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen
KR102136695B1 (ko) * 2018-08-22 2020-07-22 주식회사 인퓨전텍 현장 진단용 장치를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출 방법
WO2020090900A1 (ja) * 2018-10-31 2020-05-07 東レ株式会社 核酸回収用カラム
GB2584562B (en) * 2019-02-15 2021-07-21 Revolugen Ltd Purification method
GB2581489B (en) * 2019-02-15 2021-02-24 Revolugen Ltd Purification method
US11618917B2 (en) * 2019-07-19 2023-04-04 Pathogendx, Inc. Methods for microbial DNA analysis
DK3906982T3 (da) 2020-05-08 2022-04-25 Axagarius Gmbh & Co Kg Fremgangsmåde til plasmidrengøring under samtidig reduktion af endotoksiner
US20220059194A1 (en) * 2020-08-24 2022-02-24 FluoroMe, Inc., 3d pharmacophore model for the rapid computational screening of sars-cov-2 modulators and compositions and methods thereof
DE102021130283B4 (de) 2021-11-19 2024-03-21 Ist Innuscreen Gmbh Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren
CN115508475B (zh) * 2022-11-01 2024-08-16 未名环境分子诊断(广东)有限公司 一种污水中地芬诺酯含量检测方法

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US956832A (en) 1909-01-12 1910-05-03 Theobald Friedrich Seitz Filter.
US2114748A (en) * 1934-05-09 1938-04-19 Firm Jenaer Glaswerk Schott & Method of making porous filter bodies of particles of glass
DE1260470B (de) * 1962-07-24 1968-02-08 Roussy Inst Gustave Verfahren zur Gewinnung hochpolymerer Desoxyribonucleinsaeure
US3433782A (en) * 1965-12-27 1969-03-18 Miles Lab Separation and recovery of oligonucleotides
BE757291A (fr) * 1969-10-10 1971-04-09 Smith Kline French Lab Complexe antiviral de arn et d'un polysaccharide
US3935111A (en) * 1973-04-06 1976-01-27 Bentley Laboratories, Inc. Device for removing blood microemboli
US4033881A (en) * 1975-01-06 1977-07-05 Pall Corporation Multilayer paper sheet filter cartridges
NO760938L (ja) * 1975-03-22 1976-09-23 Biotest Serum Institut Gmbh
DE2624373C2 (de) * 1976-05-31 1983-02-03 Arnold Dr. 8782 Karlstadt Seufert Verfahren zur Herstellung von steril filtriertem Kryopräzipilat mit einer Anreicherung des Faktors VIII
JPS5312900A (en) * 1976-07-23 1978-02-04 Yamasa Shoyu Co Ltd Extraction of natural ribonucleic acid
SU638599A1 (ru) * 1977-07-11 1978-12-25 Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им. М.В.Ломоносова Способ получени фракций нуклеиновых кислот
US4303530A (en) * 1977-10-26 1981-12-01 Medical Incorporated Blood filter
US4259187A (en) 1979-06-07 1981-03-31 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Intravenous fluid filter
DE3211309A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Metin Dipl.-Ing. 6100 Darmstadt Colpan Chromatographisches verfahren zur isolierung von makromolekuelen
US4431545A (en) 1982-05-07 1984-02-14 Pall Corporation Microporous filter system and process
US4734192A (en) * 1982-07-01 1988-03-29 Millipore Corporation Multiwell membrane filtration apparatus
DE3308932A1 (de) * 1983-03-12 1984-09-13 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur abtrennung von ribonukleinsaeuren aus einer loesung, die desoxyribonukleinsaeuren enthaelt
US4643981A (en) 1983-11-09 1987-02-17 Akzo N.V. Pressure filtration system
GB8604497D0 (en) * 1986-02-24 1986-04-03 Connaught Lab Separation of islets of langerhans
GB8613476D0 (en) * 1986-06-04 1986-07-09 London Hospital Med Coll Method of sequencing nucleic acids
US4678545A (en) 1986-06-12 1987-07-07 Galik George M Printed circuit board fine line plating
US4828705A (en) * 1986-10-31 1989-05-09 Kingston Technologies, Inc. Pressure-dependent anisotropic-transport membrane system
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US4935342A (en) * 1986-12-01 1990-06-19 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
US4797260A (en) * 1987-01-27 1989-01-10 V-Tech, Inc. Antibody testing system
CA1325980C (en) 1987-04-22 1994-01-11 Sho Kikyotani Apparatus for the treatment of biological samples and treatment methods using the same
DE3717211A1 (de) * 1987-05-22 1988-12-01 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur trennung und reinigung von molekuelen
DE3717209A1 (de) * 1987-05-22 1988-12-01 Diagen Inst Molekularbio Mittel zur selektiven adsorption von biopolymeren
US4925572A (en) 1987-10-20 1990-05-15 Pall Corporation Device and method for depletion of the leukocyte content of blood and blood components
US4976861A (en) * 1987-10-20 1990-12-11 Pall Corporation Method for determining the wetting characteristic of a porous medium
US4923978A (en) * 1987-12-28 1990-05-08 E. I. Du Pont De Nemours & Company Process for purifying nucleic acids
US4810381A (en) * 1987-12-28 1989-03-07 Minnesota Mining And Manufacturing Company Composite chromatographic article
US4921952A (en) * 1988-01-21 1990-05-01 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Nucleic acid isolation process
CH674713A5 (en) 1988-05-13 1990-07-13 Agrogen Stiftung Filtration device for sepg. cell components from suspension - comprises modular elements, e.g. of PTFE, each retaining filter cloth and stacked together to form a column
GB8823706D0 (en) 1988-10-10 1988-11-16 Alcan Int Ltd Microfilter device
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
IT1226210B (it) 1988-12-22 1990-12-21 Claudio Schneider Procedimento per l'estrazione e la purificazione di dna
DE3913814A1 (de) 1989-01-13 1990-07-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US4935142A (en) * 1989-06-23 1990-06-19 Memtek Corporation Apparatus for retaining variable number of sheet membrane elements and a method for the use thereof
EP0406485A1 (en) 1989-07-03 1991-01-09 NPBI Nederlands Produktielaboratorium voor Bloedtransfusieapparatuur en Infusievloeistoffen B.V. A method for the removal of leukocytes from a leukocyte-containing suspension and filter unit for use with the method
US5185127A (en) * 1989-09-21 1993-02-09 Becton, Dickinson And Company Test device including flow control means
US5009759A (en) * 1989-09-22 1991-04-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing agarose gels having variable pore sizes
NO894161L (no) * 1989-10-19 1991-04-22 Flowtech A S Foeringsvaeskesystem for vaeskestroemcytofotometer.
DE3935098C2 (de) * 1989-10-21 1995-05-24 Macherey Nagel & Co Chem Chromatographisches Trägermaterial sowie seine Verwendung in einem Verfahren zur chromatographischen Trennung von Nukleinsäuren
AU6870091A (en) * 1989-11-08 1991-06-13 Fmc Corporation Combined centrifuge tube and porous selection means for separation and recovery of biological materials
US4997932A (en) * 1989-11-13 1991-03-05 Boehringer Mannheim Corporation Method and kit for purifying nucleic acids
JP2978518B2 (ja) * 1989-12-06 1999-11-15 東ソー株式会社 ファージｄｎａの精製方法
US5221483A (en) * 1990-06-29 1993-06-22 Coulter Corporation Process and apparatus for removal of DNA, viruses and endotoxins
US5076933A (en) * 1990-06-29 1991-12-31 Coulter Corporation Process and apparatus for removal of dna and viruses
JPH04100505A (ja) * 1990-08-20 1992-04-02 Toto Ltd セラミックフィルタの製造方法
US5256294A (en) * 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
EP0502213B1 (en) * 1990-09-25 2003-03-19 Asahi Medical Co., Ltd. A method for removing leukocytes and a filter system for removing the same
US5135627A (en) * 1990-10-15 1992-08-04 Soane Technologies, Inc. Mosaic microcolumns, slabs, and separation media for electrophoresis and chromatography
DE4034036C2 (de) 1990-10-26 1994-03-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen
US5187083A (en) * 1990-11-13 1993-02-16 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
US5078853A (en) * 1991-03-22 1992-01-07 Assay Technology, Inc. Segmented electrophoretic separation system useful for lipid profiling
US5466781A (en) * 1991-05-24 1995-11-14 Chiron Therapeutics Process for purifying bacterially produced M-CSF
DE4143639C2 (de) 1991-12-02 2002-10-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
DE69324716T2 (de) * 1992-02-13 1999-09-09 Becton Dickinson And Co. Celithydrat und Reinigung von DNS
EP0561379B1 (en) * 1992-03-17 1998-07-08 ASAHI MEDICAL Co., Ltd. Filter medium having a limited surface negative charge for treating a blood material
US5427664A (en) * 1993-07-22 1995-06-27 Stoev; Stoyan V. Free solution electrophoresis-membrane filters trapping assay apparatus and method
US5578459A (en) * 1993-11-24 1996-11-26 Abbott Laboratories Method and apparatus for collecting a cell sample from a liquid specimen
US5660984A (en) * 1994-12-09 1997-08-26 Davis; Thomas E. DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101760726B1 (ko) 2015-12-18 2017-07-24 대한민국 (식품의약품안전처장) 미생물 탈리 및 페놀-클로로포름을 이용한 동물성 식품으로부터 메타게놈 dna의 분리방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO1993011218A1 (de) 1993-06-10
JP3527884B2 (ja) 2004-05-17
US8247545B1 (en) 2012-08-21
US6277648B1 (en) 2001-08-21
US6609618B2 (en) 2003-08-26
EP0875271B1 (de) 2004-04-21
DE4139664A1 (de) 1993-06-03
EP0616639A1 (de) 1994-09-28
EP0616639B1 (de) 1998-11-04
DE4143639C2 (de) 2002-10-24
JP3329813B2 (ja) 2002-09-30
US20010047966A1 (en) 2001-12-06
WO1993011221A1 (de) 1993-06-10
DE59209549D1 (de) 1998-12-10
DE59205979D1 (de) 1996-05-15
EP0875271A3 (de) 2001-04-25
DK0616639T3 (da) 1999-07-19
JPH07501222A (ja) 1995-02-09
DE59209997D1 (de) 2004-05-27
EP0875271A2 (de) 1998-11-04
JPH07501223A (ja) 1995-02-09
EP0616638B1 (de) 1996-04-10
EP0616638A1 (de) 1994-09-28
DK0875271T3 (da) 2004-08-09
JP2001095572A (ja) 2001-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3115324B2 (ja) 核酸を単離する装置及び方法
US9624252B2 (en) Selective nucleic acid fragment recovery
US5804684A (en) Method for isolating nucleic acids
US5438128A (en) Method for rapid purifiction of nucleic acids using layered ion-exchange membranes
CA1339772C (en) Method for separating long-chain nucleic acid
US6821757B2 (en) Rapid and simple process for isolation of circular nucleic acids
US5660984A (en) DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof
JP4334012B2 (ja) 核酸精製の方法および装置
AU778440B2 (en) Sample processing device
JP2002187897A (ja) 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法
JPH08501321A (ja) クロマトグラフィーによる核酸混合物の精製分離法
PT988307E (pt) Isolamento de acidos nucleicos em fase solida
EP2137309B1 (en) Methods for the separation of biological molecules using sulfolane
EP1141234A1 (en) Methods and compositions for isolation of nucleic acid molecules
EP0991456B1 (en) One step device and process for concentration and purification of biological molecules
AU2002225942B2 (en) Lysate clearance and nucleic acid isolation using silanized silica matrices
US5834303A (en) Method and device for extraction and purification of DNA
CN1299413A (zh) 玻璃微纤维柱及用其制备和纯化质粒dna的方法
US6800752B2 (en) Chromatography material and a method using the same
US20080146789A1 (en) Methods for the separation of biological molecules using dioxolane
WO1998043724A1 (en) Isolation apparatus
CA2315257A1 (en) Method for isolating short and long-chain nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070929

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080929

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100929

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100929

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110929

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110929

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120929

Year of fee payment: 12