KR100816528B1 - 핵산 분리 정제용 다중층 필터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 시료로부터 핵산을 추출, 정제하는데 사용되는 필터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 친수성 및/또는 기공 크기가 서로 상이한 다수의 필터층이 층상 구조로 결합되어 있는 핵산 정제용 다중층 복합 필터에 대한 것이다.

핵산, 필터

Description

핵산 분리 정제용 다중층 필터{Multi-layer filter for purification of nucleic acid}

도 1은 본 발명의 트래핑 필터의 단면도이다.

도 2는 본 발명의 필터들을 사용하여 정제한 플라스미드 DNA를 전기영동한 사진이다.

도 3은 본 발명의 필터들을 사용하여 정제한 플라스미드 DNA를 전기영동한 사진이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1: 최하층 2 내지 9: 소수성 합성수지 필터층

10: 종이 필터층

본 발명은 생체 시료로부터 핵산을 추출, 정제하는데 사용되는 필터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 친수성 및/또는 기공 크기가 서로 상이한 다수의 필터층이 층상 구조로 결합되어 있는 핵산 정제용 다중층 복합 필터에 대한 것이다.

핵산이 포함된 시료에서부터 핵산을 정제하기 위해서는 물리적 및/또는 화학 적인 정제 과정을 거쳐야 한다. 일반적으로, 핵산을 정제하기 위한 과정에 있어서, 입자의 크기가 큰 고형 성분을 용액상에서 제거하는 단계가 필요한 경우가 많다.

특히, 생체 시료를 파쇄하여 핵산을 얻고자 할 경우 세포에 함유된 각종 단백질 조각 또는 염색체 DNA 침전물 등이 제거될 필요가 있는데, 일반적으로 사용되는 방법은 원심분리를 이용하여 밀도 구배를 주어 제거하거나, 필터에 의해 여과하여 제거하는 방법이 있다. 전자의 방법은 실험실에서 흔히 사용되고 있으나 대량의 시료를 처리하는 데는 부적합하고 자동화하기가 곤란하다. 반면에, 후자의 방법은 감압 또는 가압 장치가 부착된 자동화 기기에 적용시켜 대량의 시료를 연속적으로 처리하기에 적합하다.

형질전환된 대장균 또는 박테리아 세포에서 플라스미드만을 추출하는 과정에 있어서, 염색체 DNA를 분리해야 하는데, 이는 유전자 증폭, 염기서열 분석, 유전자 재조합 과정 등에서 염색체 DNA에 의해 원하지 않는 반응이 진행되는 것을 막아야 하기 때문이다.

현재까지, 대장균 또는 박테리아를 형질전환시켜 얻은 형질전환체의 배양액에서 플라스미드 DNA를 분리하는 방법으로는, 가열법(boiling method; holmes, D.S. and M. Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114:193), 알칼리 용균법(alkaline lysis method; Birnboim, H. C. 및 J. Doly, 1979, Nucleic Acids Res. 7:1513)이 흔히 알려져 있다. 또한, 고순도의 핵산을 얻기 위한 정제법으로는 페놀과 클로로포름 용액으로 추출하는 방법, 염화세슘 밀도구배 원심분리에 의해 정제하는 방법, 실리카, 규조토 또는 유리섬유에 흡착시켜 정제하는 방법, 또는 음이온 교환 칼럼에 대한 친화도 차이를 이용하여 정제하는 방법 등이 공지되어 있다.

그런데, 후자에서 언급한 순도를 높이기 위한 방법을 통해서 단백질, 염, RNA 등을 제거할 수는 있으나 크기가 상이한 DNA를 선별하여 정제하기 어려운 문제점이 있다. 따라서, 위에서 언급한 가열법 또는 알칼리 용균법을 실시하여 크기가 다른 DNA를 분류해야 한다.

가열법은 균주를 가열한 후에 급랭시킴으로써 상대적으로 크기가 큰 염색체 DNA를 침전시키서, 그리고 알칼리 용균법의 경우는 용액의 pH를 염기성에서 약산성으로 급격하게 떨어뜨림으로써 염색체 DNA를 침전시킬 수 있다. 따라서, 이러한 방식으로 침전된 성분은 화학적으로 불용성이므로 적절한 기공의 크기를 가진 필터에 의해 여과될 수 있다. 그런데, 여기에 사용되는 시약은 용액의 점도를 낮추어 주는 역할을 하는 계면활성제 성분을 포함하고 있어, 기존의 필터를 이용할 경우 필터가 장착된 용기 상에서 반응을 시키면 용액이 필터밖으로 누출되기 때문에 다른 용기에서 반응을 시킨 후 필터가 장착된 용기로 용액을 옮겨주어야 하는 문제점이 있었다.

그리고, 이 경우 옮기는 과정에서, 피펫말단에서 발생하는 전단응력 (shearing force)에 의해 염색체 DNA가 절단되어 다시 수용화됨으로써 필터에서 제거되지 아니하여, 염색체 DNA가 필터에 의해 분리되지 아니하는 경우가 많다. 따라서 염색체 DNA를 완전히 분해하기 위해서는 필터내에서 염색체 DNA가 절단되어 수용성을 띠게 되는 반응을 방지하는 기술이 요구된다.

현재까지, 핵산 함유 용액에서 핵산을 분리, 정제하기 위한 각종 수동 또는 자동화 장치가 개발되고 있으며, 이들 장치에 사용되기에 적합한 핵산 분리 정제용 필터의 개발이 이루어지고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 핵산 분리용 필터는 세포 파쇄물 용액에 함유된 고형분에 의해 필터의 기공이 조기에 폐쇄됨으로 인하여 장시간의 연속적 사용에 한계가 있고, 고속 감압 여과시에 발생하는 압력에 견딜 수 있는 기계적 강도가 미흡하였다. 또한, 계면활성제가 포함된 용액을 사용할 경우 필터층이 젖어들어 상압에서도 용액이 새는 문제가 발생하였다.

따라서, 핵산을 함유하는 생체 시료에서 핵산을 효율적으로 분리해내기 위하여는 일회에 처리할 수 있는 생체 시료의 양이 많고, 고속 감압 여과에 의해 발생하는 여과압을 견디기에 충분한 강도를 가지며, 각종 용해액을 사용하는 경우에도 용액이 새지 않는 필터가 요구되며, 자동화된 핵산 추출 정제 장치에 쉽게 장착이 가능한 형상으로 가공될 수 있는 필터의 개발이 요청되고 있다.

본 발명은 이상과 같은 물성을 충족시키는 핵산 정제용 고효율, 고선택성, 고강도 필터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 핵산 정제용 필터는 다공질 합성수지, 유리, 종이 층으로 이루어지며, 상압에서는 핵산을 함유한 세포 파쇄 용액 전체의 투과를 방지하지만 감압 여과시에는 핵산 함유 용액만을 투과시키고 세포 잔해물 및 염색체 DNA 침전물은 포집하는 트래핑 필터와 카오트로픽 염 존재하에서는 플라스미드 DNA를 흡착하고 용리 완충액을 부가하는 경우에는 플라스미드 DNA를 탈착시켜주는 바인딩 필터로 구분된다.

이하, 도면에 기재된 번호를 인용하여 본 발명의 다중층 필터의 구성을 설명한다.

본 발명의 트래핑 필터는 상압에서 세포 파쇄 용액의 투과 및 핵산의 흡착을 방지할 수 있도록, 소수성을 갖는 다공질 합성수지 또는 소수성으로 표면 처리된 다공질 유리 또는 종이필터의 조합으로 제작된다. 또한, 트래핑 필터는 특정 염을 함유한 용액으로 함침시켜 건조시킨 필터층을 추가로 더 포함한다. 트래핑 필터는 다양한 크기의 잔해물을 순차적으로 분산시켜 여과하여 일회에 여과할 수 있는 용액의 양을 극대화하기 위하여 서로 상이한 크기의 기공을 갖는 소수성 필터층이 다수 적층된 구조를 갖는다.

본 발명의 트래핑 필터의 최하층1에는 단백질, 게놈 DNA 침전물, 각종 세포 잔해물등은 투과할 수 없으나 수용성의 DNA를 포함하는 용액은 투과시킬 수 있는 필터층이 배치되며, 여기서 필터층1은 합성수지 필터층 또는 종이 필터층 또는 소수성으로 표면처리된 유리필터층 일 수 있다. 전기 필터층1 위에 소수성 합성수지 필터층2-9이 복합적으로 또는 단일하게 다층으로 누적된 필터층이 위치된다. 이러한 트래핑 필터는 상압에서는 핵산 함유 용액이 투과하는 것을 방지하며 동시에 핵산, 특히, 플라스미드 DNA는 걸러지지 않는다. 다만, 세포 용해액에 원심력이 가해지거나 필터층의 하부에서 감압 흡입하는 경우에는 핵산 함유 용액만이 필터 하부로 투과된다.

또한 중간 필터층2-9 사이에는 특정염을 함침시켜 건조시킨 필터층이 최소한 한층 포함된다. 여기서 특정염은 세포 파쇄용액에 들어 있는 용액의 점성을 낮추어 주는 물질(예를들면 SDS(sodium dodecyl sulfate), Twin20 등과 같은 계면활성제)과 반응하여 상기 물질이 침전되도록 만들어주는 염이다. 용액의 점성을 낮추어 주는 물질을 침전시킴으로써 용액이 더 이상 필터밖으로 새는 것을 막을 수 있다. 이때, 특정 염을 함침시켜 건조시킨 필터층의 바로 아래 필터층은 소수성의 필터가 위치되는 것이 바람직하며, 또한 염을 함침시켜 건조시키기 위한 필터는 염이 고르게 분포될 수 있도록 친수성의 필터를 사용하는 것이 바람직하다.

일반적으로 상층의 필터일수록 기공의 크기가 큰 것을 사용하는데, 이는 다층의 여과 구조를 갖음으로써 필터가 조기에 폐쇄되어 더 이상 여과되지 못하는 현상을 막기 위함이다. 최하층1의 필터는 최종적으로 입자를 걸러주는 역할을 하는데, 기공의 크기는 실용적인 면에서 1 내지 5㎛인 것이 바람직하고, 최상층의 필터는 입자들을 1차적으로 걸러주는 역할을 수행하며 또한 기공이 조기에 폐쇄되지 않도록 기공의 크기가 어느 정도 커야 한다.

그러나, 기공의 크기가 너무 크면 보통의 물을 가할 경우에도 상압에서 새는 경우가 발생하고, 하층 필터에 너무 큰 입자들이 걸리게 되므로 하층 필터가 조기에 폐쇄될 수 있다. 따라서 기공의 크기는 10㎛ 내지 40㎛인 것이 바람직하다.

상기한 필터를 이용하여 정제된 핵산 함유 수용액은 에탄올 첨전법, 페놀 클로로포름 추출법, 실리카, 규조토 또는 유리섬유를 이용한 흡착정제법, 음이온 교환 칼럼을 이용한 정제법, 염화세슘 밀도구배 원심분리법에 의한 정제법을 이용하 여 더욱 정제될 수 있다.

따라서, 본 발명의 트래핑 필터는 세포 배양 및 세포 용해 과정에 사용되는 용기의 하단부 재료로 사용되어, 세포 용해액을 별도의 여과 용기에 옮길 필요없이 그대로 감압 여과하여 세포 잔해물은 포집하고 핵산 함유 용액은 투과시키는 과정에 사용된다.

본 발명의 트래핑 필터의 사용으로 인하여, 세포 배양, 세포 파쇄 과정 및 여과 과정을 용기의 교체 작업없이 연속적으로 진행시킬수 있다는 점은 현재 개발중인 다양한 종류의 핵산 추출 정제 장치의 자동화에 크게 기여한다. 또한, 본 발명의 트래핑 필터는 다수의 필터층이 적층된 구조를 가지므로 고속 감압 여과시에 필터층에 가해지는 압력에 견딜 수 있고, 기공 크기나 두께가 일정한 종래의 필터에 비하여 일회에 처리할 수 있는 세포 배양액의 양이 많다는 점은 핵산 추출 정제 장치의 효율화에 기여할 수 있다.

본 발명의 트래핑 필터는 통상적으로 핵산의 분리 정제에 사용되는 원주형상의 튜브의 하단부에 장착될 수 있고, 바람직하게는 시중에서 구입 가능한 표준 멀티-웰 플레이트, 예를들면, 96(12x8)-웰 플레이트의 웰에 삽착될 수도 있으나, 밑면에 흡입구가 형성되어 있어 진공 흡입에 의한 감압 여과가 가능한 튜브나 웰에 장착되어 사용된다. 트래핑 필터 전체의 두께는 여과의 효율을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.

본 발명의 트래핑 필터의 바람직한 실시예는 종이 필터층1위에 소수성 합성수지 필터층(2내지9)들이 다층으로 누적된 형태이다. 이 때 중간에 위치되는 필터의 소수성은 크게 문제가 되지 않으나 최상층9의 필터는 소수성을 가지는 필터가 바람직한데, 이러한 소수성 필터는 상압에서 수용액이 여과되지 않게 하고 단지 감압하거나 원심분리하였을 때에만 여과되는 특성을 갖게 하기 때문이다.

이러한 필터로서는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 등과 같은 폴리올레핀계 수지 필터가 바람직하다. 종이 필터층1들의 기공의 직경은 1㎛ 내지 10㎛일 수 있으며, 바람직하게는 2㎛ 내지 5㎛이며, 0.5mm 내지 2mm의 두께를 갖는다. 소수성 합성수지 필터층(2내지9)의 기공의 직경은 5㎛ 내지 40㎛일 수 있으나, 바람직하게는 10㎛ 내지 40㎛일 수 있다.

본 발명의 트레핑 필터에 사용되는 소수성 합성수지 필터(2내지9)는 표면이 소수성인 공지의 합성수지로 제작되며, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌등과 같은 폴리올레핀계 수지로 제작되는 것이 바람직하다.

특정 염에 함침시켜 건조시킨 종이 필터층10은 공지의 종이 필터를 pH 3 내지 pH7, 바람직하게는 pH4 내지 pH6으로 완충된 NaOAc(sodium acetate) 또는 KOAc(potassium acetate) 용액에 함침시킨 후 건조시킨 종이 필터가 사용된다. 여기서 상기 종이필터는 5㎛ 내지 25㎛인 평균 직경의 기공을 갖는 필터가 사용될 수 있다. 이렇게 처리된 종이 필터층10은 배양세포의 용해시에 사용되는 계면활성제로 인하여 상압에서 핵산 함유 용액이 합성수지제 필터층을 투과하게 되는 경우라도 더 이상의 용액 투과를 막아주는 역할을 한다. 종이 필터층은 합성 수지 필터층2-9 사이에 장착되는 것이 바람직하다.

본 발명의 트래핑 필터는 핵산 분리, 정제에 있어서, 고농도의 구아니딘 염 하에서 DNA가 유리 섬유에 흡착되는 성질을 이용한, 공지의 바인딩 필터와 함께 효율적으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위가 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 트래핑 필터의 제작

기공의 평균 직경이 2㎛인 종이 필터층1위에, 기공의 평균 직경이 20㎛ 이고 두께가 1.5mm인 폴리에틸렌 필터2층을 배치하고, 그 위에 아세트산 용액(3M sodium acetate, pH 5.0, 10uL)으로 함침시키후 건조시킨 종이제 필터(Whatman paper filter no.1, 기공 크기 11㎛) 층을 배치하였다. 이들 층위에 기공의 평균 직경이 20㎛이고 두께가 1.5mm인 폴리에틸렌 필터 1층을 배치하여 트레핑 필터1을 제작하였다.

실험예 1

상기의 필터를 이용하여 형질전환 대장균 세포에서 플라스미드를 정제하는 실험을 실시하였다. TB(Terrific Broth) 배지에 약 16시간 배양한 E. coli (pBluescriptII SK(+)/ DH5α) 배양액 1 mL을 원심 분리하여 배지 성분을 제거한 용액에 50mM TrisHCl, 10mM EDTA과 100μg/ml RNase로 이루어진 현탁화액 (resuspension solution) 250㎕을 넣고 완전히 혼합하였다. 이렇게 제조된 용액을 상기 트래핑 필터1 또는 2가 하단부에 장착된 원주형 용기에 넣고 1% sodiumdodecylsulfonate와 0.2M NaOH로 이루어진 세포용해액 250㎕를 첨가하고 섞어 주었다. 이때 계면 활성제인 SDS가 첨가되어도 용액이 새지 않았다. 5분 후에 중화액(4M Guanidine hydrochloride, 0.5 KOAc pH 4.2) 350㎕를 첨가하고 섞어주었다. 상압에서는 용액이 상기 트래핑 필터1 및 2를 투과하지 아니하였으나 이들 용기의 하부를 진공 흡입하는 경우, 핵산 함유 용액은 트래핑 필터 1 및 2를 투과하였으며, 단백질, 게놈 DNA 침전물, 각종 세포 잔해물등은 투과할 수 없었다.

실험예 2

바닥 부분에 상기 실시예 1에서 제조된 필터층이 장착된 원통형태의 용기에 TB 250ul를 넣고 형질전환된 대장균 세포를 접종하고 하룻밤 배양하였다. 약 16시간의 배양 동안 배양액이 필터를 투과하여 흐르지 않았다. 따라서, 필터가 삽입된 용기상에서 직접 박테리아를 배양하여 용기의 교체작업 없이 플라스미드를 추출할 수 있음을 알 수 있었다. 이후 세포용해액을 가하는 단계부터 실험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

그 후, 왓스만사가 시판하는 종이필터(Whatman no. 1) 층위에 1.0㎛의 평균 직경의 기공을 갖는 왓스만사가 시판하는 유리 필터(whatman GF/B) 3장을 적층시켜 바인딩 필터를 제작하였다. 상기 바인딩 필터는 고농도의 구아니딘 염하에서 DNA가 유리 섬유에 흡착되는 공지의 성질을 이용한 필터이다. 이렇게 제작된 바인딩 필터를 원주형 용기의 하단부에 장착하고, 필터층위에 필터를 고정하기 위한 O-링을 장착하고 이 용기에 상기 트래핑 필터로부터 여과한 핵산 함유 용액을 넣고, 핵산 함유 용액이 담긴 상기 용기의 하부를 진공 흡입하여 핵산을 제외한 용매를 용기로부터 여과시켰다. 이들 용매가 배출된 용기에 80% ethanol, 20mM NaCl, 2mM TrisHCl pH 6.8인 세척완충액을 1ml 가하고 다시 용기의 하부를 진공 흡입하는 과 정을 수회 반복하여 바인딩 필터에 흡착된 핵산을 세척하였다. 이렇게 세척된 핵산이 담긴 용기의 하부를 약10분간 진공 흡입하여 흡착된 핵산을 건조시킨 후에 10mM TrisHCl pH 8.5인 용리 완충액 100uL를 가하고 약5분간 방치하여 핵산을 바인딩 필터로부터 탈착시키고 감압여과하여 정제된 플라스미드를 수득하였다.

이상과 같은 방법으로 정제한 핵산을 0.8% 아가로즈 겔상에 전기영동하고 Etidium Bromide 용액으로 염색하여 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 도 3은 실험예 1의 과정을 거친 결과이고, 도 4는 실험예 2의 과정을 거친 결과이다. 도 3과 도 4에 도시된 바와 같이, DNA가 고순도로 효율적으로 분리됨을 알 수 있었다. 또한, 일반적으로 DNA 용액의 순도를 알려주는 지표의 하나로서 스펙트로포토미터 (Spectrophotometer)를 이용하여 260nm 파장과 280nm 파장에서의 흡광도 비를 측정하는데, 1.8 이상일 경우 고순도로 볼 수 있는데, 본 발명의 방법으로 정제한 플라스미드 DNA가 이 조건을 만족시켰다. 또한, 자동 염기서열 분석장치(ABIPRISM 377, Perkin-Elmer Corp.)를 이용하여 염기서열을 분석했을 때 500bp 이상 읽을 수 있었다.

본 발명의 트래핑 필터는 세포 배양 및 세포 용해 과정에 사용되는 용기의 하단부 재료로 사용되어, 세포 용해 용액을 별도의 여과용 용기에 옮길 필요 없이 그대로 감압 여과하여 세포 파쇄물은 포집하고 핵산 함유 용액은 투과시키는 과정에 사용될 수 있다.

본 발명의 트래핑 필터의 사용으로 인하여, 세포 배양 및 세포 용해 과정과 여과 과정을 용기의 교체 작업없이 연속적으로 진행시킬수 있다는 점은 현재 개발 중인 다양한 종류의 핵산 추출 정제 장치의 자동화에 크게 기여하는 효과가 있다.

본 발명의 다중층 필터는 종래의 핵산 분리용 필터에 비하여 일회에 처리할 수 있는 생체 시료의 양과 핵산에 대한 선택적 흡착 능력이 우수하고, 고속 감압 여과에 견디기에 충분한 강도를 가지므로 자동화된 핵산 추출 정제 장치에 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 기공의 평균 직경이 1㎛ 내지 10㎛인 최하부 필터층 위에 기공의 평균 직경이 5㎛ 내지 40㎛인 합성수지 필터층들이 1 내지 8층으로 배치된 다중층 필터로서, 상기 최하부 필터층 위에 초산나트륨 또는 초산칼륨을 함유하는 pH 3 내지 pH 7의 완충용액에 함침시켜 건조시킨 종이 필터층을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다중층 필터.
2. 제1항에 있어서, 최하부 필터층의 기공의 평균 직경이 1㎛ 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 다중층 필터.
3. 제1항에 있어서, 최하부 필터층은 소수성 합성수지, 소수성으로 표면처리된 유리 필터 또는 종이 필터층인 것을 특징으로 하는 다중층 필터.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 합성수지 필터층이 폴리올레핀 수지로 제작된 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
5. 제4항에 있어서, 상기폴리올레핀 수지가 폴리에틸렌 수지인 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
6. 제1항에 있어서, 상기 종이 필터층은 5㎛ 내지 25㎛인 평균 직경의 기공을 갖는 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
7. 제1항에 있어서, 상기 종이 필터층이 상기 합성 수지 필터층들 사이에 추가된 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.

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