JP2003080013A - 核酸分離精製用多重層フィルター - Google Patents
核酸分離精製用多重層フィルターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高効率、高選択性、高強度の拡散分離精製用
フィルターを提供する。 【解決手段】 生体試料から核酸を分離及び精製するフ
ィルターに係り、さらに詳しくは親水性及び／又は孔径
の異なる多数のフィルター層が層状構造になっている核
酸精製用多重層複合フィルターであり、平均孔径１〜1
０μmのフィルター層(１)上に、平均孔径５〜４０μmの
合成樹脂フィルター層（２〜９）が１〜８層で配置さ
れ、好適には紙フィルター（１０）が挿入されている。
フィルターを提供する。 【解決手段】 生体試料から核酸を分離及び精製するフ
ィルターに係り、さらに詳しくは親水性及び／又は孔径
の異なる多数のフィルター層が層状構造になっている核
酸精製用多重層複合フィルターであり、平均孔径１〜1
０μmのフィルター層(１)上に、平均孔径５〜４０μmの
合成樹脂フィルター層（２〜９）が１〜８層で配置さ
れ、好適には紙フィルター（１０）が挿入されている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体試料から核酸
を分離及び精製するフィルターに係り、さらに詳しくは
親水性及び／又は孔径の異なる多数のフィルター層が層
状構造になっている核酸精製用多重層複合フィルターに
関する。
を分離及び精製するフィルターに係り、さらに詳しくは
親水性及び／又は孔径の異なる多数のフィルター層が層
状構造になっている核酸精製用多重層複合フィルターに
関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸を合有する試料から核酸を精製する
ためには、物理的及び/または化学的な精製過程を経な
ければならず、一般的にこのような過程では、粒子のサ
イズが大きい固形成分を溶液上で除去する段階が必要と
される場合が多い。特に生体試料を破砕して核酸を得よ
うとするときには、細胞に含有される各種蛋白質の断
片、または染色体ＤＮＡ沈殿物などが除去される必要が
あり、一般的に使用される方法としては、遠心分離を利
用して密度勾配によって除去する方法や、フィルターに
よって濾過して除去する方法がある。前者の方法は、実
験室でよく使用されているが、多量の試料を処理するの
には不適合であり、自動化することが困難である。一
方、後者の方法は、減圧または加圧裝置が装着された自
動化機器に適用させて多量の試料を処理するのに適合す
るものである。
ためには、物理的及び/または化学的な精製過程を経な
ければならず、一般的にこのような過程では、粒子のサ
イズが大きい固形成分を溶液上で除去する段階が必要と
される場合が多い。特に生体試料を破砕して核酸を得よ
うとするときには、細胞に含有される各種蛋白質の断
片、または染色体ＤＮＡ沈殿物などが除去される必要が
あり、一般的に使用される方法としては、遠心分離を利
用して密度勾配によって除去する方法や、フィルターに
よって濾過して除去する方法がある。前者の方法は、実
験室でよく使用されているが、多量の試料を処理するの
には不適合であり、自動化することが困難である。一
方、後者の方法は、減圧または加圧裝置が装着された自
動化機器に適用させて多量の試料を処理するのに適合す
るものである。
【０００３】形質転換させた大腸菌又はバクテリア細胞
からプラスミドだけを抽出する過程において、染色体Ｄ
ＮＡを分離すべきであるが、これは遺伝子増幅、塩基配
列分析、遺伝子再組合過程などで、染色体ＤＮＡによっ
て望ましくない反応が進められるのを防ぐ必要があるか
らである。
からプラスミドだけを抽出する過程において、染色体Ｄ
ＮＡを分離すべきであるが、これは遺伝子増幅、塩基配
列分析、遺伝子再組合過程などで、染色体ＤＮＡによっ
て望ましくない反応が進められるのを防ぐ必要があるか
らである。
【０００４】現在まで大腸菌又はバクテリアを形質転換
させて得た形質転換体の培養液からプラスミドＤＮＡを
分離する方法としては,加熱法 ( boiling method ; hol
mes,D.S. and M.Quigley,1981,Anal. Biochem. 114 : 1
93 )、アルカリ溶菌法( alkaline lysis method ; Birn
boim,H.C.及び J. Doly,1979, Nucleic Acids Res.7:1
513 )がよく知られている。また、高純度の核酸を得る
ための精製法としては、フェノールとクロロホルム溶液
で抽出する方法、塩化セシウム密度勾配遠心分理によっ
て精製する方法、シリカ、硅藻土、又はガラス繊維に吸
着させて精製する方法、または陰イオン交換カラムに対
する親和度の差を利用して精製する方法等が知られてい
る。
させて得た形質転換体の培養液からプラスミドＤＮＡを
分離する方法としては,加熱法 ( boiling method ; hol
mes,D.S. and M.Quigley,1981,Anal. Biochem. 114 : 1
93 )、アルカリ溶菌法( alkaline lysis method ; Birn
boim,H.C.及び J. Doly,1979, Nucleic Acids Res.7:1
513 )がよく知られている。また、高純度の核酸を得る
ための精製法としては、フェノールとクロロホルム溶液
で抽出する方法、塩化セシウム密度勾配遠心分理によっ
て精製する方法、シリカ、硅藻土、又はガラス繊維に吸
着させて精製する方法、または陰イオン交換カラムに対
する親和度の差を利用して精製する方法等が知られてい
る。
【０００５】しかし、後者の純度を高めるための方法で
は、蛋白質、塩、ＲＮＡなどを除去することはできる
が、大きさが相異するＤＮＡを選別して精製する事はむ
ずかしい。したがって、上述した加熱法、又はアルカリ
溶菌法を実施して大きさが相異するＤＮＡを分類すべき
である。加熱法は菌株を加熱した後に急冷させることに
より相対的に大きな染色体ＤＮＡを沈殿させることがで
き、アルカリ溶菌法は溶液のｐＨを塩基性から弱酸性ま
で急激に落とすことにより染色体ＤＮＡを沈殿させるこ
とができる。
は、蛋白質、塩、ＲＮＡなどを除去することはできる
が、大きさが相異するＤＮＡを選別して精製する事はむ
ずかしい。したがって、上述した加熱法、又はアルカリ
溶菌法を実施して大きさが相異するＤＮＡを分類すべき
である。加熱法は菌株を加熱した後に急冷させることに
より相対的に大きな染色体ＤＮＡを沈殿させることがで
き、アルカリ溶菌法は溶液のｐＨを塩基性から弱酸性ま
で急激に落とすことにより染色体ＤＮＡを沈殿させるこ
とができる。
【０００６】したがって、このような方式で沈殿された
成分は化学的に不溶性なので、適切な孔径のフィルター
によって濾過されることができる。ところで、ここに使
用される試薬は、溶液の粘度を下げるように作用する界
面活性剤の成分を含んでおり、既存のフィルタ―を利用
する場合、フィルタ―が裝着される容器上で反応させる
と、溶液がフィルタ―の外へ漏出してしまうので、他の
容器で反応をさせてから、フィルターが裝着される容器
へ溶液を移行しなければならないという問題点があっ
た。この場合の移行過程において、ピペットの先に発生
する剪断応力（shearing force）によって染色体ＤＮ
Ａが切断されて再び水溶化されるので、染色体ＤＮＡが
フィルターによって分離されない場合が多い。したがっ
て染色体ＤＮＡを完全に分離するためには、フィルタ―
内で染色体ＤＮＡが切断されて再び水溶化される現象を
防止する技術が要求される。
成分は化学的に不溶性なので、適切な孔径のフィルター
によって濾過されることができる。ところで、ここに使
用される試薬は、溶液の粘度を下げるように作用する界
面活性剤の成分を含んでおり、既存のフィルタ―を利用
する場合、フィルタ―が裝着される容器上で反応させる
と、溶液がフィルタ―の外へ漏出してしまうので、他の
容器で反応をさせてから、フィルターが裝着される容器
へ溶液を移行しなければならないという問題点があっ
た。この場合の移行過程において、ピペットの先に発生
する剪断応力（shearing force）によって染色体ＤＮ
Ａが切断されて再び水溶化されるので、染色体ＤＮＡが
フィルターによって分離されない場合が多い。したがっ
て染色体ＤＮＡを完全に分離するためには、フィルタ―
内で染色体ＤＮＡが切断されて再び水溶化される現象を
防止する技術が要求される。
【０００７】現在まで、核酸含有溶液から核酸を分離及
び精製するために、各種手動又は自動化装置が開発され
つつあり、これらの装置の使用に適した核酸分離精製用
フィルターの開発が行われている。しかし、現在まで開
発された核酸分離用フィルターは、細胞破砕物の溶液に
含有された固形分によってフィルターの気孔が早期に閉
鎖されてしまうため、長時間の連続的な使用に限界があ
り、高速減圧濾過時に発生する圧力に耐えることができ
る機械的強度が十分でなかった。また、界面活性剤が含
まれている溶液を用いた場合には、フィルター層が濡れ
てしまって常圧でも溶液が漏出する問題点が発生した。
び精製するために、各種手動又は自動化装置が開発され
つつあり、これらの装置の使用に適した核酸分離精製用
フィルターの開発が行われている。しかし、現在まで開
発された核酸分離用フィルターは、細胞破砕物の溶液に
含有された固形分によってフィルターの気孔が早期に閉
鎖されてしまうため、長時間の連続的な使用に限界があ
り、高速減圧濾過時に発生する圧力に耐えることができ
る機械的強度が十分でなかった。また、界面活性剤が含
まれている溶液を用いた場合には、フィルター層が濡れ
てしまって常圧でも溶液が漏出する問題点が発生した。
【０００８】従って、核酸を含有する生体試料から核酸
を効率的に分離させるためには、一回に多量の生体試料
を処理することができ、高速減圧濾過に耐える十分な強
度を有し、各種溶解液の処理時にも漏れないフィルター
が要求され、自動化された核酸分離精製装置に容易に装
着し得る形状に加工できるフィルターの開発が求められ
ている。
を効率的に分離させるためには、一回に多量の生体試料
を処理することができ、高速減圧濾過に耐える十分な強
度を有し、各種溶解液の処理時にも漏れないフィルター
が要求され、自動化された核酸分離精製装置に容易に装
着し得る形状に加工できるフィルターの開発が求められ
ている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上述した問題
点を解決すると共に、上記要求されている開発事項を満
足する、高効率、高選択性、高強度の核酸分離精製用フ
ィルターを提供することを目的にする。
点を解決すると共に、上記要求されている開発事項を満
足する、高効率、高選択性、高強度の核酸分離精製用フ
ィルターを提供することを目的にする。
【０００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の核酸分離精製用
多重層フィルターは、平均孔径１〜1０μmのフィルター
層(１)上に、平均孔径５〜４０μmの合成樹脂フィルタ
ー層（２〜９）が１〜８層で配置されている構成を有す
る。また、常圧では核酸を含有した細胞破砕溶液全体の
透過を防止するが、減圧濾過時には核酸含有溶液のみを
透過させ、細胞残留物及び染色体DNA沈殿物を捕集する
トラッピングフィルターと、カオトロピック塩の存在下
ではプラスミドＤＮＡを吸着し、溶離緩衝液を添加する
場合にはプラスミドＤＮＡを脱着させるバインディング
フィルターとに大別される。
多重層フィルターは、平均孔径１〜1０μmのフィルター
層(１)上に、平均孔径５〜４０μmの合成樹脂フィルタ
ー層（２〜９）が１〜８層で配置されている構成を有す
る。また、常圧では核酸を含有した細胞破砕溶液全体の
透過を防止するが、減圧濾過時には核酸含有溶液のみを
透過させ、細胞残留物及び染色体DNA沈殿物を捕集する
トラッピングフィルターと、カオトロピック塩の存在下
ではプラスミドＤＮＡを吸着し、溶離緩衝液を添加する
場合にはプラスミドＤＮＡを脱着させるバインディング
フィルターとに大別される。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照しつつ、本
発明の核酸分離精製用多重層フィルターの構成を説明す
る。
発明の核酸分離精製用多重層フィルターの構成を説明す
る。
【００１２】本発明のトラッピングフィルターは、常圧
で細胞破砕溶液の透過及び核酸の吸着を防止することが
できるように、疎水性を有する多孔質合成樹脂又は疎水
性によって表面処理された多孔質ガラス又は紙フィルタ
ーの調合で製造される。更に、トラッピングフィルター
は、特定の塩を含有している溶液で含浸させた後に乾燥
させたフィルターなどを追加で含むことができる。トラ
ッピングフィルターは、多様な大きさの残留物を逐次分
散／濾過させて一回に濾過することができる溶液の量を
著しく増大するため、孔径が互いに異なる疎水性フィル
ター層を多数積み重ねた構造を有する。
で細胞破砕溶液の透過及び核酸の吸着を防止することが
できるように、疎水性を有する多孔質合成樹脂又は疎水
性によって表面処理された多孔質ガラス又は紙フィルタ
ーの調合で製造される。更に、トラッピングフィルター
は、特定の塩を含有している溶液で含浸させた後に乾燥
させたフィルターなどを追加で含むことができる。トラ
ッピングフィルターは、多様な大きさの残留物を逐次分
散／濾過させて一回に濾過することができる溶液の量を
著しく増大するため、孔径が互いに異なる疎水性フィル
ター層を多数積み重ねた構造を有する。
【００１３】本発明のトラッピングフィルターの最下層
（１）には、蛋白質、ゲノムＤＮＡ沈殿物、各種細胞残
留物などは透過できないが、水溶性ＤＮＡを含有してい
る溶液は透過できるフィルター層が配置され、ここでフ
ィルター層（１）は合成樹脂フィルター層又は紙フィル
ター層又は疎水性によって表面処理されたガラスフィル
ター層とすることができる。また、前記フィルター層
（１）上に、疎水性合成樹脂フィルター層（２〜９）を
多層に積み重ねた構造を有する。このようなトラッピン
グフィルターは、常圧では細胞溶解液を透過させない
が、細胞溶解液に遠心力が加えられるか又はフィルター
層の下部で減圧吸入する場合には、核酸含有溶液のみを
フィルター下部に透過させる。
（１）には、蛋白質、ゲノムＤＮＡ沈殿物、各種細胞残
留物などは透過できないが、水溶性ＤＮＡを含有してい
る溶液は透過できるフィルター層が配置され、ここでフ
ィルター層（１）は合成樹脂フィルター層又は紙フィル
ター層又は疎水性によって表面処理されたガラスフィル
ター層とすることができる。また、前記フィルター層
（１）上に、疎水性合成樹脂フィルター層（２〜９）を
多層に積み重ねた構造を有する。このようなトラッピン
グフィルターは、常圧では細胞溶解液を透過させない
が、細胞溶解液に遠心力が加えられるか又はフィルター
層の下部で減圧吸入する場合には、核酸含有溶液のみを
フィルター下部に透過させる。
【００１４】また合成樹脂フィルター層（２〜９）の間
には、特定塩を含浸させた後に乾燥させたフィルター層
が少なくとも一層含まれることが望ましい。ここで特定
塩は、細胞破砕に入っている溶液の粘性を下げようとす
る物質( たどえば ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate
）、Twin20 などのような界面活性剤 )と反応して上記
の物質が沈殿されるように作用する塩である。溶液の粘
性を下げようとする物質を沈殿させて、溶液がフィルタ
ーの外へ漏れることを防ぐことができる。この時、特定
塩を含浸させた後に乾燥させたフィルター層のすぐ下の
フィルター層は、疎水性のフィルターが位置されること
が、また塩を含浸させた後に乾燥させるためのフィルタ
ーは、塩が均等に分布されることができるように親水性
のフィルターを使用するのが望ましい。
には、特定塩を含浸させた後に乾燥させたフィルター層
が少なくとも一層含まれることが望ましい。ここで特定
塩は、細胞破砕に入っている溶液の粘性を下げようとす
る物質( たどえば ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate
）、Twin20 などのような界面活性剤 )と反応して上記
の物質が沈殿されるように作用する塩である。溶液の粘
性を下げようとする物質を沈殿させて、溶液がフィルタ
ーの外へ漏れることを防ぐことができる。この時、特定
塩を含浸させた後に乾燥させたフィルター層のすぐ下の
フィルター層は、疎水性のフィルターが位置されること
が、また塩を含浸させた後に乾燥させるためのフィルタ
ーは、塩が均等に分布されることができるように親水性
のフィルターを使用するのが望ましい。
【００１５】一般的に上層のフィルターのほうが孔径が
大きいものを使用するが、これは多層の濾過構造を備え
ることにより、フィルターが早期閉鎖されて濾過されな
い現象を防ぐためである。最下層（１）のフィルターは
最終的に粒子を濾過される役割を有するが、孔径は１〜
１０μm、実用的な面で１〜５μmとすることが望まし
い。最上層のフィルターは粒子等を一次的に濾過する役
割を有し、気孔が早期閉鎖されないような役割を遂行す
るために、孔径は十分な大きさを有さなければならな
い。しかし、孔径が大きすぎると、通常の水を加えると
きも上圧で漏れる場合が発生し、下層フィルターに大き
すぎる粒子等が引っかかってしまい、下層フィルターが
早期閉鎖される可能性がある。従って、孔径は５〜４０
μm、好ましくは１０〜４０μｍとすることが望まし
い。
大きいものを使用するが、これは多層の濾過構造を備え
ることにより、フィルターが早期閉鎖されて濾過されな
い現象を防ぐためである。最下層（１）のフィルターは
最終的に粒子を濾過される役割を有するが、孔径は１〜
１０μm、実用的な面で１〜５μmとすることが望まし
い。最上層のフィルターは粒子等を一次的に濾過する役
割を有し、気孔が早期閉鎖されないような役割を遂行す
るために、孔径は十分な大きさを有さなければならな
い。しかし、孔径が大きすぎると、通常の水を加えると
きも上圧で漏れる場合が発生し、下層フィルターに大き
すぎる粒子等が引っかかってしまい、下層フィルターが
早期閉鎖される可能性がある。従って、孔径は５〜４０
μm、好ましくは１０〜４０μｍとすることが望まし
い。
【００１６】前記のフィルターを利用して精製された核
酸の含有水溶液は、エタノール沈殿法、フェノールクロ
ロホルム抽出法、シリカ、 硅藻土、又はクラス纖維を
利用する吸着精製法、陰イオン交換コラムを利用する精
製法、塩化セシウムの密度勾配遠心分理法による精製法
を利用して、更に精製することができる。
酸の含有水溶液は、エタノール沈殿法、フェノールクロ
ロホルム抽出法、シリカ、 硅藻土、又はクラス纖維を
利用する吸着精製法、陰イオン交換コラムを利用する精
製法、塩化セシウムの密度勾配遠心分理法による精製法
を利用して、更に精製することができる。
【００１７】従って、本発明のトラッピングフィルター
は、細胞培養及び細胞溶解過程で使用される容器の下端
部材料として用いることができ、細胞溶解液を別途の濾
過容器に移行せずそのまま減圧濾過することにより、細
胞残骸物を捕集し、核酸含有溶液を透過させることに用
いられる。
は、細胞培養及び細胞溶解過程で使用される容器の下端
部材料として用いることができ、細胞溶解液を別途の濾
過容器に移行せずそのまま減圧濾過することにより、細
胞残骸物を捕集し、核酸含有溶液を透過させることに用
いられる。
【００１８】本発明のトラッピングフィルターの使用に
よって、細胞培養過程、細胞破砕過程、及び濾過過程を
容器の交換作業無して連続的に遂行することができるの
で、現在開発中の多様な種類の核酸分離精製装置の自動
化に極めて有用である。また、本発明のトラッピングフ
ィルターは、多数のフィルター層が積み重なった構造を
有しているので、高速減圧濾過時にフィルター層に加え
られる圧力に耐えることができ、孔径／厚さが一定な従
来のフィルターに比べて一回に多量の細胞培養液を処理
することができる。また、細胞培養液の量を多量とする
ことができるので、核酸分離精製装置の効率化に有効で
ある。
よって、細胞培養過程、細胞破砕過程、及び濾過過程を
容器の交換作業無して連続的に遂行することができるの
で、現在開発中の多様な種類の核酸分離精製装置の自動
化に極めて有用である。また、本発明のトラッピングフ
ィルターは、多数のフィルター層が積み重なった構造を
有しているので、高速減圧濾過時にフィルター層に加え
られる圧力に耐えることができ、孔径／厚さが一定な従
来のフィルターに比べて一回に多量の細胞培養液を処理
することができる。また、細胞培養液の量を多量とする
ことができるので、核酸分離精製装置の効率化に有効で
ある。
【００１９】本発明のトラッピングフィルターは、通常
核酸の分離精製に用いられる円周形状のチューブの下端
部に装着することができ、好ましくは市場で購入可能な
標準マルチウェルプレート、例えば、９６(１２ * ８)-
ウェルプレートのウェルに挿着することができるが、底
面に吸入口が形成されているため、真空吸入による減圧
濾過が可能なチューブやウェルの内部に装着することが
できる。全体の厚さは濾過の効率を考慮して適切に調節
することができる。
核酸の分離精製に用いられる円周形状のチューブの下端
部に装着することができ、好ましくは市場で購入可能な
標準マルチウェルプレート、例えば、９６(１２ * ８)-
ウェルプレートのウェルに挿着することができるが、底
面に吸入口が形成されているため、真空吸入による減圧
濾過が可能なチューブやウェルの内部に装着することが
できる。全体の厚さは濾過の効率を考慮して適切に調節
することができる。
【００２０】本発明のトラッピングフィルターの好まし
い実施例は、紙フィルター層（１）の上に合成樹脂フィ
ルター層（２〜９）が多層に積み重なった形態である
（図１）。このとき、中間に位置するフィルターの疎水
性の有無は特に問題ではないが、最上層(９)のフィルタ
ーとしては疎水性を有するフィルターが望ましく、この
ような疎水性フィルターは、常圧では水溶液を濾過させ
ることなく、減圧又は遠心分離したときにのみ水溶液を
濾過させる特性を有するからである。かかる合成樹脂フ
ィルターとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなど
のポリオレフィン系樹脂フィルターが望ましい。 紙フ
ィルター層（１）の孔径は１〜1０μmであるが、好まし
くは２ 〜５μmで厚さ０.５〜２mmである。疎水性合成
樹脂フィルター層（２〜９）の孔径は５〜４０μmであ
るが、好ましくは１０〜４０μmである。
い実施例は、紙フィルター層（１）の上に合成樹脂フィ
ルター層（２〜９）が多層に積み重なった形態である
（図１）。このとき、中間に位置するフィルターの疎水
性の有無は特に問題ではないが、最上層(９)のフィルタ
ーとしては疎水性を有するフィルターが望ましく、この
ような疎水性フィルターは、常圧では水溶液を濾過させ
ることなく、減圧又は遠心分離したときにのみ水溶液を
濾過させる特性を有するからである。かかる合成樹脂フ
ィルターとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなど
のポリオレフィン系樹脂フィルターが望ましい。 紙フ
ィルター層（１）の孔径は１〜1０μmであるが、好まし
くは２ 〜５μmで厚さ０.５〜２mmである。疎水性合成
樹脂フィルター層（２〜９）の孔径は５〜４０μmであ
るが、好ましくは１０〜４０μmである。
【００２１】本発明のトラッピングフィルターに用いら
れる疎水性合成樹脂フィルター（２〜９）は、１〜８層
の層数で積層され、表面が疎水性である公知の合成樹脂
で製造でき、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリ
オレフィン系樹脂で製造することが望ましい。
れる疎水性合成樹脂フィルター（２〜９）は、１〜８層
の層数で積層され、表面が疎水性である公知の合成樹脂
で製造でき、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリ
オレフィン系樹脂で製造することが望ましい。
【００２２】特定の塩に含浸させた後に乾燥させた紙フ
ィルター層（１０）としては、公知の紙フィルターをｐ
Ｈ３〜ｐＨ７、好ましくてはｐＨ４〜ｐＨ６で緩衝され
たＮａＯＡｃ(sodium acetate)又はＫＯＡｃ(potassiu
m acetate)溶液に含浸させた後に乾燥させた紙フィル
ターを用いる。ここで、前記紙フィルターとしては、平
均孔径５〜２５μmのフィルターを用いることができ
る。このように処理された紙フィルター層１０は、培養
された細胞の溶解時に用いる界面活性剤により、常圧で
核酸含有溶液が合成樹脂フィルター層を透過する場合で
も、それ以上の溶液透過を防ぐ役割をする。前記紙フィ
ルター層１０は合成樹脂フィルター層２〜９の間に装着
することが望ましい。
ィルター層（１０）としては、公知の紙フィルターをｐ
Ｈ３〜ｐＨ７、好ましくてはｐＨ４〜ｐＨ６で緩衝され
たＮａＯＡｃ(sodium acetate)又はＫＯＡｃ(potassiu
m acetate)溶液に含浸させた後に乾燥させた紙フィル
ターを用いる。ここで、前記紙フィルターとしては、平
均孔径５〜２５μmのフィルターを用いることができ
る。このように処理された紙フィルター層１０は、培養
された細胞の溶解時に用いる界面活性剤により、常圧で
核酸含有溶液が合成樹脂フィルター層を透過する場合で
も、それ以上の溶液透過を防ぐ役割をする。前記紙フィ
ルター層１０は合成樹脂フィルター層２〜９の間に装着
することが望ましい。
【００２３】本発明のトラッピングフィルターは、核酸
分離と精製において、高濃度のグアニジン塩下でＤＮＡ
がガラス纖維に吸着される性質を利用する公知のバイン
ディングフィルターといっしょに效率的に使用されるこ
とができる。
分離と精製において、高濃度のグアニジン塩下でＤＮＡ
がガラス纖維に吸着される性質を利用する公知のバイン
ディングフィルターといっしょに效率的に使用されるこ
とができる。
【００２４】実施例
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する
が、本発明の範囲は下記の実施例で限度されるものでは
ない。実施例１：トラッピングフィルターの製作 平均孔径２μmの紙フィルター層（１）上に平均孔径２
０μm／厚さ１．５ｍｍのポリエチレンフィルターを２
層配置し、その上に酢酸溶液(３Ｍ sodium acetate、p
H 5.0、10μL)で含浸させた後に乾燥させた紙フィルタ
ー(Whatman paperfilter no.１、孔径１１μm)層を配
置し、その上に平均孔径２０μm／厚さ１．５ｍｍのポ
リエチレンフィルター層を１層配置してトラッピングフ
ィルター(１)を製作した。
が、本発明の範囲は下記の実施例で限度されるものでは
ない。実施例１：トラッピングフィルターの製作 平均孔径２μmの紙フィルター層（１）上に平均孔径２
０μm／厚さ１．５ｍｍのポリエチレンフィルターを２
層配置し、その上に酢酸溶液(３Ｍ sodium acetate、p
H 5.0、10μL)で含浸させた後に乾燥させた紙フィルタ
ー(Whatman paperfilter no.１、孔径１１μm)層を配
置し、その上に平均孔径２０μm／厚さ１．５ｍｍのポ
リエチレンフィルター層を１層配置してトラッピングフ
ィルター(１)を製作した。
【００２５】実験例１
前記フィルターを利用して形質転換した大腸菌細胞から
プラスミドを精製する実験を実施した。ＴＢ（ Terrifi
c Broth ）培地で約１６時間培養した E. coli (pBlues
criptII SK(+)／ＤＨ５)培養液１ｍＬを遠心分離して
培地成分を除去した溶液に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、1００μg／ｍｌのＲＮａｓｅ
からなる再懸濁溶液( resuspension solution )２５０
μｌを入れて完全に混合した。このように調製した溶液
を前記トラッピングフィルターが下端部に装着された円
周形容器に入れ、１％のナトリウムドデシルスルホナー
ト(sodium dodecyl sulfonate)と０．２ＭのＮａＯＨ
からなる細胞溶解液２５０μｌを添加して混合した。こ
の時、界面活性剤のＳＤＳが添加されても溶液が漏れな
かった。５分間バインディング緩衝液(４M Guanidine h
ydrochloride, ０．５ KOAc pH４．２)３５０μｌを添
加して混合した。
プラスミドを精製する実験を実施した。ＴＢ（ Terrifi
c Broth ）培地で約１６時間培養した E. coli (pBlues
criptII SK(+)／ＤＨ５)培養液１ｍＬを遠心分離して
培地成分を除去した溶液に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、1００μg／ｍｌのＲＮａｓｅ
からなる再懸濁溶液( resuspension solution )２５０
μｌを入れて完全に混合した。このように調製した溶液
を前記トラッピングフィルターが下端部に装着された円
周形容器に入れ、１％のナトリウムドデシルスルホナー
ト(sodium dodecyl sulfonate)と０．２ＭのＮａＯＨ
からなる細胞溶解液２５０μｌを添加して混合した。こ
の時、界面活性剤のＳＤＳが添加されても溶液が漏れな
かった。５分間バインディング緩衝液(４M Guanidine h
ydrochloride, ０．５ KOAc pH４．２)３５０μｌを添
加して混合した。
【００２６】常圧では溶液が前記トラッピングフィルタ
ーを透過しなかったが、これらの容器の下部を真空吸入
した場合、核酸含有溶液はトラッピングフィルターを透
過することができ、蛋白質、ゲノムＤＮＡ沈殿物、各種
細胞残留物などはトラッピングフィルター１及びトラッ
ピングフィルター２を透過することができなかった。
ーを透過しなかったが、これらの容器の下部を真空吸入
した場合、核酸含有溶液はトラッピングフィルターを透
過することができ、蛋白質、ゲノムＤＮＡ沈殿物、各種
細胞残留物などはトラッピングフィルター１及びトラッ
ピングフィルター２を透過することができなかった。
【００２７】実験例２
底の部分に前記実施例１で製造されたフィルターが裝着
された円筒形の容器に、ＴＢ２５０μｌを入れて形質転
換された大腸菌細胞を接種してから一晩培養した。 約
１６時間の倍養の間、倍養液はフィルターを透過して流
れることはなかった。 したがって、フィルターが装入
された容器上で直接バクテリアを培養して、容器の交替
作業をしないままプラスミドを抽出することが明らかと
なった。以後、細胞溶解液を加える段階から実験例１と
同じ方法で実施した。
された円筒形の容器に、ＴＢ２５０μｌを入れて形質転
換された大腸菌細胞を接種してから一晩培養した。 約
１６時間の倍養の間、倍養液はフィルターを透過して流
れることはなかった。 したがって、フィルターが装入
された容器上で直接バクテリアを培養して、容器の交替
作業をしないままプラスミドを抽出することが明らかと
なった。以後、細胞溶解液を加える段階から実験例１と
同じ方法で実施した。
【００２８】その後、ワットマン社が市販している紙フ
ィルター（ whatman no. I 層 ） (１１)上に平均孔径
１．０μmのガラスフィルター( whatman ＧＦ／Ｂ：ウ
ットマン社市販)３枚を積み重ねてバインディングフィ
ルターを製作した。
ィルター（ whatman no. I 層 ） (１１)上に平均孔径
１．０μmのガラスフィルター( whatman ＧＦ／Ｂ：ウ
ットマン社市販)３枚を積み重ねてバインディングフィ
ルターを製作した。
【００２９】このように製作されたバインディングフィ
ルターを円周形容器の下端部に装着し、フィルター層上
にフィルター固定用のＯ―リングを装着し、かかる容器
に前記トラッピングフィルターから濾過された核酸含有
溶液を入れ、核酸含有溶液が入っている前記容器の下部
を真空吸入することにより、核酸以外の溶媒を容器から
濾過させた。前記溶媒が排出された容器に８０％のエタ
ノール、２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ６．８からなる洗浄緩衝液１ｍｌを添加し、再
び容器の下部を真空吸入する過程を複数回繰り返すこと
により、バインディングフィルターに吸着された核酸を
洗浄した。このように洗浄した核酸が入っている容器の
下部を約１０分間真空吸入することにより、吸着された
核酸を乾燥させた後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．５からなる溶離緩衝液１００μＬを添加し、約５
分間放置して核酸をバインディングフィルターから脱着
させ、減圧濾過することにより、精製されたプラスミド
を取得した。
ルターを円周形容器の下端部に装着し、フィルター層上
にフィルター固定用のＯ―リングを装着し、かかる容器
に前記トラッピングフィルターから濾過された核酸含有
溶液を入れ、核酸含有溶液が入っている前記容器の下部
を真空吸入することにより、核酸以外の溶媒を容器から
濾過させた。前記溶媒が排出された容器に８０％のエタ
ノール、２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ６．８からなる洗浄緩衝液１ｍｌを添加し、再
び容器の下部を真空吸入する過程を複数回繰り返すこと
により、バインディングフィルターに吸着された核酸を
洗浄した。このように洗浄した核酸が入っている容器の
下部を約１０分間真空吸入することにより、吸着された
核酸を乾燥させた後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．５からなる溶離緩衝液１００μＬを添加し、約５
分間放置して核酸をバインディングフィルターから脱着
させ、減圧濾過することにより、精製されたプラスミド
を取得した。
【００３０】上述したような方法で精製された核酸を、
０.８％アガロースゲルにより電気泳動を行った後に、E
tｈidium Bromide 溶液で染色してその結果を図３と図
４に示した。図３は実験例１の過程を経た結果で、図４
は実験例２の過程を経た結果である。図３及び図４に示
すように、ＤＮＡが高純度で効率的に分離されることが
明らかとなった。また、一般にＤＮＡ溶液の純度を示す
指標の一つである分光光度計(Spectrophotometer)によ
って吸光度を測定した場合、波長２８０nmの吸光度に対
する波長２６０nmの吸光度の比が１．８以上であれば、
核酸の精製度が高いと判断され、本発明の方法で精製し
たプラスミドＤＮＡは、前記の条件を充足させた。更
に、自動塩基配列分析裝置（ ABIPRISM ３７７, Perkin
? Elmer Corp.）を利用して塩基配列を分析した場合に
も、５００bP以上読解することができた。
０.８％アガロースゲルにより電気泳動を行った後に、E
tｈidium Bromide 溶液で染色してその結果を図３と図
４に示した。図３は実験例１の過程を経た結果で、図４
は実験例２の過程を経た結果である。図３及び図４に示
すように、ＤＮＡが高純度で効率的に分離されることが
明らかとなった。また、一般にＤＮＡ溶液の純度を示す
指標の一つである分光光度計(Spectrophotometer)によ
って吸光度を測定した場合、波長２８０nmの吸光度に対
する波長２６０nmの吸光度の比が１．８以上であれば、
核酸の精製度が高いと判断され、本発明の方法で精製し
たプラスミドＤＮＡは、前記の条件を充足させた。更
に、自動塩基配列分析裝置（ ABIPRISM ３７７, Perkin
? Elmer Corp.）を利用して塩基配列を分析した場合に
も、５００bP以上読解することができた。
【００３１】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のトラッピ
ングフィルターは、細胞培養過程及び細胞溶解過程で使
用される容器の下端部材料として用いることができるも
ので、細胞溶解溶液を別途の濾過用容器に移行せずその
まま減圧濾過して、細胞破砕物を捕集して核酸含有溶液
を透過させる過程に用いることができる。本発明のトラ
ッピングフィルターを用いることによって、細胞培養過
程、細胞溶解過程、及び濾過過程を容器の交替作業無し
で連続的に遂行することができるので、現在開発中の多
様な種類の核酸分離精製装置の自動化に極めて有用であ
るという効果を有する。
ングフィルターは、細胞培養過程及び細胞溶解過程で使
用される容器の下端部材料として用いることができるも
ので、細胞溶解溶液を別途の濾過用容器に移行せずその
まま減圧濾過して、細胞破砕物を捕集して核酸含有溶液
を透過させる過程に用いることができる。本発明のトラ
ッピングフィルターを用いることによって、細胞培養過
程、細胞溶解過程、及び濾過過程を容器の交替作業無し
で連続的に遂行することができるので、現在開発中の多
様な種類の核酸分離精製装置の自動化に極めて有用であ
るという効果を有する。
【００３２】本発明の核酸分離精製用多重層フィルター
は、従来の核酸分離用フィルターに比べて、一回に多量
の生体試料を処理することができ、核酸に対する選択的
吸着能力が優秀であり、高速減圧濾過に耐えることがで
きる十分な強度を有するので、自動化された核酸分離精
製装置に用いることができる。
は、従来の核酸分離用フィルターに比べて、一回に多量
の生体試料を処理することができ、核酸に対する選択的
吸着能力が優秀であり、高速減圧濾過に耐えることがで
きる十分な強度を有するので、自動化された核酸分離精
製装置に用いることができる。
【００３３】
【図１】 本発明のトラッピングフィルターの一例の断
面図である。
面図である。
【図２】 本発明のフィルターを用いて精製したプラス
ミドＤＮＡを０．８％のアガロースゲルにより電気泳動
を行った一例の写真である。
ミドＤＮＡを０．８％のアガロースゲルにより電気泳動
を行った一例の写真である。
【図３】 本発明のフィルターを用いて精製したプラス
ミドＤＮＡを０．８％のアガロースゲルにより電気泳動
を行った一例の写真である。
ミドＤＮＡを０．８％のアガロースゲルにより電気泳動
を行った一例の写真である。
１ トラッピングフィルターの最下層
２〜９ 合成樹脂フィルター層
１０ 紙フィルター層
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 キム ハング ラエ
大韓民国 忠清北道 清原郡 南二面 尺
北里 124番地 株式会社バイオニア内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA03 HA19
4B029 AA23 CC01 HA06
4D019 AA03 BA04 BA12 BA13 BB10
BC13 BC20 BD01
Claims (7)
- 【請求項１】 平均孔径１〜1０μmのフィルター層(１)
上に、平均孔径５〜４０μmの合成樹脂フィルター層
（２〜９）が１〜８層で配置された核酸分離精製用多重
層フィルター。 - 【請求項２】 フィルター層 (１)は平均孔径が１〜５
μmであることを特徴とする請求項１記載の核酸分離精
製用多重層フィルター。 - 【請求項３】 フィルター層（１）は疎水性合成樹脂フ
ィルター層、疎水性表面処理されたガラスフィルター層
又は紙フィルター層であることを特徴とする請求項１ま
たは２記載の核酸分離精製用多重層フィルター。 - 【請求項４】 前記合成樹脂フィルター層はポリオレフ
ィン樹脂からなることを特徴とする請求項１〜３のいず
れかに記載の核酸分離精製用多重層フィルター。 - 【請求項５】 前記ポリオレフィン樹脂はポリエチレン
樹脂であることを特徴とする請求項４記載の核酸分離精
製用多重層フィルター。 - 【請求項６】 前記疎水性フィルター層（１）上に、酢
酸ナトリウムまたは酢酸カリウムのいずれかを含有する
ｐＨ３〜ｐＨ７の緩衝溶液に含浸させた後に乾燥させ
た、平均孔径５〜２５μmで厚さ１〜２ｍｍの紙フィル
ター層（１０）をさらに含むことを特徴とする請求項１
〜５いずれかに記載の核酸分離精製用多重層フィルタ
ー。 - 【請求項７】 前記紙フィルター層（１０）は前記合成
樹脂フィルター層（２〜９）の間に追加挿入されたこと
を特徴とする請求項６記載の核酸分離精製用多重層フィ
ルター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020010056919A KR100816528B1 (ko) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | 핵산 분리 정제용 다중층 필터 |
| KR2001-0056919 | 2001-09-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003080013A true JP2003080013A (ja) | 2003-03-18 |
Family
ID=19714300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001287751A Pending JP2003080013A (ja) | 2001-09-14 | 2001-09-20 | 核酸分離精製用多重層フィルター |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003080013A (ja) |
| KR (1) | KR100816528B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054660A (ja) * | 2006-06-29 | 2008-03-13 | Millipore Corp | 核酸を単離するためのろ過装置 |
| WO2013029691A3 (en) * | 2011-09-04 | 2013-10-31 | Agilent Technologies, Inc. | Debris filter for fluidic measurement with recess size decreasing in fluid flow direction |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100845971B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2008-07-11 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 핵산분리용 컬럼을 이용한 핵산분리 방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4139664A1 (de) * | 1991-12-02 | 1993-06-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren |
| WO1996041810A1 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Progen Industries Limited | Method and apparatus for dna extraction |
| KR100404235B1 (ko) * | 2000-09-19 | 2003-11-01 | (주)바이오니아 | 핵산 분리 정제용 다중층 필터 |
| KR100555435B1 (ko) * | 2003-04-02 | 2006-02-24 | 코아바이오시스템 주식회사 | 플라스미드 디엔에이 추출용 필터튜브 킷트 |
-
2001
- 2001-09-14 KR KR1020010056919A patent/KR100816528B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-09-20 JP JP2001287751A patent/JP2003080013A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054660A (ja) * | 2006-06-29 | 2008-03-13 | Millipore Corp | 核酸を単離するためのろ過装置 |
| WO2013029691A3 (en) * | 2011-09-04 | 2013-10-31 | Agilent Technologies, Inc. | Debris filter for fluidic measurement with recess size decreasing in fluid flow direction |
| CN103764250A (zh) * | 2011-09-04 | 2014-04-30 | 安捷伦科技有限公司 | 用于流体测量的在流体流动方向上凹部尺寸减小的碎屑过滤器 |
| US10073012B2 (en) | 2011-09-04 | 2018-09-11 | Agilent Technologies, Inc. | Debris filter for fluidic measurement with recess size decreasing in fluid flow direction |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20030023812A (ko) | 2003-03-20 |
| KR100816528B1 (ko) | 2008-04-10 |
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