KR100404235B1 - 핵산 분리 정제용 다중층 필터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 시료로부터 핵산을 분리, 정제하는데 사용되는 필터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기공 크기가 서로 상이한 다수의 필터 층이 층상 구조로 결합되어 있는 다중층 복합 필터에 대한 것이다. 본 발명의 필터는 합성수지, 종이, 유리 필터 또는 이들의 표면 소수성을 변화시킨 필터 층으로 이루어지며, 생체 시료로부터 플라스미드 DNA를 분리 정제하는데 사용되기에 적합하다.

Description

핵산 분리 정제용 다중층 필터{Multi-layer filter for purification of nucleic acid}
본 발명은 생체 시료로부터 핵산을 분리, 정제하는 필터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 친수성 및/또는 기공의 크기가 상이한 다수의 필터가 층상 구조로 이루어진, 핵산 정제용 다중층 복합 필터에 대한 것이다.
생체 시료로부터 핵산을 분리 및 정제하는 과정은 유전자 증폭, 염기서열 분석, 유전자 재조합 등에 요구되는 필수적인 과정이다. 현재까지, 혈액, 객담, 생체 조직, 동물 세포, 식물 조직, 대장균, 바이러스등의 생체 시료와 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔등에 분산된 핵산을 분리 및 정제하기 위해 다양한 방법들이 일반에 공지되어 있다.
예를들면, 대장균 또는 박테리아를 형질전환시켜 얻은 형질전환체의 배양액에서 플라스미드 DNA를 분리하는 가열법(boiling method; holmes, D.S. and M. Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114:193), 알칼리 용균법(alkaline lysis method; Birnboim, H. C. 및 J. Doly, 1979, Nucleic Acids Res. 7:1513)이 알려져 있고, 염화세슘 밀도구배 원심분리에 의한 플라스미드 분리 및 정제 방법등이 고순도 핵산을 얻기 위한 방법으로서 일반에 공지되어 있다.
생체 시료로부터 순수한 핵산을 분리하기 위해서 NaI 또는 NaCIO 등과 같은 카오트로프 염 존재하에서 핵산을 실리카 또는 유리 표면에 흡착시켜 분리하는 방법이 공지되어 있다(Marko, M. A. et al. 1982. A procedure for the large scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. Anal. Biochem. 121:382-387; Vogeistein. B. et al. 1979. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615-619). 이러한 실리카 또는 유리 표면에 핵산의 카오트로프 염 유도 흡착 방법은 세포 파쇄물로부터 염색체 및 플라스미드 DNA를 정제하는 일반적 방법이다(Buffone, G. J., et al. 1991. Clin. Chem. 37., 1945).
상기의 핵산 흡착 반응은 핵산이 결합하게되는 고민감성 표면을 제공하는 실리카 분말 분산액이나 압축된 유리 섬유를 사용하여, pH 4 내지 5인 구아니딘 히드로클로라이드 완충 용액 또는 pH 7.5 내지 8의 4M 요오드화나트륨 완충 용액내에서 이루어진다.
현재까지, 핵산 함유 용액에서 핵산을 분리, 정제하기 위한 각종 수동 또는 자동화 장치가 개발되고 있으며, 이들 장치에 사용되기에 적합한 핵산 분리 정제용 필터의 개발이 이루어지고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 핵산 분리용 필터는 세포 파쇄물 용액에 함유된 고형분에의해 필터의 기공이 조기에 폐쇄됨으로 인하여 장시간의 연속적 사용에 한계가 있고, 고속 감압 여과시에 발생하는 압력에 견딜 수 있는 기계적 강도가 미흡하고, 핵산의 선택적 흡착 능력에 한계가 있었다. 또한, 계면활성제가 포함된 용액을 사용할 경우 필터 층이 젖어들어 상압에서도 용액이 새는 문제가 발생하였다.
따라서, 핵산을 함유하는 생체 시료에서 핵산을 효율적으로 분리해내기 위하여는 일회에 처리할 수 있는 생체 시료의 양이 크며 핵산에 대한 선택적 흡착 능력이 우수하고, 고속 감압 여과에 견디기에 충분한 강도를 가지며 각종 용해 용액 처리시에도 새지 않는 필터가 요구되며, 자동화된 핵산 분리 정제 장치에 쉽게 장착이 가능한 형상으로 가공이 용이한 필터의 개발이 요청되고 있다.
본 발명은 이상과 같은 물성을 충족시키는 핵산 정제용 고효율, 고선택성, 고강도 필터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 트래핑 필터의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 바인딩 필터의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 필터들을 사용하여 정제한 플라스미드 DNA를 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 사진이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1: 트래핑 필터의 소수성 최하층 2 내지 9: 소수성 합성수지 필터 층
10: 소수성 종이 필터 층 11: 바인딩 필터의 소수성 최하층
12 내지 19: 핵산 흡착 층
본 발명의 핵산 정제용 필터는 다공질 합성수지, 유리, 종이 층으로 이루어지며, 상압에서는 핵산을 함유한 세포 파쇄 용액 전체의 투과를 방지하지만 감압 여과시에는 핵산 함유 용액만을 투과시키고 세포 잔해물은 포집하는 트래핑 필터와 카오트로프 염 존재하에는 플라스미드 DNA를 흡착하고 용리 완충액을 부가하는 경우에는 플라스미드 DNA를 탈착시켜주는 바인딩 필터로 구분된다.
이하, 도면에 기재된 번호를 인용하여 본 발명의 다중층 필터의 구성을 설명한다.
본 발명의 트래핑 필터는 상압에서 세포 파쇄 용액의 투과 및 핵산의 흡착을 방지하기 위하여 소수성을 갖는 다공질 합성수지 또는 소수성으로 표면 처리된 다공질 유리로 제작된다. 트래핑 필터는 핵산은 통과하지만 기타 다른 세포 잔해물은 통과할 수 없는 직경의 기공을 갖는다. 또한, 다양한 크기의 잔해물을 순차적으로 분산시켜 여과하여 일회에 여과할 수 있는 용액의 양을 극대화하기 위하여 서로 상이한 크기의 기공을 갖는 소수성 필터 층이 다수 적층된 구조를 갖는다.
본 발명의 트래핑 필터의 최하층(1)에는 단백질, 게놈 DNA, 각종 세포 잔해물등은 투과할 수 없으나 플라스미드 DNA는 투과시킬 수 있는 필터 층으로서, 소수성 필터층이 배치되며, 여기서 소수성 필터층은 합성수지 필터층 또는 종이 필터층 또는 소수성으로 표면처리된 유리필터층 일 수 있다. 상기 소수성 필터 층 위에 소수성 합성수지 필터층 또는 종이 필터층(2내지9)이 다층으로 누적된 구조를 갖는다. 이러한 트래핑 필터는 상압에서는 세포 용해액이 투과하지 아니하나 세포 용해액에 원심력이 가해지거나 필터 층의 하부에서 감압 흡입하는 경우에는 핵산 함유 용액만이 필터 하부로 투과된다.
따라서, 본 발명의 트래핑 필터는 세포 배양 및 세포 용해 과정에 사용되는 용기의 하단부 재료로 사용되어, 세포 용해액을 별도의 여과 용기에 옮길 필요없이 그대로 감압 여과하여 세포 잔해물은 포집하고 핵산 함유 용액은 투과시키는 과정에 사용된다.
본 발명의 트래핑 필터의 사용으로 인하여, 세포 배양 및 세포 파쇄 과정과 여과 과정을 용기의 교체 작업없이 연속적으로 진행시킬수 있다는 점은 현재 개발중인 다양한 종류의 핵산 분리 정제 장치의 자동화에 크게 기여한다. 또한, 본 발명의 트래핑 필터는 다수의 필터 층이 적층된 구조를 가지므로 고속 감압 여과시에 필터 층에 가해지는 압력에 견딜 수 있고, 기공 크기나 두께가 일정한 종래의 필터에 비하여 일회에 처리할 수 있는 세포 배양액의 양이 많다는 점은 핵산 분리 정제 장치의 효율화에 기여할 수 있다.
본 발명의 트래핑 필터는 통상적으로 핵산의 분리 정제에 사용되는 원주형상의 튜브의 하단부에 장착될 수 있고, 바람직하게는 시중에서 구입 가능한 표준 멀티 웰 플레이트, 예를들면, 96(12x8) 웰 플레이트의 웰에 삽착될 수 있으며, 밑면에 흡입구가 형성되어 있어 진공 흡입에 의한 감압 여과가 가능한 튜브나 웰에 내부에 장착된다. 트래핑 필터 전체의 두께는 여과의 효율을 고려하여 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 트래핑 필터의 바람직한 실시예는 소수성으로 표면 처리된 유리 필터 층(1) 과 소수성 합성수지 필터층(2 내지 9)들이 다층으로 누적된 형태이다.이 때 중간에 삽입되는 필터의 소수성은 크게 문제가 되지 않으나 최상층(9)의 필터는 소수성을 가지는 필터가 바람직하며, 이러한 필터는 상압에서 수용액이 여과되지 않게 하고 단지 감압하거나 원심분리하였을 때에만 여과되는 특성을 갖게 한다. 이러한 필터로서는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 등과 같은 폴리올레핀계 수지 필터가 바람직하다. 본 발명의 소수성 유리 필터 층(1)은 통상적인 유리 필터를 클로로포름 용매에 녹인 3% 디메틸디클로라이드실란 또는 3% 디에틸디클로라이드실란 용액에 함침시킨 후 건조시켜 표면을 소수성으로 변화시킨 필터이다. 이렇게 처리할 경우 핵산이 필터에 흡착되는 것을 방지할 수 있다. 이렇게 소수화 처리한 유리 필터 층(1)들의 기공의 직경은 1 내지 10㎛일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 5㎛이다. 소수성 합성수지 필터층(2내지9)의 기공의 직경은 5 내지 40㎛일 수 있으나, 바람직하게는 10 내지 40㎛, 더욱 바람직하게는 10내지 20㎛일 수 있다.
본 발명의 트래핑 필터에 사용되는 소수성 합성수지 필터는 표면이 소수성인 공지의 합성수지로 제작되며, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌등과 같은 폴리올레핀계 수지로 제작되는 것이 바람직하다.
본 발명의 트래핑 필터의 더욱 바람직한 실시예는, 기공의 크기가 서로 다른 합성수지 필터 층과 종이 필터 층이 교대로 적층된 다중층 복합 필터이다. 최하층 합성수지 필터 층(1)의 기공의 직경은 1내지 10㎛, 바람직하게는 2내지 5㎛이며, 최하층 위의 합성 수지 필터층(2내지9)의 기공의 직경은 5 내지 40㎛일 수 있으나, 바람직하게는 10 내지 40㎛일 수 있다.
종이 필터 층(10)은 공지의 종이 필터를 pH 3 내지 7, 바람직하게는 pH 4 내지 6으로 완충된 NaOAc(sodium acetate) 또는 KOAc(potassium acetate) 용액에 함침시킨 후 건조시킨 종이 필터가 사용된다. 여기서 상기 종이필터는 0.5mm 내지 2mm의 두께와 5μm 내지 25μm인 평균 직경의 기공을 갖는 필터가 사용될 수 있다. 이렇게 처리된 종이 필터 층(10)은 배양된 세포의 용해시에 사용되는 계면활성제로 인하여 상압에서 핵산 함유 용액이 합성수지제 필터 층을 투과하게 되는 경우라도 더 이상의 용액 투과를 막아주는 역할을 한다. 상기 종이 필터 층(10)은 합성 수지 필터 층(2내지9)들 사이에 장착되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바인딩 필터는 핵산 함유 용액에서 핵산만을 선택적으로 흡착하는 필터 층이 포함된 다중층 복합 필터로서, 최하층에 배치된 소수성 필터 층(11)과 그 위에 누적되는 다수의 통상의 유리 필터 층(12 내지 19)이 결합된 필터이다.
보다 구체적으로는, 소수화 처리된 유리 필터 층 및/또는 소수성 합성수지 필터 층이 최하층(11)으로 배치되고 그 위에 1 내지 8층, 바람직하게는 1 내지 5층의 통상적인 유리 필터 층(12 내지19)들이 배치된다. 최하층에 배치되는 유리 필터 층(11)은 클로로포름 용매에 녹인 3% 디메틸디클로라이드실란 또는 3% 디에틸디클로라이드실란 용액에 함침시킨 후 건조시켜 표면을 소수화 처리한 필터 층이다.
합성수지 필터가 최하층(11)에 사용될 경우 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 재질의 폴리올레핀계 수지로 제작되는 것이 바람직하다. 소수화 필터 층(11)은 상압에서는 핵산 함유 용액이 투과할 수 없으나, 용액에 원심력이 가해지거나 필터 하부에서 감압 흡입하는 경우에 용액을 하부로 투과시킨다. 또한 합성수지 필터의 경우 감압 및 원심력이 작용하는 경우에도 기계적인 강도가 뛰어나므로 필터의 미세 조각들이 떨어져 나가지 않으며, 감압 및 원심력하에 있을 때 유리 필터층(12내지19)에서 떨어져 나오는 미세 유리조각을 걸려주는 역할과 함께 유리 필터층이 찢어지지 않게 지지해 주는 역할도 한다.
최하층(11) 필터의 기공 크기는 0.7 내지 40㎛, 바람직하게는 1 내지 20㎛, 더욱 바람직하게는 2 내지 5㎛이다. 전술한 바와 같은 기공 크기와 표면 소수성을 갖는 합성수지 필터라면 모두 본 발명의 바인딩 필터의 최하층으로 사용될 수 있으며, 본질적으로 소수성을 나타내는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌과 같은 폴리올레핀 수지로 이루어진 다공질 발포체나 부직포 형태가 적합하다.
상기의 소수화 처리되지 아니한 통상적인 유리 필터 층(12 내지 19)들은 카오트로프 염 존재하에 핵산을 선택적으로 흡착한다. 카오트로프 염으로서는 구아니딘 염, 요오드화 나트륨(NaI), 요오드화 칼륨(KI), 퍼클로레이트 나트륨 (NaCLO4), 아이소프로판올 (isopropanol) 등이 사용될 수 있다. 이들 핵산 흡착 층(12 내지 19)은 현재 시판중인 일반적인 유리제 필터, 예를 들면 왓스만사 (Whatman)가 시판하는 GF/B 필터를 사용할 수 있으며 바인딩 완충액에 포함된 카오트로프 염에 의하여 핵산 흡착 능력이 증가된다. 이들 핵산 흡착 층(12 내지 19)은 카오트로프 염 존재하에서는 핵산을 흡착하지만, 10mM Tris HCl과 같은 용리완충액을 첨가하면 핵산을 탈착하는 기능을 수행한다.
일회의 여과 과정을 통하여 흡착할 수 있는 핵산의 양을 극대화 하기 위하여, 상기 핵산 흡착 층(12 내지 19)의 두께를 증가시키거나 다층으로 누적 배치하는 것이 바람직하다. 상기 핵산 흡착 층(12 내지 19)의 기공의 크기는 0.1 내지 10㎛, 바람직하게는 0.5 내지 5㎛, 더욱 바람직하게는 0.7 내지 3㎛일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위가 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트래핑 필터1의 제작
기공의 평균 직경이 5μm 이고 두께가 1.5 mm인 폴리에틸렌 필터 층(1)위에, 기공의 평균 직경이 20μm 이고 두께가 1.5mm인 폴리에틸렌 필터 2층을 배치하고, 그 위에 0.5M KOAc 용액으로 함침시키후 건조시킨 종이제 필터(Whatman paper filter no.1, 기공 크기 11㎛) 층을 배치하였다. 이들 층위에 기공의 평균 직경이 20μm 이고 두께가 1.5mm인 폴리에틸렌 필터 1층을 배치하여 트레핑 필터1을 제작하였다.
실시예 2. 트래핑 필터2의 제작
왓스만사가 시판하는 2.7㎛의 기공 크기의 유리 필터(Watsman glass filter GF/D)를 클로로포름을 용매로한 3% 디메틸디클로라이드실란(또는 디에틸디클로라이드실란) 용액에 함침시킨 후에 대기중에서 완전히 건조시켰다. 이렇게 처리된 유리 필터 층(1)위에, 1.5mm의 두께와 20㎛의 평균 기공 직경을 갖는 폴리에틸렌 필터 층(2내지9)들을 배치하여 트레핑 필터2를 제작하였다.
한편, TB 배지에 약 16시간 배양한E. coli(pBluescriptII SK(+)/ DH5) 배양액 1 mL을 원심 분리하여 배지 성분을 제거한 용액에 50mM TrisHCl, 10mM EDTA과 100μg/ml RNase로 이루어진 현탁화액(resuspension solution) 250㎕을 넣고 완전히 혼합하였다. 이렇게 제조된 용액을 상기 트래핑 필터1 또는 2가 하단부에 장착된 원주형 용기에 넣고 1% sodiumdodecylsulfonate와 0.2M NaOH로 이루어진 세포용해액 250㎕를 첨가하고 섞어 주었다. 이때 계면 활성제인 SDS가 첨가되어도 용액이 새지 않았다. 5분 동안 바인딩 완충액(4M Guanidine hydrochloride, 0.5 KOAc pH 4.2) 350㎕를 첨가하고 섞어주었다. 상압에서는 용액이 상기 트래핑 필터1 및 2를 투과하지 아니하였으나 이들 용기의 하부를 진공 흡입하는 경우, 핵산 함유 용액은 트래핑 필터 1 및 2를 투과하였으며, 단백질, 게놈 DNA, 각종 세포 잔해물등은 투과할 수 없었다.
실시예3. 바인딩 필터1의 제작
왓스만사가 시판하는 유리 필터(Watsman glass filter GF/A)를 3% 디메틸디클로라이드실란(또는 디에틸디클로라이드실란) 클로로포름 용액에 함침시킨 후에 대기중에서 완전 건조시켰다. 이렇게 소수화 처리된 유리 필터층(11) 위에, 1.0㎛의 평균 직경의 기공을 갖는 왓스만사가 시판하는 유리 필터 3장을 적층시켜 바인딩 필터 1을 제작하였다.
실시예4. 바인딩 필터2의 제작
1.5mm의 두께와 5㎛의 평균 기공 직경을 갖는 폴리에틸렌 필터 층(11)위에 1.0㎛의 평균 직경의 기공을 갖는 왓스만사가 시판하는 유리 필터(whatman GF/B) 3장을 적층시켜 바인딩 필터 2를 제작하였다.
이렇게 제작된 본 발명의 바인딩 필터1 또는 2를 원주형 용기의 하단부에 장착하고, 필터층위에 필터를 고정하기 위한 O-링을 장착하고 이 용기에 상기 트래핑필터들로 여과한 핵산 함유 용액을 넣고, 핵산 함유 용액이 담긴 상기 용기의 하부를 진공 흡입하여 핵산을 제외한 용매를 용기로부터 여과시켰다. 실시예 3 또는 4에서 제작된 바인딩 필터 1 또는 2 모두 상압에서는 핵산 함유 용액을 투과시키지 아니하였다. 이들 용매가 배출된 용기에 80% ethanol, 20mM NaCl, 2mM TrisHCl pH 6.8인 세척완충액을 1ml 가하고 다시 용기의 하부를 진공 흡입하는 과정을 수회 반복하여 바인딩 필터에 흡착된 핵산을 세척하였다. 이렇게 세척된 핵산이 담긴 용기의 하부를 약10분간 진공 흡입하여 흡착된 핵산을 건조시킨 후에 10mM TrisHCl pH 8.5인 용리 완충액 100L를 가하고 약 5분간 방치하여 핵산을 바인딩 필터로부터 탈착시키고 감압여과하여 정제된 플라스미드를 수득하였다.
이상과 같은 방법으로 정제한 핵산을 아가로즈 겔 전기영동으로 전기영동하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 도시된 바와 같이, DNA가 고순도로 효율적으로 분리됨을 알 수 있었다. 또한 일반적으로 DNA 용액의 순도를 알려주는 지표의 하나로서 스펙트로포토미터(Spectrophotometer)를 이용하여 260nm 파장과 280nm 파장에서의 흡광도 비를 측정하는데, 1.8 이상일 경우 고순도로 볼 수 있는데, 본 발명의 방법으로 정제한 플라스미드 DNA가 이러한 조건을 충족시켰다.
본 발명의 트래핑 필터는 세포 배양 및 세포 용해 과정에 사용되는 용기의 하단부 재료로 사용되어, 세포 용해 용액을 별도의 여과용 용기에 옮길 필요 없이 그대로 감압 여과하여 세포 파쇄물은 포집하고 핵산 함유 용액은 투과시키는 과정에 사용될 수 있다. 본 발명의 트래핑 필터의 사용으로 인하여, 세포 배양 및 세포 용해 과정과 여과 과정을 용기의 교체 작업없이 연속적으로 진행시킬수 있다는 점은 현재 개발중인 다양한 종류의 핵산 분리 정제 장치의 자동화에 크게 기여하는 효과가 있다.
본 발명의 바인딩 필터는 상압에서는 핵산 함유 용액을 투과시키지 아니하지만 용액에 원심력이 가해지거나 감압 여과시에는 용액을 투과시키는 소수성 필터 층과 카오트로프 염 존재하에서는 핵산을 흡착하고 용리완충액이 가해지면 핵산을 탈착시키는 다수의 필터층으로 구성되어 있어서 핵산 함유 용액내의 핵산을 대량으로 분리하는 자동 핵산 분리 장치에 사용될 수 있다.
종래의 실리카 부유물을 이용하여 DNA를 흡착시키는 방법은 부유물이 가라앉지 않게 처리해야 하므로 자동화하기에 힘들고 최종적으로 실리카 입자를 제거하기가 어려웠다. 그러나 본 발명의 바인딩 필터를 이용하면 실리카 부유물을 별도로 분주할 필요가 없으며, 최하층 필터가 미세 유리 조각들을 걸러주므로 불순물이 포함되지 않은 순수한 플라스미드 DNA 용액을 얻을 수 있다.
본 발명의 다중층 필터는 종래의 핵산 분리용 필터에 비하여 일회에 처리할 수 있는 생체 시료의 양과 핵산에 대한 선택적 흡착 능력이 우수하고, 고속 감압 여과에 견디기에 충분한 강도를 가지므로 자동화된 핵산 분리 정제 장치에 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 기공의 평균 직경이 1㎛ 내지 10㎛인 소수성 필터층(1) 위에, 초산나트륨과 초산칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 함유하는 pH3 내지 pH7의 완충용액에 함침시켜 건조시킨, 1mm 내지 2mm의 두께와 5㎛ 내지 25㎛인 평균 직경의 기공을 갖는 종이 필터층 및 기공의 평균 직경이 5㎛ 내지 40㎛인 1 내지 8층의 합성수지 필터층(2 내지 9)이 배치된 다중층 필터.
  2. 제 1 항에 있어서, 소수성 필터층(1)은 소수성 합성수지 또는 소수성으로 표면처리된 유리 필터 층인 것을 특징으로 하는 다중층 필터,
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 합성수지 필터 층(1)이 폴리올레핀 수지로 제작된 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기폴리올레핀 수지가 폴리에틸렌 수지인 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기의 유리 필터 층이 디메틸디클로라이드실란과 디에틸디클로라이드실란에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 피복된 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 종이 필터 층(10)이 상기 합성 수지 필터 층들(2 내지 9) 사이에 추가된 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
  8. 기공의 평균 직경이 1μm 내지 10μm 인 합성수지 필터 층(11)위에, 기공의 평균 직경이 0.1μm 내지 10μm인 유리 필터 층(12 내지 19)들이 1 내지 8층으로 배치된 다중층 필터.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 합성수지 필터 층(11)이 폴리올레핀 수지로 제작된 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
  10. 제9항에 있어서, 상기폴리올레핀 수지가 폴리에틸렌 수지인 것임을 특징으로 하는 다중층 필터.
  11. 디메틸디클로라이드실란과 디에틸디클로라이드실란에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물로 피복되고, 기공의 평균 직경이 1μm 내지 10μm인 유리 필터 층(11)위에, 기공의 평균 직경이 0.1μm 내지 10μm인 유리 필터 층(12 내지 19)들이 1 내지 8층으로 배치된 다중층 필터.
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