KR100673393B1 - 디옥시리보 핵산 분리 이중 필터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNA 분리 이중 필터에 관한 것으로, 보다 자세하게는 박테리아로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 신속하게 분리, 정제하는 2중 필터 및 그 정제방법에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 분리 이중 필터는, 세포 잔해 입자를 필터링하기 위해 합성수지층과 셀룰로오스 층으로 구성된 이중층 필터; 및 상기 이중층 필터를 통과한 시료 중 DNA를 선택적으로 결합시키는 섬유막 필터를 포함하여 구성됨에 기술적 특징이 있다.

또한 본 발명의 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법은, 박테리아 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 세포잔해를 제외한 시료(Cleared lysate)를 형성하는 제1단계; 상기 시료를 이중 필터로 이동시키는 제2단계; 상기 시료를 원심분리하여 이중층 필터로 세포 잔해 입자를 필터링하고, 플라스미드 DNA를 선택적으로 결합시키기 위해 섬유막 필터로 필터링하는 제3단계; 및 상기 플라스미드 DNA를 회수하는 제4단계를 포함하여 이루어짐에 기술적 특징이 있다.

따라서, 본 발명의 DNA 분리 이중 필터 및 그 정제방법은 박테리아로부터 플라스미드 DNA 정제시 섬유막 필터와 이중층을 갖는 필터를 결합한 이중 필터를 사용함으로써, 시료 하나의 실험시 약 10분 가량의 시간을 단축할 수 있으므로 대량의 시료를 실험할 경우 총 소요 시간을 대폭적으로 단축할 수 있다.

DNA, 섬유막 필터, 이중층 필터, 이중 필터.

Description

디옥시리보 핵산 분리 이중 필터{Double filter for purification of DNA}

도 1은 종래기술에 따른 DNA 분리 순서도.

도 2a 내지 도 2b는 본 발명에 따른 DNA 분리 개별 필터.

도 3은 본 발명에 따른 DNA 분리 이중 필터

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

10: 섬유막 필터 20: 이중층 필터

30: 이중 필터

본 발명은 DNA 분리 이중 필터에 관한 것으로, 보다 자세하게는 박테리아로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 신속하게 분리, 정제하는 2중 필터 및 그 정제방법에 관한 것이다.

종래의 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 방법은 다양하게 발표되 어 왔다. 현재 가장 널리 사용되는 방법은 알칼리성 용해(alkaline lysis) 후 유리섬유막으로 이루어진 실리카 필터(silica filter)를 통하여 정제하는 방법이다. 이 방법은 매우 간편하게 박테리아로부터 비교적 순수한 DNA를 정제할 수 있는 것으로서, 일반적으로 다음과 같은 순서로 이루어진다.

단계 1. 먼저 1㎖ 내지 3㎖의 박테리아 배양액을 원심분리하여 그 펠렛을 얻는다.

단계 2. 박테리아 세포를 250㎕의 용액1로 현탁시킨다.

단계 3. 염기성의 250㎕의 용액2를 첨가하여 용해한다.

단계 4. 250㎕의 용액3을 첨가하여 용액을 중화시킨다.

단계 5. 10분 가량 원심분리하여 세포 잔해(cell debris)를 하부에 침전시킨다.

단계 6. 세포 잔해를 제외한 상층액(Cleared lysate)만을 취하여 유리섬유막이 안착된 필터1에 옮긴다.

단계 7. 상기 필터를 원심분리하여 DNA만을 선택적으로 유리섬유막에 흡착시킨다.

단계 8. 적당량의 용액4를 필터1에 충진한 후 원심분리를 통해 유리섬유막에 흡착되어 있는 DNA를 세척한다.

단계 9. 적당량의 용액5를 필터1에 충진한 뒤 원심분리를 통해 흡착되어 있던 DNA를 회수한다.

도 1은 상기 단계 1 내지 단계 9를 간략하게 나타낸 것이다. 먼저, 상기 단 계 1 내지 단계 5의 과정을 용기1(100)에서 진행한다. 이 후, 세포 잔해를 제외한 상층액 만을 취하여 유리섬유막이 안착된 필터1(200)로 옮긴다. 상기 필터1(200)을 통해 상기 단계 7 내지 단계 9의 과정을 진행한다.

그러나, 이러한 방법은 몇개 안되는 적은 수의 시료를 이용하여 실험할 경우 깨끗한 DNA를 비교적 신속하게 정제할 수 있었으나, 시료의 수가 많아지면 실험에 필요한 시간이 매우 길어지게 되어 비효율적인 단점이 발생한다. 즉, 상기 용기1에서 단계 1 내지 단계 4의 과정을 거친 후, 단계 5의 원심분리를 진행하는데 걸리는 시간 및 시료의 개수에 따른 추가적인 조작시간이 발생하여 전체적인 시간이 대폭 증가한다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위한 것으로, 상기 단계 5 내지 단계 7의 과정을 동시에 수행할 수 있는 DNA 분리 이중 필터를 사용하여 개별 시료당 실험 시간을 단축함으로써 대량 시료의 실험시 전체적인 실험 시간을 대폭 단축시킬 수 있는 DNA 분리 이중 필터 및 필터링 방법을 제공함에 본 발명의 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 박테리아 시료로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 필터에 있어서, 세포용해 후 잔해 입자를 필터링하기 위한 이중층 필터; 및 상기 이 중층 필터를 통과한 시료 중 DNA를 선택적으로 결합시키는 유리섬유막 필터를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 DNA 분리 이중 필터에 의해 달성된다.

또한 본 발명의 상기 다른 목적은 박테리아 시료로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법에 있어서, 박테리아 배양액으로부터 DNA를 분리하기 위해 세포잔해를 제외한 시료(Cleared lysate)를 형성하는 제1단계; 상기 시료를 이중 필터로 이동시키는 제2단계; 상기 시료를 원심분리하여 이중층 필터로 세포 잔해 입자를 필터링하고, 플라스미드 DNA를 선택적으로 결합시키기 위해 섬유막 필터로 필터㎜링하는 제3단계; 및 상기 플라스미드 DNA를 회수하는 제4단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 박테리아 시료로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 상기 목적과 기술적 구성 및 그에 따른 작용효과에 관한 자세한 사항은 본 발명의 바람직한 실시예를 도시하고 있는 도면을 참조한 이하 상세한 설명에 의해 보다 명확하게 이해될 것이다.

먼저, 도 2a는 본 발명에 따른 필터를 나타낸 것이다. 도 2a의 좌측에 나타낸 필터는 DNA의 선택적인 흡착을 위한 필터(10)로써, 상기 필터(10)는 실리카(silica)표면을 갖는 고체상의 유리섬유막 혹은 셀라이트입자(celite particle)로 이루어지는 필터층(11)을 갖는다.

도 2a의 우측에 나타낸 필터는 본 발명의 특징적인 필터(20)로써, 상기 필터(20)는 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 필터링에 용이한 그물형상의 바닥면(23) 위에 이중층을 갖는 바, 합성수지 필터층(22)과 셀룰로오즈(cellulose) 필터층(21) 을 갖는다.

상기 합성수지 필터층(22)은 폴리프로필렌(polypropylene) 혹은 폴리에틸렌(polyethylene)이나 이의 파생산물(derivatives) 재질로 이루어지며, 필터층의 두께는 0.5㎜ 내지 5㎜이고, 기공직경 1㎛ 내지 100㎛를 갖는다. 상기 셀룰로오즈 필터층(21)은 셀룰로오스(cellulose), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 혹은 이와 유사한 재질을 가지며, 층의 두께 0.1㎜ 내지 2㎜, 기공직경 0.1㎛ 내지 10㎛를 갖는다. 이러한 두 가지 필터층(21, 22)을 이용하여 염기성 용해 후 생성되는 세포용출물로부터 고형질을 제거하여 플라스미드 DNA가 섞여 있는 용액만을 분리시킬 수 있다.

도 3은 상기 도 2a의 필터(10, 20)를 결합한 이중 필터(30)를 나타낸 것이다. 도 3과 같이 섬유막 필터(10) 위에 이중층을 갖는 필터(20)가 얹혀지는 구조로 이루어짐으로써 상기 언급된 종래기술의 문제점인 실험 시간을 단축할 수 있는 것이다.

도 3과 같은 이중 필터(30)를 사용하여 박테리아로부터 순수한 DNA를 정제하는 순서는 다음과 같다.

단계 1. 먼저 1㎖ 내지 3㎖의 박테리아 배양액을 원심분리하여 그 펠렛을 얻는다.

단계 2. 박테리아 세포를 150㎕의 용액1로 현탁시킨다.

단계 3. 염기성의 150㎕의 용액2를 첨가하여 용해한다.

단계 4. 200㎕의 용액3을 첨가하여 용액을 중화시킨다.

단계 5. 이중 필터(30)에 옮긴 후, 원심분리하여 DNA만을 필터(10)의 섬유막에 흡착시킨다.

단계 6. 적당량의 용액4를 필터(10)에 충진한 후 원심분리를 통해 유리섬유막에 흡착되어 있는 DNA를 세척한다.

단계 7. 적당량의 용액5를 필터(10)에 충진한 뒤 원심분리를 통해 흡착되어 있던 DNA를 회수한다.

상기 본 발명에 따른 단계 1 내지 단계 7을 수행함으로써, 종래기술의 단계 5의 세포 잔해(cell debris)를 하부에 침전시키기 위한 10분 가량의 원심분리와, 단계 7의 DNA만을 선택적으로 유리섬유막에 흡착시키기 위한 원심분리의 과정을, 본 발명의 단계 5의 단 한 번의 원심분리로 단축시킬 수 있는 것이다.

상기 본 발명에 따른 단계 1 내지 단계 7을 수행하는데 있어 사용되는 용액1 내지 용액5에 대해 살펴 보면 다음과 같다.

먼저, 상기 단계 2의 용액1은 세포를 완충시키는 것으로, 세포를 골고루 현탁하고 DNA의 정제를 위한 안정된 조건으로 만드는 용액이다. 상기 용액1의 예로, 50mM TrisCl, pH7.5 및 10mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 사용한다.

상기 단계 3의 용액2는 시료의 pH를 염기조건으로 만들어 주는 용액으로, pH가 염기조건이 되어 세포구성성분들의 특성이 변화됨으로써 세포의 구조가 이완되어 세포내의 내용물이 세포밖으로 빠져나온다. 상기 용액2의 예로, 1% SDS 및 0.2M NaOH를 사용한다.

상기 단계 4의 용액3은 용액의 pH를 다시 중성으로 바꿔 주어, 이완된 세포 구성성분들이 서로 엉겨 붙어 고형질의 침전물이 형성되도록 하는 것이다. 상기 용액3의 예로, 3M Potassium acetate 및 4M Guanidine hydrochloride를 사용한다. 이러한 상태에서 상기 단계 5에서 원심분리를 할 경우 엉겨붙은 고형질의 세포구성성분들은 이중층 필터에 필터링 되고, 수용성 분자들(단백질, 플라스미드 DNA, RNA)은 액상으로 그대로 존재하게 되어 섬유막 필터에서 필터링 된다. 상기 유리섬유막 필터는 높은 농도의 챠오트로피스(chaortopes)하, 혹은 특정 농도의 에틸알콜 혹은 이소프로필알콜(isopropanol)하의 조건에서 DNA와 선택적으로 결합하는 성질을 갖는다. 또한 상기 단계 5의 원심분리 시간은 30초 내지 1분 가량이면 족하다.

상기 단계 6의 용액4는 플라스미드 DNA 외에, 유리섬유막에 불특정하게 붙을 수 있는 RNA, 수용성 단백질 또는 염(salt)을 제거하는 역할을 한다. 상기 용액4의 예로, 100mM Sodium chloride, 10mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 20mM TrisCl, pH7.5, 60% Ethanol을 사용한다.

상기 단계 7의 용액5는 플라스미드 DNA가 저농도의 염, 7.5이상의 pH 컨디션에서 유리섬유막에 대하여 부착능력을 상실하여 분리되는 특성을 활용하는 것이다. 즉, 상기의 조건에 부합되는 용액5를 흘려주면 용액에 플라스미드 DNA가 분리된다. 상기 용액5의 예로, 10mM TrisCl, pH8.5를 사용한다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

따라서, 본 발명의 DNA 분리 이중 필터 및 그 정제방법은 박테리아로부터 플라스미드 DNA 정제시 섬유막 필터와 이중층을 갖는 필터를 결합한 이중 필터를 사용함으로써, 시료 하나의 실험시 약 10분 가량의 시간을 단축할 수 있고, 대량의 시료를 실험할 경우 시료의 개수에 비례하여 시료에 대한 조작횟수가 줄어듬으로써 총 소요 시간을 대폭적으로 단축할 수 있다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 박테리아 시료로부터 DNA를 분리하는 필터에 있어서,

   합성수지 필터층과 셀룰로오즈 필터층으로 구성되어 세포 잔해 입자를 필터링하기 위한 이중층 필터; 및

   상기 이중층 필터를 통과한 시료 중 DNA를 선택적으로 결합시키는 필터

   를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 DNA 분리 이중 필터.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 합성수지 필터층의 기공직경은 1㎛ 내지 100㎛임을 특징으로 하는 DNA 분리 이중 필터.
4. 제 2 항에 있어서,

   상기 셀룰로오즈 필터층의 기공직경은 0.1㎛ 내지 10㎛임을 특징으로 하는 DNA 분리 이중 필터.
5. 박테리아 시료로부터 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법에 있어서,

   박테리아 배양액으로부터 DNA를 분리할 수 있는 시료를 형성하는 제1단계;

   상기 시료를 이중 필터로 이동시키는 제2단계;

   상기 시료를 원심분리하여 이중층 필터로 세포 잔해 입자를 필터링하고, DNA를 선택적으로 결합시키기 위해 섬유막 필터로 필터링하는 제3단계; 및

   상기 DNA를 회수하는 제4단계

   를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 박테리아 시료로부터 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법.
6. 제 5 항에 있어서,

   상기 제1단계는,

   박테리아 배양약을 원심분리하여 그 펠렛을 형성하는 단계;

   상기 펠렛의 박테리아 세포를 현탁시키는 단계;

   상기 용액을 염기성용액을 첨가하여 용해하는 단계; 및

   상기 용액을 중화시키는 단계

   를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 박테리아 시료로부터 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법.
7. 제 5 항에 있어서,

   상기 제4단계는,

   상기 섬유막 필터를 세척하는 단계; 및

   상기 흡착된 DNA를 회수하는 단계

   를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 박테리아 시료로부터 DNA를 분리하는 이중 필터링 방법.

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