JP2003530854A - 限外濾過を使用するプラスミド回収の方法及び装置 - Google Patents
限外濾過を使用するプラスミド回収の方法及び装置Info
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Abstract
Description
本発明は、プラスミド調製方法及び該方法の実施装置に関する。
洗浄及び溶出から成る方法として公知である。この方法では、ヨウ化カリウムの
ようなカオトロピック試薬の存在下でガラス繊維フィルターに結合させることに
よってプラスミドを清澄化溶菌液から回収する。このカオトロピック試薬はプラ
スミドをガラス繊維に結合させるが、その他の細胞成分の殆どを通過させる。次
にガラス繊維フィルターをエタノール(70重量%以上の濃度)で洗浄してカオ
トロピック試薬を除去する。余剰のエタノールは吸取り、遠心または十分な真空
乾燥によってフィルタープレートの下面から除去される。次に水または低塩バッ
ファを使用してガラス繊維からプラスミドを溶出させる。
し、その完全な除去が難しい。残留エタノールはプラスミドに対してまたはプラ
スミドに行う試験に対して好ましくない影響を及ぼす。加えて、この方法には時
間がかかり、また、方法が多くの順次段階を要する。更に、ガラス繊維のプラス
ミド結合容量が小さいので結合効率がよくない。また、ガラスからの溶出が完全
でない。ある種のプラスミドはガラスに不可逆的に結合することが知見された。
総体的に、プラスミドの回収率は有効なプラスミドのしばしば80%未満であり
、ときには70%未満である。
の方法よりもはるかに高い回収速度で回収できるように改良されたプラスミドま
たはその他の環状DNAの回収方法及び装置を提供する。
microfiltration;MF)膜または粗濾過(coarse fi
ltration)膜で濾過する方法を提供する。殆どの細胞破片を上記の(1
つまたは複数の)膜によって除去し、次いで残りを限外濾過(ultrafil
tration;UF)膜によって濾過し、プラスミドまたはその他のDNAを
UF膜の上面に残留させ、この上面から回収する。
遠心また定常差圧(constant pressure different
ial)(正または負)を使用する。方法が双方の段階に定常差圧を使用するの
が好ましく、双方の段階に負の定常差圧(真空)を使用するのが特に好ましい。
ウェルを含む上段フィルタープレートを備えており、(1つまたは複数の)ウェ
ルの各々の内部に、好ましくは(1つまたは複数の)ウェルの底部近傍にMF濾
過膜または粗濾過膜が配置されている。上段プレートは定常差圧の供給源との接
続手段を備えている。1つまたは複数のウェルを有する下段プレートが配備され
ており、下段プレートの(1つまたは複数の)ウェルの各々の内部に、好ましく
はウェルの底部近傍にUF膜が配置されている。下段プレートは負の定常差圧の
供給源との接続手段を備えている。下段プレートの下方に廃液コレクタまたはド
レンが配備されている。
壁を十分に破壊する段階と、 (b)1つまたは複数の精密濾過膜または粗濾過膜または両濾過膜の組合せに
よって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段階と、 (c)1つまたは複数の限外濾過膜によって(b)の濾液を濾過して、プラス
ミドまたはその他のDNAを1つまたは複数の限外濾過膜の上面に不通過物(r
etentate)として残留させる段階と、 (d)プラスミドまたはその他のDNAを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のDNAの回収方法を提供することである。
Aを遊離させる段階と、 (b)濾過を推進するために正圧を使用し1つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 (c)濾過を推進するために負圧を使用し1つまたは複数の限外濾過膜によっ
て(b)の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のDNAを1つまたは複数
の限外濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 (d)プラスミドまたはその他のDNAを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のDNAの回収方法を提供することである。
Aを遊離させる段階と、 (b)濾過を推進するために正圧を使用し1つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 (c)濾過を推進するために正圧を使用し1つまたは複数の限外濾過膜で(b
)の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のDNAを1つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 (d)プラスミドまたはその他のDNAを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のDNAの回収方法を提供することである。
Aを遊離させる段階と、 (b)濾過を推進するために負圧を使用し1つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 (c)濾過を推進するために正圧を使用し1つまたは複数の限外濾過膜で(b
)の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のDNAを1つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 (d)プラスミドまたはその他のDNAを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のDNAの回収方法を提供することである。
Aを遊離させる段階と、 (b)濾過を推進するために負圧を使用し1つまたは複数の精密濾過膜または
粗濾過膜または両濾過膜の組合せによって細胞成分を濾過し、濾液を収集する段
階と、 (c)濾過を推進するために負圧を使用し1つまたは複数の限外濾過膜で(b
)の濾液を濾過して、プラスミドまたはその他のDNAを1つまたは複数の限外
濾過膜の上面に不通過物として残留させる段階と、 (d)プラスミドまたはその他のDNAを限外濾過膜の上面から回収する段階
と、 から成るプラスミドまたはその他のDNAの回収方法を提供することである。
段フィルタープレートと1つまたは複数の限外濾過膜を有する下段フィルタープ
レートとを含み、上段フィルタープレートが下段フィルタープレートの上方に下
段フィルタープレートに近接して配置されている、プラスミドまたはその他のD
NAの回収装置を提供することである。
囲から明らかにされるであろう。
スミドまたはその他のDNA物質を遊離させるために対象となる細胞を破壊する
段階である。この段階は多様な方法で行うことができる。最も常用される方法は
、アルカリ性物質と水酸化ナトリウム及びSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の
ような水性流体を含有する界面活性剤とを細胞の再浮遊溶液に導入して細胞の溶
解を惹起するアルカリ溶解手順を使用する方法である。
膜によって濾過して、細胞壁、変性タンパク質及び染色体DNAのような細胞破
片とその他の大きい細胞成分とを除去する。
に収集し、段階が個別段階であるときは濾液を適当な容器に収集する。
スミドまたはその他のDNAを限外濾過膜の上部に収集する。次いで段階13で
、使用すべきプラスミドまたはその他のDNAを回収する。
膜を使用するが、特に細胞破片の量が多いときまたは第一膜が早期に目詰まりし
易いときは細胞破片を完全に除去するために2つ以上の膜のシリーズを使用して
もよい。多数の膜を使用する場合、これらの膜を個別的に使用してもよく、また
は互いに連続的に配置してもよい。連続的に配置するときは、連続する膜の各層
の表示細孔径が同じであるかまたは次第に小さくなるのが好ましい。この実施態
様では、1つの粗フィルターを使用し、次いで1つの微孔質フィルター、2つの
粗フィルターまたは2つの微孔質フィルターを使用する。
細孔径は約0.01ミクロンから約100ミクロンの範囲、好ましくは約0.0
5ミクロンから約75ミクロンの範囲、より好ましくは約0.1ミクロンから約
50ミクロンの範囲である。
ミクロンの範囲、好ましくは約100ミクロンから約500ミクロンの範囲、よ
り好ましくは約100ミクロンから約250ミクロンの範囲である。
クス、または、ステンレススチールもしくはニッケルのような金属から形成され
得る。膜の製造に使用できる好ましいポリマーとして、ニトロセルロース、再生
セルロース、酢酸セルロース、並びに、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、
ポリフェニルスルホン及びポリアリールスルホンのようなポリスルホン類、ポリ
フッ化ビニリデン、並びに、超高分子量ポリエチレン、低密度ポリエチレン及び
ポリプロピレンのようなポリオレフィン類、ナイロンとその他のポリアミド類、
PTFE、並びに、ポリ(TFE−co−PFAVE)のような熱可塑性フッ化
ポリマー、ポリカーボネート類、または、Minneapolis,Minne
sotaの3Mから入手可能なEMPORERTM膜のような粒子充填膜が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。膜は多孔質流延膜、製織もしくは
不織材料、または、トラックエッチングのような別の慣用の膜製造法によって形
成された多孔質材料でよい。これらの膜はすべて当業界で周知であり、Mill
ipore Corporation of Bedford,Massach
usettsのような多くの供給業者から市販されている。
術は公知であり、その例として、グラフト化、架橋、または、親水性材料の単な
る重合、または、膜の表面コーティングなどが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。
/132,369及び2000年2月14日出願のUSSN 60/182,3
57に教示されている遠心力、重力または定常差圧(例えば正圧または真空)の
ような慣用の任意の処理によって開始し得る。これらの特許の教示はその全体が
参照によって本発明に含まれるものとする。
の水面の高さ(head height)の低下が原因で時間の経過に伴って圧
力が絶えず減少していく遠心法の圧力と違って、定常差圧法では液体に作用する
圧力が濾過サイクルを通じて一定に維持され得る。更に、圧力は該圧力の作用を
受ける液体の水面の高さから独立しているので、濾過処理をその完了まで推進す
るために圧力を時間の経過に伴って増加させることもできる。所望の場合には圧
力の経時的な減少もこの定義に包含される。しかしながら遠心と違って、この減
少は管理されており、液体の水面の高さから独立しているので予定外の流束の減
衰は抑制または抑止される。
重力により及ぶ力でなく定常差圧が濾過処理の駆動力になる。正の差圧(正圧)
を使用するとき、該圧力が典型的には液体の頂部に加えられて液体の膜通過を促
進する。負の差圧または真空を使用するとき、該圧力が典型的には膜の下流側に
加えられて液体の底部に作用し、膜を通して液体を吸引する。
因としては、濾過すべきサンプルの量、使用される膜の種類(膜の細孔径または
排除限界分子量(molecular cutoff)、膜の強度及び膜厚)、
膜の実効濾過面積、濾過を生じさせるための速度、及び、サンプルの分極レベル
がある。
完全に独立している。これは、方法が典型的には溶質の非分極性濃度で流束減衰
を全く蒙らないことを意味する。典型的には少量の場合、定常差圧によって推進
される限外濾過で得られる濃縮倍率は同じ長さの時間内に遠心によって得られる
濃縮倍率に比べてはるかに高いという結果が得られる。
リリットルである。より典型的には、方法が1ミリリットル未満、好ましくは0
.5ミリリットル(500マイクロリットル)未満の量を処理できる。十分な水
面の高さがあるので、遠心が定常差圧法と全く同様に速いという上限は存在する
(正確なレベルは特に、使用される流体並びに使用される定常差圧及び遠心のレ
ベルに依存する)。しかしながら、透析濾過に関して後述するように、遠心のほ
うが明らかに速いという速度であるときにも、遠心よりも本発明方法が好ましく
使用される正当な別の理由が存在する。例えば、本発明方法は透析濾過の必要性
を削除または軽減する。
かに速いことは明白である。定常差圧法が遠心よりも速くなる点を以後の記載で
“突破点(breakthrough point)”と呼ぶ。約0.300ミ
リリットルという少ない量を使用するとき、本発明方法は遠心よりも約60%速
い。
定常差圧を正常に加える圧力(1×)の3.5倍(3.5×)に増加させると、
濾過速度はほぼ6倍(6×)に増加する。更に、増加した(3.5×)差圧を用
いるとほぼ1分で突破点が生じる。これに比較して、不変化の(1×)圧力によ
る定常差圧を用いると突破点は7分で生じる。
合、本発明方法による濾過中にもある程度の流束減衰(flux decay)
が観察されるかもしれないが、これは、水面の高さとは無関係であり、濾過され
ている物質の固有特性に関係があると考えなければならない。これは、使用され
るサンプルの初期量が少ないほど、このような分極性材料の存在下であっても高
いレベルの限外濾過及び回収が十分な速度で得られることを意味する。このよう
な結果を遠心法で得ることは必ずしも可能ではない。
圧(例えば大気圧以上)でもよい。
Hg(169−914ミリバール)の力を使用し得る。より好ましくは、約10
インチから約27インチ(338−914ミリバール)を使用し得る。真空の力
のレベルは、システムの所望パラメーター、所望の限外濾過速度及び使用される
サンプルに適合するように使用者が容易に変更できる。
用し得る。より高い圧力に耐える強度をもつ装置を用いるならばより高い圧力の
使用も可能であろう。より好ましくは、約40psiから約60psiの範囲の
圧力を使用し得る。正圧のレベルは、システムの所望パラメーター、所望の限外
濾過速度及び使用されるサンプルに適合するように使用者が容易に変更できる。
当な水面の高さを形成し維持することが通常はできない少量の液体に対して特に
有用であることが知見された。このような量は一般に約1,000マイクロリッ
トル未満、好ましくは約500マイクロリットル未満であり、1マイクロリット
ル未満であってもよい。
て塩または汚染物質を減らし、次いで遠心濾過によって溶媒和した不純物及び塩
を除去する)の必要性が軽減または削除されることである。従ってこの方法は、
このような透析濾過段階に時間がかかりまた透析濾過段階が完全でないときには
得られる結果が歪められるような生物研究の分野で特に有利である。
ないことは公知である。従って、標準的なプロトコルではこれらの不純物を十分
に除去するために超純水または溶媒中で不通過物を希釈し、得られた物質を1回
または複数回再遠心する。
1マイクロリットルよりも少ない量になったとき、液体が限外濾過でなく主とし
て蒸発という現象によって除去されることは知見されている。何故ならば、水面
の高さが小さいので残留液体に圧力が殆ど作用せず、従って濾過が殆ど生じない
からである。このため、不純物は透析濾過フィルターの表面で脱水されるだけで
ある。不通過物に復元用液体を加えると、これらの物質は復元用液体に容易に溶
解し、不通過物と共に残留する。このため複数の透析濾過段階が必要になる。
)濾過はこれらの不純物を除去する主要手段という機能を維持しており、従って
不純物は膜を通過し、遠心によって達成できるよりもはるかに高度に不通過物か
ら除去される。本発明方法では1回の通過で本質的に全部の不純物が除去される
が、従来の遠心法では1回の通過で除去される量はしばしば不純物全量の90%
未満である。従って本発明方法では、濾過後の透析濾過段階の必要性が軽減また
は削除され、以後に使用するためのより純粋な物質が得られる。
速な処理が行われるので特に有用である。また、生物サンプルから不純物を除去
することを目的とするときにはもっと多い量の出発サンプルに対して使用でき、
遠心法よりも長い濾過時間を要するかもしれないが、透析濾過段階が殆ど不要で
あり、しかも、より純粋な不通過物が得られる。総処理時間(濾過と透析濾過)
が短縮されるので見掛け濾過時間の延長は障害にならない。
と、溶解段階または精密濾過段階で使用された溶解材料または水性流体とを含有
している。
過膜の表面にプラスミドを残留させて濾液のその他の成分を実質的に完全に除去
する。プラスミドは後で使用するために限外濾過膜の表面で収集される。限外濾
過には遠心、正圧または負圧などのいかなる方法を使用してもよいが、好ましく
は正または負の定常差圧またはその双方の組合せを使用する。
十分である。
量よりも大きい物質は主として膜の上流に残留し、排除限界分子量よりも小さい
物質は膜を通過するか膜中に移行する)の表示値は、回収を所望するプラスミド
またはその他のDNAのサイズ次第で、約3,000ダルトンから約300キロ
ダルトンの範囲でなければならない。
スルホン、ポリフェニルスルホン及びポリアリールスルホンのようなポリスルホ
ン類、ポリフッ化ビニリデン、並びに、ニトロセルロース及び再生セルロースの
ようなセルロース及びセルロース誘導体を非限定例とするグループから形成でき
る。これらの膜は典型的には、一般に高度な多孔質構造から形成される支持層を
有している。これらの支持層の典型的な材料は、紡糸接着(spun boun
ded)ポリエチレンまたはポリプロピレンのような種々の不織材料、紙または
ガラス、あるいは、膜自体と同じかまたは異なるポリマーから形成された微孔質
材料である。このような膜は当業界で公知であり、Millipore Cor
poration of Bedford,Massachusettsのよう
な種々の供給業者から市販されている。
edford,Massachusettsから市販されているYMTMまたは
BiomaxTMのような再生セルロース膜またはポリスルホン膜である。
は同時に作動できる複数の膜の形態で使用されてもよい。例えば、単一の膜をM
illiporeのAnalytical Stainless Steel
Filter Holder,Catalog #xx30 012 40のよ
うなフィルターホルダーまたはMilliporeのMicroconRTMデ
バイスに保持し得る。複数の膜を含むデバイスは、複数のMicroconRT
Mデバイス、または、Milliporeから入手できるMULTISCREE
NTMプレートのようなマルチウェルプレートを使用する。マルチウェルプレー
トのウェル数には複数の種類があり、典型的には1プレートあたり96ウェルま
たは384ウェルである。別のマルチウェル膜デバイスは1プレートあたり2ウ
ェルから1536以上のウェルを有するように設計され得る。単一デバイスまた
は多重デバイスの選択及び多重デバイス中の膜の数は用途及び回収すべきプラス
ミドの量に依存する。概して、必要量の総量はかなり少なく、MICROCONRTM デバイスのような小さい単一フィルターデバイスまたはMULTISCR
EENRTMプレートのような96ウェルもしくは384ウェルのマルチウェル
デバイスが好ましい。
深さ方向で対称または非対称の細孔形状(形態)を有し得る。対称という用語は
、細孔径が膜の一方の表面から他方の表面まで殆ど変化しないことを意味する。
非対称という用語は、細孔径が一方の側から他方の側まである程度変化すること
を意味する。非対称膜は多様な形態及び配置を有しているが、一般には、対称、
非対称、等方性部分と非対称部分との連続、膜の最も小さい細孔が構造の深部に
存在するような発散性非対称部分(diverging asymmetric portions)、最も小
さい細孔が1つの表面に存在し且つ2つの非対称層の境界近傍の細孔の寸法が隣
接する非対称層のいずれの細孔よりも小さい収束性非対称部分、から成るグルー
プから選択された形態を有している。製織(woven)形態または不織形態で
あるとき、膜は、広範囲の様々な細孔径を有することができ、対称または非対称
の定義で分類されない。膜はしばしば深部フィルター(depth filte
r)として分類される。
方法の説明と同様にして細胞を破壊し、段階21で1つまたは複数のMF濾過膜
及び/または粗濾過膜で順次濾過し、次いで段階22で1つまたは複数のUF膜
で正の定常差圧によって濾過する。これらの膜が図5に示す後述のデバイスに配
置されているとき、正圧は(1つまたは複数の)MF濾過膜及び/または粗濾過
膜だけに加えられ、その圧力がUF膜にも作用するであろう。あるいは、正圧が
各段階に個別に加えられてもよい。次いでUF濾過段階23の表面からプラスミ
ドを回収する。
範囲、好ましくは約0.17バールから約0.85バールの範囲である。2つの
濾過段階21及び22で圧力を個別に加える場合には、一方の段階で加える圧力
を他方の段階で加える圧力と同じにする必要はない。
は図1の実施態様の細胞破壊段階に等しい。精密濾過段階31及び限外濾過段階
32はいずれも各膜の下流側に負の定常差圧(CPD)を使用することによって
行う。しかしながら、図2の実施態様と違って、段階31及び32の各々に負圧
を個別に加えることが必要である。その理由は、現在入手可能なUF膜の特性で
は、MF濾過膜及び/または粗濾過膜に力を供給するだけでUF膜を十分に通過
できるような力を生じさせることができないからである。しかしながら、このよ
うな力を生じさせ得る特性をもつUF膜が開発されれば、そのようなUF膜を特
許請求の範囲に記載の本発明方法の範囲に包含することも本出願の目的である。
プラスミドまたはその他のDNAは段階33で回収される。
1の実施態様の教示と同様に行われ、精密濾過段階41は正圧によって行われ、
限外濾過段階42は負の定常差圧によって行われる。次いでプラスミドまたはそ
の他のDNAを段階43で回収する。
の教示と同様に行われ、精密濾過段階51は負の定常差圧によって行われ、限外
濾過段階52は正の定常差圧によって行われる。プラスミドまたはその他のDN
Aは段階53で回収される。
レート60と第二プレート61とは、プレート60がプレート61の上方に存在
しプレート61に着脱自在にシールされるように配置されている。上段プレート
60はカバー62を有しており、圧縮空気のような圧力源(図示せず)から正の
定常差圧を加えるポート63がカバー62に接続されている。ポートは、ポート
63に近接して図示されたバルブ64などによって正の定常差圧源に対して選択
的に開閉される。しかしながら、バルブをカバーと差圧源との間の別の位置に配
置できること、または、圧力源とポートとの接続を変更または遮断する別の公知
手段を使用できることは理解されよう。
び精密濾過膜または双方の組合せから選択された1つの膜65が使用されている
。
67がプレート間の着脱自在なシールを形成しているが、当業界で公知の別のシ
ール手段も使用できる。図では下段プレート61に取り付けられているが、上段
プレート60に取り付けられてもよくまたはプレート60または61の双方から
独立していてもよい。
されている。受容器はドレン(図示せず)に直結されてもよくまたは濾液を通過
させその後に個別に廃棄する単なる液溜めであってもよい。
ジまたはその他の保持素子を使用してもよい。
。これに代替して、各ウェルに1つの膜を備えた多数のウェルを有するプレート
も使用できることは理解されよう。8、12、96、384、1536個または
それ以上のウェルを有するプレートはMillipore Corporati
onなどのような供給業者から市販されており、公知である。
させるか、または、単独で溶解させてから上段プレートに移す。上段プレートは
ゴムガスケットなどを使用して下段プレートにシール的に接続されており、下段
プレートは液溜めまたはドレンに接続されている。カバーを取り付け、ポートを
圧縮空気源のような正の定常差圧源に接続する。液体成分及び微粒成分の全部が
上段プレートの膜を通過して下段プレートの膜の表面に到達するように圧力を作
用させる。次いで液体成分は同じこの圧力によってUF膜を通過し、プラスミド
またはその他のDNAはUF膜の上面に残留する。圧力を遮断し、カバー及び上
段プレートを取り外して廃棄する。次に以後の処理及び分析を行うために、例え
ばプラスミドまたはその他のDNAを再水和させ膜表面からピペットで吸い上げ
ることによって下段プレートの膜の上面からプラスミドまたはその他のDNAを
回収する。
効に作動する。負圧だけを使用する方法では該構造を使用できない。その理由は
、下段プレートのUF膜及び上段プレートの双方に通過流を生じさせるために必
要な負圧力は余りにも大きいのでUF膜が破壊されるからである。また、駆動力
を供給するポートが1つしかないので、正の圧力及び負の圧力を混用する方法で
も使用できない。
階で正の圧力及び他方の段階で負の圧力を混用するときに図1〜5の方法を実施
するのに適した第二の装置を示す。この図で、第一プレート80及び第二プレー
ト81は、プレート80がプレート81の上方に存在してプレート81に着脱自
在にシールされるように配置されている。但し、着脱自在にシールされることは
必須ではない。上段プレート80はカバー82を有しており、圧縮空気または真
空のような供給源(図示せず)から定常差圧を作用させる第一ポート83がカバ
ー82に接続されている。第一ポート83は該ポート83に近接して図示された
バルブ84などによって正の定常差圧源に選択的に開閉される。但し、バルブが
カバーと差圧源との間の別の位置に配置できること、または、差圧源とポートと
の接続を変更または遮断する別の公知手段を使用できることは理解されよう。
80は粗濾過膜及び精密濾過膜または両者の組合せから選択された1つの膜85
を含む。
87がプレート間の着脱自在なシールを形成している。但し、当業界で公知の別
のシール手段も使用できる。図では下段プレート81に取り付けられているが、
上段プレート80に取り付けられてもよく、または、プレート80もしくは81
の双方から分離していてもよい。
されている。受容器はドレン(図示せず)に直結しているかまたは濾液を通過さ
せ、その後に分離して廃棄する単なる液溜めであってもよい。
動力を供給するために使用される。第二ポート89は、ポート89に近接して図
示されたバルブ90などによって正の定常差圧源に選択的に開閉される。但し、
バルブがカバーと差圧源との間の別の位置に配置できること、または、差圧源と
ポート89との接続を変更または遮断する別の公知手段を使用できることは理解
されよう。
たは一方が正で他方が負)によって同時に使用されてもよくまたは順次に(第一
ポートの次に第二ポートの順で)使用されてもよい。
ジまたはその他の保持素子を使用してもよい。
。これに代替して、各ウェルに1つの膜を備えた多数ウェルを有するプレートも
使用できることは理解されよう。8、12、96、384、1536個またはそ
れ以上のウェルを有するプレートはMillipore Corporatio
nなどのような供給業者から市販されており、公知である。
させるか、または、単独に溶解させてから上段プレートに注入する。上段プレー
トはゴムガスケットなどを使用して既に下段プレートにシール的に接続されてお
り、下段プレートは液溜めまたはドレンに接続されている。カバーを取り付け、
ポートを圧縮空気源または真空のような正または負の定常差圧源に接続する。液
体成分及び微粒成分の全部が上段プレートの膜を通過して下段プレートのUF膜
の表面に到達するように圧力を作用させる。次いで液体成分は第二ポートから送
出された濾過駆動力によってUF膜を通過するが、駆動力は上段プレートで使用
された力と同じ種類の力(例えば双方が負の定常差圧であるかまたは双方が正の
定常差圧である)であるか、または、異なる種類の力(例えば、一方が負の定常
差圧であり他方が正の定常差圧である)であろう。力が最初に上段プレートに加
えられ次いで下段プレートに加えられるか(順次的)、または、力が同時に加え
られる(同時的)。プラスミドまたはその他のDNAはUF膜の上面に残留する
。駆動力または駆動圧力を、順次処理のときは下段プレートから遮断し、同時処
理のときは双方のプレートから遮断し、カバーと上段プレートとを取り外して廃
棄する。次に以後の処理及び分析を行うために、例えばプラスミドまたはその他
のDNAを再水和させ膜表面からピペットで吸い上げることによって下段プレー
トの膜の上面からプラスミドまたはその他のDNAを回収する。
ク(2ml容量)(Beckman−Coulter,Fullerton,C
A)中の適当な抗生物質を加えた2×LBの1ミリリットルのアリコートに接種
した。プレートをカバーで覆い、インキュベーターに固定した。これらを37℃
、320r.p.m.で20時間インキュベートした。
:MATA09600)で覆い、1500×gで5分間遠心した。遠心後、培養
上清を適当な処理用容器に直ちに傾瀉した。プレートを転倒させ、作業台に載せ
た数枚重ねの紙タオルの上でしっかりと叩いて、残留培養上清を除去した。
Cl,pH8;30mMのNa2EDTA;60μg/mlのリボヌクレアーゼ
A、いずれもSigma,St.Louis,Moから入手可能)に再懸濁させ
た。次に、溶液II(0.2NのNaOH;1%のSDS、Sigmaから入手
可能)を加えて直ちにプレートシェーカーで1分間激しく(最大速度)混合して
、細胞を溶解させた。このミックスを室温で更に2分間インキュベートした。8
0μlの溶液III(3.6Mのカリウム;6Mの酢酸塩,pH5以下、Sig
maから入手可能)を加えて直ちにプレートシェーカーで2分間激しく(最大速
度)混合して、細胞を溶解させた。
たは等価のデバイス)の底部に配置した。ディープウェルの側面に沿ってピペッ
トの先端を溶解液中に下ろして底部に到達させることによって溶解液を取り出し
た。流体中でピペットで3回上下させた。各ディープウェルの底部から180μ
lの溶解液を取り出して、MultiScreenTM−NA溶解液清澄化プレ
ート(Millipore:MANANLY50)の対応ウェルに吐出した。
トから取り出し、溶解液清澄化プレートの対応ウェルに移した。プレートをマニ
ホルドの頂部に載せ、真空を8インチHg(0.27バール−203トル)に調
整した。真空を3分間作用させ、溶解液をプレートからUFプレートに引き出し
た。第一プレートを廃棄した。
、完全真空(24インチHg)を8分間作用させた。濾液は廃棄物行きにした。
を4分間作用させ、濾液は廃棄物行きにした。プラスミドを溶解するために、U
Fプレートの各ウェルに50μlのTEバッファ(10mMのトリス−HCl,
pH8;1mMのNa2EDTA、Sigmaから入手可能)を添加した。プラ
スミドを回収するために、液体ハンドラーでピペットで10回上下させることに
よって再懸濁させ、v形底部をもつマイクロプレートに移した。
した。配列決定の相対品質をET Terminator Sequencin
g(Amersham Pharmacia Biotech)及びMegaB
ACERTM1000配列決定システム(Amersham Pharmaci
a Biotech)上の毛管電気泳動を順次行うことによって決定した。
ク(2ml容量)中の適当な抗生物質を加えた2×LBの1ミリリットルのアリ
コートに接種した。プレートをカバーで覆い、インキュベーターに固定し、37
℃、320r.p.m.で20時間インキュベートした。
:MATA09600)で覆い、1500×gで5分間遠心した。遠心後、培養
上清を適当な処理用容器に直ちに傾瀉した。プレートを転倒させ、作業台に載せ
た数枚重ねの紙タオルの上でしっかりと叩いて、残留培養上清を除去した。
いでピペットで撹拌することによって再懸濁させた。80μlの溶液IIを加え
て直ちにプレートシェーカーで1分間激しく(最大速度)混合した。次に室温で
更に2分間インキュベートした。80μlの溶液IIIを加えて直ちにプレート
シェーカーで2分間激しく(最大速度)混合した。
llipore:MAFB N0B 50)の各ウェルに加えた。FBプレート
を真空マニホルド(Millipore;MAVM 096 0Rまたは等価デ
バイス)の底部に配置した。
解液中に下ろして底部に到達させピペットを3回上下させた。各ディープウェル
の底部から180μlの溶解液を取り出して、MultiScreenTM−N
A溶解液清澄化プレート(Millipore:MANANLY50)の対応ウ
ェルに吐出した。
ル−203トル)に調整した。真空を3分間作用させ、溶解液をNAプレートか
ら結合溶液を予め充填したUFプレートに引き出した。NAプレートを廃棄した
。
、ピペットを数回上下させることによって清澄化溶解液を結合溶液と十分に混合
させた。FBプレートを再度、空のマニホルドの頂部に載せ、完全真空を1分間
作用させた。濾液は廃棄物行きにした。この時点でプラスミドDNAはFBブレ
ートに結合した。
し、完全真空を1分間作用させた。濾液は廃棄物行きにした。真空を3分間作用
させながらこの段階を繰り返した。
ートの底部を清拭した。FBプレートを遠心機位置合せフレームの付いた標準マ
イクロタイタープレート(Millipore:MACF09604)の頂部に
載せ、1000×gで10分間遠心して乾燥させた。プラスミドを溶解するため
に、FBプレートの各ウェルに70μlのTEバッファを添加した。TEは各ウ
ェルの中央の近傍に送出した。1000×gで5分間遠心することによってプラ
スミドを溶出させた(溶出液量は典型的には45μlである)。
たはその他のDNAの回収に必要な処理段階の数が削減され処理時間が短縮され
る。第二に、エタノールのような汚染物質を導入しないで処理できる。加えて、
プラスミドまたはその他のDNAを従来技術よりも実質的に大量に、典型的には
平均で20%から30%の増量で回収できる。更に、UF段階で定常差圧を駆動
力として使用するとき、回収されたプラスミドは従来の方法で得られたプラスミ
ドよりも純粋であり、しばしば塩またはその他の不純物を全く含有せず、従って
、複数の透析濾過段階が不要である。限外濾過プレートの頂部からプラスミド及
びその他のDNAを回収すること及び遠心が削除されることによって本発明方法
は全自動化に好適である。最後に、ガラス繊維上に形成される活性部位の量によ
って限定された容量をもつ従来の結合/溶出方法と違って、本発明は本質的に無
限の容量を有しており、フェムトグラムからミリグラムの範囲の量のプラスミド
またはその他のDNAを回収するようにシールできる。
Claims (24)
- 【請求項1】 (a)細胞壁を破壊して、プラスミドまたはその他のDNA
を含む細胞成分を遊離させる段階と、(b)精密濾過膜、粗濾過膜及びその組合
せから成るグループから選択された1つまたは複数の膜で細胞成分を濾過し、濾
液を収集する段階と、(c)1つまたは複数の限外濾過膜で(b)の濾液を濾過
して、1つまたは複数の限外濾過膜の上面にプラスミドまたはその他のDNAを
不通過物として残留させる段階と、(d)限外濾過膜の上面からプラスミドまた
はその他のDNAを回収する段階と、から成るプラスミドまたはその他のDNA
の回収方法。 - 【請求項2】 細胞壁をアルカリ溶解プロセスによって破壊し、約0.1ミ
クロンから約50ミクロンの範囲の表示細孔径をもつ1つまたは複数の膜で濾過
すること、及び、1つまたは複数の限外濾過膜が表示値で約3,000ダルトン
から約300キロダルトンの範囲の排除限界分子量を有していることを特徴とす
る請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 濾過段階(b)及び(c)を、遠心、定常差圧及びその組合
せから成るグループから選択された処理によって行うことを特徴とする請求項1
に記載の方法。 - 【請求項4】 段階(b)及び(c)を、正の定常差圧によって行うことを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 段階(b)及び(c)を、負の定常差圧によって行うことを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 段階(b)が遠心及び正の定常差圧から成るグループから選
択された処理によって行われ、段階(c)が負の定常差圧によって行われること
を特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 1つまたは複数の精密濾過膜が、天然または合成のポリマー
、セラミックス及び金属から成るグループから選択された材料から形成され、(
1つまたは複数の)限外濾過膜がポリスルホン類、ポリエーテルスルホン類、ポ
リフェニルスルホン類、ポリアリールスルホン類、ポリフッ化ビニリデン、セル
ロース及びセルロース誘導体から成るグループから選択された材料から形成され
ることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 1つまたは複数の精密濾過膜及び1つまたは複数の限外濾過
膜が有している細孔の形態が、一方の表面から他方の表面に向かって、対称、非
対称、等方性部分と非対称部分との連続、膜の最も小さい細孔が膜構造の深部に
存在するような発散性非対称部分、最も小さい細孔が1つの表面に存在し且つ2
つの非対称層の境界近傍の細孔の寸法が隣接する非対称層のいずれの細孔よりも
小さい収束性非対称部分、から成るグループから選択されることを特徴とする請
求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 濾過段階(b)及び(c)が正の定常差圧を使用することを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 濾過段階(b)が正の定常差圧を使用し、段階(c)が負
の定常差圧を使用することを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 濾過段階(b)が負の定常差圧を使用し、段階(c)が正
の定常差圧を使用することを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】 濾過段階(b)及び(c)が負の定常差圧を使用すること
を特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 濾過段階(b)及び(c)が順次に行われることを特徴と
する請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 濾過段階(b)及び(c)が同時に行われることを特徴と
する請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 精密濾過膜及び粗濾過膜から成るグループから選択される
1つまたは複数の膜を有する上段フィルターと1つまたは複数の限外濾過膜を有
する下段フィルターとを含み、上段フィルターが下段フィルターの上方に下段フ
ィルターに近接して配置されており、更に、上段フィルター及び下段フィルター
に濾過を実行させる駆動力を供給する1つまたは複数の手段を含むプラスミド回
収装置。 - 【請求項16】 フィルターが互いに液密的にシールされていることを特徴
とする請求項15に記載の装置。 - 【請求項17】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が定常差圧である
ことを特徴とする請求項15に記載の装置。 - 【請求項18】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が正の圧力である
ことを特徴とする請求項15に記載の方法。 - 【請求項19】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が負の圧力である
ことを特徴とする請求項15に記載の方法。 - 【請求項20】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が正の定常差圧で
あることを特徴とする請求項15に記載の方法。 - 【請求項21】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が負の定常差圧で
あることを特徴とする請求項15に記載の方法。 - 【請求項22】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が上段フィルター
に加えられた正の力及び下段フィルターに加えられた負の力であることを特徴と
する請求項15に記載の装置。 - 【請求項23】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が上段フィルター
次いで下段フィルターに順次に作用することを特徴とする請求項15に記載の装
置。 - 【請求項24】 駆動力を供給する1つまたは複数の手段が上段フィルター
及び下段フィルターに同時に作用することを特徴とする請求項15に記載の装置
。
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