CN101096699B - 用于制备液体微生物分析样品的方法和装置 - Google Patents

用于制备液体微生物分析样品的方法和装置 Download PDF

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Abstract

制备装置包括主体(2)，在所述主体中固定有第一隔膜(3)和第二隔膜(4)，所述第一隔膜(3)具有预定的第一孔径，所述第二隔膜(4)具有比所述第一隔膜(3)的所述预定的第一孔径小的预定的第二孔径，所述主体还包括用于回收收集在所述第二隔膜(4)上的所述样品的装置(16，20)。制备这种样品的方法包括获取这种制备装置(1)、使预定容积的所述液体通过所述第一隔膜(3)和所述第二隔膜(4)以在所述第二隔膜(4)上收集样品、以及回收收集在所述第二隔膜(4)上的所述样品。

Description

用于制备液体微生物分析样品的方法和装置
技术领域
本发明涉及液体微生物分析样品的制备。
背景技术
众所周知，存在可能包含不同类型微生物的液体，在这些液体中，微生物分析必须仅涉及一种或几种类型。
这些液体存在于，例如，用于单克隆抗体加工链的末端。更特别地是，具有能产生抗体的生育真核细胞的这种液体可能会受到细菌和/或病毒的感染。
真核细胞的存在可以在凝胶培养基的常规检测(假阴性的检测)的情况下通过释放反向影响微生物成长的毒素，或在由发光、荧光、通过放大或杂交或这些微生物的核酸分析的其他方法进行快速检测(假阳性)的情况下通过扰乱结果的读取来干扰细菌和病毒中的微生物分析。
为了实现对这类液体的可靠分析，因此需要适当的制备样品，只在属于需要检测的微生物类型的微生物(在以上给出的例子中的细菌和/或病毒)中选择样品。
用于制备液体分析样品的方法是早已公知的，在该液体中，通过发觉不同类型微生物之间的形态特征(物理的和/或化学的)的不同而选择要检测的微生物。
更特别地是，早已公知的制备方法包括选择步骤，该选择步骤包括添加液体以分析适合实现属于不需要保存在样品中的微生物类型的微生物的特定溶解的反应物，随即在隔膜上过滤液体，以使得在隔膜上选择仅包含要检测的，并且与溶解试剂不发生特殊反应的微生物(它们经受毁坏的溶解并穿过隔膜)的样品。这样选择的样品随即回收并以传统的或快速微生物分析技术进行分析。
用于形成样品的另一种方案包括通过低速离心法根据它们在质量上的不同而将微生物从其他物质中分离出来。
发明内容
本发明涉及根据相似的方法制备样品，其同时具有改善的性能，并且实施起来更加简单，更加方便。
为此，提供了一种用于制备液体微生物分析样品的方法，所述液体可能包含几种不同类型的微生物，每种微生物具有预定形态特征，所述方法包括从所述不同类型微生物中选择微生物的步骤，其特征在于，所述选择步骤包括：
获取用于制备所述样品的装置的步骤，所述装置包括大体管状主体，在所述主体中固定有第一隔膜和第二隔膜，所述主体具有用于引入所述液体的开口、在所述引入开口和所述第一隔膜之间的第一腔室、在所述第一隔膜和第二隔膜之间的第二腔室、以及在所述第二隔膜与第一隔膜相反侧的第三腔室，所述第一隔膜具有预定的第一孔径，所述第二隔膜具有比所述第一隔膜的所述预定的第一孔径小的预定的第二孔径；
使预定容积的所述液体通过所述第一隔膜从第一腔室至第二腔室的步骤；
使所有到达第二腔室的滤液通过所述第二隔膜从所述第二腔室至第三腔室以在所述第二隔膜上收集所述样品的步骤，所述样品具有从所述不同类型的微生物中选择的所述微生物，从所述不同类型的微生物中选择的所述微生物是其尺寸小于所述第一隔膜的预定孔径、并大于所述第二隔膜的预定孔径的微生物；并且
回收收集在所述第二隔膜上的所述样品的步骤。
在根据本发明的方法中，由用于分析的微生物构成的样品(例如细菌和/或病毒)从不需要的尺寸巨大以致不能通过第一隔膜的微生物(例如真核细胞)中分离出来后被收集在第二隔膜上。
这种基于它们尺寸的不同对微生物进行的选择非常有效，通常比前述现有技术中的方法更有效。
对于这种现象的一种解释是，在离心分离的情况下，要收集的微生物的一部分通过离心力会带上要除去的微生物；并且，在化学溶解的情况下，溶解试剂从来不是具有完美地选择性，使得要收集的微生物的小但非零的部分经受溶解，并且因此不收集在隔膜上，然而，在根据本发明的方法中(由尺寸选择)，这种边际效应可以忽略，或甚至不存在。
根据优选特征，出于加工和使用都简单与方便的原因：
获取制备装置的步骤包括选择制备装置的步骤，所述装置的主体包括所述第一隔膜固定其上的第一部分、和所述第二隔膜固定其上的第二部分，所述第一部分和第二部分可相互分离，并且回收所述样品的步骤包括从所述主体的所述第一部分分离所述主体的所述第二部分的步骤；和/或
获取制备装置的步骤包括选择在其制备装置的主体上形成能够被打开以与所述第二腔室连通的辅助开口的制备装置的步骤，以及回收所述样品的步骤包括打开所述开口的步骤、通过所述辅助开口淀积试剂以溶解所述第二隔膜上选择的所述微生物的步骤、以及使所形成的溶解产物通过所述第二隔膜从第二腔室至第三腔室的步骤。
因此，依靠形成为两个可分离部分的主体或依靠设置在主体中的开口可接近第二隔膜，更具体地是，接近样品收集在其上的第二隔膜的表面。
根据其他优选特征，出于如上述相同的原因：
通过将所述第三腔室放置在减小的压力下进行所述液体通过所述隔膜的步骤；
通过将所述第一腔室放置在增大的压力下进行所述液体通过所述隔膜的步骤；
通过离心分离所述制备装置进行所述液体通过所述隔膜的步骤；
获取制备装置的步骤包括选择孔径大于1μm的隔膜作为所述第一隔膜的步骤；
获取制备装置的步骤包括选择孔径小于0.65μm的隔膜作为所述第二隔膜的步骤；和/或
获取制备装置的步骤包括选择孔径小于0.1μm的隔膜作为所述第二隔膜的步骤。
根据第二方面，本发明还涉及适合于为实现以上提出的方法而用于制备样品的装置，其特征在于，所述装置包括大体管状主体，在所述主体中固定有第一隔膜和第二隔膜，所述主体具有用于引入所述液体的开口、在所述引入开口和所述第一隔膜之间的第一腔室、在所述第一隔膜和第二隔膜之间的第二腔室、以及在所述第二隔膜与第一隔膜相反侧的第三腔室，所述第一隔膜具有预定的第一孔径，所述第二隔膜具有比所述第一隔膜的所述预定的第一孔径小的预定的第二孔径；所述装置适于使预定容积的所述液体通过所述第一隔膜从第一腔室至第二腔室，并接着使所有到达第二腔室的滤液通过所述第二隔膜从第二腔室至第三腔室以在所述第二隔膜上收集所述样品；所述主体还包括用于回收收集在所述第二隔膜上的所述样品的装置。
制备装置因此设计成可使全部预定容积通过两个隔膜(除了由隔膜保持部分的情况)，而且依靠用于回收样品的装置可接近样品。
应注意的是，具有几级的简单过滤装置，例如溶液净化装置，不能作为根据本发明的制备装置，因为这种过滤装置不是由隔膜制成，不适于使到达中间腔室的所有滤液通过第二级(剩余滤液总是保留)和/或缺少用于回收样品的装置。
根据优选特征，出于加工和使用都简单与方便的原因，当潮湿时，所述第一隔膜对于空气是可渗透的。
如此，当液体完全从第一腔室中排空，并且第一隔膜与空气在朝向腔室的侧面上相接触时，隔膜依靠其孔的足够尺寸，保持对空气的可渗透性(无泡点现象)，以使得空气可以通过隔膜渗透到第二腔室中，从而能够排空其中包含的液体。
根据其他优选特征，出于如上所述的相同原因：
所述第一隔膜的孔的直径大于1μm；
所述第二隔膜的孔的直径小于0.65μm；
所述第二隔膜的孔的直径小于0.1μm；
所述主体包括所述第一隔膜固定其上的第一部分以及所述第二隔膜固定其上的第二部分，以及所述回收装置是用于从所述第一部分分离所述第二部分的装置；
所述回收装置包括能够被打开地形成在所述主体上、并与所述第二腔室连通的开口；
所述主体包括限定出所述第三腔室的杯状物；和/或
所述杯状物是可分离的。
附图说明
参照附图，特定地通过优选地但非限制性地示例，本发明的特征和优点将从以下说明中变得显而易见，其中：
图1为根据本发明的制备装置的横截面视图；
图2为与图1相似的装置的视图，但其中装置主体的两个套在一起的部分已经分离开来；
图3为与图1相似的制备装置的第二实施例的视图；以及
图4为与图1相似的制备装置的第三实施例的视图。
具体实施方式
图1中所示的制备装置1包括大体管状主体2，其中固定了隔膜3、隔膜4以及两个多孔支撑件5和6。
隔膜3和4由聚偏氟乙烯(PVDF)构成，隔膜3具有等于5μm的孔径，隔膜4具有等于0.4μm的孔径。
主体2由一个套在另一个之中的部分9和部分10构成。部分9具有用于液体引入的开口7，同时部分10具有用于液体排出的开口8。
部分9具有在一侧上限定开口7，并在相对一侧连接第二部分16的第一圆柱形部分15，该第二部分16也是圆柱形、并且直径小于部分15的直径，部分15和16通过横向环形壁17相连接。
多孔支撑件5紧邻横向壁17固定，并且由隔膜3密封，隔膜3通过其表面12从与开口7相同侧紧靠多孔支撑件5(图1)。
部分10包括直径基本上等于圆柱形部分15的直径的第一圆柱形部分20、直径基本上等于圆柱形部分16的直径的第二圆柱形部分21、以及直径小于部分21的直径并限定出开口8的第三圆柱形部分22。
部分20和21通过横向环形壁23相互连接，而部分21和22通过横向环形壁24相互连接。
多孔支撑件6紧邻环形壁23固定，并且由隔膜4密封，隔膜4通过其表面14紧靠多孔支撑件6，隔膜的表面13朝向多孔支撑件5(图1)。
具有隔膜3的部分9限定出用于允许液体进入过滤器的腔室26，处于套装状态的部分9和10与隔膜3和4限定出中间腔室27，而具有隔膜4的部分10限定出用于液体排出的腔室28。
在主体2的部分10中的部分9处于套装状态时，圆柱形部分16的向外翻转的表面面对圆柱形部分20的内表面，而它们通过弹性变形相互抵靠，以使得将部分9和10保持固定在一起。
现在将对从要分析的液体制备样品的不同步骤进行说明，该液体可能包含真核细胞和细菌，需要从那些细胞中检测细菌的存在。
第一步，操作者将圆柱形部分22连接至真空源(例如真空泵)，以将腔室28放置在降低的压力之下，并且将预定容积(例如10ml)的液体输送至腔室26中。
将腔室28放置在降低的压力之下导致将腔室27放置在降低的压力下，以使得预定容积的液体被吸取，并且穿过隔膜3和支撑件5，以占据腔室27。
隔膜3的孔的尺寸设计成使得只有最大尺寸的微生物，此处的真核细胞，能够由该隔膜保持；而其他微生物，此处的细菌，穿过隔膜和多孔支撑件5，以到达占据腔室27的滤液。
而且，隔膜3的大尺寸孔意味着即使在隔膜潮湿的时候，它仍保持对空气的可渗透性(无泡点现象)，以使得空气可以通过隔膜3渗透到腔室27中。
由于隔膜允许空气穿过，包含在腔室27中的滤液随即通过隔膜4和支撑件6流出以占据腔室28，并且随即通过排出开口8离开主体2。
隔膜4的孔的尺寸设计成使得保留需要检测的细菌。
一旦这些操作已经实施，操作者从圆柱形部分22断开真空源。
接下来，通过相对于部分10滑动部分9使部分9和10分离，以使得它们如图2中所示的相互脱离。
隔膜4以及尤其在其上收集样品的该隔膜表面13因此变为可接近的。
可把隔膜取出，将其放置成与凝胶培养基相接触，并且随即将组件放置到培养器中以培养细菌。
另一方案包括通过从表面13侧在其上沉积试剂来处理隔膜(在从部分10中取出或未取出之后)，该反应物通过发光显示细菌的ATP的存在，或另一种可能是反应物可通过荧光识别细菌。
另一种方案包括通过传统方法(例如PCR类型)分析在隔膜4上收集的细菌的DNA。
如果需要独立于隔膜回收样品，还可在在隔膜上淀积用于溶解细菌的试剂。
通过再次将该装置连接至真空源，包含细菌的生物材料的溶解产物随即穿过隔膜4和腔室28，收集在布置于开口8外的容器内。回收在该容器内的液体可能随即由快速微生物检测方法(例如通过发光)进行分析。
根据本发明的装置与微生物的快速检测方法的组合使用使得可在短期内大规模地检测可能包含几种类型微生物的所有液体样品。
制备装置的另一个实施例表示在图3中。
通常，对于相同的元件使用相同的附图标记，并增加了数字100。
制备装置101适合放置在离心机中，以使得在不需要将制备装置放置在降低的压力下的情况下，液体穿过两个隔膜。
在该实施例中，去除了环形壁24和圆柱形部分22，而圆柱形部分121相对于前述实施例的部分21延伸，以使得可将其安装在属于主体102的杯状物130上，从而当液体从开口108流出时将第二滤液取出，或者回收杯状物中的溶解产物，一旦已经排空第二滤液，需要独立于隔膜4回收样品(通过在隔膜上淀积溶解试剂)。
杯状物因此适合从部分110分离(通过沿圆柱形部分121滑动)，以排空第二滤液或便于接近溶解产物，从而对溶解产物进行快速微生物检测，例如，通过向杯状物中添加由发光显示ATP的存在的试剂。
另一个实施例表示在图4中。
在该实施例中，制备装置201具有与制备装置101相似的结构，除了通过可取下的塞子以液密方式密封的开口232，该开口横向设置在主体202的部分210的圆柱形部分220中。
一旦样品已经制备并取下塞子233，该开口使得可根据需要接近腔室227、以及尤其是隔膜3的表面13，例如，在不需要分离主体202的部分209和210的情况下，在此沉积溶解试剂，微生物的生物材料随即回收在杯状物230中。
在一种变形中，隔膜4的孔的直径小于0.1μm，以使得在隔膜上收集细菌和/或病毒。
在另一种变形中，通过将进入腔室26放置在增大的压力下，液体穿过隔膜3和4，例如使用与圆柱形部分15啮合的活塞，通过在活塞与液体之间保持大量空气。当活塞被驱动时，其引起液体容积的位移、以及压缩在活塞与液体之间的空气容积的位移，以使得腔室26放置在增大的压力下。液体从而渗透进入腔室27，并且随即被由活塞推动的空气冲洗，空气又通过对空气保持可渗透性的隔膜3渗透进入腔室27。
在更进一步的变形中，要检测的微生物不是细菌或病毒，而是例如酵母菌(其具有足够小的尺寸，不会被第一隔膜保留住)或真菌。
在另一种变形中，要分析的液体不包含真核细胞，而包含其他类型的微生物(从要检测的微生物中分离出来的)，例如酵母菌或其他丝状真菌。
在再一其他变形中，制备装置的主体的两个部分搭扣配合在一起，并且部分的分离由例如破坏搭扣配合底部而实现。
在另一变形中，两个部分形成单一件，并且由将断裂的易碎区域连接，以便于将两部分相互分离。
在另一变形中，收集样品的隔膜不密封到制备装置的主体，但压靠住“O”型环形密封和/或隔膜由聚苯醚砜(PES)、聚碳酸酯、聚酯构成或另一可能是纤维素脂。
本发明并不限于说明和描述的实施例，而是覆盖了任意变形形式。

Claims (17)

1.一种用于制备液体微生物分析样品的方法，所述液体可能包含几种不同类型的微生物，每种微生物具有预定形态特征，所述方法包括从所述不同类型微生物中选择微生物的步骤，所述选择步骤包括：
获取用于制备所述样品的装置(201)的步骤，所述装置包括大体管状主体(202)，在所述主体中固定有第一隔膜(3)和第二隔膜(4)，所述主体(202)具有用于引入所述液体的开口(207)、在所述引入开口(207)和所述第一隔膜(3)之间的第一腔室(226)、在所述第一隔膜(3)和第二隔膜(4)之间的第二腔室(227)、以及在所述第二隔膜(4)与第一隔膜(3)相反侧的第三腔室(228)，所述第一隔膜(3)具有预定的第一孔径，所述第二隔膜(4)具有比所述第一隔膜(3)的所述预定的第一孔径小的预定的第二孔径；
使预定容积的所述液体通过所述第一隔膜(3)从第一腔室(226)至第二腔室(227)的步骤；
使所有到达第二腔室(227)的滤液通过所述第二隔膜(4)从所述第二腔室(227)至第三腔室(228)以在所述第二隔膜(4)上收集所述样品的步骤，所述样品具有从所述不同类型的微生物中选择的所述微生物，从所述不同类型的微生物中选择的所述微生物是其尺寸小于所述第一隔膜(3)的预定孔径、并大于所述第二隔膜(4)的预定孔径的微生物；并且
回收收集在所述第二隔膜(4)上的所述样品的步骤；
其特征在于，获取制备装置的步骤包括选择在其主体(202)上形成能够被打开以与所述第二腔室(227)连通的辅助开口(232)的制备装置(201)的步骤，所述辅助开口(232)由可取下的塞子以液密方式密封。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，回收所述样品的步骤包括打开所述辅助开口(232)的步骤、通过所述辅助开口(232)淀积试剂以溶解所述第二隔膜(4)上选择的所述微生物的步骤、以及使所形成的溶解产物通过所述第二隔膜(4)从第二腔室(227)至第三腔室(228)的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，获取制备装置的步骤包括选择制备装置(201)的步骤，所述装置的主体(202)包括所述第一隔膜(3)固定其上的第一部分(209)、和所述第二隔膜(4)固定其上的第二部分(210)，所述第一部分和第二部分可相互分离。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过将所述第三腔室(228)放置在减小的压力下进行所述液体通过所述隔膜(3，4)的步骤。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过将所述第一腔室(226)放置在增大的压力下进行所述液体通过所述隔膜(3，4)的步骤。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过离心分离所述制备装置(201)进行所述液体通过所述隔膜(3，4)的步骤。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，获取制备装置(201)的步骤包括选择孔径大于1μm的隔膜作为所述第一隔膜(3)的步骤。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，获取制备装置的步骤包括选择孔径小于0.65μm的隔膜作为所述第二隔膜(4)的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，获取制备装置的步骤包括选择孔径小于0.1μm的隔膜作为所述第二隔膜(4)的步骤。
10.一种适合于实施如权利要求1至9中任一方法的用于制备样品的装置，所述装置包括大体管状主体(202)，在所述主体中固定有第一隔膜(3)和第二隔膜(4)，所述主体(202)具有用于引入所述液体的开口(207)、在所述引入开口(207)和所述第一隔膜(3)之间的第一腔室(226)、在所述第一隔膜(3)和第二隔膜(4)之间的第二腔室(227)、以及在所述第二隔膜(4)与第一隔膜(3)相反侧的第三腔室(228)，所述第一隔膜(3)具有预定的第一孔径，所述第二隔膜(4)具有比所述第一隔膜(3)的所述预定的第一孔径小的预定的第二孔径；所述装置适于使预定容积的所述液体通过所述第一隔膜(3)从第一腔室至第二腔室，并接着使所有到达第二腔室(227)的滤液通过所述第二隔膜(4)从第二腔室至第三腔室以在所述第二隔膜(4)上收集所述样品；所述主体还包括用于回收收集在所述第二隔膜(4)上的所述样品的装置，其特征在于，所述回收装置包括能够被打开地形成在所述主体(202)上、并与所述第二腔室(227)连通的开口(232)，所述开口(232)由可取下的塞子以液密方式密封。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述第一隔膜(3)潮湿时对于空气是可渗透的。
12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，所述第一隔膜(3)的孔的直径大于1μm。
13.根据权利要求10至12中任一所述的装置，其特征在于，所述第二隔膜(4)的孔的直径小于0.65μm。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述第二隔膜(4)的孔的直径小于0.1μm。
15.根据权利要求10至12中任一所述的装置，其特征在于，所述主体(202)包括所述第一隔膜(3)固定其上的第一部分(209)以及所述第二隔膜(4)固定其上的第二部分(210)。
16.根据权利要求10至12中任一所述的装置，其特征在于，所述主体(202)包括限定出所述第三腔室(228)的杯状物(230)。
17.根据权利要求16所述的装置，其特征在于，所述杯状物(230)是可分离的。
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