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Diese
Erfindung betrifft einen temperaturempfindlichen Interpolymerkomplex,
der für
Trennmittel, immobilisierte Enzyme, denaturierte Proteinmodifizierer,
Trennverfahren oder die Aufkonzentrierung von Mikroorganismen, die
Reinigung oder Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren, Wirkstoff freisetzende
Mikrokapseln und dgl. eingesetzt werden kann.
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<Stand der Technik>
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Polyethylenoxid
(PEO), Polyacrylamid (PAAm), Polyacrylsäure (PAAc) oder Polymethacrylsäure (PMAAc),
welches wasserlösliche
Polymere sind, lösen
sich in Wasser als wäßrige Lösung innerhalb
eines optionalen Temperaturbereichs. Jedoch wurde von Yoshihito
Nagata und Tasuku Saito in Nippon Kagaku Kaishi (Journal of the
Japanese Chemical Society), 1, 171 (1976) beschrieben, daß eine gemischte
wäßrige Lösung aus
PEO mit PAAc oder PMAAc einen Interpolymerkomplex unter sauren Bedingungen
bildet, und der Komplex zeigt eine untere kritische Lösungstemperatur
(LCST) in der wäßrigen Lösung.
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Andererseits
wurde von D.J. Eustance et al. beschrieben (J. Appl. Polym. Sci.,
35, 707 (1988)), daß eine
gemischte wäßrige Lösung aus
PAAm mit PAAc einen Interpolymerkomplex unter sauren Bedingungen
bildet, und der Komplex zeigt eine obere kritische Lösungstemperatur
(UCST).
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Jedoch
bilden die oben gezeigten Polymere Interpolymerkomplexe mit Polyacrylsäure (PAAc) oder
Polymethacrylsäure
(PMAAc), welches Polyelektrolyte sind, aber die Interpolymerkomplexe
werden nicht unter neutralen bis alkalischen Bedingungen aufgrund
der Dissoziation der Carboxyl-Gruppen der Polyelektrolyte gebildet,
so daß der
Anwendungsbereich beschränkt
ist.
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Entsprechend
ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine Technik zu finden, durch
die Interpolymerkomplexe, die temperaturempfindlich sind, selbst
unter neutralen bis alkalischen Bedingungen gebildet werden können.
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<Offenbarung der Erfindung>
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Wir
haben jetzt einen Versuch unternommen, einen Interpolymerkomplex
zwischen nichtionischen Polymeren zu bilden, und fanden als Ergebnis, daß ein Interpolymerkomplex
zwischen nichtionischen wasserlöslichen
Polymeren gebildet werden kann, was zum Erreichen der Erfindung
führte.
Das heißt
die Erfindung umfaßt
die folgenden Konstruktionen.
- (1) Ein temperaturempfindlicher
Interpolymerkomplex, der Thermoempfindlichkeit in einer wäßrigen Lösung zeigen
kann und ein Poly-N-acetylacrylamid und Polyethylenglykol enthält.
- (2) Ein temperaturempfindlicher Interpolymerkomplex, der Thermoempfindlichkeit
in einer wäßrigen Lösung zeigen
kann und ein Poly-N-acetylacrylamid und Polyacrylamid oder Polymethacrylamid
enthält.
- (3) Ein temperaturempfindlicher Interpolymerkomplex, der Thermoempfindlichkeit
in einer wäßrigen Lösung zeigen
kann und Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol enthält.
- (4) Ein temperaturempfindlicher Interpolymerkomplex, der Thermoempfindlichkeit
in einer wäßrigen Lösung zeigen kann
und Polyvinylalkohol und Polyacrylamid oder Polymethacrylamid enthält.
- (5) Der temperaturempfindliche Interpolymerkomplex, der oben
in (1) oder (2) beschrieben wird, worin das Poly-N-acetylacrylamid ein
Copolymer aus N-Acetylacrylamid mit einem hydrophilen oder hydrophoben
Monomer ist.
Da der zuvor genannte Interpolymerkomplex der Erfindung
Temperaturempfindlichkeit selbst unter neutralen bis alkalischen
Bedingungen zeigen kann, ist sein Anwendungsbereich stark erweitert, so
daß er
zum Beispiel durch Bindung eines Liganden mit der Fähigkeit
zur Erkennung von Molekülen
in breiter Weise für
Trennmittel, Testreagenzien, immobilisierte Enzyme, denaturierte Proteinmodifizierer,
Trennverfahren oder die Aufkonzentrierung von Mikroorganismen, die
Reinigung oder Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren, Wirkstoff freisetzende
Mikrokapseln und dgl. eingesetzt werden kann. Somit umfaßt die Erfindung ferner
die folgenden Konstruktionen.
- (6) Der temperaturempfindlich Interpolymerkomplex, der in einer
der oben genannten Ziffern (1) bis (5) beschrieben wird, worin ein
Ligand mit der Fähigkeit
zur Erkennung von Molekülen
an wenigstens einen Vertreter aus dem Poly-N-acetylacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol,
Polyacrylamid und Polymethacrylamid gebunden ist.
- (7) Ein Trennmittel, das den temperaturempfindlichen Interpolymerkomplex
verwendet, der oben unter Ziffer (6) beschrieben wird.
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<Beste Ausführungsform der Erfindung>
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Besonders
veranschaulichend zeigt eine Mischung aus dem Poly-N-acetylacrylamid
und Polyethylenglykol oder eine Mischung aus einem Copolymer aus
N-Acetylacrylamid mit einem hydrophilen oder hydrophoben Monomer
und Polyacrylamid oder Polymethacrylamid gemäß der Erfindung eine obere kritische
Lösungstemperatur
(UCST) in einer wäßrigen Lösung. Das
heißt
sie bildet einen Interpolymerkomplex bei einer Temperatur, die gleich
oder niedriger als die UCST ist. Insbesondere besitzt sie eine Entmischungsfähigkeit.
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Auch
zeigt eine Mischung aus dem Poly-N-acetylacrylamid und Polyacrylamid
oder Polymethacrylamid eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in einer
wäßrigen Lösung. Das
heißt
sie bildet einen Interpolymerkomplex bei einer Temperatur, die gleich
oder höher
als die LCST ist.
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Zusätzlich zeigt
eine Mischung aus Polyvinylalkohol und Polyacrylamid und Polymethacrylamid
oder eine Mischung aus Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol sowohl
eine UCST als auch eine LCST in einer wäßrigen Lösung. Das heißt sie bildet einen
Interpolymerkomplex bei einer Temperatur, die gleich oder niedriger
als die UCST und gleich oder höher
als die LCST ist, und besitzt Entmischungsfähigkeit.
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Als
das zuvorgenannte hydrophile Monomer, das mit N-Acetylacrylamid
copolymerisiert wird, können
exemplarisch Acrylamid, Methacrylamid, N-Mettylacrylamid, N-Ethylacrylamid,
N,N-Dimethylacrylamid, Allylalkohol und dgl. angegeben werden. Auch können als
das hydrophobe Monomer, das mit N-Acetylacrylamid copolymerisiert
wird, ein Acrylsäureester,
ein Methacrylsäureester,
Styrol, ein N-Alkylacrylamid (bevorzugt mit einem Alkyl mit 3 oder
mehr Kohlenstoffatomen), Vinylchlorid, Ethylen, Propylen und dgl.
exemplarisch angegeben werden.
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Es
ist wünschenswert,
daß das
zuvor genannte hydrophile oder hydrophobe Monomer in einem Copolymerisationsverhältnis von
0,5 bis 80 % verwendet wird, insbesondere in einem Copolymerisationsverhältnis von
5 bis 70 %, bezogen auf N-Acetylacrylamid.
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Erfindungsgemäß bedeutet
die LCST (untere kritische Lösungstemperatur)
einen Temperaturzustand, bei dem eine Mischung einen gelösten Zustand
bei einer angegebenen Temperatur oder weniger beibehält, aber
bei der angegebenen Temperatur oder darüber aggregiert, indem es in
seiner Lösung unlöslich wird,
und die UCST (obere kritische Lösungstemperatur)
bedeutet einen Temperaturzustand, bei dem eine Mischung einen gelösten Zustand
bei einer angegebenen Temperatur oder darüber beibehält, aber bei der angegebenen
Temperatur oder darunter aggregiert, indem es in seiner Lösung unlöslich wird.
Das heißt,
daß z.B.
der Begriff "eine Polymermischung
zeigt eine untere kritische Lösungstemperatur
(LCST) in einer wäßrigen Lösung" bedeutet, daß sie gleichförmig in
der Lösung
bei einer angegebenen Temperatur (LCST) oder darunter dispergiert
ist, aber aggregiert, indem sie einen Interpolymerkomplex bildet,
wenn die Lösungstemperatur auf
die angegebene Temperatur (LCST) oder darüber erhöht wird.
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Das
Molekulargewicht des durch die Erfindung erhaltenen Interpolymerkomplexes
ist nicht besonders beschränkt
und kann optional als Reaktion auf seine Verwendung und dgl. eingestellt
werden. Allgemein ist ein Bereich von mehreren 100 bis mehreren
Millionen angemessen. Auch ist das Molekulargewicht für jedes
Polymer, das den Interpolymerkomplex bildet, nicht besonders beschränkt, aber
es ist wünschenswert,
daß der
Unterschied des Molekulargewichts zwischen den jeweiligen Polymeren,
die den Interpolymerkomplex bilden, gering ist. Wenn der Unterschied
des Molekulargewichts gering ist, wird ein temperaturempfindlicher
Interpolymerkomplex mit guter Thermoempfindlichkeit mit geringeren Übergangstemperaturbreiten
von UCST und LCST gebildet.
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Zusätzlich kann
auch die Konzentration jedes Polymers, das in der wäßrigen Lösung gelöst ist, optional
als Reaktion auf seine Verwendung eingestellt werden. Eine gute
Temperaturreaktion kann bevorzugt bei 0,1 % oder mehr erhalten werden.
Auch verursacht im Falle eines Interpolymerkomplexes, der zum Beispiel
eine UCST zeigt, eine höhere
Konzentration der Polymere in der wäßrigen Lösung eine Tendenz zur Verschiebung
der UCST zur Seite der höheren
Temperatur.
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Da
die temperaturempfindliche Polymermischung der Erfindung eine UCST
oder LCST selbst unter neutralen bis alkalischen Bedingungen zeigt, sind
verschiedene Anwendungen möglich.
Da insbesondere ein Ligand mit der Fähigkeit zur Erkennung von Molekülen an ein
beliebiges der Polymere gebunden werden kann, die die zuvor genannte
temperaturempfindliche Polymermischung bilden, kann sie dadurch
weithin eingesetzt werden für
Trennmittel, Testreagenzien, immobilisierte Enzyme, denaturierte Proteinmodifizierer,
Trennverfahren oder die Aufkonzentrierung von Mikroorganismen, die
Reinigung oder Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren, Wirkstoff freisetzende
Mikrokapseln und dgl.
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Als
Ligand mit der Fähigkeit
zur Erkennung von Molekülen
können
Antigene, Antikörper,
Biotin und dgl. exemplarisch angegeben werden.
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<Beispiele>
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Die
Erfindung wird nachfolgend in größerem Detail
unter Verweis auf Beispiele beschrieben, aber die Erfindung wird
nicht durch diese Beispiele beschränkt. In diesem Zusammenhang
wurden in bezug auf die Messung von UCST und LCST in wäßrigen Lösungen diese
unter Verwendung der Durchlässigkeit
von sichtbarem Licht (550 nm) gemessen. Auch wurden die UCST oder
LCST als die Temperatur für
50 % Durchlässigkeit
des sichtbaren Lichts definiert.
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Beispiel 1 (Interpolymerkomplex
1 aus Poly-N-acetylacrylamid
und PEG)
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Wenn
800 mg Poly-N-acetylacrylamid mit einem Molekulargewicht von ca.
13 000 mit 400 mg Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von
ca. 8500 in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde ein
Interpolymerkomplex gebildet, der eine Trübung zeigte. Wenn dieser Interpolymerkomplex unter
einem optischen Mikroskop beobachtet wurde, hatten sich Koazervate
mit einem Durchmesser von jeweils ca. 1 μm gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 51°C
sowohl zum Zeitpunkt des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 2 (Interpolymerkomplex
2 aus Poly-N-acetylacrylamid
und PEG)
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Wenn
800 mg Poly-N-acetylacrylamid mit einem Molekulargewicht von ca.
13 000 mit 800 mg Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von
ca. 8500 in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde ein
Interpolymerkomplex in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 76°C
zum Zeitpunkt des Temperaturanstiegs und 80°C zum Zeitpunkt des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 3 (Interpolymerkomplex
3 aus Poly-N-acetylacrylamid
und PEG)
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Wenn
1,4 g Poly-N-acetylacrylamid mit einem Molekulargewicht von ca.
13 000 mit 320 mg Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von
ca. 3000 in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde in Interpolymerkomplex
in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 23°C
zum Zeitpunkt des Temperaturanstiegs und 10°C zum Zeitpunkt des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 4 (Interpolymerkomplex
aus Poly-N-acetylacrylamid
und Polyacrylamid)
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Wenn
1,3 q Poly-N-acetylacrylamid mit einem Molekulargewicht von ca.
13 000 mit 1,4 g Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht von ca.
14 000 in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde ein Interpolymerkomplex
gebildet.
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Der
so erhaltene Interpolymerkomplex zeigte eine LCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 23°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der LCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 5 (Interpolymerkomplex
1 aus N-Acetylacrylamid-Acrylamid-(1:2)-Copolymer
und Polyacrylamid)
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Wenn
200 mg eines N-Acetylacrylamid-Acrylamid-(1:2)-Copolymers mit einem Molekulargewicht
von ca. 340 000 mit 8 mg Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht
von ca. 10 000 in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde
ein Interpolymerkomplex in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 35°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 6 (Interpolymerkomplex
2 aus N-Acetylacrylamid-Acrylamid-(1:2)-Copolymer
und Polyacrylamid)
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Wenn
400 mg eines N-Acetylacrylamid-Acrylamid-(1:2)-Copolymers mit einem Molekulargewicht
von ca. 340 000 mit 16 mg Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht
von ca. 10 000 in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde
ein Interpolymerkomplex in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 66°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 7 (Interpolymerkomplex
3 aus N-Acetylacrylamid-Acrylamid-(1:2)-Copolymer
und Polyacrylamid)
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Wenn
400 mg eines N-Acetylacrylamid-Acrylamid-(1:2)-Copolymers mit einem Molekulargewicht
von ca. 340 000 mit 16 mg Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht
von ca. 10 000 in 10 g PBS-Kochsalzpufferlösung vermischt wurden, wurde ein
Interpolymerkomplex in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 34°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 8 (Interpolymerkomplex
aus Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol)
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Wenn
1 g Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht von ca. 16 000 mit
500 mg Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von ca. 8000
in 10 g gereinigtem Wasser vermischt wurden, wurde ein Interpolymerkomplex
in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine UCST in der wäßrigen Lösung, und
die Temperatur betrug 42°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der UCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Beispiel 9 (Interpolymerkomplex
aus Polyvinylalkohol (80 % Hydrolysat) und Polyacrylamid)
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Wenn
400 mg Polyvinylalkohol (80 % Hydrolysat) mit einem Molekulargewicht
von ca. 10 000 mit 400 mg Polyacrylamid mit einem Molekulargewicht von
ca. 10 000 in 10 g PBS-Kochsalzpufferlösung vermischt
wurden, wurde ein Interpolymerkomplex in Form von Koazervaten gebildet.
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Die
so erhaltenen Koazervate zeigten eine LCST und UCST in der wäßrigen Lösung. Die
LCST betrug 35°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls, und
die UCST betrug 84°C
zum Zeitpunkt sowohl des Temperaturanstiegs als auch des Temperaturabfalls.
In diesem Zusammenhang wurde die Messung der LCST nach Einstellung
des pH der wäßrigen Lösung auf
7,4 durchgeführt.
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Obwohl
die Erfindung im Detail und unter Bezugnahme auf ihre spezifischen
Ausführungsformen beschrieben
wurde, wird es einem Fachmann ersichtlich sein, daß verschiedene
Veränderungen
und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Ansprüche vorgenommen
werden können.
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Diese
Anmeldung beruht auf der japanischen Patentanmeldung Nr. 2000-252526,
eingereicht am 23. August 2000.
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<Gewerbliche Anwendbarkeit>
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Die
Polymermischung der Erfindung bildet einen Polymerkomplex, der auf
die Temperatur reagiert, und zeigt eine UCST und/oder LCST in einer wäßrigen Lösung selbst
unter neutralen bis alkalischen Bedingungen.
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Somit
kann Sie durch Binden eines Liganden mit der Fähigkeit zur Erkennung von Molekülen an eine
beliebige der Komponenten der Polymermischung weithin für verschiedene
Trennmittel, Testreagenzien, denaturierte Proteinmodifizierer, Mittel
zur Reinigung von Nukleinsäuren,
Wirkstoff freisetzende Mikrokapseln und dgl. eingesetzt werden.