JP7458907B2 - ろ過カートリッジ及び微生物検査方法 - Google Patents

Description

本開示は、ろ過カートリッジ及び微生物検査方法に関する。

細胞治療薬や遺伝子治療薬を含む近年の再生医療等製品の分野では、医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律（薬機法）、及び、再生医療等の安全性の確保等に関する法律が施行されている。薬機法において、再生医療等製品の製造管理と品質管理の基準となる省令（ＧＣＴＰ省令：Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice）が施行され、「無菌操作等区域」と「清浄度管理区域」が環境区域として定義されている。ここで、「無菌操作等区域」とは、作業所のうち、無菌操作により取り扱う必要のある製品等の調製作業を行う場所、滅菌された容器等が作業所内の空気に触れる場所及び「無菌試験」等の無菌操作を行う場所をいう、と定義されている。具体的に、ここでの場所とは、重要区域：グレードＡ（安全キャビネット内、クリーンベンチ内、アイソレータ内など）、直接支援区域：グレードＢ、その他の支援区域：グレードＣ又はＤと分類され、無菌試験の際には、グレードＢに無菌操作員、滅菌済み材料などが所在し、グレードＡにて、検査試料や試薬類の無菌的分注操作が実施される。なお、グレードＣ／Ｄは、製品汚染の影響が少ない区域として、滅菌前材料を取り扱うエリアである。

これまで、製造施設の清浄度や製造に用いる水（製薬用水）や製品自体の無菌性を保証するための微生物検査や無菌試験において培養法が用いられている。特に、メンブレンフィルタ法（ＭＦ法）が一般的に採用されている。ＭＦ法は、採取した試料をメンブレンフィルタでろ過した後、寒天培地に試料をろ過したメンブレンフィルタに乗せて、恒温機中にて最大１４日間培養し、生育した菌のコロニー数を目視で計数する方法である。しかしながら、コロニーの目視検出に至るまでに増殖の比較的早い菌においても少なくとも数日の期間を要するだけでなく、従来の培地ではコロニー形成能が低いため、培養法のみでは検出及び定量が困難な菌が存在することが、多種多様な微生物の研究の進展により明らかとなってきている。これらの課題を解決する手段として、ＭＦ法などの従来の培養法とは異なる、培養を必ずしも必要としない様々な測定原理を利用した迅速微生物検査技術に期待が寄せられている。

迅速微生物検査法は、直接的検出法と間接的検出法に大別される。前者には固相サイトメトリー、フローサイトメトリーなどがあり、後者には免疫学的方法、核酸増幅法、生物発光、蛍光（染色）法などがある。迅速化に要求される性能において最も優先させるべき性能は、感度であるが、感度の向上は特異性の低下につながるのが常である。例えば、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）生物発光法（以下、ＡＴＰ法という）は、ホタルの発光反応を利用して、菌体内に存在するＡＴＰを光に変換して測定する方法である。ＡＴＰ法では細胞１個あたりに含まれるＡＴＰ分子の存在を数万個相当のフォトンとして検出できるため、細胞１個相当の光をフォトンカウンティング光計測により高感度に検出する。

ＡＴＰ法において、検体に混入した極微量（数個レベル）の菌を高感度、高精度で検出するためには、発光計測装置の性能が高感度であると同時に、環境中に存在するＡＴＰや菌、ヒトが保有している微生物、ＡＴＰを吸着した塵などのコンタミネーションによる偽発光要因を抑制しなければならない。また、一般に、検体には死菌由来のＡＴＰや遊離ＡＴＰが混在しているため、検体をそのまま発光計測に用いた場合には、正確な生菌数を見積もることが難しい。

特許文献１には、検体中の遊離ＡＴＰを除去するために、検体液をろ過することや、アピラーゼなどのＡＴＰ分解酵素を用いて微生物や死菌を予め分解することが記載されている。

国際公開第２０１６／１４７３１３号

ＡＴＰ法に限らず、あらゆる迅速微生物検査法において、高い感度と高い特異性を両立させるための試みがなされており、検査対象に含まれる夾雑物からの偽陽性要因の物質を排除する特別な前処理工程が付加される場合がある。そのため、複数回の試薬による反応や、ろ過、遠心などを用いた物質の分離及び洗浄などの煩雑な操作の工程が増え、環境中（浮遊、付着、ヒト由来）からのコンタミネーションが発生して偽陽性が生じ、やはり特異性が低下してしまうという課題がある。

そこで、迅速検査法を適用する際には、しばしば、安全キャビネットやアイソレータなどの無菌操作区域に代表されるグレードＡレベルのエリアに遠心機やインキュベータなどの機器を持ち込む必要性が生じてしまう。これにより、機器の持ち込みによるグレードＡの環境ブレイクのリスクが高まり、グレードＡの水準が保証されていることを証明するための妥当性試験（バリデーション）が必要となる。これにより、作業者は新しい技術を導入するために多大な労力を要することになり、迅速検査のメリットは理解しつつも導入を断念する場合がある。

そのため、操作性に優れ、かつ環境からの汚染物質の侵入を抑制できる微生物検査の前処理キット、前処理用の専用反応容器若しくはカートリッジ、及び完全閉鎖系ベースの自動化が望まれている。

そこで、本開示は、環境由来のコンタミネーションによる偽陽性を抑制し、高感度かつ高精度な微生物検査を容易に実施する技術を提供する。

本開示のろ過カートリッジは、微生物を捕捉するフィルタを有するフィルタカップと、前記フィルタカップの下部を覆い、底面部に少なくとも１つの貫通孔を有する第１のフィルタカップアタッチメントと、前記第１のフィルタカップアタッチメントと接続され、前記フィルタカップの上部を覆い、前記フィルタカップの開口面から離れた位置に設置された蓋を有する第２のフィルタカップアタッチメントと、を備えることを特徴とする。

本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。

本開示のろ過カートリッジによれば、環境由来のコンタミネーションによる偽陽性を抑制し、高感度かつ高精度な微生物検査を容易に実施することができる。
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

第１の実施形態に係るろ過カートリッジを示す概略断面図である。 第１の実施形態に係るフィルタカップの側面図である。 第１の実施形態に係るフィルタカップの底面図である。 第１の実施形態に係る第１のフィルタカップアタッチメントの構成例を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る第１のフィルタカップアタッチメントの他の構成例を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る第１のフィルタカップアタッチメントの他の構成例を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る第１のフィルタカップアタッチメントの他の構成例を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る第２のフィルタカップアタッチメントの概略正面図である。 第１の実施形態に係る第２のフィルタカップアタッチメントの概略側面図である。 第１の実施形態に係る第２のフィルタカップアタッチメントの他の構成例を示す概略正面図である。 吸引ろ過アタッチメントとろ過カートリッジとを接続した状態を示す概略図である。 第１の遠心ろ過アタッチメントとろ過カートリッジとを接続した状態を示す概略図である。 第２の遠心ろ過アタッチメントとろ過カートリッジとを接続した状態を示す概略図である。 第１の遠心ろ過アタッチメントが胴体部を兼用する変形例を示す概略図である。 第２の遠心ろ過アタッチメントが胴体部を兼用する変形例を示す概略図である。 バイオロジカルクリーンルームを示す概略図である。 迅速微生物検査方法を示すフローチャートである。 ろ過カートリッジ及び吸引ろ過アタッチメントを用いたフォトンカウンティングタイムコースを示す図である。 ろ過カートリッジ及び遠心ろ過アタッチメントを用いた迅速微生物検査方法を示すフローチャートである。 ろ過カートリッジ、吸引ろ過アタッチメント及び遠心ろ過アタッチメントを用いた迅速微生物検査方法を示すフローチャートである。 第５の実施形態に係る微生物検査装置を示す概略図である。 第６の実施形態に係る微生物検査装置を示す概略図である。

以下、添付図面を参照して本開示の実施形態について説明する。ただし、各実施形態は本開示の技術を実現するための一例に過ぎず、本開示の技術を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。

［第１の実施形態］
＜ろ過カートリッジの全体構成例＞
図１は、第１の実施形態に係る微生物検査に用いるろ過カートリッジ１を示す概略断面図である。図１に示すように、ろ過カートリッジ１は、フィルタカップ２、第１のフィルタカップアタッチメント３及び第２のフィルタカップアタッチメント４を備える。

フィルタカップ２の底部には、細菌、真菌、古細菌などの菌（微生物）の通過を基本的には許さない孔径を有するフィルタ２１が設けられている。フィルタカップ２に液体の検査試料を添加してフィルタ２１を通過させることで、検査試料がろ過されてフィルタ２１に菌を捕捉し、ろ液を排除することにより濃縮することができる。

フィルタカップ２の上部には、つば２２が設けられている。つば２２の開口部が、フィルタカップ２への検査試料及び試薬類の導入口となる。

第１のフィルタカップアタッチメント３は、フィルタカップ２の下部を覆い、フィルタカップ２の外壁及びフィルタ２１の汚染を防止する。第１のフィルタカップアタッチメント３は、作業者の指や、作業エリア内のベンチトップ、天井、側壁やガラス窓のような表面が、フィルタカップ２に直接触れないようにするためのコンタミネーション防御カバーとして機能する。

第１のフィルタカップアタッチメント３の底部には、ろ過ノズル３１（貫通孔）が設けられている。これにより、フィルタカップ２に加えられた検査試料や試薬などの液体試料がフィルタ２１を通過して、フィルタ２１の上部から下部への強制的な通過が可能となる。

第２のフィルタカップアタッチメント４は、第１のフィルタカップアタッチメント３に接続され、フィルタカップ２の上部、特につば２２を覆い、蓋４１がフィルタカップ２の開口面からある一定の距離だけ離れた位置に設けられている。これにより、フィルタカップ２の内部への粉塵の侵入やフィルタカップ２に作業者の手や腕が触れることを防止することができる。通常、ろ過カートリッジ１を使用する作業者は、粉塵の侵入や、作業者又は作業エリア内からのコンタミネーションのリスクを避けるために、蓋４１を閉めた状態で操作し、フィルタカップ２へ検査対象の試料や検査用の試薬類を分注する作業のときには、一時的に蓋４１を開けて使用する。蓋４１は、フィルタカップ２の開口面に対して平行に移動可能に構成されている。

ろ過カートリッジ１は、後述する吸引ろ過アタッチメントや遠心ろ過アタッチメントと共に、微生物検査キットとしてユーザに提供することができる。また、ろ過カートリッジ１は、使い捨てとすることができる。

＜フィルタカップの構成例＞
図２Ａは、フィルタカップ２の側面図である。図２Ａに示すように、フィルタカップ２は、フィルタ２１、つば２２、容器部２３及び支持板２４を有する。フィルタ２１は、容器部２３の底部に設けられ、支持板２４により支持される。

容器部２３及び支持板２４は、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどの樹脂製とすることができ、射出成型又は機械加工などで製造することができる。フィルタ２１、容器部２３及び支持板２４は、例えば超音波溶着を用いた接着によりこれらを固定することができる。流体的観点から、容器部２３の形状は円筒形状とすることができるが、用途に応じて、角を有する四角筒状又は多角筒状とすることもできる。

容器部２３の上部には、第２のフィルタカップアタッチメント４により支持するためのつば２２が設けられている。フィルタカップ２を第２のフィルタカップアタッチメント４に差し込むと、つば２２がストッパとなり、予め定められた位置でフィルタカップ２が固定される。

フィルタ２１は、検査対象の微生物を捕捉可能なものであればよく、例えばメンブレンフィルタを用いることができる。フィルタ２１の材質としては、例えばセルロース混合エステル、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｏｒｉｄｅ）、ポリカーボネートなどが挙げられる。

フィルタ２１の孔径は、検査対象の微生物のサイズや、微生物検査の諸条件に応じて適宜選択することができ、例えば０．２０μｍ以上とすることができる。具体的には、フィルタ２１として、孔径が０．２２μｍや０．４５μｍ等のメンブレンフィルタが挙げられる。

フィルタ２１の大きさ（径）と容器部２３の径とを同径とし、容器部２３の内壁と、フィルタ２１の側面とをいずれもストレートにすることにより、ろ過後の液残存を極力少なくすることができる。あるいは、フィルタ２１の側面の形状と、容器部２３の底部の形状とを同じにすることによっても、ろ過後の液残存を極力少なくすることができる。もちろん、容器部２３が上部から底部に向かって細くなるテーパー状に形成されていてもよい。用途に応じて、容器部２３は上部から底部に向かって太くなるテーパー状であってもよいが、吸引又は遠心によるろ過の際にフィルタ２１のろ過面を通過する単位時間あたりの液体量に分布が大きく生じてしまう可能性があるため、詰まりの原因になる。さらに、用途に応じて、容器部２３は途中で屈曲した構造であってもよいが、ろ過面に通過する液体量の均一性が崩れ、分布が大きく生じてしまう可能性があるため、詰まりの原因になる。

フィルタ２１の直径は、例えば数ｍｍ～４７ｍｍとすることができる。容器部２３の底部の径は、フィルタ２１の径と概ね同等である。容器部２３の高さは、検査試料の液量に合わせて設計され、例えば、数μＬから、数１００ｍＬが収容できるように設計することができる。

ただし、フィルタ２１の直径を可能な限り小さくし、微生物を捕捉する面積及び体積を小さくすることは、計測に利用する試料濃度（単位面積あたり、又は、単位リットルあたり）が高められることから、感度向上において有用である。フィルタ２１の面積を小さくした場合には、フィルタカップ２の開口部にファンネルを取付けることで、大容量の検査試料をろ過することができる。

図２Ｂは、フィルタカップ２の底面図である。図２Ｂの左図に示すように、支持板２４は、十字形状に代表される、中心から放射線状に伸びる複数の支持棒で構成することができる。また、図２Ｂの中央の図に示すように、支持板２４は、数ｍｍ～数ｃｍレベルの貫通孔を複数個有するメッシュ構造によりフィルタ２１を支持することもできる。さらに、図２Ｂの右図に示すように、支持板２４は、フィルタ２１の端部のみを支持する形状であってもよい。以上のように、支持板２４は、フィルタ２１を通過した液体を通過可能な貫通孔を有する。

＜第１のフィルタカップアタッチメントの構成例＞
図３Ａは、第１のフィルタカップアタッチメント３の構成例を示す概略断面図である。上述したように、第１のフィルタカップアタッチメント３は、フィルタカップ２の外壁及びフィルタ２１の汚染を防止するアタッチメントである。第１のフィルタカップアタッチメント３は、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどの樹脂製とすることができ、射出成型又は機械加工などで製造することができる。

図３Ａに示すように、第１のフィルタカップアタッチメント３は、ろ過ノズル３１、アタッチメント接合孔３３及びフィルタカップ挿入部３４が形成された胴体部３２を有し、胴体部３２の下面にはシーリング材３５が設けられている。

アタッチメント接合孔３３及びフィルタカップ挿入部３４は、フィルタカップ２の容器部２３の外形に合わせたくぼみであり、これらの内部にフィルタカップ２が挿入される。フィルタカップ挿入部３４は、ろ過ノズル３１と連結している。フィルタカップ２と第１のフィルタカップアタッチメント３とは、例えば押し込みによる圧着により固定される。また、後述する第２のフィルタカップアタッチメント４の胴体部の一部も、第１のフィルタカップアタッチメント３内に内包される。

作業者によるろ過カートリッジ１を用いた微生物検査の工程中に、第１のフィルタカップアタッチメント３からフィルタカップ２を取り外すことがあるため、第１のフィルタカップアタッチメント３の内径は、フィルタカップ２の容器部２３の外径より大きく形成される。

アタッチメント接合孔３３に第２のフィルタカップアタッチメント４のコネクタ（後述する爪状コネクタ又は筒状コネクタ）を嵌合することにより、第１のフィルタカップアタッチメント３がフィルタカップ２と密着した状態で保持される。これにより、第１のフィルタカップアタッチメント３と第２のフィルタカップアタッチメント４内にフィルタカップ２がさらに安定して格納される。図３Ａに示すアタッチメント接合孔３３は、押し込みによる圧着や、筒状コネクタを備えた第２のフィルタカップアタッチメント４に適した形態である。筒状コネクタが雄ねじの場合、アタッチメント接合孔３３の壁面はメスタップ形状とすることができる。

第１のフィルタカップアタッチメント３は、後述する吸引ろ過アタッチメント、第１の遠心ろ過アタッチメント、第２の遠心ろ過アタッチメントと接続して使用される。そのため、胴体部３２の底部は、吸引ろ過アタッチメント、第１の遠心ろ過アタッチメント、第２の遠心ろ過アタッチメントに設けられたくぼみに挿入される。

ろ過ノズル３１の内径は、フィルタ２１を通過した物質を捕捉することなく通過させ、かつ、効率よく液体を排出するという観点から、少なくとも０．５ｍｍ以上とすることができ、可能な限り大きくすることができる。ろ過ノズル３１の内径を例えば０．５ｍｍ～１０ｍｍとすることにより、吸引に用いる汎用的なチューブの内径との適合性に優れる。

ろ過ノズル３１の開放部は、作業者による使用直前までシーリング材３５によりシーリングされた状態で作業者に提供され、これにより第１のフィルタカップアタッチメント３の内部が外気と接触したり、作業者や物体の表面と接触したりすることを防止する。シーリング材３５は、作業者により取り外すことができる。シーリング材３５は、例えば金属製又は樹脂製のテープとすることができる。

図３Ｂは、第１のフィルタカップアタッチメント３の他の構成例を示す概略断面図である。図３Ｂに示す例においては、アタッチメント接合孔３３は、爪状コネクタを備えた第２のフィルタカップアタッチメント４に適した構造となっている。

また、図３Ｂに示す例においては、フィルタカップ挿入部３４は、ろ過ノズル３１の方向に沿って、内径が小さくなる若干のテーパー構造を有している。これにより、より容易にフィルタカップ２を第１のフィルタカップアタッチメント３から取り出すことができる。

図３Ｂに示す例においては、ろ過ノズル３１の形成部は、胴体部３２よりも外径が小さくなっており、ろ過ノズル３１の開放部は、キャップ（例えば樹脂製）の形態のシーリング材３５でシーリングされている。

図３Ｃ及び３Ｄは、第１のフィルタカップアタッチメント３の他の構成例を示す概略断面図である。図３Ｃに示す例においては、胴体部３２の外周面に凹部３６が設けられており、図３Ｄに示す例においては、胴体部３２の外周面に凸部３７が設けられている。これにより、例えば吸引ろ過アタッチメント、第１の遠心ろ過アタッチメント又は第２の遠心ろ過アタッチメントと、第１のフィルタカップアタッチメント３との脱着における作業者の掴みやすさが向上する。

＜第２のフィルタカップアタッチメントの構成例＞
図４Ａは、第２のフィルタカップアタッチメント４の概略正面図である。図４Ｂは、第２のフィルタカップアタッチメント４の概略側面図である。図４Ａ及び４Ｂにおいて、部分的に第２のフィルタカップアタッチメント４の断面が示されている。

図４Ａに示すように、第２のフィルタカップアタッチメント４は、蓋４１、胴体部４２及び爪状コネクタ５０を備える。胴体部４２には、フィルタカップ導入孔４３、つば保持部４４、第１の固定部材４５、蓋固定孔４６、第２の固定部材４７が設けられている。

フィルタカップ導入孔４３にはつば保持部４４として段差が設けられ、フィルタカップ導入孔４３は、つば保持部４４より上段の内径よりも下段の内径が小さくなっている。フィルタカップ導入孔４３から挿入されたフィルタカップ２のつば２２がつば保持部４４に当接してストッパとなることで、フィルタカップ２は所定の位置に保持される。フィルタカップ導入孔４３の内径とフィルタカップ２の容器部２３の外径がほぼ同一の場合、押し込みによって圧着固定される。フィルタカップ導入孔４３の段差箇所には第１の固定部材４５が挿入されており、つば２２の下の容器部２３の外周を密着させる。これにより、フィルタカップ２の固定性能が向上する。第１の固定部材４５は、例えばＯリングやシーリングテープなどである。

蓋４１を閉めるときは、蓋固定孔４６に蓋４１の突起部４９が入りこみ、蓋固定孔４６のテーパー角度が変化する場所で、一旦閉まる。この位置では、外気が流れこむ微小な隙間を有するため、セミクローズ状態（第１の閉状態）である。さらに蓋４１を蓋固定孔４６内に押し込むと、外気を遮断する密閉状態が形成される。これをフルクローズ状態（第２の閉状態）とする。セミクローズ状態となる蓋４１の位置を「セミクローズ位置」とする。セミクローズ位置は、吸引ろ過の際に必要な空気の流れを作るのに必要な閉ポジションである。一方、フルクローズ状態となる蓋４１の位置を「フルクローズ位置」とする。フルクローズ位置は、無菌操作区域から周辺区域に持ち出すときに、空中浮遊微生物の混入を防ぐために必要なポジションである。第２の固定部材４７は、例えばＯリングやシーリングテープなどであり、蓋４１の意図しない開放を防止する。このように、蓋４１は２段階の閉状態をとることができる。

蓋４１の上面に設けられたくぼみはつまみ４８であり、蓋４１の開閉操作のときに、作業者の指をひっかける場所である。図４Ａに示すようにつまみ４８は凹形状であるが、凸形状であってもよい。

爪状コネクタ５０は、胴体部４２の底面から突出するように設けられている。図４Ｂに示すように、爪状コネクタ５０は、外側に湾曲する略Ｕ字形状を有する。第２のフィルタカップアタッチメント４を上述の第１のフィルタカップアタッチメント３に接続する際に、アタッチメント接合孔３３に爪状コネクタ５０が挿入される。このとき、爪状コネクタ５０の湾曲部がひずみ、鍵と鍵穴の関係を用いて、図３Ｂに示したアタッチメント接合孔３３に接合される。

図４Ｃは、第２のフィルタカップアタッチメント４の他の構成例を示す概略正面図である。図４Ｃに示す例においては、蓋４１は、フィルタカップ２の開口面に対して例えば９０°以上１８０°未満の角度で開閉するヒンジ機構５２の形態であり、このような形態によっても蓋４１の開閉の操作性に優れる。ヒンジ機構５２の蓋４１には、凸部であるつまみ５３が設けられている。また、図４Ｃに示す例においては、胴体部４２の底面に筒状コネクタ５１が設けられている。筒状コネクタ５１は、筒状の雄ねじとなっており、図３Ａに示したアタッチメント接合孔３３（メスタップ形状）にねじ止めされる。

＜第１の実施形態のまとめ＞
以上のように、第１の実施形態に係るろ過カートリッジ１は、菌を捕捉するフィルタ２１を底部に有するフィルタカップ２と、フィルタカップ２の下部と底面を覆い、底部に少なくとも１つのろ過ノズル３１（貫通孔）を有する第１のフィルタカップアタッチメント３と、フィルタカップ２の上部を覆い、フィルタカップ２の最上面からある離れた位置に空間を設けて設置された蓋４１を有する第２のフィルタカップアタッチメント４と、を備える。このような構成により、作業者の使用時や運搬時に蓋４１を閉じておくことができ、かつ蓋４１はフィルタカップ２の開口部に接触しないので、外部からフィルタカップ２へのコンタミネーションを防止することができる。また、作業者がフィルタカップ２に検査試料や試薬を添加する際には蓋４１を開ければよいので、操作も簡便である。

ろ過カートリッジ１の製造時に、上述の無菌操作区域のグレードＡの環境下で、フィルタカップ２、第１のフィルタカップアタッチメント３及び第２のフィルタカップアタッチメント４を組み立てることができる。さらに、作業者への提供時には蓋４１が密閉され、ろ過ノズル３１がシーリング材３５で密閉された状態であるので、ろ過カートリッジ１をグレードＢなどの区域からグレードＡの区域に運搬した場合にも、内部に配置されるフィルタカップ２についてはグレードＡの水準を維持することができる。結果として、グレードＡ内に遠心機やインキュベータなどの機器を持ち込む必要がなく、機器を持ち込ことによるグレードＡ内の完全な無菌環境の劣化による環境ブレイクのリスクを高めることがなく、無菌的操作が容易となる。

以上のことから、第１の実施形態に係るろ過カートリッジ１によれば、環境由来のコンタミネーションによる偽陽性を抑制し、高感度かつ高精度な微生物検査（特にＭＦ法）を容易に実施することができる。

［第２の実施形態］
第２の実施形態においては、ろ過カートリッジに接続される吸引ろ過アタッチメントについて説明する。

＜吸引ろ過アタッチメントの構成例＞
図５は、吸引ろ過アタッチメント１００とろ過カートリッジ１とを接続した状態を示す概略図である。図５において、部分的に断面が示されている。図５に示すように、吸引ろ過アタッチメント１００は、支持ブロック１０１、開閉バルブ１０２及び配管コネクタ１０３（接続構造部）を備える。吸引ろ過アタッチメント１００は、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどの樹脂製とすることができる。

支持ブロック１０１には、第１のフィルタカップアタッチメント３が嵌合され、これを支持する。支持ブロック１０１の内部には流路１０４が設けられ、流路１０４の一端部は、第１のフィルタカップアタッチメント３のろ過ノズル３１と接続される。流路１０４の他端部は、開閉バルブ１０２と配管コネクタ１０３を介して不図示の吸引装置と接続される。換言すれば、流路１０４は、ろ過ノズル３１と配管コネクタ１０３とを接続する。これにより、フィルタカップ２に添加された液体試料は、ろ過カートリッジ１のフィルタ２１を通過してろ過され、フィルタ２１に捕捉された微生物以外の液体（ろ液）は、吸引ろ過アタッチメント１００の流路１０４を通過して配管コネクタ１０３から排出される。

［第３の実施形態］
第３の実施形態においては、ろ過カートリッジに接続される遠心ろ過アタッチメントについて説明する。

＜遠心ろ過アタッチメントの構成例＞
図６Ａは、第１の遠心ろ過アタッチメント２００とろ過カートリッジ１とを接続した状態を示す概略図である。図６Ａにおいて、部分的に断面が示されている。図６Ａに示すように、第１の遠心ろ過アタッチメント２００は、第１の嵌合部２０１及び廃液チューブ２０２（容器）を備える。第１の遠心ろ過アタッチメント２００は、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどの樹脂製とすることができる。第１の嵌合部２０１には、第１のフィルタカップアタッチメント３の胴体部３２が嵌合される。また、胴体部３２が嵌合された側とは反対側において、第１の嵌合部２０１に廃液チューブ２０２が挿入されている。

第１の遠心ろ過アタッチメント２００とろ過カートリッジ１とを接続した状態で遠心機にセットし、遠心分離を行うことで、フィルタカップ２に添加された液体試料は、フィルタ２１を通過してろ過され、ろ液が廃液チューブ２０２に回収される。

図６Ｂは、第２の遠心ろ過アタッチメント３００とろ過カートリッジ１とを接続した状態を示す概略図である。図６Ｂにおいて、部分的に断面が示されている。図６Ｂに示すように、第２の遠心ろ過アタッチメント３００は、第２の嵌合部３０１及び測定チューブ３０２（容器）を備える。第２の嵌合部３０１には、ろ過カートリッジ１の胴体部３２が嵌合される。また、胴体部３２が嵌合された側とは反対側において、第２の嵌合部３０１に測定チューブ３０２が挿入されている。

第２の遠心ろ過アタッチメント３００とろ過カートリッジ１とを接続した状態で遠心機にセットし、遠心分離を行うことで、フィルタカップ２に添加された液体試料は、フィルタ２１を通過してろ過され、ろ液が測定チューブ３０２に回収される。

図６Ｃは、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が胴体部３２を兼用する変形例を示す概略図である。図６Ｃに示すように、第２のフィルタカップアタッチメント４の胴体部４２が第１の遠心ろ過アタッチメント２００の第１の嵌合部２０１に接続されている。この場合、第１の嵌合部２０１には、胴体部４２の爪状コネクタ又は筒状コネクタを接続するためのアタッチメント接合孔が設けられる。図６Ｃに示す状態は、例えば、作業者がろ過カートリッジ１の第１のフィルタカップアタッチメント３を取り外した後に第１の遠心ろ過アタッチメント２００を接続することにより実現される。

図６Ｄは、第２の遠心ろ過アタッチメント３００が胴体部３２を兼用する変形例を示す概略図である。図６Ｄに示すように、第２のフィルタカップアタッチメント４の胴体部４２が第２の遠心ろ過アタッチメント３００の第２の嵌合部３０１に接続されている。その余の点については図６Ｃと同様である。

［第４の実施形態］
第４の実施形態では、上述のろ過カートリッジを用いた微生物検査方法について説明する。ここでは、本開示のろ過カートリッジを製薬用水管理に適用することとする。製薬用水の微生物管理基準は、各国の薬局方に基づいて、水に含まれる微生物量の許容量で処置基準値として管理されている。日本薬局方においては、常水は１００ＣＦＵ／ｍＬ、精製水は１０ＣＦＵ／ｍＬ、注射用水は１０ＣＦＵ／１００ｍＬを超えたときに、製薬用水製造ラインのメンテナンスが必要となる。米国薬局方における処置基準値は、飲料水が５００ＣＦＵ／ｍＬ、精製水が１００ＣＦＵ／ｍＬ、注射用水が１０ＣＦＵ／１００ｍＬであり、欧州薬局方における処置基準値は、精製水が１００ＣＦＵ／ｍＬ、高度精製水が１０ＣＦＵ／１００ｍＬ、注射用水が１０ＣＦＵ／１００ｍＬと定められている。

そこで、以下においては、日本薬局方の検査に準拠した製薬用水の微生物検査を行うため、常水、精製水及び注射用水の３種類を検査試料とする。常水と精製水は１ｍＬを検査容量とし、注射用水のみ１００ｍＬとする。

製薬用水の微生物検査において、蛍光染色法など、様々な微生物迅速試験法が適用できるが、本実施形態では、高感度ＡＴＰ検査キット（Ｌｕｍｉｏｎｅ（登録商標）微生物迅速検査用試薬キット（日立ハイテクソリューションズ社製））と、高感度のＡＴＰ計測装置（Ｌｕｍｉｏｎｅ ＢＬ－２０００（日立ハイテクソリューションズ社製））とを用いたＡＴＰ発光法による迅速試験法を用いることとする。高感度ＡＴＰ検査キットは、活性消去液、洗浄液、発光液、抽出液、ポジティブコントロール（ＡＴＰ １００ａｍｏｌ／５０μＬ抽出液）、測定チューブとその専用ラックを含むものである（医薬品の品質を担保する微生物迅速検査装置Lumione BL-2000、2018 vol.100 No.6）。

＜微生物検査環境＞
図７は、バイオロジカルクリーンルーム７０を示す概略図である。ＡＴＰ発光法による迅速試験法は、バイオロジカルクリーンルーム７０にて実施することができる。図７に示すように、バイオロジカルクリーンルーム７０には、重要区域グレードＡである安全キャビネット７１と、グレードＢの無菌操作区域７９が設けられている。無菌操作区域７９には、吸引ポンプ７２（吸引装置）及びその周辺ツール（廃液トラップ７３、吸引ポンプチューブ７４）、インキュベータ７５、遠心機７６、計測装置７７が設置されている。無菌操作区域７９にいる作業者は、安全キャビネット７１、吸引ポンプ７２及びその周辺ツール（廃液トラップ７３、吸引ポンプチューブ７４）、インキュベータ７５、遠心機７６、計測装置７７に任意にアクセスできる。

ここで、グレードＡとは、製品への汚染リスクを高いレベルで防ぐ必要のある作業を行う局所的な無菌操作区域のことである。一方、グレードＢとは、製品への汚染リスクを比較的高いレベルで防ぐ必要のある作業を行う多目的な区域である。つまり、無菌を維持できるように収納された滅菌後の容器、原料及び中間製品の搬入、無菌操作区域に直接介入する人、器具、装置などが所在する区域である。一般的な無菌室では、グレードＡの周辺環境である。

なお、図７の配置は一例に過ぎず、実現場では、図７に図示した以外のインフラ設備が設置されており、清浄度が保たれている。バイオロジカルクリーンルーム７０内の清浄と環境モニタリングは適宜行われ、例えば空中浮遊菌は、グレードＡである安全キャビネット７１内は、１ＣＦＵ／ｍ^３未満で管理され、グレードＢは、１０ＣＦＵ／ｍ^３以下で管理されている検査エリアである。

作業者は、検査試料、ろ過カートリッジ１、吸引ろ過アタッチメント１００並びに第１の遠心ろ過アタッチメント２００及び第２の遠心ろ過アタッチメント３００のうち少なくとも一方、検査試薬類、試料／試薬分注ツール（例えばマイクロピペット、ピペットマン）を、パスボックス７８を介して、無菌操作区域７９に持ち込み、安全キャビネット７１内に滅菌梱包された状態で導入することができる。ろ過カートリッジ１は、少なくとも２重に包装され、安全キャビネット７１に導入前に１つの包装を除去し、安全キャビネット７１への導入後に残りの包装を除去することができる。ろ過カートリッジ１は、ガンマ線滅菌、ＥＯＧ滅菌、オートクレーブなどの滅菌工程を経て包装されている。

検査試薬類は、高感度ＡＴＰ検査キットに含まれる活性消去液（以下、試薬Ａという）、洗浄液（以下、試薬Ｂという）、抽出液（以下、試薬Ｃという）である。発光液は、計測装置７７の所定の位置にセットされる。

＜ろ過カートリッジと吸引ろ過アタッチメントを用いた迅速微生物検査＞
図８は、ろ過カートリッジ１及び吸引ろ過アタッチメント１００（図５）を用いた迅速微生物検査の方法を示すフローチャートである。

（ステップＳ１１：菌の捕捉）
ステップＳ１１において、作業者は、ろ過カートリッジ１のフィルタ２１に菌を捕捉する。本ステップＳ１１の詳細は以下の通りである。

まず、作業者は、検査試料、ろ過カートリッジ１、吸引ろ過アタッチメント１００、検査試薬類、試料／試薬分注ツールを安全キャビネット７１に導入し、ろ過カートリッジ１と吸引ろ過アタッチメント１００を開封し、ろ過ノズル３１のシーリング材３５を取り外し、ろ過カートリッジ１と吸引ろ過アタッチメント１００を接続する。なお、検査試料（常水１ｍＬ、精製水１ｍＬ、注射用水１００ｍＬ）のそれぞれに対し、１つのろ過カートリッジ１及び吸引ろ過アタッチメント１００が用いられる。

次に、検査試料のろ過工程の準備として、作業者は、吸引ろ過アタッチメント１００に取り付けられている配管コネクタ１０３のみを安全キャビネット７１の前面シャッターからグレードＢ区域に引っ張り出し、グレードＢ区域で、吸引ポンプチューブ７４と接続し、吸引ポンプ７２を駆動する。

次に、作業者は、安全キャビネット７１内で、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、検査試料を含む容器からピペット操作により、検査試料をフィルタカップ２に注入する。作業者は、検査試料の必要量をフィルタカップ２に注入した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をセミクローズ位置まで閉め、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を開けることで、検査試料のろ過を開始する。ろ過開始後、作業者は、透明又は半透明の吸引ポンプチューブ７４を目視観察し、液体の流れが目視できなくなったところで、蓋４１を開け、フィルタ２１上に液体が残留していないこと確認した後、蓋４１をフルクローズ位置まで閉める。残液が存在しないことから、ろ過が完了したと判断し、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を閉じ、吸引ろ過アタッチメント１００と吸引ポンプ７２の接続を遮断し、ろ過をストップする。

ここまでの操作により、検査試料（常水１ｍＬ、精製水１ｍＬ、注射用水１００ｍＬ）の液体成分は、それぞれフィルタ２１を通過し、フィルタ２１に菌が存在すれば、フィルタ２１に濃縮されて、捕捉される。

（ステップＳ１２：ＡＴＰ活性消去反応）
ステップＳ１２において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ａを用いてＡＴＰの活性消去反応を実施する。本ステップＳ１２の詳細は以下の通りである。

作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、定められた添加量の試薬Ａをピペット操作により添加した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をフルクローズ位置まで閉める。作業者は、吸引ろ過アタッチメント１００が接続されたろ過カートリッジ１を安全キャビネット７１内から取り出すために、開閉バルブ１０２と配管コネクタ１０３を吸引ろ過アタッチメント１００から取り外し、開閉バルブ１０２と配管コネクタ１０３は、安全キャビネット７１内に保持する。作業者は、吸引ろ過アタッチメント１００が接続されたろ過カートリッジ１をインキュベータ７５内（グレードＢ区域）に導入し、４０分間、３７℃でインキュベートする。作業者は、４０分後に、吸引ろ過アタッチメント１００が接続されたろ過カートリッジ１をインキュベータ７５から取り出し、アルコール洗浄した後に、安全キャビネット７１に再導入し、開閉バルブ１０２と配管コネクタ１０３を接続する。作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をセミクローズ位置まで開けてから、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を開け、試薬Ａをろ過する。作業者は、吸引ポンプチューブ７４を目視観察し、液体の流れが目視できなくなったところで、蓋４１を開け、フィルタ２１上に液体が残留していないこと確認する。その後、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を閉じ、ろ過をストップする。

（ステップＳ１３：洗浄）
ステップＳ１３において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ｂを用いてフィルタ２１の洗浄を実施する。本ステップＳ１３の詳細は以下の通りである。

作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、定められた添加量の試薬Ｂをピペット操作により添加した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をセミクローズ位置にして、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を開け、試薬Ｂをろ過する。作業者は、吸引ポンプチューブ７４を目視観察し、液体の流れが目視できなくなったところで、蓋４１を開け、フィルタ２１上に液体が残留していないこと確認し、開閉バルブ１０２を閉じ、ろ過をストップする。

（ステップＳ１４：ＡＴＰ抽出）
ステップＳ１４において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ｃを用いてＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ測定試料の調製を完了させる。本ステップＳ１４の詳細は以下の通りである。

作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、キットのマニュアルに定められた添加量５０μＬの試薬Ｃをピペット操作により添加した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をフルクローズ位置にし、試薬Ｃをフィルタ２１に浸漬した状態で、数～１０分程度常温で保持する。その後、作業者は、蓋４１を開けて、試薬Ｃと菌との反応後の反応液（以下、「試薬Ｃ反応液」という）をピペット操作にてフィルタ２１上から全量（５０μＬ）回収し、測定チューブに分注する。作業者は、測定チューブを専用のチューブラックにセットして、チューブラックの蓋をする。

最後に、作業者は、チューブラックをグレードＢに設置されている計測装置７７に導入し、ＡＴＰ測定する。

（ＡＴＰ発光計測）
計測装置７７には、高感度のＡＴＰ計測装置（Ｌｕｍｉｏｎｅ ＢＬ－２０００（日立ハイテクソリューションズ社製））を用いることとする。作業者は、高感度ＡＴＰ検査キット（Ｌｕｍｉｏｎｅ微生物迅速検査用試薬キット（日立ハイテクソリューションズ社製））の発光液を計測装置７７にセットし、専用のチューブラックをセットして、測定をスタートさせると、計測装置７７は、最大２４個の測定チューブに収められた試薬Ｃ反応液を順に測定する。

図９は、試薬Ｃ反応液が導入された測定チューブに発光液が自動分注されて得られる典型的なフォトンカウンティングタイムコースのグラフである。ＡＴＰ量は、フォトンカウンティングタイムコースの一定時間の発光量を積算し、発光量の平均値をＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）として規格化することにより算出される。

なお、作業者は、あらかじめ、５０μＬの試薬Ｃを測定チューブに直接分注したブランク試料を少なくとも３試料以上用意し、また、検査キットに含まれているポジティブコントロール（ＡＴＰ １００ａｍｏｌ／５０μＬ抽出液）を測定チューブに分注した標準陽性試料を少なくとも１試料以上用意する。そして、これらを実検査試料である試薬Ｃ反応液の測定前に測定し、０ａｍｏｌと１００ａｍｏｌの２点検量線を作成しておくことで、実検査試料のＡＴＰ量を定量化する。このＡＴＰ測定の流れは、Ｌｕｍｉｏｎｅ ＢＬ－２０００の計測装置で実施するマニュアルに沿って行われる標準的なものである。

生菌１個相当のＡＴＰ量を１ａｍｏｌ以上とし、それを閾値として測定した場合、１ａｍｏｌを超えるＡＴＰ量が検出されたときに、試料中に微生物が存在したと判断することができる。

＜ろ過カートリッジと遠心ろ過アタッチメントを用いた迅速微生物検査＞
図１０は、ろ過カートリッジ１と、第１の遠心ろ過アタッチメント２００（図６Ａ）及び第２の遠心ろ過アタッチメント３００（図６Ｂ）を用いた迅速微生物検査の方法を示すフローチャートである。

（ステップＳ２１：菌の捕捉）
ステップＳ２１において、作業者は、ろ過カートリッジ１のフィルタ２１に菌を捕捉する。本ステップＳ２１の詳細は以下の通りである。

まず、作業者は、検査試料、ろ過カートリッジ１、第１の遠心ろ過アタッチメント２００、第２の遠心ろ過アタッチメント３００、検査試薬類、試料／試薬分注ツールを安全キャビネット７１に導入し、微生物検査ろ過カートリッジ１と第１の遠心ろ過アタッチメント２００を開封し、ろ過ノズル３１のシーリング材３５を取り外し、ろ過カートリッジ１と第１の遠心ろ過アタッチメント２００を接続する。

次に、作業者は、安全キャビネット７１内で、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、検査試料を含む容器からピペット操作により、検査試料をフィルタカップ２に注入する。

作業者は、検査試料の必要量をフィルタカップ２に注入した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をフルクローズ位置まで閉め、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１を安全キャビネット７１から取り出し、遠心機７６（グレードＢ区域）にセットし、遠心ろ過する。遠心力（×ｇ）は、菌に損傷を加えないように、２０００×ｇ以下とすることができる。遠心をかける時間は検査試料の容量と粘性に依存するので、予め検査試料毎に全量がろ過される時間を把握しておく。本実施形態での条件は、１０００×ｇの１分間とする。

遠心が停止した後、作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１を遠心機７６から取り出し、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１をアルコールでスプレーし、洗浄した後に、安全キャビネット７１に導入する。次に、作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、残液が無いことを確認する。ここで、液が残存していた場合、遠心機７６による遠心ろ過を再度実施してもよい。

ここまでの操作により、検査試料（常水１ｍＬ、精製水１ｍＬ、注射用水１００ｍＬ）の液体成分は、それぞれフィルタ２１を通過し、フィルタ２１に菌が存在すれば、フィルタ２１に濃縮されて、捕捉される。

（ステップＳ２２：ＡＴＰ活性消去反応）
ステップＳ２２において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ａを用いてＡＴＰの活性消去反応を実施する。本ステップＳ２２の詳細は以下の通りである。

作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、定められた添加量の試薬Ａをピペット操作により添加した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をフルクローズ位置まで閉める。次に、作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１をインキュベータ７５内（グレードＢ区域）に導入し、４０分間、３７℃でインキュベートする。作業者は、４０分後に、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１をインキュベータ７５から取り出し、遠心機７６（グレードＢ区域）にセットし、遠心ろ過する。遠心力（×ｇ）は、菌に損傷を加えないように、２０００×ｇ以下とすることができる。遠心をかける時間は検査試料の成分によるフィルタ２１の詰まり具合に依存するので、予め検査対象毎に試薬Ａの全量がろ過される時間を把握しておく。本実施形態での条件は、１０００×ｇの１分間とする。

遠心が停止した後、作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１を遠心機７６から取り出し、アルコールでスプレーし洗浄した後に、安全キャビネット７１に導入する。次に、作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて残液が無いことを確認する。ここで、液が残存していた場合、蓋４１をフルクローズ位置まで閉めてから、遠心機７６による遠心ろ過を再度実施しても良い。

（ステップＳ２３：洗浄）
ステップＳ２３において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ｂを用いてフィルタ２１の洗浄を実施する。本ステップＳ２３の詳細は以下の通りである。

作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、定められた添加量の試薬Ｂをピペット操作により添加した後、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１をフルクローズ位置まで閉める。作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１を安全キャビネット７１から取り出し、遠心機７６（グレードＢ区域）にセットし、遠心ろ過する。遠心力（×ｇ）は、菌に損傷を加えないように、２０００×ｇ以下とすることができる。遠心をかける時間は検査試料の成分によるフィルタの詰まり具合に依存するので、予め検査対象毎に試薬Ｂの全量がろ過される時間を把握しておく。本実施形態での条件は、１０００×ｇの１分間とする。

遠心が停止した後、作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００が接続されたろ過カートリッジ１を遠心機７６から取り出し、アルコールでスプレーして洗浄した後に、安全キャビネット７１に導入する。次に、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて残液が無いことを確認する。ここで、液が残存していた場合、遠心機７６による遠心ろ過を再度実施しても良い。

（ステップＳ２４：ＡＴＰ抽出及びＡＴＰ発光計測）
ステップＳ２４において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ｃを用いてＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ測定試料の調製を完了させる。本ステップＳ２４の詳細は以下の通りである。

作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて残液が無いことを確認した後、第２の遠心ろ過アタッチメント３００を開封する。次に、作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００を取り外し、第２の遠心ろ過アタッチメント３００をろ過カートリッジ１に取り付ける。作業者は、蓋４１を開けて、試薬Ｃをピペット操作によりキットのマニュアルに定められた添加量５０μＬを添加した後、蓋４１をフルクローズ位置まで閉めて、試薬Ｃをフィルタ２１に浸漬した状態で、数～１０分程度常温で保持する。

試薬Ｃによる反応後、作業者は、第２の遠心ろ過アタッチメント３００が接続されたろ過カートリッジ１を安全キャビネット７１内から取り出し、遠心機７６（グレードＢ区域）にセットし、遠心ろ過する。遠心力（×ｇ）は、菌に損傷を加えないように、２０００×ｇ以下とすることができる。遠心をかける時間は検査試料の成分によるフィルタの詰まり具合に依存するので、予め検査対象毎に試薬Ｃの全量（５０μＬ）に対して、４０μＬ以上が遠心で回収できるろ過の所要時間を把握しておく。本実施形態での条件は、１０００×ｇの１分間とする。

遠心が停止した後、作業者は、第２の遠心ろ過アタッチメント３００が接続されたろ過カートリッジ１を遠心機７６から取り出し、満遍なくアルコールでスプレーして洗浄した後に、安全キャビネット７１に導入する。次に、作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて残液が無いことを確認する。ここで、液が残存していた場合、遠心機７６による遠心ろ過を再度実施しても良い。フィルタ２１に残液が存在していないことが確認できた後、作業者は、蓋４１をフルクローズ位置まで閉め、試薬Ｃ反応液を含む測定チューブ３０２を第２の遠心ろ過アタッチメント３００から取り出し、専用のチューブラックに入れて、チューブラックに蓋をする。

最後に、作業者は、チューブラックをグレードＢに設置されている計測装置７７に導入し、ＡＴＰ測定する。

＜ろ過カートリッジと吸引ろ過アタッチメントと遠心ろ過アタッチメントを用いた迅速微生物検査＞
図１１は、ろ過カートリッジ１、吸引ろ過アタッチメント１００（図５）、第１の遠心ろ過アタッチメント２００（図６Ａ）及び第２の遠心ろ過アタッチメント３００（図６Ｂ）を用いた迅速微生物検査の方法を示すフローチャートである。

本方法は、ファンネルを用いた検査方法でもあり、大容量の検査試料をろ過するのに好適である。また、試薬Ａ、試薬Ｂ及び試薬Ｃによる試薬反応において、遠心ろ過は、吸引ろ過よりも液切れが良く、キャリーオーバーが少ない。そのため、より高精度かつ高感度な検査が可能になる場合が多いという利点がある。一方で、吸引ろ過よりも、遠心ろ過の方がフィルタ２１に負荷がかかるため、生菌の損傷や菌が死に至る場合も鑑みなければならない。そのため、遠心力（×ｇ）、遠心時間、検査試料の種類、さらに検出すべき菌体へのダメージについて配慮し、遠心条件を決定する必要がある。

（ステップＳ３１：菌の捕捉）
ステップＳ３１において、作業者は、ろ過カートリッジ１のフィルタ２１に菌を捕捉する。本ステップＳ３１の詳細は以下の通りである。

まず、作業者は、検査試料、ろ過カートリッジ１、吸引ろ過アタッチメント１００、第１の遠心ろ過アタッチメント２００、第２の遠心ろ過アタッチメント３００、ファンネル、検査試薬類、試料／試薬分注ツールを安全キャビネット７１に導入し、微生物検査ろ過カートリッジ１、吸引ろ過アタッチメント１００及びファンネルを開封し、ろ過ノズル３１のシーリング材３５を取り外し、ろ過カートリッジ１と吸引ろ過アタッチメント１００を接続する。さらに、作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開けて、ファンネルをフィルタカップ２に挿入する。

次に、検査試料のろ過工程の準備として、作業者は、吸引ろ過アタッチメント１００に取り付けられている配管コネクタ１０３のみを安全キャビネット７１の前面シャッターからグレードＢ区域に引っ張り出し、グレードＢ区域で、吸引ポンプチューブ７４と接続し、吸引ポンプを駆動する。次に、作業者は、安全キャビネット７１内で、ファンネルのキャップを開けて、検査試料を含む容器からピペット操作により、検査試料をファンネルに注入するか、又は、検査試料を含む容器からファンネルに直接注ぎ込む。検査試料を直接注ぎ込む場合は、ファンネルの目盛りを基準に、検査試料の必要量を注ぎ込むと便利である。作業者は、検査試料の必要量をファンネルに注入した後、ファンネルのキャップで差圧を作りつつ、コンタミネーションを防ぐためセミクローズ位置まで閉めて、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を開けることで、検査試料のろ過を開始する。ろ過開始後、作業者は、ファンネルの透明又は半透明の容器内の試料の減少していく様の目視観察と吸引ポンプチューブ７４の液体の流れを目視観察する。

検査試料が全量ろ過されたと判断したところで、ファンネルを取り外し、さらに、作業者は、第２のフィルタカップアタッチメント４の蓋４１を開け、フィルタ２１上に液体が残留していないこと確認した後、蓋４１をフルクローズ位置まで閉める。残量が存在しないことから、ろ過が完了したと判断し、吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２を閉じ、吸引ろ過アタッチメント１００と吸引ポンプ７２の接続を遮断し、ろ過をストップする。

ここまでが吸引ろ過アタッチメント１００を用いた操作であり、検査試料（例えば注射用水１００ｍＬ以上）の液体成分はフィルタ２１を通過し、フィルタ２１に菌が存在すれば、フィルタ２１に濃縮されて、捕捉される。なお、次のステップＳ３２の試薬Ａの反応に移る際に、検査試料の微量液によるキャリーオーバーが起こす試薬濃度の希釈を極力避ける目的で、吸引ろ過アタッチメント１００を第１の遠心ろ過アタッチメント２００に交換し、遠心力を用いたろ過工程を追加することにより、検査試料の残液量を可能な限り減らしてから試薬Ａを添加してもよい。

（ステップＳ３２：ＡＴＰ活性消去反応）
ステップＳ３２において、作業者は、Ｌｕｍｉｏｎｅ検査キットの試薬Ａを用いてＡＴＰの活性消去反応を実施する。本ステップＳ３２の詳細は以下の通りである。

作業者は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００を開封し、吸引ろ過アタッチメント１００を取り外し、第１の遠心ろ過アタッチメント２００をろ過カートリッジ１に取り付ける。

その後の操作は、図１０に示したステップＳ２２と同様であるので、説明を省略する。

（ステップＳ３３：洗浄）
ステップＳ３３については、図１０に示したステップＳ２３と同様であるので、説明を省略する。

（ステップＳ３４：ＡＴＰ抽出及びＡＴＰ発光計測）
ステップＳ３４については、図１０に示したステップＳ２４と同様であるので、説明を省略する。

＜第４の実施形態のまとめ＞
以上のように、ろ過カートリッジ１は容易に蓋４１の開閉が可能であり、検査試料や試薬類の分注作業は、グレードＡ区域内で実施し、検体前処理に用いる遠心機７６やインキュベータ７５などの機器を用いた作業の際には、蓋４１を閉じた密閉状態で、グレードＡの直接支援区域グレードＢ、場合によっては、その他の支援区域（グレードＣ又はＤ）に持ち出すことができる。したがって、グレードＡ内に遠心機７６やインキュベータ７５などの機器を持ち込む必要がなく、機器を持ち込むことによるグレードＡ内の完全な無菌環境の劣化による環境ブレイクのリスクを高めることなく、無菌的操作を容易に実施することができる。

第４の実施形態においては、ＡＴＰ発光計測による微生物検査方法について説明したが、ろ過カートリッジ１を用いた微生物検査方法は、他の迅速微生物検査法（固相サイトメトリー、フローサイトメトリー、免疫学的方法、核酸増幅法、蛍光（染色）法など）にも適用することができる。

［第５の実施形態］
第５の実施形態においては、図８の微生物検査方法を自動で実施する自動化装置を提案する。

図１２は、第５の実施形態に係る微生物検査装置５００を示す概略図である。図１２に示すように、微生物検査装置５００は、制御装置５０１、ステージ５０２、チューブラック５０３、蓋開閉レバー５０４、ディスペンサ５０５、可動式バルブ廃液ポート５０６を備える。

ステージ５０２には、吸引ろ過アタッチメント１００が接続されたろ過カートリッジ１が載置される。

チューブラック５０３には、試薬が収容される試薬チューブ５０７と、検査試料が収容される測定チューブ３０２とが配置される。

蓋開閉レバー５０４は、アクチュエータ５０８及び５０９により三軸方向に移動可能に構成され、ろ過カートリッジ１の蓋４１を開閉する。

ディスペンサ５０５は、アクチュエータ５１０及び５１１により三軸方向に移動可能に構成され、測定チューブ３０２からろ過カートリッジ１に検査試料を分注し、試薬チューブ５０７からろ過カートリッジ１に試薬を分注する。

吸引ろ過アタッチメント１００の開閉バルブ１０２は、可動式バルブ廃液ポート５０６に設けられる。可動式バルブ廃液ポート５０６は、アクチュエータ５１２により水平方向に移動可能に構成され、アクチュエータ５１２により開閉バルブ１０２の開閉も制御される。

制御装置５０１は、所定の指示値に基づき、アクチュエータ５０８～５１２の動作を制御する。

微生物検査装置５００は、例えば上述のグレードＡ区域に設置することができる。微生物検査装置５００は、グレードＡ区域で実施すべき操作（例えば検査試料及び試薬の分注操作）のみを実施する装置とすることができるが、グレードＢ区域で行える操作を実施できる装置としてもよい。

＜微生物検査方法＞
本実施形態に係る微生物検査方法は、図８に示した方法とほぼ同様であり、作業者による操作を、制御装置５０１がアクチュエータ５０８～５１２を動作させることにより実行する。

＜第５の実施形態のまとめ＞
以上のように、第５の実施形態の微生物検査装置５００は、ろ過カートリッジ１及び吸引ろ過アタッチメント１００を用いた微生物検査を自動で実施する。これにより、作業者がマニュアルで操作する作業が削減されるので、微生物検査がより簡便になる。

［第６の実施形態］
第６の実施形態においては、図１０の微生物検査方法を自動で実施する自動化装置を提案する。

図１３は、第６の実施形態に係る微生物検査装置６００を示す概略図である。図１３に示すように、微生物検査装置６００は、制御装置５０１、チューブラック５０３、蓋開閉レバー５０４、ディスペンサ５０５、アクチュエータ５０８～５１１については、第５の実施形態の微生物検査装置５００（図１２）と同様である。

微生物検査装置６００は、遠心ろ過アタッチメントラック６０１及びスウィングロータ６０２を備える。遠心ろ過アタッチメントラック６０１は、第１の遠心ろ過アタッチメント２００（不図示）及び第２の遠心ろ過アタッチメント３００を保持し、スウィングロータ６０２は、ろ過カートリッジ１を保持する。遠心ろ過アタッチメントラック６０１及びスウィングロータ６０２は、回転可能に構成される。遠心ろ過アタッチメントラック６０１は、上下動可能に構成される。スウィングロータ６０２は、ろ過カートリッジ１の向きを変更可能に構成される。遠心ろ過アタッチメントラック６０１及びスウィングロータ６０２の駆動は、制御装置５０１により制御される。

ろ過カートリッジ１を第１の遠心ろ過アタッチメント２００及び第２の遠心ろ過アタッチメント３００に取り付ける際は、第２のフィルタカップアタッチメント４と、第１の嵌合部２０１及び第２の嵌合部３０１とをそれぞれ位置合わせした状態で遠心ろ過アタッチメントラック６０１が上昇する。

ろ過カートリッジ１の遠心操作が必要な際には、第２の遠心ろ過アタッチメント３００が取り付けられたろ過カートリッジ１の蓋をフルクローズ位置として、水平方向に向きを変えて、スウィングロータ６０２により回転させる。これにより、スウィングロータ６０２の径方向に遠心力が発生するので、ろ過カートリッジ１に添加された液体がろ過される。このように、遠心ろ過を行う際に、ろ過カートリッジ１を遠心機に移動させる必要がないので、移動に伴うコンタミネーションのリスクがなく、また、動作も簡易となる。

＜微生物検査方法＞
本実施形態に係る微生物検査方法は、図１０に示した方法とほぼ同様であり、作業者による操作を、制御装置５０１がアクチュエータ５０８～５１１、遠心ろ過アタッチメントラック６０１及びスウィングロータ６０２を動作させることにより実行する。

＜第６の実施形態のまとめ＞
以上のように、第６の実施形態の微生物検査装置６００は、ろ過カートリッジ１及び第２の遠心ろ過アタッチメント３００を用いた微生物検査を自動で実施する。これにより、作業者がマニュアルで操作する作業が削減されるので、微生物検査がより簡便になる。

＜第５及び第６の実施形態の変形例＞
なお、図示は省略しているが、第５の実施形態の構成と、第６の実施形態の構成とをいずれも備える微生物検査装置を使用して、図１１に示した微生物検査方法（吸引ろ過アタッチメント１００と、遠心ろ過アタッチメント２００及び３００とを両方用いる方法）を実施することもできる。

［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。

１…ろ過カートリッジ、２…フィルタカップ、２１…フィルタ、２２…つば、２３…容器部、２４…支持板、３…第１のフィルタカップアタッチメント、３１…ろ過ノズル、３２…胴体部、３３…アタッチメント接合孔、３４…フィルタカップ挿入部、３５…シーリング材、３６…凹部、３７…凸部、４…第２のフィルタカップアタッチメント、４１…蓋、４２…胴体部、４３…フィルタカップ導入孔、４４…つば保持部、４５…第１の固定部材、４６…蓋固定孔、４７…第２の固定部材、４８…つまみ、４９…突起部、５０…爪状コネクタ、５１…筒状コネクタ、５２…ヒンジ機構、５３…つまみ、７０…バイオロジカルクリーンルーム、７１…安全キャビネット、７２…吸引ポンプ、７３…廃液トラップ、７４…吸引ポンプチューブ、７５…インキュベータ、７６…遠心機、７７…計測装置、７８…パスボックス、７９…無菌操作区域、１００…吸引ろ過アタッチメント、１０１…支持ブロック、１０２…開閉バルブ、１０３…配管コネクタ、１０４…流路、２００…第１の遠心ろ過アタッチメント、２０１…第１の嵌合部、２０２…廃液チューブ、３００…第２の遠心ろ過アタッチメント、３０１…第２の嵌合部、３０２…測定チューブ、５００…微生物検査装置、６００…微生物検査装置。

Claims (17)

1. 微生物を捕捉するフィルタを有するフィルタカップと、
   前記フィルタカップの下部を覆い、底面部に少なくとも１つの貫通孔を有する第１のフィルタカップアタッチメントと、
   前記第１のフィルタカップアタッチメントと接続され、前記フィルタカップの上部を覆い、前記フィルタカップの開口面から離れた位置に設置された蓋を有する第２のフィルタカップアタッチメントと、を備えることを特徴とするろ過カートリッジ。
2. 前記貫通孔は、吸引ろ過アタッチメントと連結可能であり、前記吸引ろ過アタッチメントは、吸引装置と接続可能な接続構造部を有することを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
3. 前記吸引ろ過アタッチメントは、前記貫通孔と前記接続構造部とを連通させる流路をさらに有し、前記接続構造部は、前記流路の開通及び遮断を制御するバルブを有することを特徴とする請求項２記載のろ過カートリッジ。
4. 前記貫通孔は、遠心ろ過アタッチメントと連結可能であることを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
5. 前記遠心ろ過アタッチメントは、前記貫通孔と連通する容器を有することを特徴とする請求項４記載のろ過カートリッジ。
6. 前記第２のフィルタカップアタッチメントの前記蓋の閉状態は、隙間が形成される第１の閉状態と、密閉状態となる第２の閉状態とを含むことを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
7. 前記蓋は、前記フィルタカップの開口面に対して平行に移動することを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
8. 前記蓋は、ヒンジ機構で開閉することを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
9. 前記貫通孔は、前記フィルタの上部から下部へ液体の通過が可能なろ過ノズルであることを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
10. 前記貫通孔の開放部は、シーリング材でシーリングされることを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
11. 前記フィルタカップは、前記フィルタを固定する支持板を備え、
    前記支持板は、前記フィルタを通過した液体を通過させる貫通孔を有することを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
12. 使い捨てであることを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
13. 少なくとも２重に包装されることを特徴とする請求項１記載のろ過カートリッジ。
14. 請求項１に記載のろ過カートリッジと、吸引ろ過アタッチメントとを無菌操作区域内で接続することと、
    前記吸引ろ過アタッチメントを吸引装置に接続することと、
    前記第２のフィルタカップアタッチメントの前記蓋を開けて前記フィルタカップに試料を添加することと、
    前記蓋を閉めて、前記吸引装置を駆動して前記試料をろ過し、前記フィルタに微生物を捕捉することと、を含む微生物検査方法。
15. 前記微生物の捕捉後に、前記無菌操作区域内で前記蓋を開けて、第１の試薬を前記フィルタカップに添加した後、前記蓋を閉めて反応させることと、
    前記反応後に、前記吸引装置を駆動して前記第１の試薬をろ過することと、
    前記無菌操作区域内で前記蓋を開けて、第２の試薬を前記フィルタカップに添加した後、前記蓋を閉めて反応させることと、
    前記無菌操作区域内で前記蓋を開けて、前記第２の試薬と前記微生物との反応液を前記フィルタカップの前記フィルタの上方から分取することと、をさらに含む請求項１４記載の微生物検査方法。
16. 請求項１に記載のろ過カートリッジと、第１の遠心ろ過アタッチメントとを無菌操作区域内で接続することと、
    前記第２のフィルタカップアタッチメントの前記蓋を開けて前記フィルタカップに試料を添加することと、
    前記蓋を閉めて、前記第１の遠心ろ過アタッチメントが接続された前記ろ過カートリッジを無菌操作区域の周辺区域に設置された遠心機にセットして、前記試料を遠心ろ過し、前記フィルタに微生物を捕捉することと、を含む微生物検査方法。
17. 前記微生物の捕捉後に、前記無菌操作区域内で前記蓋を開けて、第１の試薬を前記フィルタカップに添加した後、前記蓋を閉めて反応させることと、
    前記反応後に、前記遠心機にセットして、前記第１の試薬と前記微生物との第１の反応液を遠心ろ過によりろ過することと、
    前記無菌操作区域内で、前記第１の遠心ろ過アタッチメントを取り外し、第２の遠心ろ過アタッチメントを前記ろ過カートリッジに接続することと、
    前記蓋を開けて、第２の試薬を前記フィルタカップに添加した後、前記蓋を閉めて反応させることと、
    前記反応後に、前記第２の遠心ろ過アタッチメントが接続された前記ろ過カートリッジを前記遠心機にセットして、前記第２の試薬と前記微生物との第２の反応液を遠心ろ過によりろ過して、前記第２の遠心ろ過アタッチメントに備えられた容器に回収することと、をさらに含む請求項１６記載の微生物検査方法。

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