CN105203510B - 一种食品中微生物快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品检测领域，提供一种食品中微生物快速检测方法及检测前快速处理装置。该方法包括(1)食品预处理；(2)第一次膜过滤(3)第二次膜过滤(4)微生物细胞裂解‑ATP检测前一体化处理(5)微生物检测。所述装置包括：瓶体(1)，与瓶体内壁紧密贴合的活塞(2)，活塞杆(3)，第一过滤膜(4)、细胞裂解‑ATP检测前一体化处理室(6)、第二过滤膜(8)。利用本发明方法对食品样品进行预处理，能够有效消除食品本身对检测体系的影响。本发明装置也提供一种方便、快速、高效的食品中微生物检测前快速方式，减少操作过程中不必要的步骤，更可以消除食品本身所携带的细胞及游离ATP的影响，提高检测准确性，轻巧方便。

Description

一种食品中微生物快速检测方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及一种食品中卫生物快速检测方法及检测前快速处理装置。

背景技术

随着我国经济的不断发展，食品种类越来越丰富，而新的食品安全问题亦不断涌现，严重影响了人民群众的生命安全及社会经济的可持续发展。食品中微生物总数的检测是确保食品安全的一个重要检测项目。目前我国普遍采用平板菌落计数检验法进行检测，从采集样品，微生物细胞稀释、涂布、培养到取得结果至少需要24-48小时，因此，难于从生产原料、生产设备层面、物流、销售等方面进行实时有效的监测，造成产品质量下降、资源浪费，食品安全事故频发。

所有生物，包括细菌细胞在内都有数量相对稳定的生物能量物质，三磷酸腺苷(ATP)。美国太空总署用荧光素酶检测月球样品中是否含有痕迹量ATP，作为月球存在或者有过生命存在的佐证。早在1884年，Dubois发现将萤火虫研磨后荧光很快会消失，添加萤火虫尾部的新鲜提取物后又能重现荧光。此后，他证实提取物中存在荧光素和荧光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的条件下，虫光素酶可催化荧光素氧化并发出便于灵敏检测的荧光。且上述反应遵循细胞数越多，ATP能量越高，荧光值越高的线性比例关系。上世纪80年代后，美、英、德、日根据上述原理先后设计生产出各种形式的可付诸使用的细菌总数的快速检测系统系列产品，用于样品中微生物总数的测定，在几分钟内就可获得结果，大大缩短了检测时间。但所有生物体内均含有ATP，包括食品中可能存在的动植物细胞。食品中动植物细胞及可能的游离ATP的存在对检测结果的准确性将会产生影响，限制了该方法在食品领域的应用范围。所以，ATP方法自二十世纪80年代问世后，在很长一段时间内只能用于对食品加工环境、器具或包装进行检测，不能检测食品成品本身。

发明内容

本发明通过开发分级裂解与过滤食品样品的装置，消除了食品体系中非微生物细胞及游离ATP对测定结果的影响，拓宽了ATP检测方法在食品领域的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现

1.本发明提供一种食品中微生物快速检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)食品预处理：用拭子轻拭样品表面后，将拭子置于无菌的4.5-5ml 0.1-0.2MpH 7.0-7.4的PBS缓冲液中荡洗干净，获得样品液；

(2)第一次膜过滤：室温下，将上述步骤(1)获得的样品液通过孔径为10-20um的过滤膜，得到过滤液1；

(3)第二次膜过滤：室温下，将上述步骤(2)获得的过滤液1通过孔径为0.2～0.5um的过滤膜，截获膜上微生物细胞；

(4)微生物细胞裂解—ATP检测前一体化处理：将步骤(3)截获的微生物细胞通过细胞裂解与ATP检测一体化试剂，室温下反应10-15s，获得样品处理液；

其中，细胞裂解与ATP检测一体化试剂为：1-2％Triton X-100、100-120mmolNaCl、 0.1-0.5％脂肽类表面活性剂、2-2.5ul荧光素酶，0.1-0.15mg/ml荧光素，1-1.5mMDTT， 4.5-5mM MgSO4，20-25mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，pH 7.8；反应量为：每100ul上述一体化试剂加入1.5-2ul样品液；

(5)微生物检测：利用酶标仪测定样品处理液的光度值，记录10-15s内光输出量；根据光输出量与菌落数的线性关系，计算出样品处理液的菌落数。

2.本发明还提供一种食品中微生物检测前快速处理装置，该装置包括：瓶体，与瓶体内壁紧密贴合的活塞，活塞杆，第一过滤膜；其中，距离瓶顶端1/4-1/3处沿瓶体内壁有一环形凹槽，第一过滤膜卡合在瓶体环形凹槽中；瓶底端1/5-1/4处为细胞裂解—ATP检测前一体化处理室，该处理室与瓶体可拆卸固定连接，二者紧密配合保证瓶体自顶端至一体化处理室底端为一密闭空间；一体化处理室顶端有一环形凹槽，第二过滤膜卡合在反应室环形凹槽中；其中，第一过滤膜的孔径为10～20um、第二过滤膜的孔径为0.2～0.5um。

所述瓶体自顶端至一体化处理室为一密闭空间，指瓶体活塞以下至处理室为一整体密闭空间。拔出活塞，倒入样品液，向瓶体塞入活塞，并向下按压活塞杆使活塞不断压缩瓶体内空间，样品液在压力的作用下，微生物细胞通过第一过滤膜，而残余动植物细胞被截留至第一过滤膜上；继续按压活塞杆，游离ATP通过第二过滤膜进入一体化处理室，而微生物细胞被截留至第二过滤膜上，消除了非微生物细胞及游离ATP对检测的影响；打开一体化处理室，倒除滤液，获得微生物细胞，进入下一步过程。环形凹槽卡合过滤膜，保证过滤膜不会在压力和液体的压力下，变形，从环形凹槽中脱落。一体化处理室与瓶体可拆卸固定连接为任一方式，可以采取卡合方式、螺纹方式、螺栓杆等多种本领域可以想到的方式，只要保证最终达到紧密配合，装置在工作状态时，整个空间为密闭即可。第一过滤膜距离瓶顶端的位置、一体化处理室的位置无特别限定，本发明采用的位置是根据本装置整体大小给出的，但上述位置，可以根据装置大小合理改进。

3.上述2提供的快速处理装置，其中，上述活塞杆为中空结构，中空结构为预处理室；活塞杆顶端具有活塞杆帽，二者通过卡合方式或螺纹方式连接。

使用过程中，打开活塞杆帽，将待检测食品和缓冲液加入预处理室进行食品预处理，获得样品液；之后，拔出活塞，将样品液倒入瓶体，进行上述操作。

4.上述3提供的快速处理装置，其中，所述活塞杆帽与预处理室接触面中心固定连接有一针刺杆；活塞中心位置有一通孔，连接预处理室和瓶体空间，通孔直径小于等于针刺杆直径；通孔面向预处理室一侧有一可刺穿薄膜，当薄膜未被刺穿时，预处理室与瓶体空间不通连；针刺杆靠近活塞的顶端有一针尖，用于刺穿薄膜。

所述薄膜为任一材料制成，只要性状稳定，不会与样品液反应即可。打开活塞杆帽，加入待检测食品和缓冲液，获得样品液；继续向下按压活塞杆帽或者旋转活塞杆，针刺杆向活塞中心通孔移动，直到针尖刺穿薄膜，样品液通过通孔进入到瓶体中；针刺杆继续向活塞中心通孔移动，直至针刺杆闭合通孔，此时，瓶体活塞以下至反应室为一整体密闭空间。后续操作，如上所述。

5.上述4提供的快速处理装置，其中，所述通孔为倒漏斗型，旋转活塞盖使针刺杆向通孔移动，继续旋动活塞盖针刺杆的针尖刺破薄膜，针尖卡合在通孔处，使瓶体形成密闭空间。

6.上述2-5任一项提供的快速处理装置，其中，在第一过滤膜与第二过滤膜之间的瓶体部位向瓶体外延伸长4-5cm的液体流通管，液体流通管另一端连接细胞裂解与ATP检测一体化试剂储存室；液体流通管设置有控制阀门，控制裂解液向瓶体流动及流动速度；一体化试剂储存室顶端设置有盖子，方便添加一体化试剂。

液体流通管与瓶体之间呈45-60°夹角，保证打开控制阀，一体化试剂会在重力的作用下流入一体化处理室。盖子与一体化试剂之间的连接方式可以为螺旋或卡合等本领域可知的多种方式，只要方便打开盖子，方便向一体化试剂储存室中添加一体化试剂即可。阀门的方式不固定，但要保证，关上阀门，瓶体活塞以下至反应室为一整体密闭空间。

7.上述6提供的快速处理装置，其中，所述环形凹槽和环形凹槽的下端均各设置有一环形凸台，分别承托第一过滤膜和第二过滤膜，保证压缩液体进行过滤过程中，第一过滤膜和第二过滤膜不会在压力的作用下变形。

环形凸台突出宽度不固定，根据瓶体直径进行调整，原则有二点：1.不影响样品液、过滤液1通过过滤膜，完成过滤；2.可以承托过滤膜，保证液体在压力的作用下通过过滤膜不会使过滤膜破裂或者脱离凹槽。

所使用的装置材料为任一，只要满足不与各种试剂反应，不影响食品检测前处理；能够承受活塞压力即可。当然，如果，装置体积较大，以活塞压缩瓶体内空间过滤效果不好，可以打开活塞杆帽，通过活塞上的通孔向瓶体内通入气体，保证过滤效果。

有益效果：

1.通过第一过滤膜的作用，消除动植物细胞对后期检测食品中ATP的影响，同时最大限度稳定微生物细胞完整性。同时设计第二过滤膜过滤样品，从而基本完全消除非细菌细胞、游离ATP的影响，达到快速获得符合荧光素酶检测ATP的条件。通过合理优化荧光素酶检测条件，从而达到微生物定性定量的目的。

2.本发明通过设计具有中空结构的活塞杆、一体化处理室，使整个食品微生物检测前快速处理一气呵成，不用另行采用其他装置而减少了装置投入，更重要的是减少不必要的微生物污染；针刺杆和通孔的配合使用避免拔出活塞增加污染，方便操作，并且，通孔设计也有利于后期在必要时进行加压过滤操作；一体化处理室与整个瓶体属于可拆卸固定连接，既方便操作过程中倾倒过滤废液，也方便取出包括微生物细胞的第二过滤膜；在一个实施例中，打开液体流通管上的控制阀门，一体化试剂通过液体流通管进入到一体化处理室，浸没第二过滤膜上的微生物细胞，直接进行微生物细胞裂解—ATP检测前一体化处理，而不需要再取出经过第二次过滤后的第二过滤膜，再在别的装置中进行后续的裂解、检测前处理等步骤。总之，本发明提供的快速处理装置可以提供一种方便、快速、高效的食品中微生物检测前快速方式，减少操作过程中不必要的步骤，更可以减少操作中微生物污染，轻巧方便。

综上所述，利用本发明方法和装置对食品样品进行预处理，能够有效消除食品本身对检测体系的影响。与现有检测方法相比，本发明方法应用范围更广，准确性更高。所设计的装置方便携带，便于生活生产中随时取样进行检测。

附图说明

图1本发明装置结构；

图2微生物细胞裂解—ATP检测前一体化处理室结构

图3通孔结构

图4装置使用状态图

其中，1.瓶体、2.活塞、3.活塞杆、4.第一过滤膜、5.环形凹槽Ⅰ、6.一体化处理室、7. 环形凹槽Ⅱ；8.第二过滤膜、9.预处理室、10.活塞杆帽、11.针刺杆、12.通孔、13.薄膜、14. 针尖、15.液体流通管、16.一体化试剂储存室、17.控制阀门、18.环形凸台

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

蔬菜样品中的细菌检测

1、食品预处理

用拭子轻拭样品表面后，分别记为样品A、样品B。其中样品A直接利用传统ATP法对其体内ATP含量进行测定，确定菌落数。而B样品将采用本发明所述方法和装置进行测定。

该装置包括：瓶体1，与瓶体内壁紧密贴合的活塞2，活塞杆3，第一过滤膜4；其中，距离瓶顶端1/4-1/3处沿瓶体内壁有一环形凹槽Ⅰ5，第一过滤膜4卡合在瓶体环形凹槽中；距离瓶底端1/5-1/4处为细胞裂解—ATP检测前一体化处理室6，该一体化处理室与瓶体1可拆卸固定连接，二者紧密配合保证瓶体1自顶端至一体化处理室6底端为一密闭空间；一体化处理室6顶端有一环形凹槽Ⅱ7，第二过滤膜8卡合在反应室环形凹槽中；其中，第一过滤膜4的孔径为10～20um、第二过滤膜8的孔径为0.2～0.5um。

对样品B进行预处理：在样品B中加入4.5-5ml 0.1-0.2M pH 7.0-7.4的PBS缓冲液荡洗干净，获得样品液。拔出活塞2，向瓶体加入样品液，塞入活塞2，并向下按压活塞杆3使活塞2不断压缩瓶体内空间，样品液在压力的作用下，微生物细胞通过第一过滤膜4，而残余动植物细胞被截留至第一过滤膜4上；继续按压活塞杆3，游离ATP通过第二过滤膜8进入一体化处理室6，而微生物细胞被截留至第二过滤膜8上，消除了非微生物细胞及游离 ATP对检测的影响；打开一体化处理室6，去除过滤液，重新装上一体化处理室6，放入细胞裂解与ATP检测一体化试剂，一体化试剂进入一体化处理室6并淹没截留在第二过滤膜8 上的微生物细胞，室温下反应10-15s,获得样品处理液。其中，细胞裂解与ATP检测一体化试剂为：1-2％Triton X-100、100-120mmol NaCl、0.1-0.5％脂肽类表面活性剂、2-2.5ul荧光素酶，0.1-0.15mg/ml荧光素，1-1.5mM DTT，4.5-5mM MgSO4，20-25mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，pH 7.8；反应量为：每100ul上述一体化试剂加入1.5-2ul样品液；

进一步地，上述活塞杆3为中空结构，中空结构为预处理室9；活塞杆3顶端具有活塞杆帽10，二者通过卡合方式或螺纹方式连接。

使用过程中，打开活塞杆帽10，向预处理室9中加入样品B和4.5-5ml 0.1-0.2M pH7.0- 7.4的PBS缓冲液，荡洗干净，获得样品液；之后，拔出活塞2，将样品液倒入瓶体，进行上述操作。

进一步地，上述活塞杆帽10与预处理室9接触面中心固定连接有一针刺杆11；活塞2 中心位置有一通孔12，连接预处理室9和瓶体1空间，通孔12直径小于等于针刺杆11直径；通孔12面向预处理室9一侧有一可刺穿薄膜13，当薄膜未被刺穿时，预处理室9与瓶体1空间不通连；针刺杆11靠近活塞2的顶端有一针尖14，用于刺穿薄膜13。

使用过程中，打开活塞杆帽10，向预处理室9加入样品B和4.5-5ml 0.1-0.2M pH7.0- 7.4的PBS缓冲液，荡洗干净，获得样品液；之后，继续向下按压活塞杆帽10或者旋转活塞杆3，针刺杆11向活塞中心通孔移动，直到针尖刺穿薄膜13，样品液通过通孔进入到瓶体1中；针刺杆11继续向活塞中心通孔12移动，直至针刺杆11闭合通孔12，此时，瓶体活塞以下至反应室为一整体密闭空间。后续操作，如前所述。

进一步地，上述通孔12为倒漏斗型，旋转活塞盖10使针刺杆11向通孔12移动，继续旋动活塞盖10针刺杆11的针尖14刺破薄膜13，针尖14卡合在通孔12处，使瓶体1形成密闭空间。

进一步地，在第一过滤膜4与第二过滤膜8之间的瓶体部位向瓶体外延伸长4-5cm的液体流通管15，液体流通管另一端连接连接细胞裂解与ATP检测一体化试剂储存室16；液体流通管15设置有控制阀门17，控制一体化试剂向瓶体1流动及流动速度；一体化试剂储存室16顶端设置有盖子，方便添加一体化试剂。当微生物细胞被截留至第二过滤膜上，打开一体化处理室6，倒出过滤后的废液，重新装上一体化处理室。打开控制阀门15，向一体化处理室放入一体化试剂；通过裂解、ATP前处理的作用，膜上截留的微生物细胞发生裂解，释放出ATP，得到样品B的处理液。

进一步地，所述环形凹槽Ⅰ5和环形凹槽Ⅱ7的下端均各设置有一环形凸台18，分别承托第一过滤膜4和第二过滤膜8，保证压缩液体进行过滤过程中，第一过滤膜4和第二过滤膜8不会在压力的作用下变形

推动注射器塞子，在压力的作用下，吸入注射器的样品通过第一道膜，进一步消除非微生物细胞的影响。在持续压力的作用下，样品液通过第二道膜，细菌细胞被截留，样品中游离的ATP通过该膜，得以去除。

2、样品检测

采用含有荧光素酶、荧光素、反应缓冲液、Mg²⁺的检测体系，标准反应条件：2uL酶液，0.15mg/mL的荧光素(Promega)，1mM DTT，5mM MgSO₄，25mM Tricine (pH7.8)，2ul样品处理液(A或B)，室温下反应10s。利用酶标仪测定样品A、B处理液的光度值，记录10s内光输出量(RLU)。根据RLU与菌落数的线性关系，可以计算出样品 A、B处理液的菌落数分别为489、276个，实验重复三次以上。采用国标所规定的平板菌落计数法获得的菌落数为250个左右，与本发明方法接近。表明，本方法能够更准确的确定蔬菜样品中的微生物数。

实施例2

肉制品中的微生物的检测

1、样品预处理

用棉球轻拭肉制品表面，分别记为样品A、样品B。其中样品A直接利用传统ATP法对其体内ATP含量进行测定，确定菌落数。而B样品将采用本发明所述方法进行测定。

样品A的处理方法：将样品A用裂解液进行裂解，释放出体内ATP，得到样品A处理液。

样品B的处理方法：将样品B置于4.5-5ml 0.1-0.2M pH 7.0-7.4的PBS缓冲液中，获得样品液；取出上述溶液1ml*2管，将得到的样品液通过孔径为0.2-0.5um的过滤膜，截获膜上微生物细胞；放置入细胞裂解与ATP检测一体化试剂中，通过一体化试剂的作用，膜上截留的微生物细胞发生裂解，释放出ATP，得到样品B的处理液。

2、样品检测

采用含有荧光素酶、荧光素、反应缓冲液、Mg²⁺的检测体系，标准反应条件：2uL酶液，0.15mg/mL的荧光素(Promega)，1mM DTT，5mM MgSO₄，25mM Tricine (pH7.8)，2ul样品处理液，室温下反应10s。利用酶标仪测定样品A、B处理液的光度值，记录10s内光输出量(RLU)。根据RLU与菌落数的线性关系，可以计算出样品A、B 处理液的菌落数分别为2000、1200个，实验重复三次以上。采用国标所规定的平板菌落计数法获得的菌落数为1250个左右，与本发明方法接近。表明本方法能够更准确的确定肉制品中的微生物数。

根据实施例1、2实验结果可以看出，不同的处理方式导致最终样品A、B的光输出值产生较大差异，这主要是因为样品A未消除非细菌细胞、游离ATP的影响，所以产生很大的光输出量。而利用本发明所述方法则可以有效消除食品本身对检测体系的影响，从而保证检测结果的准确性。。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种食品中微生物快速检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)食品预处理：用拭子轻拭样品表面后，将拭子置于无菌的4.5-5ml 0.1-0.2M pH7.0-7.4的PBS缓冲液中荡洗干净，获得样品液；

(2)第一次膜过滤：室温下，将上述步骤(1)获得的样品液通过孔径为10-20um的过滤膜，得到过滤液1；

(3)第二次膜过滤：室温下，将上述步骤(2)获得的过滤液1通过孔径为0.2～0.5um的过滤膜，截获食品中微生物细胞；

(4)微生物细胞裂解—ATP检测前一体化处理：将步骤(3)截获的微生物细胞通过细胞裂解与ATP检测一体化试剂，室温下反应10-15s，获得样品处理液；

其中，细胞裂解与ATP检测一体化试剂为：1-2％Triton X-100、100-120mmol NaCl、0.1-0.5％脂肽类表面活性剂、2-2.5ul荧光素酶，0.1-0.15mg/ml荧光素，1-1.5mM DTT，4.5-5mM MgSO₄，20-25mM N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，pH 7.8；反应量为：每100ul上述一体化试剂加入1.5-2ul样品液；

(5)微生物检测：利用酶标仪测定样品处理液的光度值，记录10-15s内光输出量；根据光输出量与菌落数的线性关系，计算出样品处理液的菌落数。