CN107034127A - 一种用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管及方法，该试管包括：位于底部的第二试管部和置于第二试管部上方的第一试管部，以及位于第一试管部和第二试管部之间的连接部；第一试管部内设置有第一滤膜；第二试管部内设置有第二滤膜。经由本发明，能够从土壤中分离出更加全面的微生物种类以及无机化学物质，以此来判断土壤中微生物含量及种类的变化，所得到的信息也能够更好地说明土壤的状态。

Description

一种用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管及 方法

技术领域

本发明涉及土壤中微生物基因与无机化学物质提取技术领域，具体涉及一种用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管及方法。

背景技术

现有的土壤分离技术需将土壤用水稀释后取上清，通过涂平板、划线的方法进行单个微生物的培养分离鉴定。此技术只能分离鉴定出少部分常见微生物，并不能鉴定出所有微生物，因此很难反应土壤的整体状况。

若要真实地反应土壤中存在的微生物，我们需要用新的方法检测到更加全面的微生物种类，这样我们所得到的信息才能更好地说明土壤的状态。

发明内容

针对以上缺陷，本发明提供一种试管，能够从土壤中分离出更加全面的微生物种类以及无机化学物质。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管，包括：

位于底部的第二试管部和置于所述第二试管部上方的第一试管部，以及位于所述第一试管部和第二试管部之间的连接部；

所述第一试管部内设置有第一滤膜，其孔径为80-120微米；

所述第二试管部内设置有第二滤膜装置，其孔径为0.20-0.60微米。

一种利用所述试管来提取土壤中的微生物基因的方法，包括以下步骤：

1)采集土壤样品；

2)将土壤样品溶于水，然后使得所获得的土壤水溶液通过所述试管进行过滤；

3)进行土壤微生物的提取，

基因提取的方法可以包括珠磨法(bead beating)，化学裂解法等等。

其中，所述珠磨法包括以下步骤：

i)收集所述第二滤膜上的微生物，将微生物溶于5ml培养基，37℃过夜震荡培养；

ii)离心收集菌体，用0.5ml无菌水重悬，转移至1.5ml离心管中；

iii)离心收集菌体，加入200ul裂解缓冲液重悬；

iv)加入0.3g玻璃珠，200ul苯酚/氯仿/异戊醇，高速震荡3分钟；

vi)加入200ulTE缓冲液，快速震荡30s，然后高速离心5分钟；

vii)将水相转移至另一个干净1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇颠倒混匀；

vii)高速离心3分钟，去上清，沉淀用0.4mlTE缓冲液溶解；

viii)加入30ul 1mg/ml的RNA酶A，37℃孵育5分钟；

ix)加入10ul 4M乙酸铵及1ml无水乙醇，混匀后高速离心3分钟；

x)沉淀干燥后用100ulTE缓冲液溶解即得土壤微生物DNA。

一种利用所述试管来提取土壤中无机化学物质的方法，包括：

1)采集土壤样品；

2)将土壤样品溶于水，然后使得所获得的土壤水溶液通过所述试管进行过滤；

3)收集所述第二试管部中的无机物溶液，进行土壤中无机化学物质的检测，由此得到土壤中的无机化学物质。

经由本发明，能够从土壤中分离出更加全面的微生物种类以及无机化学物质，并且通过DNA测序的方法来鉴定微生物的类别，以此来判断土壤中微生物含量及种类的变化，所得到的信息也能够更好地说明土壤的状态。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明的用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管的结构示意图。

图中：1、第一试管部；2、连接部；3、第二试管部；4、第一滤膜；5、第二滤膜。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

如图1所示的用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管，包括：位于底部的第二试管部3和置于第二试管部上方的第一试管部1，以及位于第一试管部1和第二试管部3之间的连接部2；第一试管部1内设置有第一滤膜4，其孔径为80-120微米；第二试管部3内设置有第二滤膜5，其孔径为0.20-0.60微米。

第一试管部1、第二试管部3的直径可以相同，亦可以不同，优选为相同。第一试管部1、第二试管部3的形状没有特别的限制，但是优选为圆柱形。

连接部2的直径小于第一试管部1的直径以及第二试管部3的直径。连接部2与第一试管部1和第二试管部3二者之间的连接可以通过一个直径逐渐变大的部分来实现。第二试管部3的底部可以是平的，或者可以是U形或V形。

第一滤膜4和第二滤膜5的边缘可以通过加热、超声或高频热合等技术来固定在第一试管部1的内壁上和第二试管部3的内壁上。

所述第一滤膜和第二滤膜可以是聚氨酯膜、聚碳酸酯膜等等，本领域技术人员可以结合现有技术、根据本发明的教导来适当的选择。

使用时，首先将土壤样品溶于水，然后使土壤水溶液通过试管。第一滤膜4的孔径为80-120微米，优选为100微米。由于绝大部分土壤微生物直径都远远小于100微米，并且土壤中的大块固体物质直径都远大于100微米，因此，第一滤膜4可以将土壤中固体物质拦截，使微生物的水溶液通过。流出第一滤膜4的微生物水溶液将经由连接部2流入第二滤膜5。

第二滤膜5的孔径为0.20-0.60微米，优选为0.45微米。由于微生物直径一般大于0.2微米，再加上滤膜的阻挡作用和静电吸附，0.45微米的滤膜足以拦截大多数微生物。从第二滤膜5中流出的则是直径远远小于0.45微米的无机化学物质，例如硅盐、钙盐、氧化铝、氧化镁等。

这样通过两次过滤，土壤中的大块固体物质、微生物、无机化学物质即被分开。

提取土壤中的微生物基因时，首先采集土壤样品，然后将土壤样品溶于水，接着使得所获得的土壤水溶液通过所述试管进行过滤，之后收集第二滤膜5上的微生物，接下来则开始提取土壤中的微生物基因。

基因检测的方法可以采用珠磨法(bead beating)，具体包括如下步骤：

(1)将收集到的微生物溶于5ml培养基，37℃过夜震荡培养；

(2)离心收集菌体，用0.5ml无菌水重悬，转移至1.5ml离心管中；

(3)离心收集菌体，加入200ul裂解缓冲液重悬；

(4)加入0.3g玻璃珠，200ul苯酚/氯仿/异戊醇，高速震荡3分钟；

(5)加入200ulTE缓冲液，快速震荡30s，然后高速离心5分钟；

(6)将水相转移至另一个干净1.5ml离心管中，加入1ml无水乙醇颠倒混匀；

(7)高速离心3分钟，去上清，沉淀用0.4mlTE缓冲液溶解；

(8)加入30ul 1mg/ml的RNA酶A，37℃孵育5分钟；

(9)加入10ul 4M乙酸铵及1ml无水乙醇，混匀后高速离心3分钟；

(10)沉淀干燥后用100ulTE缓冲液溶解即得土壤微生物DNA。

将得到的微生物DNA中加入DNA稳定剂。DNA稳定剂可用于运输或保存的DNA包括基因组DNA、质粒DNA、寡合苷酸等。广泛运用于室温生物样品库建设、司法实践、临床诊断研究、学术研究、普通实验室DNA保存等等。需要使用DNA时，只需加水或缓冲液到基质中，即可在数分钟内复效样品。将加有DNA稳定剂的微生物DNA送入生物公司测序，即可获得土壤微生物的种类及数量，因此我们可以通过微生物来得知土壤的状态。

提取土壤中无机化学物质时，收集第二试管部3中的无机物溶液，进行土壤中无机化学物质的检测，由此可以更加全面的反映土壤状态。

相比普通的平板划线培养，本发明通过具有两个滤膜的二联管式的试管，可以简单快速分离微生物与无机化学物质，获得种类更加全面的微生物种类。

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，然后将单菌落作为微生物的纯种进行研究。但很多时候这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种，十分费事费力。此外，自然界中很多微生物是无法在人工条件下进行培养的，因此用平板划线法鉴定出的微生物种类是很不准确的。本发明通过具有两个滤膜的二联管式的试管，不仅可以简单快速分离微生物与无机化学物质，并且鉴定获得种类更加全面的微生物种类。

本专利与平板划线法的实验对比

首先按照传统平板划线法配置牛肉膏蛋白胨培养基，配方如下：

表1牛肉膏蛋白胨培养基配方表(pH 7.4-7.6)

试剂	牛肉膏	蛋白胨	NaCl	琼脂	水
						用量	3.0g	10.0g	5.0g	1.2％	1000ml

分别取北京市海淀区的农业用地土壤、林业用地土壤与城市街道旁绿化带土壤。每个地区取三个地点采样，用本专利的方法和平板划线法分别处理，检测其中微生物的种类，结果如下表2：

表2

其中，在平板划线法中，农业用地土壤中检测出：葡萄球菌，大肠杆菌、普通变形杆菌以及产气荚膜杆菌；林业用地土壤检测出：葡萄球菌，大肠杆菌、普通变形杆菌以及枯草芽孢杆菌；城市街道旁绿化带土壤检测出：葡萄球菌，铜绿假单胞菌、普通变形杆菌以及产气荚膜杆菌。

在本发明的方法中，各种土壤样品中均检测出十多种的微生物种类，包括细菌、放线菌和真菌等，例如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、产气荚膜杆菌、绿弯菌、酸杆菌、沙门菌、志贺菌、链霉菌属、若卡菌属、小单孢菌属、曲霉属等等。

由上述实验结果可知，本新型试管法能够鉴定出的微生物种类远大于传统的平板划线法，可见该专利有巨大的优越性。

上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于提取土壤中的微生物基因与无机化学物质的试管，包括：

位于底部的第二试管部和置于所述第二试管部上方的第一试管部，以及位于所述第一试管部和第二试管部之间的连接部；

所述第一试管部内设置有第一滤膜，其孔径为80-120微米；

所述第二试管部内设置有第二滤膜，其孔径为0.20-0.60微米。

2.根据权利要求1所述的试管，其中所述第一滤膜的孔径为100微米。

3.根据权利要求1所述的试管，其中所述第二滤膜的孔径为0.45微米。

4.一种利用权利要求1的试管来提取土壤中的微生物基因的方法，包括以下步骤：

1)采集土壤样品；

2)将土壤样品溶于水，然后使得所获得的水土混合溶液通过所述试管进行过滤；

3)进行土壤微生物的基因提取。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述基因提取为珠磨法。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述珠磨法包括以下步骤：

i)收集所述第二滤膜上的微生物，将微生物溶于培养基中，37℃过夜震荡培养；

ii)离心收集菌体，用无菌水重悬，转移至离心管中；

iii)离心收集菌体，加入裂解缓冲液重悬；

iv)加入玻璃珠，苯酚/氯仿/异戊醇，高速震荡；

vi)加入TE缓冲液，快速震荡，然后高速离心；

vii)将水相转移至另一个干净离心管中，加入无水乙醇混匀；

vii)高速离心分钟，去上清液，沉淀物用TE缓冲液溶解；

viii)加入的RNA酶A，37℃孵育；

ix)加入乙酸铵及无水乙醇，混匀后高速离心；

x)沉淀物干燥后用TE缓冲液溶解即得土壤微生物DNA。

7.一种利用权利要求1的试管来提取土壤中无机化学物质的方法，包括：

1)采集土壤样品；

2)将土壤样品溶于水，然后使得所获得的土壤水溶液通过所述试管进行过滤；

3)收集所述第二试管部中的无机物溶液，进行土壤中无机化学物质的检测，由此得到土壤中的无机化学物质。