KR20130004771U

KR20130004771U - 무균검사 방법 및 이에 사용된 밀폐식 집균앰플배양기

Info

Publication number: KR20130004771U
Application number: KR2020127000010U
Authority: KR
Inventors: 옌단; 샤오샤오허; 장핑; 런용션; 진청
Original assignee: 302 밀리터리 호스피탈 오브 차이나
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2013-08-07
Also published as: US8778629B2; KR200474522Y1; CN101893589B; WO2012000309A1; CN101893589A; US20130109052A1

Abstract

본 고안은 일종의 무균검사방법이며, 이 방법은 균주, 배지를 선택하고, 균 액을 준비하고, 식별특징으로서 각 균주의 지문특징인 열 곡선을 기록하고, 열 곡선의 열역학 파라미터를 취득하고, 균주의 양성 판정지표를 확정하고, 시료의 무균검사를 실시하는 등의 단계를 포함하는 무균검사 방법이다. 본 발명은 이 방법의 실시시 사용되는 밀폐성 집균 앰플(ampoule) 배양기를 소개하였고, 이 집균 앰플 배양기는 집균 앰플 시스템, 시료첨가시스템 및 연동배출시스템으로 구성되어 있다. 시료첨가시스템과 집균앰플시스템 사이는 진입 관을 통해 연결되어 있다.
본 발명은 미생물 오염의 검출 시간이 짧고, 정밀도 및 자동화 수준이 높고, 검측결과가 정확하고, 검측 전 과정의 미생물 생장상태곡선을 제공한다. 이 곡선은 미생물의 상태를 분석하는데 비교적 양호한 지문과 같은 성질을 제공하여, 미생물의 오염 상황을 정확히 판정할 수 있게 한다.

Description

무균검사 방법 및 이에 사용된 밀폐식 집균앰플배양기{A Methodological development of sterility testing and its use of full-enclosed filtration-culture ampoule system}

본 발명은 약품, 식품, 생물제품, 의료기계 등 무균제품 검사영역과 관련이 있으며, 구체적으로 일종의 무균검사 방법과 이에 사용된 밀폐식 집균앰플배양기가 언급된다.

무균검사는 무균제품의 안전한 사용의 보장을 위해 필요한 항목이며, 무균제품의 생산주기를 결정하는데 있어서 중요한 일환 가운데 하나이다. 예를 들어, 약품 영역에서 각국의 약전은 주사의 무균검사에 엄격한 요구를 하고 있으며, 기본적으로 국제적으로 일치한 검사 표준과 운영 규칙을 형성하여, 무균 보증 수준을 효과적으로 제제시켰다.

그러나 현행하는 무균검사방법은 어느정도 국한성을 지니고 있다. 먼저, 무균검사 주기가 비교적 길어 제약회사의 생산효율제고를 제약한다. 각국 약전에 일반적으로 규정하고 있는 무균검사의 배양주기는 14일이다. 만약 결과를 판정하지 못하면 종의 전환을 다시 거쳐 7일 배양해야 하고, 만약 결과가 "거짓양성"으로 판정되면 재시험을 해야하는 관계로 제품의 출하 대기시간과 생산주기를 지연시키게 된다. 둘째, 현행하는 약전 중, 무균검사에 대한 판정결과는 미생물대량생장으로 인하여 나타나는 배지 혼탁을 육안으로 관찰하고, 관찰자의 실전 경험이 큰 영향을 끼치며, 그 주관성을 배재할 수 없고, 자동화 수준도 낮다. 또한, 단순히 배지 혼탁에 의하여 시료의 무균상태를 판단하는 것은 다음과 같이 리스크가 존재한다. 육안관찰으로는 비미생물 생장으로 인하여 나타나는 배지의 혼탁을 배제할 수 없다. 생장이 느리고, 규정된 검측시간 내에 배지에 혼탁되지 않는 미생물 오명믄 더욱 식별할 수 없다. 그러므로 거짓양성과 거짓음성판정을 내려 결과의 정확성과 신뢰성에 영향을 미친다. 상위에 서술한 문제점에서 보면, 신속히 무균제제의 미생물 오염을 식별하는 방법을 확립하고, 검사의 정밀도, 정확도, 검사 시간단축, 검사 자동회 수준을 제고하여 현존하는 방법을 보충 혹은 대체하는 것 이야 말로, 국내와 무균제제 연구의 중요 관심사가 되었다. 또한, 미생물레이저반사검출법과 생물발광 검측법, PCR 확장 검측법 등의 새로운 방법을 형성하였다. 상위의 각종 방법은 미생물 오염의 검사 능력을 향상시켰다. 그러나 미생물 입자가 매우 작고, 기타 입자의 교란, 조작 운용의 복잡성, 기기설비 및 시약의 높은 단가 혹은 방법의 보편성 결여 (특정 미생물을 말함, 검측면 협소)등 요소로 인해 응요의 확대를 제약한다. 따라서 미생물의 생명, 생장 특징에 의한 새로운 검측방법을 수립해야 한다.

생물역학이론에 의하면 일체의 생명활동에는 에너지와 물질의 대사전환을 수반하며, 이러한 에너지는 미세열량계시스팀으로 감시할 수 있다. 미세열량법은 정밀하고, 신속하며 조작이 간단할 뿐 아니라, 방법이 많아 현장에서 즉시 검측할 수 있는 계기 시스템으로 근래에는 발명자를 포함한 연구팀이 미세열량법을 응용하여 미생물생장과정의 열효능을 검측하여 약물의 품질제어와 효용평가에 사용하여, 일정의 경험과 성과를 취득하였다. 적절한 조건 하에, 미생물의 생장은 명확한 규율성과 특징성이 있음을 연구를 통해 표명하였다. 따라서 이에 미세열량법을 이용하여 무균검사의 새로운 방법을 수립할 수 있음을 시사한다.

본 고안의 원리는 미세열량계를 이용하여 미생물 생장과정의 열효능 기능을 검측하고, 미세열량계에 상이한 종류와 상이한 생장상태의 미생물의 특징적 열곡선을 기록하여 수치를 분석하는 표준 데이터를 수립하는 것이다. 그리고 나서, 시료의 열곡선을 기록하여 만약 시료를 미멸균 혹은 철저히 멸균을 하지 않아 미생물이 오염되었다면, 시료의 열곡선에 미생물 생장 추이가 나타나고, 이때, 이미 수립한 표준 데이터와 비교하여 오염된 시료를 신속히 가려낼 수 있고, 일차적으로 어느 종류의 미생물에 오염되었는지 분별 해낼 수 있다.

미세열량계는 통상적으로 검측채널에 넣은 후, 미생물 생장에 나타나는 열량변화를 기록한다. 그러나 미세열량계를 이용하여 무균검사를 진행할 때, 작동과정에 중대한 결함이 존재한다. 즉, 무균검사를 진행할 때, 미세열량계의 부속에 사용되는 앰플 구조를 시료와 배지 주입 시, 밀폐된 곳에서 진행할 수 없음으로 인해, 제품의 미생물 오염검사(무균검사)가 요구하는 외부 환경과의 격리(2차 오염을 피하기 위함), 미생물 수집 동시에 제품의 세균발육억제기능의 제거 요구를 만족 시킬 수 없다. 이로 인하여 운영과정에 외부의 요소로 인해 시료를 오염시켜 거짓양성판정을 내리게 된다. 그러므로 미세열량법을 이용하여 무균검사를 진행할 때 미세열량계의 앰플을 개선해야 한다. 본 고안의 밀폐성 집균앰플배양기의 설계 원칙은 다음을 포함한다. (1) 무균성: 적합한 멸균방법을 이용하여 집균기의 무균성을 확보한다. (2) 밀폐 성: 시스템 내부와 외부 환경의 효과적인 격리를 확보한다. (3) 집균 성: 필요한 집균 장치를 배치하여 시료에 대해 미생물 집균 및 세균발육억제를 실현한다. 또한, 검사 대기중인 시료의 성질에 따라 적절한 여과막을 설치할 수 있다. (4) 열 정밀성: 시스템에 사용된 재료는 미생물생장대사에너지를 열량계가 정밀하게 검측할 수 있게 한다. (5) 내압성: 시스템은 집균 과정의 음압 요구를 만족시켜 미생물의 손상을 피한다. (6) 내수성: 시스템은 무균검사의 시료량 수요를 만족시켜 충분한 검측 능력을 지닌다. (7) 간편성: 시스템 운영이 간편하고, 자동화 성능이 좋아, 결과를 자동으로 알려준다. (8) 경제성: 시스템이 경제적이며 대량생산이 가능하고 널리 응용된다.

본 고안의 목적은 현재의 무균검사방법의 긴 주기, 정밀도 저하, 관찰자에 의한 검사결과의 주관적 경향 및 미세열량계의 앰플 밀폐 성 결여 등의 문제를 해결하기 위한 것이다.

위와 같이 서술한 목적의 실현을 위해 본 발명의 기술방안 일종의 무균검사방법이며 이 방법은 아래와 같은 순서를 포함한다.

(1) 균액 준비: 서로 다른 균주를 무균 배지에 배양하여, 농도와 생존상태가 서로 다른 균액을 획득한다. 이것을 균주의 특징 지문 열곡선을 그리는 양성 대조구로 삼는다.

(2) 식별특징으로서 각 균주의 기준 특징인 열곡선을 기록한다. 단계 (1)에서 획득한 균액을 미세열량계에 놓고, 각 균주의 농도와 생존상태가 서로 다른 열곡선을 기록하여, 서로 다른 균주의 특징 지문 열곡선을 취득한다.

(3) 위 단계 (2)에서 취득한 열곡선의 열역학 파라미터를 채취하여 균주의 양성판정지표를 확정한다.

(4) 시료에 무균검사를 진행한다. 대기 중인 시료를 여과시켜 무균세척액을 이용하여 여과막 위에 여과된 물질을 씻는다. 이 시료의 여과물과 배지를 혼합한 후, 미세열량계의 검측채널에 넣어 이의 열곡선을 기록한다; 단계 (2)를 통화한 서로 다른 균주의 열곡선과 단계 (3)의 균주 양성판정시표를 비교하여 이 시료의 미생물 오염 여부를 검사한다.

이상 단계 (1)에서 단계 (3)은 검측 표준을 수립하는 단계이며, 실험을 통하여 각 균주의 지문특징 열곡선과 연관된 열역학 파라미터를 획득하였고, 균주 양성판정지표를 수립한 후, 이러한 도표와 데이터를 향후 검측 작업의 표준으로서 사용할 수 있다. 다시 말해, 단계 (1)에서 단계 (3)의 표준 수립 작업은 1회로 가능하며 표준을 수립한 후, 시료의 검측은 단계 (4)의 작업 과정을 거쳐 표준과 비교하면 된다.

단계 (1)에서 서로 다른 농도의 균액을 획득하는 방법은 신선한 균주 배양물을 여과 세척하여 세척액을 확보하고, 0.9% 식염수 용액으로 세척액을 10배 연속 희석시킨다; 각 균주마다 생존 상태가 서로 다른 균액을 획득하는 방법은 배양물을 여과 세척하여 세척액을 얻고, 상기 세척액을 각각 -70℃ 냉동고와 60℃ 수조에 두 시간 둔 뒤, 다시 0.9% 식염수 용액으로 10배 연속 희석시킨다.

단계 (2)에서 균액을 미세열량계에 두는 구체적인 순서는 다음과 같다.

(2-1) 단계 (1)의 방법에서, 각 균주를 10^-3,10^-5,10^-7,10^-8,10^-9,10^-10,10^-11배의 연속 농도로 희석한 배양물을 채취한다.

(2-2) 같은 부피의 각 균주의 연속 농도 희석 배양물을 무균 배지에 첨가하고, 이것을 미세열량계의 양성검측채널로 삼는다.

(2-3) 무균 배지 일 회분 양을 별도로 획득하여 미세열량계 공백대조채널로 삼는다.

단계 (3)에서 서술한 열역학 파라미터는 다음을 포함한다. 시간에 따라 변화하는 검측채널 열공률 P_i 및 동일시각 공백의 대조채널열공률 P₀, 최대발열공률 P_max, 최대발열공율 도달시간 T_max, 총 발열량 H_total 및 지수생장 15분 간격의 각 곡선의 기울기 k이다.

단계 (3)에서 서술한 균주 양성판성지표는: k≥0 를 출현시간으로 기록하고, k≥0 를 미생물 오염을 검사하는 필요조건으로 삼고, 동시에 미생물 생장을 양성으로 판단하는 시간지표로 확정한다.

미생물 생장을 양성으로 판단하는 시간지표는 아래와 같은 방법으로 확정한다. 검측채널열공률 P_i 와 동일시각의 공백채널열공률P₀ 사이의 차이값이 P₀ 절대치의 3배 일때의 시간이 시료의 미생물 오염시간 T_d 이다. 즉 다음과 같다.

T_d=Time[(P_i-P₀)/|P₀|≥3]

단계 (4)에서 시료 여과물과 배지를 혼합하여 미세열량계의 앰플에 넣을 때, 앰플 내부의 부피에 비례하여 균주의 생장을 촉진시키는 기체 환경을 유지한다. 가장 좋은 방안은 단계 (4)의 앰플을 미세열량계의 검측채널에 놓을 때, 검측채널의 온도를 균주생장에 적합한 온도인 23℃에서 37℃로 설정한다.

본 고안은 상위에 서술한 방법을 실시할 시, 사용하는 밀폐식 집균앰플배양기를 포함하며 집균앰플배양기는 집균앰플시스템, 시료첨가시스템 및 연동배출시스템으로 구성되어 있으며, 시료첨가시스템과 집균앰플시스템 사이는 진입관을 통해 연결되어 있고, 집균앰플시스템과 연동배출시스템은 배출관을 통해 연결되어 있다.

집균앰플시스템은 앰플병을 포함한다. 앰플의 입구는 고무덮개로 밀폐되어 있고, 진입관, 배출관과 배기관은 고무덮개를 통과해 앰플 몸체 내에 뻗어 있으며, 앰플병 내에는 여과기가 배치되어 있고, 여과기의 하부에 여과막이 있으며, 여과기의 상부와 앰플 내부의 진입관이 연결되며, 앰플 내부의 배출관은 여과기를 지나 앰플 하부에 뻗어있다. 앰플 외부의 진입관, 배출관과 배기관에는 각각 진입제어밸브, 배출제어밸브와 배기제어밸브가 설치되어 있으며, 배기관 상부는 공기여과기와 연결되어 있다.

시료첨가시스템은 시료 배지 용기와 공기여과기의 진입장치를 포함한다.

연동배출시스템은 연동펌프 한 개를 포함하며, 연동펌프의 출구는 폐액수집기와 연결된다.

진입제어밸브와 시료첨가시스템 사이의 진입관에 연결기가 설치되어 있다. 이 연결기를 끊어주면 시료첨가시스템과 집균앰플시스템을 분리시킬 수 있다. 용액배출밸브와 연동배출시스템 사이의 배출관에는 배출관연결기가 설치되어 있고, 이 연결기를 끊어주면 연동배출시스템과 집균앰플시스템을 분리 할 수 있다.

진입관연결기와 배출관연결기는 마개형태이다. 진입관연결기 관과 배출관연결기의 마개는 연결되어 밀폐파이프연결기를 형성한다.

진입관, 배출관과 배기관은 실리콘의 부드러운 관이며 진입밸브, 배출밸브와 배기밸브는 마운트 밸브(mount valve)이다.

배기관 상부는 광기여과 장치의 스테인리스 바늘이 있다.

앰플 몸체에 진입해 있는 진입관은 위가 가늘고 아내가 넓은 원뿔모양관이며 여과기는 원뿔모양관의 하단에 고정되어 있다. 상위에 서술된 원뿔모양관의 상단 외표면은 나사산 모양구조이며, 고무마개 아래의 진입관은 암나사 연결부에 고정되어 있다. 원뿔모양관은 나사산 모양구조를 통해 암나사 연결부와 연결되어 있다.

이번에 발명된 미세열량분석 무균검측법과 현존하는 기술의 집균관찰법을 비교해보면 아래와 같은 이점이 있다. ① 검측 시간상, 미세열량법이 집균관찰법 보다 빠르다: 미세열량법의 검출시간은 0~18시간 사이에 집중 분포해 있으나, 집균관찰법으로 양성판단을 내리는 시간은 10~36시간 사이에 집중 분포해있다. ② 정밀도에 있어서 미세열량법은 집균관찰법의 상위에 있다. 미세열량법은 10^-10,10^-11보다 낮은 희석도의 미생물 생장을 검출할 수 있다. 그러나 관찰법으로는 동등한 조건 하에서 이 희석도의 양성균의 생장을 검출할 수 없다. ③ 정량성과 특징 지문 곡선의 식별에 있어서 미세열량법은 관찰법보다 우수하다. 미세 열량법은 미생물 균주를 구별할 수 있는 지문특징 생장 열곡선 및 정량의 열역학 파라미터 및 양성균검출판정 표준 방정식을 제공하나, 관찰법은 배지의 혼탁을 육안관찰법에 의지하므로 양을 정할 수 없고, 균주 판단의 특징도 갖추지 못한다. ④ 자동화 및 정확성에 있어서 미세열량법이 관찰법보다 우수하다. 미세열량법은 미생물 생장 과정 중, 에너지대사의 검측 기록을 통하는 것으로 결과가 정확하다. 또한, 열역학 파라미터의 분석에 대해 양성검사결과를 보고할 수 있고 자동화 수준이 높다. 동시에 집균관찰법의 반복 관찰로 초래되는 작업량 중가 및 2차 오염 리스크를 피할 수 있다. 전통적인 관찰방법 중, 존재할 수 있는 비미생물 생장으로 배지가 혼탁 되면 거짓양성판단(예를 들어, 약물과 배지 혼합으로 발생한 혼탁) 및 미생물 생장에 나타나기 힘든 배지의 거짓음성판단(예를 들어, 백색의 칸디다[Candida]) 곰팡이, 바실루스[Bacillus]간 균은 생장과정에서 짧은 시간 내에 배지가 현저히 혼탁 되기 어려우므로 결과를 판정하기 어렵다.)을 피할 수 있다.

본 고안은 밀폐식 집균앰플배양기와 보통 미세열량앰플을 비교하면 밀폐식 무균시스템에서 시료 미생물의 풍부한 채집(집균 기능), 박막세척으로 시료의 세균발육억제활동의 교란을 해소하고(교란 저항기능), 배지에 첨가하여 미생물 회생 배양(배양기능) 및 열량계채널에 넣어 미생물 생장 열대사 상황의 기록(기록기능)을 실현하였다. 시료채집에서 배양까지 모든 운용에서 외부요소로 인한 시료오염 혹은 배양기 오염의 가능성을 배제하였고, 시료의 미생물오염 양성판정으로 오판되는 가능성(거짓양성)을 해소함으로써 검측 정확성을 뚜렷이 향상시켰다.

본 고안은 밀폐식 집균앰플배양기를 현존하는 무균검사집균배양기와 비교했을 때, 그 이점은 다음과 같다. ① 본 고안은 미세열량법의 무균검사에 사용할 수 있다. 그러나 현존하는 무균검사집균기는 보통관찰법에서만 적합하다; ② 이에 비해, 현존하는 집균배양기는 육안관찰에 의존하므로 중복하여 여러차례(14일) 관찰해야 하며 노동량이 많고 인건비가 높은 결함을 지니다. 본 발명으로 미세열량계를 통해 즉시 현장에서 여러 경로로 시료의 미생물 생장대사 열량의 변화를 자동 적으로 기록하므로, 자동화 수준이 놓고, 노동 강도와 인건비를 낮출 수 있다. ③ 본 미세열량법을 통해 시료의 미생물 오염물의 열량대사를 검사하면 더욱 정확하고 신속하게 미생물 오염을 판단할 수 있다. 현존하는 집균배양기가 육안관찰에 의지해 배양기의 혼탁을 관찰하는 것과 비교해서 더욱 정확하며 초기에 미생물 오염을 검출할 수 있으므로 검사시간을 절약할 수 있다. ④ 미세열량법을 통해 시료의 미생물 오염물의 열량대사를 검사하면 시료의 무균상태를 판단하는 집균배양기법과 비교하면 미세열량법이 더욱 정확하다. 따라서, 육안관찰로 발생할 수 있는 오판을 효과적으로 피할 수 있다. ⑤ 본 고안의 미세열량법을 사용하여 시료의 미생물 오염물 열량대사 곡선의 전 과정을 기록하여 일정한 특징적인 지문을 가진다; 현존하는 결과만 판단해주는 육안관찰법과 비교하면 더욱 전면적인 데이터를 제공한다. 오염된 미생물 종류의 1차 감정에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 황색포도상구균 생장도표
도 2는 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 대장균 생장도표
도 3은 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 녹농균 생장도표
도 4는 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 Clostridium sporogenes 생장도표
도 5는 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 Shigella dysenteriae (이질균) 생장도표
도 6은 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 Bacillus subtilis 생장도표
상위 도면에서, A: 무균티오글리콜산염 배지, B: 10^- ³희석도, C: 10^- ⁵희석도, D: 10^- ⁷희석도, E: 10^- ⁸희석도, F: 10^- ⁹희석도, G: 10^- ¹⁰희석도, H: 10^- ¹¹희석도
도 7은 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 아스페르질루스 니제르 생장도포
도 8은 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 농도의 백색 칸디다균 생장도표
상위 도면에서, A: 무균의 개량된 마틴(Martin)배지, B: 10^- ³희석도, C: 10^- ⁵희석도, D: 10^- ⁷희석도, E: 10^- ⁸희석도, F: 10^- ⁹희석도, G: 10^- ¹⁰희석도 H: 10^- ¹¹희석도
도 9는 본 고안의 방법을 이용해 기록한 서로 다른 상태의 황색 포도상구균 생장도포
상위 도면에서 A: 무균티오글리콜산염 배지, B: 무균 식염수, C: 35℃ 10^- ⁵희석도, D:35℃ 10^- ⁷희석도, E: -70℃ 10^- ⁸희석도, F: -70℃ 10^- ⁹희석도, G: 60℃ 10^-5희석도, H: 60℃ 10^- ⁷희석도
도 10은 서로 다른 멸균 조건 하에 복합인진주사약에 대해 본 방법으로 무균 검사를 실시한 열곡선이다.
도면에서 A: 정상시료 + 티오글리콜산염 배지, B: 황색포도구균 + 티오글리콜산염 배지, C: 멸균하지 않은 시료 + 티오글리콜산염 배지 D: 철저한 멸균을 하지 않은 시료 + 티오글리콜산염 배지, E: 정상 시료 + 개량한 마틴 배지, F: 백색 칸디다균 + 개량한 마틴 배지, G: 멸균하지 않은 시료 + 개량한 마틴 배지, H: 철저한 멸균을 하지 않은 시료 + 개량한 마틴 배지
도 11은 무균검사법 양성으로 판단한 지표의 각 파리미터 관계를 나타내는 도면이다.
도면에서 : P_i 테스트 시료의 열공률, P₀:P_i:과 동일 시각의 무균배지 열공률, k: 열곡선 15분 간격의 기울기, T_e: 지수 생장기 k≥0가 나타나는 시간(Time of exponential growth), T_d : 시료의 미생물 오염 양성반응을 검출하는 시간점(Time of Detection)
도 12는 밀폐식집균앰플배양기의 구조도이다.
도 13은 진입관 연결기와 배출관 연결기의 마개가 연결되어 밀폐파이프연결기를 형성한다. 또한 배기관을 뽑은 뒤의 밀폐식집균앰플배양기 구조를 나타내는 도면이다.
도 14는 진입관을 앰플 내부로 넣어 원뿔관으로 변한 구조를 나타내는 도면이다.
도 15는 원뿔관의 구조를 나타내는 도면이다.
도면에서 1: 앰플병, 2: 여과기, 3: 고무패킹, 4: 진입관, 5: 배출관, 6: 배기관, 7: 진입제어밸브, 8: 배출제어밸브, 9: 선, 10: 진입장치, 11: 진입관연결기, 12: 시료 배지용기, 13: 연동펌프, 14: 폐액수집기, 15: 여과막, 16: 공기여과기, 17: 배기제어밸브, 18: 배출관연결기, 19: 밀봉관연결기, 20: 월뿔관, 21: 원뿔관 상부의 나사산모양구조, 22: 고무패킹 내 암나사모양 연결구

본 고안의 기술방법은 아래 열거된 구체적인 실시방식에 국한되지 않으며 각각의 구체적 실시방식 사이에 어떤 조합을 포함하고 있다.

구체적인 실시예 1: 본 고안이 제공한 무균제제에 무균성 검사를 실시하는 방법은 다음과 같은 단계로 진행된다.

<1> 실험재료

1. 약품과 시약: 복합인진주사액 (규결 50ml/병, LOT NO. : 20100120). 정상적 시료(Norm-sterilized Samples, norm-SS), 멸균하지 않은 시료(Non-sterilized Samples, Non-SS), 철저한 멸균을 하지 않은 시료(Non-sterilized Samples, Sub-SS) (100℃ 증기멸균 10min)를 포함하며 모두 해방군제 302 의원약학부가 제공.

2. 기계와 재료: 3113형 TAM air 등온 미세열량분석기(Isothermal microcalorimeter) (TA Instrument, US), TAM Assistant 작업장. 검사는 4μW, 24h 기준드리프트가 ±20μW 미만으로 제한되며 측정범위는 ±600mW, 작업온도는 5~90℃이다. SW-CT-2FD 2인 단면정화대 (소주 정화 설비공장)

NS01-2형 밀폐식 무균시험 여과배양기 (북경 니우니우 유전기술 유한공사, Lot No.20090910)

TH2-22보온진탕기 (강소 태창시 실험설비공장)

HTY-Ⅲ 형 지능형 집균기 (항주 태림의료기계유한공사)

303AB-6형 방수 배양상자 (상해 수립의기의표공사), 0.45μm 아세테이트 셀룰로스 에스테르막 (북경화학공장), 0.9% 무균 식염수용액 (석가장 4약집단).

3. 균주와 배지

[ Staphylococcus aureus (S. aureus ), CMCC (b) 26003],

[ Escheichia coli (E. coli ), CMCC (B) 44102],

[ Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ), CMCC (B) 10104],

[ Shigella dysenteriae , (S. dysenteriae ), CMCC (b) 51252],

[ Bacillus subtilis (B. subtilis ), CMCC (B) 63501],

[ Clostridium sporogenes (C. sporogenes ), CMCC (B) 64941],

[ Candida albicans (C. albicans ), CMCC (F) 98001],

[ Aspergillus niger (A. niger ), CMCC (F) 98003] ,이상은 중국약품생물제품 점검소에서 제공하였다.

[Thioglycollate medium (TM), LOT NO. 091020]

[Modified martin medium(MMM) LOT NO. 090915],

(Nutrient Broth Medium, LOT NO. 091022)

(Powered Agar, LOT NO. 091022)

(Sodium Rose Bengal Medium, LOT NO. 090912)

(Peptone, LOT NO. 090708), 이상은 중국약품생물제품 점검소에서 제공하였다.

<2> 균액준비

황색 포도당구균, 대장균, 녹농균, Shigella dysenteriae , Bacillus subtilis을 점종한 신선한 배양물을 액체배지에 넣고, Clostridium sporogenes 을 접종한 신선한 티오클리콜산염 배지에 넣고 30~35℃ 에서 18~24h 배양한다. 칸디다균을 접종한 신선한 배양물을 개량된 마틴 배지에 넣고 23~28℃의 에서 24~48h 배양한다. 위 배양물을 0.9% 멸균 식염수 용액에 10배 희석하여 균수가 100cfu·mL^-1미만의 세균현탄액을 만든다.

아스페르질루스 니제르를 접종한 신선한 배양물을 개량된 마틴 배지 경사면에 넣고, 23~28℃에서 5~7일 배양하고, 3~5mL 의 0.9% 식염수용액에 넣어 포자를 세척한다. 세척액은 0.9% 무균 식염수용액을 10배 희석한 것으로 포자수가 100cfu·mL^-1 미만의 포자현탄액을 만든다.

신선한 황색 포도당 구균을 5mL의 배양물에 각각 -70℃ 냉동고와 60℃ 수조에서 2h 둔 후, 0.9% 식염수용액을 넣오 10배 연속 희석한다.

상위에 서술한 각 미생물의 서로 다른 농도 희석을 무균검사의 양성 구조대로 삼는다.

<3> 시료 균주의 지문특징 열곡선 확보방법

10^-3,10^-5,10^-7,10^-8,10^-9,10^-10,10^- ¹¹으로 각각 희석한 배양물 1mL를 미세열량계 앰플에 각각 넣고, 이에 호응하는 무균배양기에 9mL를 넣어 양성검측채널로 삼는다. 별도로 앰플 하나를 이와 상응하는 무균배양기에 직접 넣어 공백대조채널로 삼는다.

그 중에서 황색 포도당구균, 대장균, 녹농균, Bacillus subtilis , Clostridium sporogenes , 시겔라균의 희석배양물에 티오글리콜산염을 넣은 배지를 35℃ 미세열량계에 넣어, 도 1~8과 같이 각 균주의 생장열곡선을 기록한다.

황색 포도당구균의 신선한 배양물과 -70℃의 보존배양물 및 60℃의 보존배양물 10^-5,10^-7의 희석한 배양물을 취득하여 각각 1mL를 주입한 후, 미세열량분석기 앰플에 넣고, 다시 각각 9mL 무균 티오글리콜산염 배지를 넣어 서로 다른 상태의 미생물의 검사채널로 삼는다. 별도로 두 개의 앰플을 취하여 각각 무균 티오글리콜산염과 무균식염수를 10mL 부어 공백대조채널로 삼고, 각각의 앰플을 35℃ 미세열량계에 넣고 도 9와 같이 각 균주의 생장 열곡선을 기록한다.

<4> 열곡선의 열역학 파라미터의 취득: 시간에 따라 변화하는 검측채널열공률 P_i 및 동일시간의 공백대조채널열공률 P₀, 최대발열공률 P_max, 최대발열공률도달시간 T_max, 총 발열량 H_total. 지수생장의 15분 간격의 각 곡선의 기울기 k 값, k≥0의 출현시간(Time of exponential growth T_e)

각 균주의 서로 다른 농도하에 취득한 파라미터는 다음과 같다.

그 중, Dilution: 희석도, cfu (colony forming unit), 콜로니형성단위 T_e: k≥0 출현시간, k: 열곡선 15분 간격의 기울기, T_d: 미생물 검출시간, P_i: 희석도가 서로 다른 균액생장열공률, P₀:P_i 의 동일시각의 무균배지열공률, P_max: 최대발열공률, T_max: 최대발열공률도달시간, H_total: 총발열량.

표 1A 농도가 서로 다른 황색 포도당 구균 생장의 열역학 파라미터

표 1B 농도가 서로 다른 장균 생장의 열역학 파라미터

표 1C 농도가 서로 다른 녹농균 생장의 열역학 파라미터

표 1D 농도가 서로 다른 Bacillus subtilis 생장 열역학 파라미터

표 1E 농도가 서로 다른 Clostridium sporogenes 생장 열역학 파라미터

표 1F 농도가 서로 다른 시겔라균 생장의 열역학 파라미터

표 1G 농도가 서로 다른 아스페르질루스 니제르 생장의 열역학 파라미터

표 1H 농도가 서로 다른 칸디다균 생장의 열역학 파라미터

생존상태가 서로 다른 상황에서 취득한 황색 포도당 구균의 파라미터는 다음과 같다.

표 2 상태가 서로 다른 황색 포도당 구균 생장의 열역학 파라미터

방대한 수치의 분석과 정리를 통해, 본 발명에서 미생물오염의 판정지표 확보는 k≥0를 시료 균주의 필요 조건으로 한다. 또한, 규정검사채널열공률 P_i값과 동일시각의 공백경로열공률 P₀값의 차이가 절대치 3배의 시간을 검출 수식의 양성판단시간(Time of Detection, T_d ) 즉, T_d =Time[(P_i-P₀)/|P₀|≥3]으로 한다.이 판정지표에 의거하여 이상의 실험수치를 분석한 결과 다음을 알 수 있다.

(1) 각 균주의 생장곡선에 명확한 특징이 있다. 이것은 서로 다른 균주의 특징을 식별하는데 사용한다. 그 중, 최대발열공률 (P_max), 총 발열량 (H_total) 및 곡선의 굴곡 구조는 각 균주 사이의 특징 차이를 가장 많이 대표할 수 있으며 안정성을 가지고 있다.

(2) 희석도가 낮아짐에 따라 각 균주 열곡선의 굴곡은 기본적으로는 변하지 않으나, 최고발열공률에 도달하는 시간 (T_max)과 지수생장기 (T_e)는 지연된다.

균주의 농도(Dillustion)가 낮아짐에 다라, 대장균 및 시겔라 균의 최대발열공률이 낮아진다.

희석도가 낮아지면 각 균주의 검출시간(T_d )은 점차 지연되고, 비교적 양호한 선형 관계가 나타난다.

(3) 칸디다균의 검출시간은 약 36시간을 제외하고 다른 균주는 기본적으로 18시간내 검출되며, 검출시간과 균액 농도에 명확한 선형 관계를 형성하고, 미세열량법은 각종 미생물 검출에 비교적 좋은 보편성과 신속성을 지니고, 동시에 칸디다 균은 생장이 느린 미생물이나, 기타 미생물은 이러한 조건 하에서 생장이 신속하여 빠르게 검출이 가능하다.

(4) 서로 다른 상태의 황색 포도당 구균의 검출시간은 다음과 같다:

신선한 배양물(<18시간)< 냉동보관 배양물(<24시간) < 고온보관 배양물(<36시간). 그 결과 이러한 검측 조건 하에 서로 다른 상태의 미생물 증식 시간은 손상받은 정도에 따라 지연됨을 알 수 있고, 서로 다른 상태의 미생물을 정밀하게 검출할 수 있다.

(5) 활균 수 계산 결과: 본 발명은 1cfu 미만의 각 미생물을 검출할 수 있고 정밀도도 높다. 그 중, 황색 포도당 구균, 녹농균, 아스페르질루스 니제르 등의 10^-11미만의 희석배양물을 검출할 수 있다.

상위의 단계로 각 균주의 특징 지문 열곡선과 연관된 열역학 파라미터를 획득하였으며 균주양성판단지표를 수립하였다. 이러한 곡선과 수치는 본 발명의 기술 분석자료이며, 또한 향후 검측작업의 표준으로 사용될 수 있다. 다시 말해, 상위의 표준은 1차례만 진행하면 되는 것이며, 표준의 수립 후, 이후의 검측은 단계 (5)를 중복하여 표준과 비교하면 된다.

예를 들어, 복합인진주사액이 테스트를 받은 제제(조제한 약)인 경우, 여과, 배양을 거쳐 미세열량계에서 열곡선을 기록한다. 이 열곡선과 단계 (4)에서 획득한 균주양성판정지표를 비교하여, 이 시료의 열곡선이 균주양성판정지표에 부합되는 곡선을 나타내면 미생물 오염으로 판정할 수 있다. 그 후, 단계 (3)에서 획득한 균주의 특징 지문 열곡선에 근거하여 오염된 균주의 유형을 판단할 수 있다.

<5> 검사받은 제제의 무균성 검사

본 고안의 신뢰성과 정밀도를 검증하기 위해, 아래와 같이 검사과정에서 복합인진주사액의 정상멸균시료를 선택하여 견본 시료로 삼고, 이외에 복합인진주사액의 멸균하지 않은 시료와 철저히 멸균하지 않은 시료, 정상멸균시료+100cfu 이하의 황색 포도당 구균, 정상멸균시료+1cfu 미만의 칸디다 균을 견본시료의 대조물로 삼아, 그 수치를 채집하여 수치분석을 한다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

복합인진주사액의 멸균하지 않은 시료, 철저히 멸균하지 않은 시료와 정상멸균시료를 각각 20mL 채취하여 박막에 여과한다. 여과막은 0.1%의 펩톤용액에 100mL씩 세차례 세척하고 세척액을 버린다. 다시 앰플에 10mL의 티오글리콜산염 배지를 넣는다. 위의 견본을 별도 채취하여 앞과 같은 방법을 되풀이 한 후, 세척액을 버리고, 10mL 의 개량된 마틴 배지에 놓는다.

별도로 정상멸균시료 200mL를 두 개를 채취하여 세척액을 버린 후, 두 개의 앰플에 각각 10mL의 티오글리콜산염 배지와 10mL의 개량된 마틴 배지를 넣는다. 티오글리콜산염 배지에 100cfu 미만의 칸디다 균 희석 배양물을 넣어 양성 여부를 대조한다.

각 앰플을 상응하는 미세열량계 채널에 놓고 열곡선을 기록한다. 열곡선을 도 10과 같이 기록한다. 각 열곡선에서 취득한 수치는 아래의 표와 같이 열거되어 있다. 그중 k: 열곡선 15분 간격 기울기,T_e : k≥0 출현시간, T_d :미생물검출시간, P_max: 최대발열공률, T_max: 최대발열공률 도달시간, H_total: 총 발열량

표 3. 복합인진주사액 무균검사의 매개변수의 추출과 결과판정

수치분석 결과는 아래와 같다.

(1) 열곡선에서 정상견본 (정상견본+티오글리콜산염 배지, 정상견본+개량된 마틴배지) 채널의 열곡선은 완만한 하강 곡선을 나타내고, 열역학 파라미터에서 정상견본 k 값이 지속적인 마이너스 상태를 나타내며, 정상견본에서는 미생물 오염이 없고 배지의 무균성도 양호함을 나타낸다.

(2) 열곡선 양성대조채널 (황색포도당 구균+티오글리콜산염 배지, 칸디다균+개량된 마틴 배지)의 미생물 생장이 양호함을 나타내주어, 이 조건이 복합인진주사액 무균검사에 부합함을 설명하고 정밀도도 비교적 양호한 편이다.

(3) 멸균하지 않은 시료 및 철저히 멸균하지 않은 시료에서 미생물 오염은 모두 10.5시간 내에 검출되었다. 열역학 파라미터는 멸균하지 않은 시료의 P_max가 철저히 멸균하지 않은 시료보다 높으며, 그 오염 정도가 높고, 이 무균검사법이 시료의 서로 다른 오염 정도에 얼마나 정밀한지를 나타낸다.

상위에 서술한 내용은 본 고안의 방법을 사용하여 무균검사를 진행하는 단계 및 확보한 실험수치이다. 본 발명과 현존 기술을 비교하기 위해 아래에 상위에 서술한 방법과 같은 실험 조건 하에 집균관찰법을 이용한 무균검사결과 수치를 제고안다. 또한, 본 고안의 실험수치와 비교를 진행하였다.

1. 서로 다른 균주와 농도하에서 두 방법의 미생물 검출에 필요한 시간을 다음과 같이 비교하였다.

표 4A 각 미생물 소속 종류와 배양조건표

표 4B 본 발명법의 각 세균 검출시간표

표 4C 집균관찰법의 각 세균 검출 시간표

결과는 다음과 같다. (1) 칸디다 균 외에 집균관찰법으로 기타 미생물을 검출한 시간은 36시간 미만이다. 단, 평균검출시간은 미세열량법보다 길다. (미세열량법은 0~18시간에 집중되어 있고, 집균관찰법은 10~36시간 사이에 집중 분포해 있다.); (2) 집균관찰법으로 검출이 가능한 최저 희석도는 10^-10이며, 10^- ¹¹희석도에서 미생물은 검출되지 않았다. 동시에 각 미생물의 검출 최저 농도는 일제히 미세열량법보다 높아 검출 정밀도가 미세열량법보다 낮다; (3) 칸디다 균은 검사과정에서 배지의 혼탁이 두렷하게 나타나지 않았으며 집균관찰법으로 미생물이 생장하였는지 정확히 판단할 수 없다; (4) 집균관찰법으로 저온 (-70℃)과 고운 (60℃)에서 황색포도당 구균을 보존하고 있는 각각 희석도 배양물 검출시간은 미세열량법보다 길어진다. 또한 60℃일 경우, 10^- ⁸희석 배양물을 검출하지 못한다; (5) 선택한 미생물 균주는 aerobic bacteria / Anaerobic bacteria / Facultative bacteria , Gram -Pssitive Bacteria / Gram - Nagaative Bacteria , Bacillus / Yeast / Fungi 등 자연계에서 쉽게 볼 수 있는 미생물 유형 (일반 미생물 오염원)을 포함한다. 미세열량법으로 상위의 미생물을 모두 검출할 수 있으므로 보편성을 지니며, 무균검사수요에 부합된다.

2. 복합인진주사액을 견본으로 하는 무균성 검사에서 두 방법의 검사 결과의 비교는 다음과 같다.

본 고안의 방법으로 판정한 결과는 표 3과 같다.

집균관찰법으로 판정한 결과는 아래의 표와 같다.

표 5. 집균관찰법에 의한 인진주사액 무균검사 판정결과

표에서 "-": 미생물오염 미검출; "±": 정확한 판단 불가; "+" :미생물오염 검출.

두 방법의 미생물오염 검출시간 총 결산에 대한 비교는 다음과 같다.

표 6. 본 고안의 방법과 집균관찰법의 복합인진주사액 미생물오염 검출에 필요한 시간 대조표

결과는 다음과 같다. 본 고안의 방법이 집균관찰법보다 신속하며 정밀하다. 생장이 배지 혼탁에 뚜렷한 변화를 가져오지 않는 미생물오염 (칸디다균, Bacillus subtilis 등)에 대해 검사의 정밀도가 상대적으로 높다.

본 고안의 방법과 현존 기술의 집균관찰법을 전면적으로 비교한 결론은 아래의 표와 같다.

표7. 미세열량법과 집균관찰법 검측 수치 비교

이상 비교한 내용을 살펴보면 미세열량법을 이용해 무균검사를 진행하는 것이 현존하는 집균관찰법보다 신속하며 정밀하고 자동화 정도가 높고 객관적이다. 이것은 무균검사의 새로운 방법이라 할 수 있다.

구체적인 실시 예 2: 본 실시방식 단계 (1)~(4)는 구체적 실시방식 1과 같다.

단계 (5)는 시료를 여과하고 배양기에 넣는 과정에서 외부 환경과의 격리(2차 오염으로 인한 거짓양성판단 판정을 피하기 위해), 미생물의 충분한 채집 동시 세균발육억제의 제거 요구를 위해, 본 실시 방식에서는 밀폐식 집균앰플배양기를 사용하며 그 구조 및 사용 방법은 다음과 같다.

도 12와 같이 밀폐식 집균앰플배양기는 집균앰플시스템, 시료첨가시스템 및 연동배출시스템으로 구성되어 있다. 상위에 서술한 시료첨가시스템과 집균앰플시스템 사이는 진입관(4)을 통해 연결되어 있고, 집균앰플시스템과 연동배출시스템은 배출관(5)를 통해 연결되어 있다.

선별된 구조는 다음과 같다. 집균앰플시스템은 앰플병(1)을 포함하여 앰플의 입구는 고무덮개(3)로 밀폐되어 있고, 진입관(4), 배출관(5)과 배기관(6)은 고무덮개를 통과해 앰플 몸체 내에 뻗어있다. 앰플병 내에 여과기(2)가 배치되어 있으며, 여과기의 하부에 여과막(15)이 있고, 여과기의 상부와 앰플내의 진입관이 연결되며, 앰플 내의 배출관은 여과기를 지나 앰플 하부에 뻗어있다. 여과막은 여과대상에 따라 다른 재질로 설치한다. 앰플 외부의 진입관, 배출관과 배기관에는 각각 진입 제어밸브(7), 배출 제어밸브(8)와 배기 제어밸브(17)가 있고, 배기관 상부는 공기여과기(16)와 연결되어 있다.

위에서 서술한 시료첨가시스템은 시료배지용기(12)와 공기여과기(16)를 가지고 있는 액체진입장치(10)를 포함한다. 상위에 서술한 연동배출시스템은 연동펌프 한 개(13)를 포함하며, 연동펌프의 출구는 폐액수집기(14)와 연결된다.

선별된 구조의 연동배출시스템은 연동펌프(13) 한 개를 포함하며 연동펌프의 출구는 폐액수집기(14)와 연결된다.

진입제어밸브와 시료첨가시스템 사이의 진입관연결기(11)가 설치되어있다. 이 연결기를 끊어주면 시료첨가시스템과 집균앰플시스템을 분리시킬 수 있다. 용액배출밸브와 연동배출시스템 사이의 배출관에는 배출관연결기(18)가 설치되어 있고, 이 연결기를 끊어주면 연동배출시스템과 집균앰플시스템을 분리할 수 있다.

진입관연결기와 배출관연결기는 마개형태이다. 진입관연결기 관과 배출관연결기의 마개는 연결되어 밀폐파이프연결기(19) 를 형성한다.

집균앰플배양기에 여과와 배양기 주입 절차를 완성한 후, 진입관연결기(11) 마개부분에 시료첨가시스템과 집균앰플시스템을 분리하단다. 배기관연결기(18) 마개부분에 연동배출시스템과 집균앰플시스템을 분리한다. 그 후, 진입관연결기 마개와 배출관연결기 마개를 연결하여 밀폐파이프연결기(19)를 형성하며 집균앰플배양기가 도 13처럼 밀폐상태가 되게 한다.

앰플병에 눈금선(9)이 새겨져 있다. 필요에 따라 표시를 할 수 있는데 5mL, 10mL, 15mL 등을 새길 수 있다.

앰플병은 유리구조 혹은 경질 플라스틱 구조이며 투명한 재료는 외부관찰의 정확성을 보증한다.

진입제어밸브, 배출제어밸브와 배기 밸브는 마운트 밸브(mount valve)이다.

진입관, 배출관과 배기관은 실리콘의 부드러운 관이다.

배기관은 실리콘의 부드러운 관이 연결된 상단 공기여과장치를 지니고 있고, 하단 부분의 측면에 구멍이 있는 스테인레스 바늘이 있다.

이 밖에, 본 발명은 진입관의 변형구조도 제공한다.

도 14, 15와 같이 앰플 몸체에 진입해 있는 진입관은 위가 가늘고 아래가 넓은 원뿔모양관(20)이며 여과기는 원뿔모양관의 하단에 고정되어 있다.

상위와 같이 서술한 원뿔모양관의 상단 외표면은 나사 산 모양(21)구조이며, 고무마개 아래의 진입관은 암나사(22)에 고정되어 있으며 원뿔모양관은 나사 산 모양구조(21)를 통해 암나사와 연결되어 있다.

위에서 서술한 밀폐식집균앰플배양기의 사용방법은 다음과 같다.

(1) 시료첨가시스템, 집균앰플시스템, 연동배출시스템을 순서대로 연결한다. 즉, 진입관장치(10)를 견본/배지 용기(12)에 연결하고 진입관연결기(11)에 맞춘다. 견본/배지용기(12)는 검사를 기다리는 시료이다. 그리고나서 배출관연결기(18)의 입구도 맞춘다.

(2) 배기제어밸브(17)을 잠그고 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8), 연동펌프를 개방하여 유속을 조절하여 천천히 시료를 여과시켜 약액을 배출한다. 이 단계를 완성 한 후, 배기제어밸브(17)를 개방하여, 연동펌프(13), 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8)를 잠근다.

(3) 시료/배지 용기를 무균세척액용기로 교체하고, 배기제어밸브(17)를 닫고, 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8), 연동펌프(13)를 개방하고 유속을 조절하여 여과막을 세척하고 폐액을 배출시킨다.

(4) 연동펌프(13), 배출제어밸브(8), 진입제어밸브(7)를 닫고, 배기제어밸브(17)를 개방하여 시료/배지 용기(12)속의 견본을 대응 배지로 대체한다.

(5) 배기제어밸브(17)를 닫고, 배출제어밸브(8), 연동펌프(13)를 개방하여 앰플내부가 음압상태가 되도록 한다. 또한 여과막(15)을 뽑아 여과기(2)와 병속이 관통되게 한다.

(6) 배출제어밸브(8), 연동펌프(13)를 닫고 진입제어밸브(7)를 개방하여 배양기를 해당 눈금에 맞추고 진입제어밸브(7)를 닫는다.

(7) 배양과정에 미생물 생장을 촉진시키기 위해 일정 비례의 공기가 필요하다면, 배기제어밸브(17)를 열어 집균앰플배양기 내에 비례에 맞춰 공기를 주입한 뒤, 배기관(6)을 뽑는다. 배양과정에 공기가 필요 없다면 순서(6)를 완료 후 바로 배기관을 뽑는다.

(8) 진입관연결기(11)과 배출관연결기(18)의 마개를 열고 이 두 개 관 연결기의 마개를 맞물려 밀폐관연결기(19)를 형성하여 집균앰플배양기가 밀폐상태에 놓이게한다.

(9) 밀폐상태의 집균앰플배양기를 상응하는 검측계기나 환경에 놓고 견본의 검측 결과를 취득한다.

밀폐식 집균 앰플을 이용하여 테스트를 받은 제제 복합인진주사액에 무균검사를 진행하는 구체적인 방법은 다음과 같다.

(1) 진입장치(10)를 견본/배지 용기(12)에 연결하고 진입관연결기(11)를 맞춘다. 견본/배지 용기(12) 내에 있는 것은 복합인지주사액 시료이다. 그 후, 배출관 연결 기(18)의 입구에도 연결한다.

(2) 배기제어밸브(17)를 잠그고 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8), 연동펌프를 개방하여 유속을 조절하여 천천히 복합인진 주사액 시료를 여과시켜 약액을 배출한다. 이 단계를 완성 한 후, 배기제어밸브(17)를 열고, 연동펌프(13), 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8)을 잠근다.

(3) 복합인진 주사액 용기를 무균세척액용기로 교체하고, 배기제어밸브(17)를 닫고, 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8), 연동펌프(13)를 개방하여 유속을 조절하여 여과 막을 세척하고 폐액을 배출시킨다. 진입제어밸브 막을 세척하고 폐액을 배출시킨다.

(4) 연동펌프(13), 배출제어밸브(8), 진입제어밸브(7)를 닫고, 배기제어밸브(17)를 개방하여 시료/배지 용기(12)속의 주사액견본을 티오글리콜산염 배지 혹은 개량된 마틴 배지로 대체한다.

(5) 배기제어밸브(17)를 닫고, 배출제어밸브(8), 연동펌프(13)를 열어 앰플 내부가 음압상태가 되도록 하고, 여과 막(15)을 뽑아 여과기(2)와 병 속이 관통되게 한다.

(6) 배출제어밸브(8), 연동펌프(13)를 닫고 진입제어밸브(7)를 개방하여 배지를 해당 눈금에 맞추고 진입제어밸브(7)를 닫는다.

(7) 배기제어밸브(17)를 개방하여 집균앰플배양기 내에 공기를 주입한 뒤, 배기관(6)을 뽑는다.

(8) 진입관연결기(11)와 배출관연결 기(18)의 입구를 열고 이 두 개의 관 연결 기의 입구를 연결하여 밀폐관연결기(19)를 형성하여 집균앰플배양기가 밀폐상태에 놓이게 한다.

(9) 밀폐상태의 집균앰플배양기를 미세열량계에 놓고 복합인진 주사액 견본의 열 곡선을 확보한다.

위에서 서술한 기술방안은 본 고안이 선별한 기술방안을 가능한 구현시켰고, 본 기술영역의 당업자가 그 중 일부분에 가할 수 있는 변동을 통해 본 발명의 원리를 균등하게 구현시킬 수 있고, 이는 본 고안의 보호 범위 내에 속한다.

Claims

무균검사방법의 특징은 아래의 단계를 포함하는데 그 특징이 있다.
(1) 균액준비: 서로 다른 균주를 무균 배지에 배양하여 농도와 생존상태가 서로 다른 균 액을 획득한다. 이것을 균주의 지문특징 열 곡선을 그리는 양성 대조구로 삼는다. 균주마다 서로 다른 농도의 균 액을 획득하는 방법은 신선한 균주 배양물을 세척하여 세척액을 획들하고, 0.9% 식염수 용액으로 세척액을 10배 연속 희석시킨다; 균주마다 생존 상태가 서로 다른 균 액을 획득하는 방법은 배양물을 여과 세척하여 세척액을 얻고, 상기 세척액을 각각 -70℃ 냉동고와 60℃ 수조에 두 시간 둔 뒤, 다시 0.9% 식염수 용액으로 10배 연속 희석시킨다.
(2) 식별특징으로서 각 균주의 기준 특징인 열 곡선을 기록한다: (1)에서 획득한 균 액을 미세열량계에 놓고, 각 균주의 농도와 생존상태가 서로 다른 균 액의 열 곡선을 기록하여, 서로 다른 균주의 특징 지문 열 곡선을 취득한다.
(3) 위(2)에서 취득한 열 곡선의 열역학 파라미터를 채취하여 균주 양성판정지표를 확정한다; 열역학 파라미터는 다음을 포함한다. 시간에 따라 변화하는 검측채널 열 공률 P_i 및 동일시각 공백의 대조채널열공률P₀ _,지수생장 15분 간격의 각 곡선의 기울기 k이다; 균주 양성판정지표는: k≥0 를 출현시간으로 기록하고, k≥0 를 미생물 오염을 검사하는 필요조건으로 삼고, 동시에 미생물 생장을 양성으로 판단하는 시간지표로 확정한다.
(4) 시료에 무균검사를 진행한다. 시료를 여과시켜 무균세척액을 이용하여 여과 막 위의 여과된 물질을 씻는다. 이 시료의 여과 물과 배지를 혼합한 후, 미세열량계의 검측채널에 넣어 이의 열 곡선을 기록한다. 단계(2)를 통과한 서로 다른 균주의 열 곡선과 단계 (3)의 균주 양성판정지표를 비교하여 이 시료의 미생물 오염 여부를 검사한다.
청구항 제 1항에 서술된 무균검사방법은 다음과 같은 특징이 있다. 단계 (2)중, 균 액을 미세열량계에 두는 구체적인 단계는 다음과 같다.
(2-1) 단계 (1)의 방법에서, 각 균주를 10^-3,10^-5,10^-7,10^-8,10^-9,10^-10,10^-11배의 연속 농도로 희석한 배양물을 채취한다.
(2-2) 같은 부피의 각 균주의 연속 농도 희석 배양물을 무균 배지에 첨가하고, 이것을 미세열량계의 양성검측채널로 삼는다.
(2-3) 무균 배지 일 회분 양을 별도로 획득하여 미세열량계 공백대조채널로 삼는다.
청구항 제 1항에 서술된 무균검사방법의 특징은 다음과 같다. 단계 (3)의 미생물 생장을 양성으로 판단하는 시간지표는 아래와 같은 방법으로 확정한다. 검측채널열공률 P_i 와 동일시각의 공백채널열공률P₀ 사이의 차이 값이 P₀ 절대치의 3배 일 때의 시간이 시료의 미생물 오염시간 T_d 이다. 즉 다음과 같다.
T_d=Time[(P_i-P₀)/|P₀|≥3]
청구항 제 1항의 방법을 실시하는데 사용되는 밀폐성 집균앰플배양기의 특징은 다음과 같다. 집균앰플배양기는 집균앰플시스템, 시료첨가시스템, 및 연동배출시스템으로 구성되어 있다. 상기의 시료첨가시스템과 집균앰플시스템 사이는 진입관(4)을 통해 연결되어 있고, 집균앰플시스템과 연동배출시스템은 배출관(5)을 통해 연결되어 있다; 집균앰플시스템은 앰플 병(1)을 포함한다. 앰플 병은 유리구조나 투명한 경질 플라스틱 구조이며 앰플 몸체에 눈금 선(9)이 표시되어 있다. 앰플의 입구는 고무덮개(3)로 밀폐되어 있고, 진 입관(4), 배출관(5)과 배기관(6)은 고무 덮개를 통과해 앰플 몸체에 뻗어있다. 앰플 병 내에 여과기(2)가 내장되어 있으며, 여과기 하부에 여과 막(15)이 있고, 여과기 상부와 앰플 내의 진입 관이 연결되어, 앰플 내의 배출관은 여과기를 지나 앰플 하부에 뻗어 있다. 앰플 외부의 진 입관, 배출관과 배기관에는 각각 진입제어밸브(7), 배출제어밸브(8)와 배기제어밸브(27)가 있고, 배기관 상부는 공기여과기(16)와 연결되어 있다; 상술한 시료 첨가시스템은 시료배지용기(12)와 공기여과기(16)를 가지고 있는 액체진입장치(10)를 포함한다; 상술한 연동배출시스템은 연동펌프 한 개(13)를 포함하며, 연동펌프의 출구는 폐액수집기(14)와 연결된다.
청구항 제 4항에 서술된 밀폐식 집균앰플배양기의 특징은 다음과 같다. 진입제어밸브와 시료첨가시스템 사이의 진입관연결기(11)가 설치되어 있다. 이 연결 기를 끊어주면 시료첨가시스템과 집균앰플시스템을 분리할 수 있다; 용액배출밸브와 연동배출시스템 사이의 배출관에는 배출관연결 기(18)가 설치되어 있고, 이 연결 기를 끊어주면 연동배출시스템과 집균앰플시스템을 분리할 수 있다.
청구항 제 5항에 서술된 밀폐식집균앰플배양기의 특징은 다음과 같다. 진입관연결기(11)와 배출관연결기(18)은 마개형태이다. 진입관연결기 관과 배출관 연결 기의 마개는 연결되어 밀폐파이프연결 기(19)를 형성한다.
청구항 제 4항에 서술된 밀폐식 집균앰플배양액의 특징은 다음과 같다. 진 입관 배출관과 배기관은 실리콘의 부드러운 관이며 배기관 상부는 공기여과장치의 스테인리스 바늘과 연결되어 있고 진입밸브, 배출밸브와 배기밸브는 마운트 밸브(mount valve)이다.
청구항 제 4항에 서술된 밀폐식 집균앰플배양기의 특징은 다음과 같다. 앰플 몸체에 진입해 있는 진입 관은 위가 가늘고 아래가 넓은 원뿔모양 관(20)이며 여과기(2)는 원뿔모양 관의 하단에 고정되어 있다.
청구항 제 8항에 상술 된 밀폐식 집균앰플배양기의 특징은 다음과 같다. 원뿔 모양 관의 상단 외표면은 나 사산모양구조(21)이며, 고무마개 아래의 진입 관은 암나사 연결부에 고정되어 있다. 원뿔모양 관은 나 사산모양구조와 암나사 연결부로 연결되어 있다.