CN101893589A - 一种无菌检查方法及其使用的全封闭集菌安瓿培养器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无菌检查方法，该方法包括选取菌种、培养基、制备菌液、录制各个菌种的指纹特征热谱曲线作为鉴别特征、提取热谱曲线的热动力学参数并确定菌种阳性判定指标以及对待测样品进行无菌检查等步骤。本发明还公开了一种实施该方法时使用的全封闭集菌安瓿培养器，该集菌安瓿培养器由集菌安瓿系统、加样加液系统和蠕动排液系统组成，所述加样加液系统与集菌安瓿系统之间通过进液管连接在一起，集菌安瓿系统和蠕动排液系统通过排液管连接在一起。本发明检出微生物污染的时间短，灵敏度高，自动化程度高，检测结果准确，能提供检测全过程微生物生长状态曲线，该曲线具有较好指纹性，可定性分析微生物污染状况。

Description

一种无菌检查方法及其使用的全封闭集菌安瓿培养器
技术领域
本发明涉及药品、食品、生物制品、医疗器械等无菌产品检查领域，具体涉及一种无菌检查方法及其使用的全封闭集菌安瓿培养器。
背景技术
无菌检查是确保无菌产品使用安全的必检项目，也是决定无菌产品生产周期的重要环节之一。如在药品领域中，各国药典对注射剂无菌检查均有严格要求，并基本形成了国际一致的检查标准与操作规程，有效地提高了制剂无菌保证水平。
但是现行无菌检查方法具有一定的局限性。首先，无菌检查周期较长，制约企业生产效率的提高：各国药典均规定无菌检查的培养周期为14天，如果不能判定结果的需经转种培养7天，如果判断出现“假阳性”结果则需复试一次，延长了产品的出厂等待时间和生产周期。其次，现行药典中对无菌检查的结果判断为肉眼观察微生物大量生长所产生的培养基浑浊，受观察人员的操作经验影响较大，具有一定的主观性，自动化程度低。另外，单纯依靠培养基浑浊判定样品无菌状况仍存在以下风险：肉眼观察对与非微生物生长引起的培养基浑浊则不易排除，对于生长缓慢、在规定检查时间内不引起培养基浑浊的微生物污染更无从识别，由此可能产生假阳性和假阴性判断，影响结果的准确性和可靠性。
鉴于上述问题，建立一种能够快速识别无菌制剂微生物污染的方法，提高检查灵敏度、准确度、缩短检查时间、提高检查自动化程度，以补充或替代现有方法，已经成为国内外无菌制剂研究的关注焦点，并形成了微生物激光散射检测法、生物发光检测法、PCR扩增检测法等新方法。以上各种方法提高了微生物污染的检查能力；但是由于受微生物粒径大小、其他微粒干扰、操作复杂、仪器设备及试剂昂贵或方法缺乏普适性(仅针对某种微生物，检测面窄)等因素的制约影响其推广应用，因而需要根据微生物的生命、生长特征尝试建立新的检测方法。
根据生物热力学理论，一切生命活动均伴随着能量和物质的代谢与转化，这种能量能够为微量量热系统所监视。微量量热法是一种灵敏、快速、操作简便、多通道、实时在线监测的仪器系统，近年来发明人所在课题组应用微量量热法检测微生物生长过程中的热效应，用于药物质量控制和效用评价取得了一定的经验和成果。研究表明，在适宜的条件下，微生物的生长呈现明显的规律性和特征性，由此启示可以尝试采用微量量热法建立一种无菌检查的新方法。
本发明的原理是，利用微量量热仪可检测微生物生长过程中的热效应的功能，在微量量热仪中录制不同种类不同生存状态微生物的指纹特征热谱曲线，建立数据分析的标准档案。然后录制待测样品的热谱曲线，如果样品未灭菌或灭菌不彻底，被微生物污染，在样品的热谱曲线中就会出现微生物生长的趋向，这时与已经建立的标准档案进行比较，即可快速将已经被污染的样品选检出来，并可初步分辨出样品被何种微生物污染。
微量量热仪通常操作是将微生物菌种置入特定的培养基的微量量热安瓿中，然后将安瓿置于微量量热仪检测通道中，记录微生物生长产生的热量变化。但在使用微量量热仪进行无菌检测时，存在一个操作环节的重大缺陷，即进行无菌检查时，由于微量量热仪中配套使用的安瓿结构无法实现样品和培养基注入时的密封操作，不能满足产品微生物污染检查(无菌检查)所要求的隔绝外界环境(避免二次污染)、富集微生物同时消除产品抑菌性能的要求，导致操作过程中可能因外界因素污染样品，而致使做出假阳性判断。因此，使用微量量热法进行无菌检查时，需要对微量量热仪的安瓿进行改进。本发明全封闭集菌安瓿培养器的设计原则包括：(1)无菌性：采用合适灭菌方法确保集菌器自身的无菌性；(2)密封性：确保系统内部与外界环境的有效隔离；(3)集菌性：配置必要的集菌装置，实现对样品微生物富集及抑菌性消除，并可根据待检样品性质配置适宜的滤膜；(4)热敏性：系统材料能够使微生物生长代谢热量能够为量热仪灵敏地检测；(5)耐压性：系统能够满足集菌过程负压要求并避免微生物损伤；(6)耐受性：系统应能满足无菌检查样本量需要，有足够的检查能力；(7)简便性：系统应操作简便，自动化性能好，具自动提示结果功能；(8)经济型：系统应经济易得，可批量生产并推广应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有无菌检查方法周期较长、灵敏度低、检测结果受观察人员的主观性影响较大、以及微量量热仪中安瓿不能实现全封闭无菌操作的缺陷。
实现上述目的的本发明的技术方案为，一种无菌检查方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)选取菌种和培养基：选取不同种类的菌种及适合菌种生长的无菌培养基；
(2)制备菌液：将步骤(1)选取的菌种在无菌培养基中进行培养，获得各个菌种不同浓度、不同生存状态的菌液，作为录制菌种的指纹特征热谱曲线的阳性控制物；
(3)录制各个菌种的指纹特征热谱曲线作为鉴别特征：将步骤(2)获得的菌液置于微量量热仪中，记录各个菌种不同浓度、不同生存状态的菌液的热谱曲线，获得不同菌种的指纹特征热谱曲线；
(4)提取步骤(3)所获热谱曲线的热动力学参数，确定菌种阳性判定指标；
(5)对待测制剂进行无菌性检查：将待测制剂样品进行过滤，用无菌清洗液冲洗滤膜上的过滤物；将样品的过滤物和培养基混合后置入微量量热仪的检测通道，记录其热谱曲线；通过与步骤(3)的不同菌种的指纹特征热谱曲线以及步骤(4)的菌种阳性判定指标进行比对，检查待测制剂是否被微生物污染。
在以上步骤中，步骤(1)至步骤(4)是建立检测标准的步骤，当通过实验获得了各个菌种的指纹特征热谱曲线和相关的热动力学参数，并建立起菌种阳性判定指标后，这些图谱及数据公式就可以作为以后检测工作的标准来使用。也就是说，步骤(1)至步骤(4)建立标准的操作只需要一次，标准建立后，以后对待测样品的检测只需要实施步骤(5)的操作程序并与标准进行比较即可。
步骤(2)中，获得各个菌种不同浓度菌液的方法是，将菌种新鲜培养物过滤洗脱得到洗脱液，用0.9％灭菌氯化钠溶液将洗脱液按10倍系列稀释；获得各个菌种不同生存状态的菌液的方法是，将培养物过滤洗脱得到洗脱液，将洗脱液分别置于-70℃冰箱和60℃水浴中保持2h后，再用0.9％灭菌氯化钠溶液按10倍系列稀释。
步骤(3)中将菌液置于微量量热仪中的具体步骤是：
(3-1)按步骤(2)的方法取各菌种10-3、10-5、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11倍系列浓度的稀释培养物；
(3-2)将等体积的各菌种的系列浓度稀释培养物加入步骤(1)中所述的无菌培养基中，作为微量量热仪的阳性检测通道；
(3-3)另取一份无菌培养基，作为微量量热仪的空白对照通道。
步骤(4)所述热谱曲线的热动力学参数包括，随时间变化的检测通道热功率Pi及与其同时刻的空白对照通道热功率P0、最大发热功率Pmax、达到最大发热功率时间Tmax、总发热量Htotal，以及各曲线指数生长段每15min斜率k。
步骤(4)所述菌种阳性判定指标可以是：记录k≥0的出现时间，并以k≥0为检出样品微生物污染的必要条件，同时建立微生物生长的阳性判断时间指标。
微生物生长的阳性判断时间指标可以按以下方法确定：检测通道热功率Pi与同时刻空白通道热功率P0之间的差值大于P0绝对值3倍的时间为检出样品微生物污染的时间点(Td)，即：Td＝Time[(Pi-P0)/|P0|≥3]。
步骤(5)中将样品过滤物和培养基进行混合时，按照适合菌种生长的条件选择培养基。
步骤(5)中将样品过滤物和培养基混合并置入微量量热仪的安瓿中时，安瓿中按照体积比例保留促使菌种快速生长的气体环境。
优选方案是，步骤(5)将安瓿放入微量量热仪的检测通道时，检测通道的温度按照适合菌种生长的温度设定。
步骤(5)将安瓿放入微量量热仪的检测通道时，检测通道的温度可以设定为23℃～37℃。
本发明还包括一种实施上述方法时使用的全封闭集菌安瓿培养器，所述集菌安瓿培养器由集菌安瓿系统、加样加液系统和蠕动排液系统组成，所述加样加液系统与集菌安瓿系统之间通过进液管连接在一起，集菌安瓿系统和蠕动排液系统通过排液管连接在一起。
集菌安瓿系统包括安瓿瓶身，在安瓿瓶身的瓶口上密封固定橡胶密封塞，进液管、排液管和排气管穿透橡胶密封塞后伸入安瓿瓶身内，安瓿瓶身内置一滤器，滤器的底部铺有滤膜，滤器的顶部与安瓿瓶内的进液管口连接，安瓿瓶内的排液管口越过滤器伸至安瓿瓶底部，在安瓿瓶身外部的进液管和排液管上分别安装有进液控制阀和排液控制阀，排气管顶部连接空气过滤器。
加样加液系统包括样品/培养基容器和带空气过滤器的进液装置。
蠕动排液系统包括一蠕动泵，蠕动泵的出口连接废液收集器。
在进液控制阀和加样加液系统之间的进液管上安装一进液管道连接器，断开该管道连接器时，可将加样加液系统与集菌安瓿系统分离；在排液控制阀和蠕动排液系统之间的排液管上安装一排液管道连接器，断开该管道连接器时，可将蠕动排液系统与集菌安瓿系统分离。
进液管道连接器和排液管道连接器为塞口式，进液管道连接器和排液管道连接器的塞口可对接形成密封管道连接器。
安瓿瓶身为玻璃结构或硬质塑料结构，在安瓿瓶身上标有刻度线。
进液管、排液管和排气管为硅胶软管，进液控制阀、排液控制阀和排气控制阀为卡口阀。
排气管为顶端带空气过滤装置的不锈钢针头。
进液管伸入安瓿瓶身的部分可以是上细下粗的锥形管，滤器固定在锥形管的下端。所述锥形管的上端外表面为螺纹结构，橡胶密封塞的下表面固定一内螺纹接口，锥形管可通过螺纹结构与该内螺纹接口连接。
本发明微量量热无菌检测法与现有技术的集菌观察法相比，具有以下优点：①检测时间上，微量量热法快于集菌观察法：微量量热法检出时间集中分布在0～18h，而集菌观察法判断阳性时间集中分布在10～36h；②灵敏度上，微量量热法高于集菌观察法：微量量热法可以检出低于10-10～10-11稀释度的微生物生长，而观察法未检出同等条件下该稀释度的阳性菌生长；③定量性及指纹特征鉴别性上，微量量热法优于观察法：微量量热法可提供具有微生物菌种指纹特征性的生长热谱曲线及可定量的热动力学参数及阳性菌检出判断标准方程，而观察法仅依靠肉眼观察培养基浑浊度，不可定量且无菌种判断特征；④自动化及准确性上，微量量热法优于观察法：微量量热法通过对微生物生长过程中热量代谢的检测与记录，方法灵敏准确，并可通过对热动力学参数的分析报告阳性检查结果，自动化程度高；同时可以避免集菌观察法反复人工介入观察带来的工作量增加及再次污染风险；避免常规观察方法中可能存在的非微生物生长引起培养基浑浊的假阳性判断(如药物与培养基混合产生的浑浊等)及微生物生长不引起培养基浑浊的假阴性判断(如白色念珠菌、枯草芽孢杆菌生长过程中并不引起培养基的显著浑浊，结果较难断定)。
本发明全封闭集菌安瓿培养器和普通微量量热安瓿相比，可以在全封闭无菌体系中实现样品微生物富集(集菌功能)、冲洗薄膜消除样品抑菌活性干扰(抗扰功能)、加入培养基培育复苏微生物(培养功能)以及置入量热仪通道记录微生物生长热代谢状况(记录功能)，从取样到培养整个操作过程都排除了外界因素污染样品或培养基的可能性，消除样品误判为微生物污染阳性的可能(假阳性)，显著提高了检测的准确性。
本发明全封闭集菌安瓿培养器与现有无菌检查集菌培养器相比的优点是：①本发明可用于微量量热法无菌检查，而现有无菌检查集菌器仅适合普通观察法；②较之现有集菌培养器依靠肉眼观察，需要重复多次观察(14天)、劳动量大、人力成本高的缺点；本发明通过微量量热仪实时、在线、多通道、自动化地记录检测样品中微生物生长代谢热量的变化，自动化程度高，可以降低劳动强度和人力成本；③采用本发明通过微量量热法检查样品微生物污染物的热量代谢，可以更灵敏、快速地判断微生物污染；较现有现有集菌培养器依靠肉眼观察培养基浑浊的的方法更为灵敏，能够早期检出微生物污染，从而节约检查时间；④采用本发明通过微量量热法检查样品微生物污染物的热量代谢，可以结合样品无菌状态定量判别方程，从而准确、定量地判断样品的无菌状态；较之现有的采用肉眼观察培养基浑浊方法判断样品无菌状态的集菌培养器法，方法更为准确，能够有效避免现有方法肉眼观察可能产生的结果误判；⑤采用本发明通过微量量热法可以全程记录检查样品微生物污染物的热量代谢曲线，具有一定的特征指纹性；较之现有仅提供结果判断的肉眼观察法，能够提供更全面的信息，并可用于污染微生物种类的初步鉴定。
附图说明
图1是用本发明方法录制的不同浓度金黄色葡萄球菌生长图谱；
图2是用本发明方法录制的不同浓度大肠埃希菌生长图谱；
图3是用本发明方法录制的不同浓度铜绿假单胞菌生长图谱；
图4是用本发明方法录制的不同浓度生孢梭菌生长图谱；
图5是用本发明方法录制的不同浓度志贺氏痢疾杆菌生长图谱；
图6是用本发明方法录制的不同浓度枯草芽孢杆菌生长图谱；
以上图中，A：无菌硫乙醇酸盐流体培养基；    B：10-3稀释度；
          C：10-5稀释度；                  D：10-7稀释度；
          E：10-8稀释度；                  F：10-9稀释度；
          G：10-10稀释度；                 H：10-11稀释度；
图7是用本发明方法录制的不同浓度黑曲霉生长图谱；
图8是用本发明方法录制的不同浓度白色念珠菌生长图谱；
以上图中，A：无菌改良马丁培养基；    B：10-3稀释度；
          C：10-5稀释度；            D：10-7稀释度；
          E：10-8稀释度；            F：10-9稀释度；
          G：10-10稀释度；           H：10-11稀释度；
图9是用本发明方法录制的不同状态金黄色葡萄球菌生长图谱；
图中，A：无菌硫乙醇酸盐流体培养基；    B：无菌生理盐水；
      C：35℃10-5稀释度；              D：35℃10-7稀释度；
      E：-70℃10-5稀释度；             F：-70℃10-7稀释度；
      G：60℃10-5稀释度；              H：60℃10-7稀释度；
图10是对不同灭菌条件复方茵陈注射液使用本发明方法进行无菌检查的热谱曲线；
图中，A：正常样品+硫乙醇酸盐流体培养基；
      B：金黄色葡萄球菌+硫乙醇酸盐流体培养基；
      C：未灭菌样品+硫乙醇酸盐流体培养基；
      D：灭菌不彻底样品+硫乙醇酸盐流体培养基；
      E：正常样品+改良马丁培养基；
      F：白色念珠菌+改良马丁培养基；
      G：未灭菌样品+改良马丁培养基；
      H：；灭菌不彻底样品+改良马丁培养基；
图11本发明无菌检查法阳性判断指标的各参数关系的示意图；
图中，Pi：供试样品热功率；
      P0：与Pi同时刻的无菌培养基热功率；
k：热谱曲线每15min段斜率；
Te：指数生长期k≥0的出现时间(Time of exponentialgrowth)；
Td：检出样品微生物污染阳性的时间点(Time of Detection)；
图12是本发明全封闭集菌安瓿培养器的结构图；
图13是进液管道连接器和排液管道连接器塞口对接形成密封管道连接器，并拔出排气管后的全封闭集菌安瓿培养器结构示意图；
图14是进液管伸入安瓿瓶身内的部分变形为锥形管时的结构示意图；
图15是锥形管的结构示意图；
以上图中，1、安瓿瓶身；           2、滤器；
          3、橡胶密封塞；         4、进液管；
          5、排液管；             6、排气管；
          7、进液控制阀；         8、排液控制阀；
          9、刻度线；             10、进液装置；
          11、进液管道连接器；    12、样品/培养基容器；
          13、蠕动泵；            14、废液收集器；
          15、滤膜；              16、空气过滤器；
          17、排气控制阀；        18、排液管道连接器；
          19、密封管道连接器；    20、锥形管；
          21、锥形管上端的螺纹结构；
          22、橡胶密封塞的内螺纹接口。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一、本发明提供的对无菌制剂进行无菌性检查的方法按照以下步骤进行：
一、实验材料
1、药品与试剂  复方茵陈注射液(规格50mL/瓶，批号20100120)，包括正常样品(Norm-sterilized Samples，Norm-SS)、未灭菌样品(Non-sterilized Samples，Non-SS)、灭菌不彻底样品(Sub-sterilized Samples，Sub-SS)(100℃流通蒸汽灭菌10min)均由解放军第302医院药学部提供。
2、仪器与材料  3114型TAM air等温微量量热仪(Isothermal microcalorimeter)(TA Instrument，US)，TAM Assistant工作站，检测限为4μW，24h基线漂移小于±20μW，检测量程为±600mW，工作温度为5～90℃。SW-CT-2FD双人单面净化台(苏州净化设备厂)；NS01-2型全封闭无菌试验过滤培养器(北京牛牛基因技术有限公司，批号20090910)；TH2-22台式恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；HTY-III型智能集菌仪(杭州泰林医疗器械有限公司)；303AB-6型隔水培养箱(上海树立仪器仪表公司)，0.45μm醋酸纤维素酯微孔滤膜(北京化学厂)，0.9％无菌氯化钠溶液(石家庄四药集团)。
3、菌种与培养基金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(S.aureus)，CMCC(B)26003]，大肠埃希菌[Escheichia coli(E.coli)，CMCC(B)44102]，铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa(P.aeruginosa)，CMCC(B)10104]，志贺氏痢疾杆菌[Shigelladysenteriae，(S.dysenteriae)，CMCC(B)51252]，枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis(B.subtilis)，CMCC(B)63501]，生孢梭菌[Clostridium sporogenes(C.sporogenes)，CMCC(B)64941]，白色念珠菌[Candida albicans(C.albicans)，CMCC(F)98001]，黑曲霉[Aspergillus niger(A.niger)，CMCC(F)98003]，均由中国药品生物制品检定所提供；硫乙醇酸盐流体培养基[Thioglycollate medium(TM)，(简称“硫乙”)，批号091020]，改良马丁培养基[Modified martinmedium(MMM)，(简称“马丁”)，批号090915]，营养肉汤培养基(NutrientBroth Medium，批号090922)，琼脂粉(Powered Agar，批号091022)，玫瑰红钠培养基(Sodium Rose Bengal Medium，批号090912)，蛋白胨(Peptone，批号090708)，均购于中国药品生物制品检定所。
二、菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、志贺氏痢疾杆菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48h，上述培养物用0.9％灭菌氯化钠溶液进行10倍系列稀释，制成含菌数小于100cfu·mL-1的菌悬液；
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面中，23～28℃培养5～7天，加入3～5mL 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。洗脱液用0.9％无菌氯化钠溶液液行10倍系列稀释制成含孢子数小于100cfu·mL-1的孢子悬液。
取新鲜金黄色葡萄球菌培养物5mL，分别置于-70℃冰箱和60℃水浴中保持2h，加入0.9％灭菌氯化钠溶液行10倍系列稀释。
上述各微生物不同浓度稀释液作为无菌检查的阳性控制物。
三、获取受试菌种的指纹特征热谱曲线
取各菌种10-3、10-5、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11的稀释培养物各1mL，分别注入微量量热仪安瓿中，然后分别导入9mL相应无菌培养基，作为检测阳性通道；另取一只安瓿直接导入对应无菌培养基，作为空白对照通道。
其中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、痢疾杆菌的稀释培养物中加入硫乙醇酸盐流体培养基，置35℃微量量热仪中，记录各菌株生长热谱曲线(heat flow)；白色念珠菌及黑曲霉的稀释培养物中加入改良马丁培养基，置28℃微量量热仪中，记录各菌株生长热谱曲线，如图1至图8所示。
取金黄色葡萄球菌新鲜培养物、-70℃保藏培养物与60℃保藏培养物10-5、10-7的稀释培养物各1mL注入微量量热仪安瓿中，然后分别导入9mL无菌硫乙醇酸盐流体培养基，作为不同状态微生物检查通道；另取两只安瓿分别导入无菌硫乙醇酸盐流体培养基和无菌生理盐水各10mL，作为空白对照通道，各安瓿置35℃微量热仪中，记录各菌株生长热谱曲线，如图9所示。
四、提取热谱曲线的热动力学参数，确定菌种阳性判定指标
提取各曲线热动力学参数：随时间变化的检测通道热功率Pi及与其同时刻的空白对照通道热功率P0、最大发热功率Pmax、达到最大发热功率时间Tmax、总发热量Htotal；提取各曲线指数生长段每15min斜率k值，记录k≥0的出现时间(Time of exponential growth，Te)。
各菌种不同浓度情况下提取到的参数如下：
其中，Dilution：稀释度；
cfu：colony forming unit，菌落形成单位；
Te：k≥0出现时间；
k：热谱曲线每15min段斜率；
Td：微生物检出时间；
Pi：不同稀释度菌液生长发热功率；
P0：与Pi同时刻的无菌培养基热功率；
Pmax：最大发热功率；Tmax：达到最大发热功率时间；
Htotal：总发热量。
表1A不同浓度金黄色葡萄球菌生长的热动力学参数
  Dilution   cfu   Te(h)   k(min-1)   Td(h)   P0(μW)   Pi(μW)   Pmax(μW)   Tmax(h)   Htotal(μJ)
  0   0   -0.0050   74.900   1.011   279.746
  10-3   107   8.25   0.0155   10.300   21.092   84.450   2079.002   20.453   15521.674
  10-5   105   8.75   0.0104   10.539   18.501   74.161   2349.857   21.658   14630.561
  10-7   765   8.75   0.0121   10.864   19.507   78.052   1977.391   23.575   15214.055
  10-8   75   5.25   0.0241   10.994   20.520   82.263   2082.762   24.786   14686.436
  10-9   10   8.25   0.0146   11.206   20.258   81.255   1995.019   25.056   14885.644
  10-10   1   9.00   0.0092   11.594   18.757   75.323   1123.599   26.297   13852.769
  10-11   ＜1   9.25   0.0125   11.772   18.205   72.940   570.219   27.558   9176.494
表1B不同浓度大肠埃希菌生长的热动力学参数
Dilution cfu Te(h) k(min-1) Td(h) P0(μW) Pi(μW)   Pmax(μW) Tmax(h) Htotal(μJ)
  0   0   -0.0049   179.871   1.367   -2145.798
10-3   105 0.75 1.3062 0.817   -192.291 390.713   1156.069 3.358 4668.304
  10-5 103   2.25   0.0432   3.697   70.112   280.515   876.261   5.806   7049.632
  10-7   38   5.25   0.0172   5.469   24.478   98.313   530.565   11.122   5459.391
  10-8   4   9.00   0.0058   13.508   -39.752   79.687   472.617   19.956   6097.893
  10-9   ＜1   12.00   0.0100   23.372   -8.231   16.758   18.491   28.019   635.264
  10-10   ＜1   -0.0078   未检出   303.623   1.028   -3284.053
  10-11   ＜1   -0.0076   未检出   251.221   1.144   -2305.055
表1C不同浓度铜绿假单胞菌生长的热动力学参数
  Dilution   cfu   Te(h)   k(min-1)   Td(h)   P0(μW)   Pi(μW)   Pmax(μW)   Tmax(h)   Htotal(μJ)
0   0   -0.0077   -71.591   8.389   -1611.395
  10-3   105   3.25   0.0025   9.833   -64.897   130.250   2664.904   14.925   9905.841
10-5   2500 4.00 0.0109 11.614 -57.866 115.937 2451.536 17.819 9990.182
10-7   25 7.75 0.0026 12.850 -51.461 102.927 2466.974 19.422 10371.445
10-8   2 6.25 0.0333 14.311 -47.739 95.622 2407.372 20.958 9661.111
10-9   ＜1 10.25 0.0116 14.753 -45.047 90.102 2388.660 21.217 9576.258
10-10   ＜1 5.75 0.0264 15.344 -42.288 84.701 2272.854 21.828 9164.188
10-11   ＜1 5.75 0.0475 16.253 -39.750 79.616 2082.067 22.364 8430.976
表1D不同浓度枯草芽孢杆菌生长的热动力学参数
  Dilution   cfu   Te(h)   k(min-1)   Td(h)   P0(μW)   Pi(μW)   Pmax(μW)   Tmax(h)   Htotal(μJ)
  0   0   -0.0088   158.450   1.567   1696.003
  10-3   105   5.50   0.0127   8.383   57.614   230.569   633.049   11.753   8631.254
  10-5   2000   8.25   0.0172   10.456   46.911   187.687   962.157   13.192   12183.089
  10-7   20   10.50   0.1180   13.261   38.736   155.109   787.727   16.103   10216.512
  10-8   2   12.00   0.0121   15.706   39.718   159.193   632.033   19.686   7512.225
  10-9   ＜1   -0.0057   未检出   114.331   1.108   207.008
  10-10   ＜1   -0.0037   未检出   64.495   1.672   -174.555
  10-11   ＜1   -0.0019   未检出   100.899   0.803   -489.902
表1E不同浓度生孢梭菌生长的热动力学参数
  Dilution   cfu   Te(h)   k(min-1)   Td(h)   P0(μW)   Pi(μW)   Pmax(μW)   Tmax(h)   Htotal(μJ)
0   0   -0.0064   206.729   0.936   2788.582
  10-3   105   1.25   0.0563   5.108   118.721   475.123   1049.431   7.683   16584.828
  10-5   3600   5.25   0.0117   9.644   80.822   323.642   1100.793   13.661   15832.796
  10-7   36   9.00   0.0225   13.536   68.729   275.166   1127.010   17.528   15430.693
  10-8   3   9.50   0.0072   15.242   63.895   256.033   1065.710   19.683   15480.996
  10-9   ＜1   12.75   0.0075   17.672   57.831   231.328   1078.571   22.269   15249.404
  10-10   ＜1   14.25   0.0088   18.953   55.945   223.794   1020.511   23.478   14994.583
    10-11     ＜1   -0.0048   未检出   136.633     1.028   2111.035
表1F不同浓度痢疾杆菌生长的热动力学参数
  Dilution     cfu     Te(h)     k(min-1)     Td(h)     P0(μW)     Pi(μW)     Pmax(μW)     Tmax(h)    Htotal(μJ)
  0     0     -0.0009     80.296     1.169    881.967
  10-3     105     0.75     2.7368     3.333     50.764     203.237     718.936     5.528    9375.730
  10-5     2000     4.25     0.0073     5.708     30.970     124.122     632.982     8.869    8611.000
  10-7     26     7.25     0.0126     8.342     18.449     73.914     354.460     12.989    6975.583
  10-8     2     0.75     2.1408     11.814     12.907     51.639     110.610     18.600    3724.997
  10-9     ＜1     12.75     0.0063     13.058     10.862     43.480     75.744     24.086    3135.658
  10-10     ＜1     -0.003     未检出     206.729     0.947    3220.400
  10-11     ＜1     -0.0008     未检出     127.919     1.122    2380.774
表1G不同浓度黑曲霉生长的热动力学参数
  Dilution     cfu     Te(h)     k(min-1)     Td(h)     P0(μW)     Pi(μW)     Pmax(μW)     Tmax(h)     Htotal(μJ)
  0     0     -0.0101     161.194     1.003     -108.527
  10-3     104     2.25     0.0073     4.750     26.813     107.258     180.680     5.733     2895.429
  10-5     3000     4.75     0.0117     6.953     13.212     52.990     156.541     8.667     1898.576
  10-7     360     2.75     0.0093     9.189     5.542     22.507     142.759     11.697     1934.208
  10-8     3     3.00     0.0617     11.700     -0.960     1.975     123.643     14.853     1173.551
  10-9     ＜1     11.50     0.0053     13.608     -4.899     9.797     134.891     17.514     1974.932
  10-10     ＜1     14.25     0.0057     15.953     -4.931     9.919     128.662     19.472     1976.428
  10-11     ＜1     15.50     0.0113     17.68l     -7.885     15.774     122.944     20.778     1624.164
表1H不同浓度白色念珠菌生长的热动力学参数
    Dilution     cfu     Te(h)     k(min-1)   Td(h)   P0(μW)     Pi(μW)     Pmax(μW)   Tmax(h)    Htotal(μJ)
    0     0     -0.0047     171.439   1.003    4865.695
    10-3     106     6.25     0.0056   36.400   65.756     263.029     358.032   52.011    15889.942
    10-5     104     6.25     0.0053   63.700   50.118     200.725     252.685   71.006    8759.188
    10-7     500     6.25     0.0058   ＞71.011   46.316     112.481     112.747   70.761    5251.484
    10-8     48     6.25     0.0319   ＞711.011   46.316     85.384     86.658   70.636    3965.306
    10-9     5     20.00     0.0015   ＞71.011   46.316     119.575     119.575   71.011    7133.872
    lO-10     ＜1     20.00     0.0018   ＞71.011   46.316     112.162     112.273   71.000    6628.107
    10-11     ＜1     7.25     0.0032   ＞71.011   46.316     88.287     88.449   70.900    4605.575
金黄色葡萄球菌不同生存状态下提取参数如下：
表2不同状态金黄色葡萄球菌生长的热动力学参数
  Dilution   cfu   Te(h)   k(min-1)     Td(h) P0(μW) Pi(μW)   Pmax(μW)   Tmax(h)   Htotal(μJ)
  TM   0   -0.0004   142.725   1.003   1446.990
  Phys   0   0.0000   210.286   1.003   -164.582
  35℃10-5   105   10.25   0.0093   12.853   23.532   94.177   479.526   18.989   10094.389
  35℃10-7   750   10.50   0.0074   15.169   20.825   83.434   401.608   23.219   8278.074
  -70℃10-5   105   18.00   0.0058   22.628   16.876   67.555   222.876   55.903   8501.300
  -70℃10-7   280   19.50   0.0051   23.694   17.403   69.617   169.815   32.350   8623.707
  60℃10-5   104   19.50   0.0004   37.308   15.657   62.669   285.059   52.178   9163.460
  60℃10-7   38   78.50   0.0086   82.108   7.482   29.950   59.617   90.042   2425.452
通过对大量数据的分析和整理，给出本发明方法判断微生物污染的判定指标为，以k≥0为检出受试菌种的必要条件，并规定检查通道热功率Pi值与同时刻空白通道热功率P0差值大于P0绝对值3倍的时间为检出受试菌种阳性的检出时间点(Time of Detection，Td)，即：Td＝Time[(Pi-P0)/|P0|≥3]。按照这个判定指标对以上实验数据进行分析，结果表明：
(1)各菌种生长热谱曲线具有明显的指纹特征性，可用于不同菌种的特征鉴别；其中最大发热功率(Pmax)、总发热量(Htotal)以及曲线峰形结构最能够代表各菌种间特征差异，并具有稳定性。
(2)随稀释度降低，各菌种热谱曲线峰形基本不变，达到最大发热功率时间(Tmax)均匀推迟，指数生长期(Te)推迟；
随菌种浓度(Dilution)降低，大肠杆菌及痢疾杆菌的最大发热功率降低；
随稀释度降低，各菌种检出时间(Td)逐渐推迟，并呈良好的线性关系；
(3)除白色念珠菌检出时间较长外(大于36h)，其它各菌种基本于18h内检出，且检出时间与菌液浓度呈明显的线性关系；提示微量量热法对于各种微生物的检出具有较好的普适性和快速性；同时提示白色念珠菌为生长缓慢微生物，而其它微生物在该条件下生长迅速，能够快速检出。
(4)不同状态金黄色葡萄球菌检出时间为：新鲜培养物(＜18h)＜冷冻保藏培养物(＜24h)＜高温保藏培养物(＞36h)；结果提示在该检测条件下不同状态微生物复苏时间随其受损伤的程度而延长，本发明方法可以灵敏地检出不同状态下生长的微生物。
(5)活菌计数结果表明：本发明方法能够检出低于1cuf的各种微生物，方法灵敏度高；其中，可以检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉等微生物低于10-11的稀释培养物。
以上步骤完成后，就获得了各个菌种的指纹特征热谱曲线和相关的热动力学参数，并建立起菌种阳性判定指标，这些图谱及数据公式既是本发明的技术分析资料，也可以作为以后检测工作的标准来使用。也就是说，以上建立标准的操作只需要进行一次，标准建立后，以后的每次检测只需重复本发明步骤(5)的操作，并与标准进行比对即可。
例如，待测制剂为复方茵陈注射液，对其进行无菌检查时，只需将样品进行过滤、培养，在微量量热仪中录制样品的热谱曲线。将样品的热谱曲线与步骤(4)获得的菌种阳性判定指标进行比较，当样品热谱曲线中出现符合菌种阳性判定指标的表征时，可判定样品中有微生物污染，然后根据步骤(3)获得的菌种指纹特征热谱曲线，可判断样品中污染菌种的类型。
五、受试制剂的无菌性检查
为了检验本发明方法的可靠性和灵敏度，以下检查程序中除选取复方茵陈注射液的正常灭菌样品作为受试样品外，还选取复方茵陈注射液的未灭菌样品、灭菌不彻底样品、正常灭菌样品+小于100cfu的金黄色葡萄球菌、正常灭菌样品+小于100cfu的白色念珠菌作为受试样品的对照物，采集其数据并进行数据分析。具体操作方法如下：
取复方茵陈注射液未灭菌样品、灭菌不彻底样品和正常灭菌样品各200mL，薄膜过滤，滤膜用0.1％蛋白胨水溶液冲洗三次，每次100mL，排净冲洗液，在安瓿中注入10mL硫乙醇酸盐流体培养基；另取上述样品，照前法操作，排净冲洗液后导入10mL改良马丁培养基。
另取正常灭菌样品两份各200mL，照前法操作，排净冲洗液后在两个安瓿中分别导入10mL硫乙醇酸盐流体培养基和10mL改良马丁培养基；并在硫乙醇酸盐流体培养基中加入小于100cfu的金黄色葡萄球菌，在改良马丁培养基中加入小于100cfu的白色念珠菌稀释培养物，作为阳性对照。
各安瓿分别置相应微量量热仪通道，记录热谱曲线。录制好的热谱曲线如图10所示。
各曲线中提取到的数据如下表所列，其中
k：热谱曲线每15min段斜率；
Te：k≥0出现时间；
Td：微生物检出时间；
Pmax：最大发热功率；Tmax：达到最大发热功率时间；
Htotal：总发热量。
表3.本发明方法对复方茵陈注射液进行无菌检查的参数提取与结果判定
  Sample   Te/h   k/min-1   Td/h   Pmax/μW   Tmax/h   Htotal/μJ
  正常灭菌样品+硫乙   -0.0036
  金黄色葡萄球菌+硫乙   2   597.813   4   1449.653   5.017   12426.624
  未灭菌样品+硫乙   5   1050.195   9   2149.121   9.708   16361.561
  灭菌不彻底样品+硫乙   5.5   1101.199   10   1274.160   10.392   8741.553
  正常灭菌样品+马丁   -0.0041
  白色念珠菌+马丁   4.5   670.254   15.5   767.432   17.308   10052.645
  未灭菌样品+马丁   6   297.024   10   1705.366   10.614   12971.938
  灭菌不彻底样品+马丁   6.5   219.156   10.5   616.537   13.208   5863.318
数据分析如下：：
(1)热谱曲线显示正常样品通道(正常样品+硫乙醇酸盐流体培养基，正常样品+改良马丁培养基)热谱曲线呈平缓下降趋势，热动力学参数显示正常样品k值呈持续负值状态，表明正常样品无微生物污染且培养基无菌性良好；
(2)热谱曲线显示阳性对照通道(金黄色葡萄球菌+硫乙醇酸盐流体培养基，白色念珠菌+改良马丁培养基)微生物生长良好，表明该条件适合复方茵陈注射液无菌检查，具有较好的灵敏性；
(3)未灭菌样品及灭菌不彻底样品中微生物污染均在10.5h内检出，热动力学参数显示未灭菌样品Pmax高于灭菌不彻底样品，提示其污染程度较高，也表明该无菌检查方法对样品污染程度差异的敏感性。
以上是使用本发明方法进行无菌检测的步骤及获得的实验数据。为了将本发明与现有技术进行比对，以下提供与上述方法同样的实验条件下使用集菌观察法进行无菌检查的数据，并与本发明实验数据进行比较：
1、不同菌种不同浓度下两种方法检出微生物所需时间比较如下：
表4A各类微生物所属种类与培养条件汇总表
  菌种   简称   代表微生物类别   培养温度   适用培养基
  金黄色葡萄球菌   金葡   好氧性革兰氏阳性菌   35℃   硫乙
  铜绿假单胞菌   铜绿   好氢性革兰氏阴性菌   35℃   硫乙
  大肠埃希菌   大肠   革兰氏阴性兼性厌氧菌   35℃   硫乙
  志贺氏痢疾杆菌   痢疾   革兰氏阴性兼性厌氧菌   35℃   硫乙
  枯草芽孢杆菌   枯草   好氧性芽孢杆菌   35℃   硫乙
  生孢梭菌   生孢   厌氧菌   35℃   硫乙
  白色念珠菌   白念   酵母菌   28℃   马丁
  黑曲霉   黑曲   真菌   28℃   马丁
  35℃金黄色葡萄球菌   35℃金葡   新鲜培养物   35℃   硫乙
  -70℃金黄色葡萄球菌   -70℃金葡   低温培养物   35℃   硫乙
  50℃金黄色葡萄球菌   50℃金葡   高温培养物   35℃   硫乙
表4B本发明方法的各细菌检出时间表
Figure BSA00000164442000181
表4C集菌观察法的各细菌检出时间表
Figure BSA00000164442000182
Figure BSA00000164442000191
结果表明：(1)除白色念珠菌外，其它各微生物使用集菌观察法检出时间虽然小于36h，但平均检出时间较微量量热法长(微量量热法集中分布在0～18小时，集菌观察法集中分布在10～36小时)；(2)集菌观察法检出最低稀释度为10-10，未检出各微生物10-11稀释度；同时各微生物检出最低浓度均较微量量热法高，检出灵敏度较微量量热法低；(3)白色念珠菌在检查过程中不引起培养基的明显浑浊，集菌观察法难以准确判断是否有微生物生长；(4)使用集菌观察法低温(-70℃)及高温(60℃)保藏金黄色葡萄球菌各稀释度培养物检出时间较微量量热法长，且未检出60℃时10-8稀释培养物；(5)所选微生物菌种囊括好氧菌/厌氧菌/兼性菌、革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌、芽孢杆菌/酵母菌/真菌等自然界常见微生物类型(也为常见微生物污染源)，微量量热法均能检出以上微生物，表明方法具有良好的普适性，符合无菌检查需要。
2、以复方茵陈注射液为样品的无菌性检查，两种方法检查结果的比较如下：
本发明方法的判定结果如表3所示。
集菌观察法的判定结果如下表所示：
表5.集菌观察法对复方茵陈注射液进行无菌检查的判定结果
Figure BSA00000164442000192
Figure BSA00000164442000201
表中“-”：未检出微生物污染；“±”：不可准确判定；“+”：检出微生物污染.
两种方法准确检出微生物污染所需时间总结对比如下：
表6本发明方法和集菌观察法检出复方茵陈注射液微生物污染所需时间对比表
Figure BSA00000164442000202
结果表明：本发明方法比集菌观察法更快速、灵敏。对于生长不明显引起培养基浑浊的微生物污染(白色念珠菌、枯草芽胞杆菌等)其检查灵敏性相对更高。
本发明方法和现有技术集菌观察法全面比较总结如下表：
表7微量量热法和集菌观察法检测数据比较
  项目   本发明方法   集菌观察法
时效性   集中分布在0～18h，对生长缓慢细菌(白色念珠菌)在72h内检出   分布在10～36h，较难检出生长缓慢细菌(白念，培养基不浑浊)
灵敏度 可检出低于10-11(小于1cfu)稀释度微生物生长   检出能力较低(多未检出10-10、10-11稀释度)
  定量性   可提供定量热动力学参数及结果判断方程   肉眼观察，主观判断
准确性 结果判定准确，可有效避免假阴性/假阳性判断   较难判定非微生物生长引起培养基浑浊的假阳性结果及微生物生长不引起培养基浑浊的假阴性结果
指纹性   提供检测全过程微生物生长状态曲线，具有较好指纹性，可用于污染物种类初步判定   定时间断观察，较难提供相关特征指纹信息
自动化   自动检测样品热谱曲线，根据判断标准，自动判定样品无菌状态，并提供预警信息，自动化程度高   需人员反复观察，工作量大，且易引起误判和二次污染，自动化程度低
以上比较内容提示：采用本发明微量量热法进行无菌检查比常规集菌观察法更加快速、灵敏，且有较高的自动化程度和客观性，可以作为无菌检查的新方法。
具体实施方式二：本实施方式的步骤(1)至步骤(4)与具体实施方式一相同。
在步骤(5)对样品进行过滤和注入培养基的操作过程中，为了隔绝外界环境(避免因二次污染而做出假阳性判断)、满足富集微生物同时消除产品抑菌性能的要求，本实施方式采用一种全封闭集菌安瓿培养器，其结构及使用方法如下：
如图12所示，全封闭集菌安瓿培养器由集菌安瓿系统、加样加液系统和蠕动排液系统组成，所述加样加液系统与集菌安瓿系统之间通过进液管4连接在一起，集菌安瓿系统和蠕动排液系统通过排液管5连接在一起。
优选结构为，集菌安瓿系统包括安瓿瓶身1，在安瓿瓶身的瓶口上密封固定橡胶密封塞3。进液管4、排液管5和排气管6穿透橡胶密封塞后伸入安瓿瓶身内。安瓿瓶身内置一滤器2，滤器的底部铺有滤膜15，滤器的顶部与安瓿瓶内的进液管口连接，安瓿瓶内的排液管口越过滤器伸至安瓿瓶底部。滤膜可根据过滤对象的不同预先设置为不同的材质。在安瓿瓶身外部的进液管和排液管上分别安装有进液控制阀7、排液控制阀8和排气控制阀17，排气管顶部连接空气过滤器16。
优选结构为，加样加液系统包括样品/培养基容器12和带空气过滤器的进液装置10。
优选结构为，蠕动排液系统包括一蠕动泵13，蠕动泵的出口连接废液收集器14。
优选结构为，在进液控制阀和加样加液系统之间的进液管上安装一进液管道连接器11，断开该管道连接器时，可将加样加液系统与集菌安瓿系统分离；在排液控制阀和蠕动排液系统之间的排液管上安装一排液管道连接器18，断开该管道连接器时，可将蠕动排液系统与集菌安瓿系统分离。
进液管道连接器和排液管道连接器为塞口式，进液管道连接器和排液管道连接器的塞口可对接形成密封管道连接器19。
在集菌安瓿培养器中完成过滤和培养基的注入程序后，从进液管道连接器11塞口处将加样加液系统与集菌安瓿系统分离；从排液管道连接器18塞口处将蠕动排液系统与集菌安瓿系统分离；然后将进液管道连接器塞口和排液管道连接器塞口对接形成密封管道连接器19，使集菌培养容器处于密封状态，如图13所示。
优选结构为，在安瓿瓶身上标有刻度线9。可根据需要决定标示精度，如可以标示5mL、10mL、15mL等刻度线。
优选结构为，安瓿瓶身为玻璃结构或硬质塑料结构，透明材料可以保证外部观察的准确性。
优选结构为，进液控制阀、排液控制阀和排气控制阀为卡口阀。
优选结构为，进液管、排液管和排气管为硅胶软管。
优选结构为，排气管为由硅胶软管连接的顶端带空气过滤装置、尾端中空侧壁开口的不锈钢针头。
另外，本发明还提供一种进液管的变形结构。
如图14和图15所示，进液管伸入安瓿瓶身的部分可以是上细下粗的锥形管20，滤器固定在锥形管的下端。所述锥形管的上端外表面为螺纹结构21，橡胶密封塞的下表面固定一内螺纹接口22，锥形管可通过螺纹结构21与该内螺纹接口连接。
上述全封闭集菌安瓿培养器的使用方法为：
①、将加样加液系统、集菌安瓿系统、蠕动排液系统顺次连接在一起，也就是将进液装置10连接在样品/培养基容器12上，将进液管道连接器11的塞口对接好，样品/培养基容器12内是待检样品；再将排液管道连接器18的塞口也对接好；
②、关闭排气控制阀17，打开进液控制阀7、排液控制阀8、蠕动泵13，调整流速，缓慢过滤样品并排除药液；上述步骤完成后，打开排气通道控制阀17，关闭蠕动泵13、进液控制阀7、排液控制阀8；
③、替换样品/培养基容器为无菌清洗液容器，关闭排气通道控制阀17，打开进液控制阀7、排液控制阀8、蠕动泵13，调整流速，清洗滤膜并排除废液；
④、关闭蠕动泵13、排液控制阀8、进液控制阀7，打开排气控制阀17，替换样品/培养基容器12内样品为对应培养基；
⑤、关闭排气控制阀17，打开排液控制阀8、蠕动泵13，使瓶内呈负压状态；并抽破滤膜15，使滤器2与瓶内联通；
⑥、关闭排液控制阀8、蠕动泵13，打开进液控制阀7，使培养基加至相应刻度，关闭进液控制阀7；
⑦、如果培养过程中需要一定比例的空气促使微生物快速生长，就打开排气控制阀17向集菌安瓿培养器内按比例注入空气，然后拔出排气通道6；如果培养过程不需要空气，就完成步骤⑥后直接拔出排气通道6；
⑧、打开进液管道连接器11和排液管道连接器18的塞口，并将这两个管道连接器的塞口组合对接在一起，形成密封管道连接器19，使集菌安瓿培养器处于密封状态；
⑨、将密封状态的集菌安瓿培养器置于相应的检测仪器/环境中，获取样品的检测结果。
具体到使用全封闭集菌安瓿对受试制剂复方茵陈注射液进行无菌检查的方法为：
①、将进液装置10连接在样品/培养基容器12上，将进液管道连接器11的塞口对接好，样品/培养基容器12内是待检的复方茵陈注射液样品；然后将排液管道连接器18的塞口也对接好；
②、关闭排气控制阀17，打开进液控制阀7、排液控制阀8、蠕动泵13，调整流速，缓慢过滤复方茵陈注射液样品并排除药液；上述步骤完成后，打开排气通道控制阀17，关闭蠕动泵13、进液控制阀7、排液控制阀8；
③、替换复方茵陈注射液容器为无菌清洗液容器，关闭排气通道控制阀17，打开进液控制阀7、排液控制阀8、蠕动泵13，调整流速，清洗滤膜并排除废液；
④、关闭蠕动泵13、排液控制阀8、进液控制阀7，打开排气控制阀17，替换样品/培养基容器12内注射液样品为硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基；
⑤、关闭排气控制阀17，打开排液控制阀8、蠕动泵13，使瓶内呈负压状态；并抽破滤膜15，使滤器2与瓶内联通；
⑥、关闭排液控制阀8、蠕动泵13，打开进液控制阀7，使培养基加至相应刻度，关闭进液控制阀7；
⑦、打开排气控制阀17向集菌安瓿培养器内注入空气，然后拔出排气通道6；
⑧、打开进液管道连接器11和排液管道连接器18的塞口，并将这两个管道连接器的塞口组合对接在一起，形成密封管道连接器19，使集菌安瓿培养器处于密封状态；
⑨将密封状态的集菌安瓿培养器置于微量量热仪中，获取复方茵陈注射液样品的热谱曲线。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种无菌检查方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)选取菌种和培养基：选取不同种类的菌种及适合菌种生长的无菌培养基；
(2)制备菌液：将步骤(1)选取的菌种在无菌培养基中进行培养，获得各个菌种不同浓度、不同生存状态的菌液，作为录制菌种的指纹特征热谱曲线的阳性控制物；
(3)录制各个菌种的指纹特征热谱曲线作为鉴别特征：将步骤(2)获得的菌液置于微量量热仪中，记录各个菌种不同浓度、不同生存状态的菌液的热谱曲线，获得不同菌种的指纹特征热谱曲线；
(4)提取步骤(3)所获热谱曲线的热动力学参数，确定菌种阳性判定指标；
(5)对待测样品进行无菌检查：将待测样品进行过滤，用无菌清洗液冲洗滤膜上的过滤物；将样品的过滤物和培养基混合后置入微量量热仪的检测通道，记录其热谱曲线；通过与步骤(3)的不同菌种的指纹特征热谱曲线以及步骤(4)的菌种阳性判定指标进行比对，检查待测制剂是否被微生物污染。
2.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(2)中，获得各个菌种不同浓度菌液的方法是，将菌种新鲜培养物洗脱得到洗脱液，用0.9％灭菌氯化钠溶液将洗脱液按10倍系列稀释；获得各个菌种不同生存状态的菌液的方法是，将培养物过滤洗脱得到洗脱液，将洗脱液分别置于-70℃冰箱和60℃水浴中保持2h后，再用0.9％灭菌氯化钠溶液按10倍系列稀释。
3.根据权利要求2所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(3)中将菌液置于微量量热仪中的具体步骤是：
(3-1)按步骤(2)的方法取各菌种10-3、10-5、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11倍系列浓度的稀释培养物；
(3-2)将等体积的各菌种的系列浓度稀释培养物加入步骤(1)中所述的无菌培养基中，作为微量量热仪的阳性检测通道；
(3-3)另取一份无菌培养基，作为微量量热仪的空白对照通道。
4.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(4)所述热谱曲线的热动力学参数包括，随时间变化的检测通道热功率Pi及与其同时刻的空白对照通道热功率P0、最大发热功率Pmax、达到最大发热功率时间Tmax、总发热量Htoral，以及各曲线指数生长段每15min斜率k。
5.根据权利要求4所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(4)所述菌种阳性判定指标可以是：记录k≥0的出现时间，并以k≥0为检出样品微生物污染的必要条件，同时建立微生物生长的阳性判断时间指标。
6.根据权利要求5所述的无菌检查方法，其特征在于，微生物生长的阳性判断时间指标可以按以下方法确定：检测通道热功率Pi与同时刻空白通道热功率P0之间的差值大于P0绝对值3倍的时间为检出样品微生物污染的时间点(Td)，即：
Td＝Time[(Pi-P0)/|P0|≥3]
7.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(5)中将样品过滤物和培养基进行混合时，按照适合菌种生长的条件选择培养基。
8.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(5)中将样品过滤物和培养基混合并置入微量量热仪的安瓿中时，安瓿中按照体积比例保留促使菌种快速生长的气体环境。
9.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(5)将安瓿放入微量量热仪的检测通道时，检测通道的温度按照适合菌种生长的温度设定。
10.根据权利要求9所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤(5)将安瓿放入微量量热仪的检测通道时，检测通道的温度可以设定为23℃～37℃。
11.一种实施权利要求1所述方法时使用的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，所述集菌安瓿培养器由集菌安瓿系统、加样加液系统和蠕动排液系统组成，所述加样加液系统与集菌安瓿系统之间通过进液管(4)连接在一起，集菌安瓿系统和蠕动排液系统通过排液管(5)连接在一起。
12.根据权利要求11所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，其中集菌安瓿系统包括安瓿瓶身(1)，在安瓿瓶身的瓶口上密封固定橡胶密封塞(3)，进液管(4)、排液管(5)和排气管(6)穿透橡胶密封塞后伸入安瓿瓶身内，安瓿瓶身内置一滤器(2)，滤器的底部铺有滤膜(15)，滤器的顶部与安瓿瓶内的进液管口连接，安瓿瓶内的排液管口越过滤器伸至安瓿瓶底部，在安瓿瓶身外部的进液管、排液管和排气管上分别安装有进液控制阀(7)、排液控制阀(8)和排气控制阀(17)，排气管顶部连接空气过滤器(16)。
13.根据权利要求11所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，加样加液系统包括样品/培养基容器(12)和带空气过滤器(16)的进液装置(10)。
14.根据权利要求11所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，蠕动排液系统包括一蠕动泵(13)，蠕动泵的出口连接废液收集器(14)。
15.根据权利要求12所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，在进液控制阀和加样加液系统之间的进液管上安装一进液管道连接器(11)，断开该管道连接器时，可将加样加液系统与集菌安瓿系统分离；在排液控制阀和蠕动排液系统之间的排液管上安装一排液管道连接器(18)，断开该管道连接器时，可将蠕动排液系统与集菌安瓿系统分离。
16.根据权利要求15所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，进液管道连接器(11)和排液管道连接器(18)为塞口式，进液管道连接器管和排液管管道连接器的塞口可对接形成密封管道连接器(19)。
17.根据权利要求12所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，安瓿瓶身为玻璃结构或透明硬质塑料结构，在安瓿瓶身上标有刻度线(9)。
18.根据权利要求12所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，进液管、排液管和排气管为硅胶软管，进液控制阀、排液控制阀和排气控制阀为卡口阀。
19.根据权利要求12所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，排气管为由硅胶软管连接的顶端带空气过滤装置的不锈钢针头。
20.根据权利要求12所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，进液管伸入安瓿瓶身的部分为上细下粗的锥形管(20)，滤器(2)固定在锥形管的下端。
21.根据权利要求20所述的全封闭集菌安瓿培养器，其特征在于，所述锥形管的上端外表面为螺纹结构(21)，橡胶密封塞的下表面进液管口处固定一内螺纹接口(22)，锥形管可通过螺纹结构与该内螺纹接口连接。
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