CN103499600B - 一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法，属于病菌检测技术领域。该方法包括：(1)、对肝硬化病人的肝腹水样本进行培养；(2)、对步骤(1)中进行培养的样本采用安瓿法，放入微热量热仪中，得到样本中细菌生长代谢热谱曲线；(3)、将步骤(2)得到的热谱曲线与相同条件下标准细菌的热谱曲线进行对比，确定肝硬化腹水中细菌的种类。本发明的方法具有可信度高、灵敏度好，可以快速有效的鉴定肝硬化腹水细菌感染病原菌的优点，同时相对于微生物自动化检测系统，本方法还具有简便实用、成本低的特点。
Description
技术领域
本发明属于病菌检测技术领域，具体涉及一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法。
背景技术
肝硬化腹水，是一种慢性肝病，俗称肝腹水。正常人腹腔内有少量(约50ml)起维持脏器间润滑作用的游离腹水，当腹腔内出现过多游离液体时，称为腹水。而肝硬化肝功能减退引起门静脉高压，导致脾肿大，对蛋白质和维生素的不吸收而渗漏出的蛋白液，形成了腹水症。由于肝腹水患者的抵抗力低，特别是肝内网状内皮系统严重受损、巨噬细胞吞噬功能以及白细胞粘附趋化与吞噬功能降低等原因有关，这时肠道内细菌就会增多，易引起肝硬化腹水细菌感染和少数真菌感染，出现自发性细菌性腹膜炎(Spontaneousbacterialperitonitis，SBP)、呼吸道感染、尿路感染以及软组织感染约占肝硬化合并感染等症。
近年研究表明，肝硬化腹水患者约20%伴自发性细菌性腹膜炎。其原因主要包括肠道细菌的转运、病原菌的接触传播以及血源污染。致病菌常为来源于肠道的需氧的革兰阴性菌(49.5%)及非肠源性的链球菌。最常见的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、枯草芽胞杆菌、产气肠杆菌等。目前，微生物自动化检测系统，如API和VITEK系统，相对于常规鉴定方法具有准确、快速和鉴定病原体的特点，较广泛地应用于临床检验、疾病控制等领域。临床上鉴定肝硬化腹水感染细菌种类主要通过制作血培养阳性标本，采用VITEK、API方法和药敏法等方法进行检测，均具有较好的灵敏度和准确度，但是微生物自动化检测系统在检测中过程复杂、成本较高。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法，包括下述步骤：
(1)、对肝硬化病人的肝腹水样本进行培养；
(2)、对步骤(1)中进行培养的样本采用安瓿法，放入微热量热仪中，得到样本中细菌生长代谢热谱曲线(热功率-时间曲线)；
(3)、将步骤(2)得到的热谱曲线与相同条件下标准细菌的热谱曲线进行对比，确定肝硬化腹水中细菌的种类。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(1)中的样本在接种量为1×106cells/ml条件下，在LB培养基中进行培养，所述LB培养基的组成为蛋白胨0.01g/ml、酵母膏0.005g/ml和NaCl0.005g/ml。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(2)中得到热谱曲线的条件为37℃等温条件下得到热谱曲线。
上述技术方案所述的方法，其中，步骤(3)中是通过对比两个热谱曲线之间的出峰数量N、峰宽W和各峰出峰时间t来确定肝硬化腹水中细菌的种类。
上述技术方案所述的方法，其中，在步骤(1)之前还包括获得标准细菌热谱曲线的过程，步骤为：在37℃恒温条件下，采用安瓿法，将标准细菌以1×106cells/ml的浓度接种到LB培养基中，放入微热量热仪中，得到标准细菌的生长代谢热谱曲线。
本发明具有以下有益效果：
本发明一种利用微量热法鉴别肝硬化腹水感染细菌种类的方法是将检测样本中的细菌生长代谢热谱曲线与标准细菌生长代谢热谱曲线的出峰数量（N）、峰宽（W）、各峰的达峰时间t等指标进行对比，从而可以快速、准确地鉴定样本中细菌种类；与VITEK等方法(直接法)检测的结果相比，本发明方法的鉴定结果具有可信度高、灵敏度好，可以快速有效的鉴定肝硬化腹水细菌感染病原菌的优点，同时相对于微生物自动化检测系统，本方法还具有简便实用、成本低的特点。
附图说明：
1、图1为大肠埃希菌在不同接种量下的热谱曲线图(37℃，安瓿法)；
2、图2为大肠埃希菌在不同培养基下的热谱曲线图(37℃，安瓿法)；
3、图3为大肠埃希菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
4、图4为肺炎克雷伯菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
5、图5为阴沟肠杆菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
6、图6为铜绿假单胞菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
7、图7为金黄色葡萄球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
8、图8为表皮葡萄球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
9、图9为屎肠球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
10、图10为血液链球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
11、图11为临床样本中大肠埃希菌热功率-时间曲线图谱；
12、图12为临床样本中肺炎克雷伯菌热功率-时间曲线图谱；
13、图13为临床样本中阴沟肠杆菌热功率-时间曲线图谱；
14、图14为临床样本中铜绿假单胞菌热功率-时间曲线图谱；
15、图15为临床样本中金黄色葡萄球菌热功率-时间曲线图谱；
16、图16为临床样本中表皮葡萄球菌株热功率-时间曲线图谱；
17、图17为临床样本中屎肠球菌标准菌株热功率-时间曲线图谱；
18、图18为临床样本中血液链球菌热功率-时间曲线图谱。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种鉴定肝硬化腹水中感染细菌种类的方法作进一步的说明。
以下试验例中的病例选择、仪器及材料如下：
一、肝硬化腹水细菌感染病例及入选、排除标准：
入选标准：(1)腹水病原菌培养阳性。(2)符合炎性渗出液特点，白细胞计数＞0.5×109／L，或多形核粒细胞计数＞0.25×109／L。(3)发热、寒战、腹痛、腹泻。(4)不同程度的腹膜刺激征。(5)腹水量迅速增加、利尿剂治疗无效。(6)排除继发性、结核性及癌性腹水者。
排除标准:(1)入院前2周内应用过抗生素、微生态制剂者；(2)继发性腹膜炎患者。
按上述入选标准和排除标准，选取2005年1月至2013年3月中国人民解放军第302医院治疗的500例肝硬化合并SBP患者，男362例，女138例，年龄26-67岁。原发病情况：病毒性肝炎后肝硬化329例(乙型肝炎263例，丙型肝炎28例，乙丙型肝炎28例)，酒精性肝硬化151例，原发性胆汁性肝硬化6例，自身免疫性肝炎肝硬化5例，血吸虫性肝硬化2例，不明原因7例。肝脏储备功能情况：Child-PughB级101例，c级399例。
二、标准菌株：
大肠埃希菌标准菌株ATCC25922；肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603；阴沟肠杆菌标准菌株CMCC45301；铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853；金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300；表皮葡萄球菌标准菌株ATCC12228；屎肠球菌标准菌株ATCC35667；血液链球菌标准菌株BZW23112。
以上标准菌株均从南京便诊生物科技有限公司购买。
三、试验仪器及耗材：
TAMAir微量量热仪(瑞典Thermometric公司)；BACYEC9120全自动血培养仪(美国BD公司)；VITEK-32自动微生物检测系统和API鉴定条(法国生物梅里埃公司)；APIl20cAUX自动微生物检测系统(法国生物梅里埃公司)；YXQG02型高压蒸汽灭菌器(山东安得医疗科技有限公司)；超净工作台(青岛冰峰公司)；ATL-032摇床(上海堪鑫仪器设备有限公司)；微量加样器(德国eppendorf公司)；加样枪头(德国eppendorf公司)；离心管、冻存管(德国Greiner公司)；血平板(北京世纪奥科生物技术有限公司，20120108)；麦康凯琼脂平板(上海泛柯实业有限公司，20120112)。
四、试验试剂：
1、LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl5g,溶于1000ml蒸馏水中，调pH=7.2后分装，121.1℃高压蒸汽灭菌30min，4℃冰箱中放置备用；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司，20120412；酵母膏购自北京奥博星生物技术有限责任公司，20120412；NaCl购自北京化工厂，20120114。
2、营养肉汤培养基：蛋白胨10g，酵母膏3g，NaCl5g,溶于1000ml蒸馏水中，调pH=7.2后分装，121.1℃高压蒸汽灭菌30min，4℃冰箱中放置备用。
3、葡萄糖肉汤培养液：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，葡萄糖10g，加入蒸馏水至1000mL，搅拌加热至全部溶解，调整pH为7.3±0.2，分装，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
试验例1：
一、肝硬化腹水细菌感染样本病原菌分布鉴别试验：
病原菌培养鉴定方法：无菌抽取500例肝硬腹水细菌感染患者的腹水各10ml注入血培养瓶增菌液，置于BACYEC9120全自动血培养仪中常规培养，阳性者即时报警。革兰阳性菌及阴性菌的鉴定采用VITEK-32系统和API鉴定条，真菌的鉴定采用APIl20cAUX系统。以标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC43300、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853作室内质控菌株。以上检测按照VITEK-32系统操作指南和API鉴定条使用说明进行鉴定，严格无菌操作。
1周内2次腹水培养检出相同病原菌记为一株。观察SBP致病菌的分布情况。
试验结果：500例肝硬化合并SBP患者腹水标本中141例培养阳性，共检出148株病原菌，阳性率为28.2%，单一病原菌感染比例为95.3%。148株病原菌中，革兰阴性菌115株，革兰阳性菌29株，真菌4株，厌氧菌未分离得到，病原菌构成比见表1。
表1500例肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者腹水检出病原菌构成比
二、微量量热法测定标准病原菌图谱试验：
1、微量量热仪系统条件的优化及方法学考察试验：
生物热动力学法是一种可以用于研究生命体系代谢生长过程中微量热变化的记录，在实际应用中，供试生物、培养基、接种量等可对研究结果造成影响。为了保证试验结果的可靠性，本发明采用TAMAir微量量热系统，以不同病原菌为受试菌，考察不同培养基和不同接种量对微生物热活性的影响，同时对仪器的稳定性和精密度也进行了方法学考察。
本发明涉及微量量热法采用安瓿法，考察不同病原菌在不同接种量、不同培养基中的生长情况，37℃下跟踪记录各病原菌的生长代谢热谱图，当曲线回归到基线时，试验结束。同时对微量量热仪中8个通道各病原菌的生长代谢进行监测，进行仪器的精密度和稳定性试验。热谱图参数定义如下：
(a)、出峰数量为细菌生长过程中出峰总数，记为N；
(b)、峰宽为细菌整个生长过程总时间，记为W；
(c)、出峰时间为对应峰的达峰时间，记为t，各峰的出峰时间分别记为t1，t2，t3，t4......。
(1)、大肠埃希菌不同接种量下的生长代谢热谱曲线：
采用微量量热仪，以安瓿法考察大肠埃希菌在不同接种量(0.2×106、0.5×106、1×106cells/ml)、在LB培养基中的生长情况，37℃等温条件下实时记录细菌生长代谢热谱曲线，当曲线回到基线后，试验结束，得到相似的热谱曲线，提取各参数信息，进行分析。结果见图1，图1为大肠埃希菌在不同接种量下的热谱曲线图(37℃，安瓿法)，图1中a线的接种量为1×106cells/ml；b线的接种量为0.5×106cells/ml；c线的接种量为0.2×106cells/ml。
试验结果：从上图1可以看出，细菌浓度较大时，停滞期较短；细菌浓度较小，停滞期明显增长。因此，一般细菌接种的起始浓度以1×106cells/ml为宜。
(2)、大肠埃希菌不同培养基下的生长代谢热谱曲线：
以安瓿法考察大肠埃希菌在接种量为1×106cells/ml、在营养肉汤培养基和LB培养基中的生长情况，37℃等温条件下实时记录细菌生长代谢热谱曲线，当曲线回到基线后，试验结束，得到相似的热谱曲线，提取各参数信息，进行分析。结果见图2，图2为大肠埃希菌在不同培养基下的热谱曲线图(37℃，安瓿法)，图2中a线为LB培养基；b线为营养肉汤培养基。
试验结果：从图2可以看出，大肠杆菌在不同的培养基条件下得到的热谱曲线有明显的差异，因此在本试验条件下LB培养基较营养肉汤培养基更适宜作为试验用培养基。
(3)、仪器精密度考察：
在相同情况下，记录仪器8个通道大肠埃希菌的热谱曲线，提取生物热动力学参数出峰数量N、峰宽W、出峰时间t1、t2，进行统计学分析，计算各试验RSD值。见表2。
表2八通道大肠埃希菌热谱曲线的参数值
试验结果：从表2看出，本试验选取大肠埃希菌热功率-时间曲线的主要参数出峰数量N、峰宽W、出峰时间t1、t2的RSD(相对标准偏差)均小于3%，表明仪器有良好的精密性。
(4)、仪器稳定性考察：
采用安瓿法，以大肠埃希菌为模式生物，使用微量量热仪同一通道记录热动力学曲线，测量5次，提取生物热动力学参数：出峰数量N、峰宽W、出峰时间t1、t2......等信息，进行统计学分析，计算各试验RSD值。见表3。
表3单通道大肠埃希菌生物热动力学曲线参数值
试验结果：从表3看出，本试验选取大肠埃希菌热功率-时间曲线的主要参数出峰数量N、峰宽W、出峰时间t1、t2的RSD均小于3%，表明仪器的稳定性良好。
以上结果表明：在设定条件下，微量量热仪具有良好的重现性、稳定性和精密度，满足菌株的生物热动力学研究的需要。
平行对其它各病原菌进行接种量、培养基等条件的筛选，结果均表明细菌接种量为1×106cells/ml，培养基选择LB培养基为宜；各试验仪器的精密度和稳定性均符合试验要求。
2、各病原菌生物热动力学标准图谱测定试验：
以安瓿法考察各病原菌标准菌株(大肠埃希菌标准菌株、肺炎克雷伯菌标准菌株、阴沟肠杆菌标准菌株、铜绿假单胞菌标准菌株、金黄色葡萄球菌标准菌株、表皮葡萄球菌标准菌株、屎肠球菌标准菌株、血液链球菌标准菌株)在接种量为1×106cells/ml、LB培养基中的生长情况，37℃等温条件条件下实时记录细菌生长代谢热谱曲线，当曲线回到基线后，试验结束，得到菌株的标准热谱曲线图，提取各参数信息，进行分析。以上试验重复5次，结果见表4，各病原菌热功率-时间曲线标准图谱(重复性试验结果)见图3-图10，其中图3为大肠埃希菌标准菌株，图4为肺炎克雷伯菌标准菌株，图5为阴沟肠杆菌标准菌株，图6为铜绿假单胞菌标准菌株，图7为金黄色葡萄球菌标准菌株，图8为表皮葡萄球菌标准菌株，图9为屎肠球菌标准菌株，图10为血液链球菌标准菌株。
表4各病原菌生物热动力学标准曲线主要参数值
试验结果：以上数据用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析，各病原菌的出峰数量N和峰宽W两两比较均有显著性差异(P<0.05)，故N和W可为直接比较指标；以各峰出峰时间t1、t2、t3、t4……为间接比较指标，以上指标能够表征出各病原菌标准菌株的生长情况(P<0.05)，说明此方法可以用于诊断各病原菌的种类。同时本发明所指微量量热法测肝腹水菌类感染的病原菌热谱图,具有重现性好、灵敏度高、速度快的优点,有利于快速、准确鉴定病原菌种类。
三、微量量热法鉴别肝硬化腹水合并SBP感染细菌种类试验：
本试验的原理在于采用微量量热法检测500例标本的细菌构成，然后与微生物自动化检测系统(VITEK-32和API系统)的结果进行对比，从而对微量量热法在临床肝腹水菌类感染鉴定中的应用效果进行评价，说明微量量热法能够用于肝硬化腹水细菌感染的鉴定，同时具有较高的灵敏度和准确性。
将上述2005年1月至2013年3月中国人民解放军第302医院治疗的500例肝硬化合并SBP患者的腹水样本接种于装有葡萄糖肉汤培养基的葡萄糖肉汤培养管中。培养阳性者转种于血平板和麦康凯平板，应用微量量热法对分离出的单个菌落进行鉴定。将以上菌落用LB液体培养基稀释为1×106cells/ml浓度的细菌悬液；采用安瓿法将各细菌悬液5ml注入10ml的安瓿瓶中，封口，放入微量量热仪中，等温条件条件下(37℃)实时记录细菌生长代谢热谱曲线，当曲线回到基线后，试验结束，得到菌落热谱曲线图，提取各热谱参数信息(峰数量N、峰宽W等)，对比各病原菌标准热谱图信息(表4、图3-图10)，进行分析鉴定，以上过程中严格无菌操作。
试验结果：病原菌检出率及分布。500例肝硬化合并SBP患者腹水标本中115例培养阳性，共检出120株病原菌，阳性率为23.0%，单一病原菌感染比例为92.0%。120株病原菌中，革兰阴性菌92株，革兰阳性菌28株。具体鉴定结果见表5、表6，微量量热法鉴定肝硬化合并SBP感染细菌种类热谱图见图11-图18，将图11-图18的图谱与图3-图10的标准图谱在出峰数量N、峰宽W和各峰出峰时间t三个参数上进行对比，得出图11为大肠埃希菌；图12为肺炎克雷伯菌；图13为阴沟肠杆菌；图14为铜绿假单胞菌；图15为金黄色葡萄球菌；图16为表皮葡萄球菌株；图17为屎肠球菌标准菌株；图18为血液链球菌。
表5微量量热法鉴定肝硬化合并SBP感染细菌种类热谱图参数
表6微量量热法鉴定500例肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者腹水病原菌构成比
从表5、表6中得出，本发明涉及微量量热法用于肝硬化腹水合并SBP感染细菌种类鉴定中，对比微生物鉴定系统法(API法)结果(见表1)，革兰阴性菌的检出准确率为80.0%，其中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌的检出准确率分别为93.3%、95.5%、100.0%、100.0%，说明有标准图谱的病原菌的检出准确率均>93%，具有良好的检出准确率；革兰阳性菌的检出准确率为93.1%，其中金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、血液链球菌的检出准确率分别为100.0%、100.0%、100.0%、100.0%，说明有标准图谱的病原菌的检出准确率均为100%，具有良好的检出准确率。
综合以上试验说明，本发明涉及微量量热法能够应用于临床鉴定肝硬化腹水合并SBP感染细菌种类，并且检出准确率高、检出时间短、成本低的特点。但同时本发明涉及的微量量热法需要进一步补充肝硬化合并SBP感染病原菌的标准菌株的测量图谱信息，才能更好地应用于临床鉴定肝硬化腹水细菌感染中的细菌鉴种类。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法，包括下述步骤：
(1)、对肝硬化病人的肝腹水样本在接种量为1×106cells/ml条件下，在LB培养基中进行培养，所述LB培养基的组成为蛋白胨0.01g/ml、酵母膏0.005g/ml和NaCl0.005g/ml；
(2)、对步骤(1)中进行培养的样本采用安瓿法，放入微热量热仪中，得到样本中细菌生长代谢热谱曲线；
(3)、将步骤(2)得到的热谱曲线与相同条件下标准细菌的热谱曲线进行对比，确定肝硬化腹水中细菌的种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中得到热谱曲线的条件为37℃等温条件下得到热谱曲线。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中是通过对比两个热谱曲线之间的出峰数量N、峰宽W和各峰出峰时间t来确定肝硬化腹水中细菌的种类。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括获得标准细菌热谱曲线的过程，步骤为：在37℃恒温条件下，采用安瓿法，将标准细菌以1×106cells/ml的浓度接种到LB培养基中，放入微热量热仪中，得到标准细菌的生长代谢热谱曲线。
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