ES2184661T3 - Metodo y aparato para la recuperacion de plasmidos que implica ultrafiltracion. - Google Patents

Metodo y aparato para la recuperacion de plasmidos que implica ultrafiltracion.

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ES2184661T3 ES01922922T ES01922922T ES2184661T3 ES 2184661 T3 ES2184661 T3 ES 2184661T3 ES 01922922 T ES01922922 T ES 01922922T ES 01922922 T ES01922922 T ES 01922922T ES 2184661 T3 ES2184661 T3 ES 2184661T3
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Abstract

Un procedimiento para recuperar plásmidos u otro DNA que comprende las etapas de: (a) romper las paredes celulares para liberar los componentes celulares incluyendo plásmidos u otro DNA; (b) filtrar los componentes celulares a través de una o más membranas seleccionadas del grupo que consiste en microfiltración, filtración en bruto y sus combinaciones y recoger el filtrado; (c) filtrar el filtrado de (b) a través de una o más membranas de ultrafiltración de manera que se dejan los plásmidos u otro DNA como material retenido en la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración y (d) recuperar los plásmidos u otro DNA de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración.

Description

Método y aparato para la recuperación de plásmidos que implica ultrafiltración.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método de recuperación de plásmido, que implica filtración a diferencial de presión constante y un aparato para llevarlo a cabo. Más particularmente, se refiere a un método de preparación de plásmido y los dispositivos para llevar a cabo el método.
Antecedentes de la invención
El método convencional de recuperación de plásmido de un lisado bacteriano después de lisis alcalina se conoce comúnmente como un proceso de retención, lavado y elución. Este proceso recupera el plásmido de un lisado aclarado mediante retención en un filtro de fibra de vidrio en presencia de un agente caotrópico tal como ioduro de potasio. Este agente caotrópico ocasiona que el plásmido se retenga en las fibras de vidrio mientras que la mayoría de los otros constituyentes celulares pasan a través. El filtro de fibra de vidrio se lava después con etanol (al 70% en peso o más) para eliminar el agente caotrópico. El exceso de etanol se elimina de la cara inferior de la placa del filtro mediante absorción, centrifugación o secado bajo vacío extensivo. El plásmido después se eluyó de las fibras de vidrio utilizando agua o un tampón bajo en sal.
Este método tiene muchas desventajas. Primero, introduce un contaminante (etanol) en el sistema, el cual es difícil de eliminar completamente. El etanol residual puede afectar de forma adversa a los plásmidos o a los ensayos que se lleven a cabo con ellos. Adicionalmente, este es un proceso que requiere mucho tiempo y que requiere muchas etapas en serie. Además, la capacidad de las fibras de vidrio para retener los plásmidos es limitada, haciendo ineficaz la retención. Igualmente, la elución desde el vidrio no es completa. Se ha encontrado que algo del plásmido se retiene irreversiblemente en el vidrio. En resumen, la recuperación de los plásmidos es a menudo menor del 80%, algunas veces menor del 70% de los plásmidos disponibles.
La presente invención proporciona un método mejor y un aparato para recuperar plásmidos u otro ADN circular que elimina la introducción de nuevos contaminantes, proporciona velocidades más altas de recuperación de plásmido con mayor pureza y que es mucho más rápido que el proceso actual.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un método para romper las células y filtrar después las células rotas a través de una o más membranas de microfiltración (MF) o membranas de filtración gruesa, como se reivindica en la reivindicación 1. La mayor parte de los desechos celulares se eliminan mediante la membrana o membranas y el resto se filtra a continuación, a través de una membrana de ultrafiltración (UF), de manera que los plásmidos u otro ADN queden retenidos sobre la superficie superior de la membrana UF, desde donde se recupera.
Se prefiere que el proceso utilice un diferencial de presión constante para ambas etapas, y más particularmente, se prefiere que se utilice un diferencial de presión constante negativo (vacío) en ambas etapas.
Adicionalmente, se describe un aparato para realizar este proceso, tal y como se reivindica en la reivindicación 14. Está comprendido por una placa filtrante superior que contiene uno o más pocillos, teniendo cada pocillo colocada en su interior, una membrana de filtración gruesa o una membrana MF, preferiblemente adyacente al fondo del pocillo o pocillos. La placa superior tiene una conexión a una toma de diferencial de presión constante. Se proporciona una placa inferior que contiene uno o más pocillos, teniendo cada pocillo o pocillos una membrana UF colocada en él, preferiblemente adyacente al fondo de los pocillos. La placa inferior tiene una toma a un suministro de diferencial de presión constante negativo. Por debajo de la placa inferior está un colector de residuo líquido o
sumidero.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso para recuperar plásmidos u otro ADN que comprende las etapas de:
a)
rotura de las paredes celulares, suficientemente para liberar los componentes celulares, en particular plásmidos y otro ADN;
b)
filtrado de los componentes a través de una o más membranas de microfiltración o de filtración gruesa o combinaciones de las dos y recogida del filtrado;
c)
filtración del filtrado de (b) a través de una o más membranas de ultrafiltración para que los plásmidos u otro ADN queden como un retenido sobre la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración; y
d)
recuperación de los plásmidos u otro ADN de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un proceso para recuperar plásmidos u otro ADN que comprende las etapas de:
a)
rotura de las paredes celulares suficientemente para liberar los componentes celulares, en particular plásmidos u otro ADN;
b)
filtrado de los componentes celulares a través de una o más membranas de microfiltración o membranas de filtración gruesa o combinaciones de las dos utilizando una presión positiva para llevar a cabo la filtración y recogida del filtrado;
c)
filtración del filtrado de (b) a través de una o más membranas de ultrafiltración utilizando una presión negativa para llevar a cabo la filtración para que queden los plásmidos u otro ADN como un retenido sobre la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración; y
d)
recuperación de los plásmidos u otro ADN de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un proceso para la recuperación de plásmidos u otro ADN que comprende las etapas de:
a)
rotura de las paredes celulares suficientemente para liberar los componentes celulares, en particular plásmidos u otro ADN;
b)
filtrado de los componentes celulares a través de una o más membranas de microfiltración o membranas de filtración gruesa o combinaciones de las dos utilizando una presión positiva para llevar a cabo la filtración y recogida del filtrado;
c)
filtración del filtrado de (b) a través de una o más membranas de ultrafiltración utilizando una presión positiva para llevar a cabo la filtración para que los plásmidos u otro ADN queden como un retenido sobre la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración; y
d)
recuperación de los plásmidos u otro ADN de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un proceso para la recuperación de plásmidos u otro ADN que comprende las etapas de:
a)
rotura de las paredes celulares suficientemente para liberar los componentes celulares, en particular plásmidos u otro ADN;
b)
filtrado de los componentes celulares a través de una o más membranas de microfiltración o membranas de filtración gruesa o combinaciones de las dos utilizando una presión negativa para llevar a cabo la filtración y recogida del filtrado;
c)
filtración del filtrado de (b) a través de una o más membranas de ultrafiltración utilizando una presión positiva para llevar a cabo la filtración para que queden los plásmidos u otro ADN como un retenido sobre la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración; y
d)
recuperación de los plásmidos u otro ADN de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración.
Es un objeto adicional de la presentación proporcionar un proceso para la recuperación de plásmidos u otro ADN que comprende las etapas de:
a)
rotura de las paredes celulares suficientemente para liberar los componentes celulares, en particular plásmidos u otro ADN;
b)
filtrado de los componentes celulares a través de una o más membranas de microfiltración o membranas de filtración gruesa o combinaciones de las dos utilizando una presión negativa para llevar a cabo la filtración y recogida del filtrado;
c)
filtración del filtrado de (b) a través de una o más membranas de ultrafiltración utilizando una presión negativa para llevar a cabo la filtración para que queden los plásmidos u otro ADN como un retenido sobre la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración; y
d)
recuperación de los plásmidos u otro ADN de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un aparato para la recuperación de plásmidos u otro ADN que comprende una placa filtrante superior que tiene una o más membranas de microfiltración o membranas de filtración gruesa y una placa filtrante inferior que tiene una o más membranas de ultrafiltración, estando localizada la placa filtrante superior por encima y adyacente a la placa filtrante inferior.
Estos y otros objetos de la presente invención se aclararán a partir de la descripción de la invención y las reivindicaciones.
En los dibujos
La figura 1 muestra un diagrama de bloques de un primer proceso preferido de la presente invención.
La figura 2 muestra un diagrama de bloques del segundo proceso preferido de la presente invención.
La figura 3 muestra un diagrama de bloques de un tercer proceso de la presente invención.
La figura 4 muestra un diagrama de bloques de un cuarto proceso de la presente invención.
La figura 5 muestra un diagrama de bloques de un proceso según la presente invención.
La figura 6 muestra un aparato para el proceso de la presente invención vista en sección transversal.
La figura 7 muestra un segundo aparato para llevar a cabo el proceso de la presente invención vista en sección transversal.
Descripción detallada de la invención
En la figura 1 se muestra una primera realización de un proceso de acuerdo con la presente invención. La primera etapa 10 es la rotura de las células en cuestión para liberar el plásmido u otro material de ADN para recuperación. Esto se puede hacer en una variedad de formas. El método más común es el uso del procedimiento de lisis alcalina en el cual un material alcalino y un detergente que contiene un fluido acuoso como hidróxido de sodio y SDS (dodecil sulfato de sodio) se introduce en una disolución de células resuspendidas provocando la lisis de las células.
Las células lisadas se filtran después 11 a través de una o más membranas de filtración microporosas o membranas de filtración gruesa para eliminar los desechos celulares tales como las paredes celulares, las proteínas desnaturalizadas y ADN cromosómico y otros componentes celulares mayores.
El filtrado se recoge a continuación, bien sobre la parte superior de una membrana de ultrafiltración, si el proceso se hace en serie, o en un contenedor apropiado si las etapas se hacen por separado.
El filtrado se filtra después 12 a través de una o más membranas de ultrafiltración para recoger los plásmidos u otro ADN sobre la parte superior de la membrana de ultrafiltración. El plásmido u otro ADN se recoge después para el uso 13.
Se pueden utilizar una o más membranas de microfiltración o materiales de filtración gruesa. Típicamente, se utiliza uno, sin embargo, se puede usar una serie de dos o más membranas para eliminar todos los desechos celulares, especialmente cuando la cantidad de residuos es alta o la primera membrana tiende a atorarse rápidamente. Si se utilizan múltiples membranas, se pueden utilizar por separado o dispuestas en serie una con otra, si se disponen en serie, se prefiere que el tamaño de poro nominal de cada capa de membrana sucesiva sea el mismo o menor. En esta realización, se puede utilizar un filtro grueso seguido de un filtro microporoso, dos filtros gruesos o dos filtros microporosos.
Típicamente, los tamaños de poro nominales de estas membrana o membranas microporosas para esta aplicación están en el intervalo de aproximadamente 0,01 micras a aproximadamente 100 micras, preferiblemente de aproximadamente 0,05 micras a aproximadamente 75 micras y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 micras.
Típicamente, los filtros gruesos tienen tamaños de poro nominales desde aproximadamente 100 micras a aproximadamente 1.000 micras, preferiblemente desde aproximadamente 100 micras a aproximadamente 500 micras y más preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 micras.
La membrana o membranas de microfiltración y/o de filtración gruesa se pueden formar a partir de cualquier polímero natural o sintético, papel, materiales cerámicos o metal tal como acero inoxidable o níquel. Los polímeros preferidos útiles para la fabricación de membranas incluyen, pero no están limitados a, nitrocelulosa, celulosa regenerada, acetato de celulosa, polisulfonas incluyendo polisulfona, polietersulfona, polifenilsulfonas y poliarilsulfonas, fluoruro de polivinilideno, poliolefinas tales como polietileno de peso molecular ultraalto, polietileno de baja densidad y polipropileno, nylon y otras poliamidas, PTFE, polímeros fluorados termoplásticos tales como poli(TFE-co-PFAVE), policarbonatos o membranas rellenas de partículas tales como membranas EMPORE®, disponibles en 3M, Minneapolis, Minnesota. Las membranas pueden ser membranas porosas de fundición, materiales tejidos o no tejidos o materiales porosos formados por otros métodos convencionales de fabricación de membranas tales como ataque químico. Todas estas membranas son bien conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente en una variedad de fuentes incluyendo Millipore Corporation of Bedford, Massachusetts.
Si se desea, estas membranas se pueden tratar para hacerlas hidrofílicas. Dichas técnicas son bien conocidas e incluyen pero no están limitadas al injerto, entrecruzamiento o simplemente polimerización de materiales hidrofílicos o recubrimientos de las superficies de las membranas.
La microfiltración o la etapa de filtración gruesa puede iniciarse con algún proceso convencional tal como fuerza centrífuga, gravedad o un diferencial de presión constante (tal como presión positiva o vacío) como se enseña en el documento de patente WO 00/66723.
Por "diferencial de presión constante", se entiende bien una presión positiva o una presión negativa (o vacío). A diferencia de la presión del método centrífugo en el cual la presión es siempre decreciente con el tiempo debido a una reducción en la altura de cabeza del líquido, en un proceso a diferencial de presión constante la presión que actúa sobre el líquido puede permanecer constante a lo largo del ciclo de filtración. Adicionalmente, cuando la presión es independiente de la altura de la cabeza del líquido sobre el cual está actuando puede incluso aumentarse a lo largo del tiempo para llevar el proceso de filtración a término. También está dentro de esta definición el tener una disminución en la presión a lo largo del tiempo si se desea, sin embargo, a diferencia de en la centrifugación, esta disminución se controla y es independiente de la altura de cabeza del líquido reduciendo así o eliminando una disminución no intencionada del flujo.
En este método, una fuerza de diferencial de presión constante se aplica al líquido en el equipo y el diferencial de presión constante se convierte en la fuerza impulsora del proceso de filtración en vez de la tradicional fuerza de la gravedad de la centrifugación. Cuando se utiliza un diferencial de presión positivo (presión positiva), se aplica típicamente en la cara superior del líquido para conducir el líquido a través de la membrana. Cuando se utiliza un diferencial de presión negativo o vacío, la presión se aplica típicamente en la cara aguas debajo de la membrana para que así actúe sobre el fondo del líquido y lo conduzca a través de la membrana.
El nivel de fuerza (positiva o negativa) aplicado depende de un número de factores entre los que están: la cantidad de muestra que va a ser filtrada, el tipo de membrana utilizada (el tamaño de poro o punto de corte molecular de la membrana, su fuerza y grosor), el área activa de filtración de la membrana, la velocidad a la cual tiene que tener lugar la filtración y el nivel de polarización de la muestra.
A diferencia de la filtración centrífuga, la filtración a diferencial de presión constante es completamente independiente de la capacidad de alcanzar y mantener un altura de cabeza, queriendo esto decir que el proceso no está típicamente sometido a una disminución de flujo para concentraciones no polarizantes de soluto. Típicamente, con pequeños volúmenes, la consecuencia es que factores de mucha mayor concentración son alcanzables con ultrafiltración llevada a cabo con diferencial de presión constante, en relación con los que se pueden alcanzar mediante centrifugación, dentro del mismo periodo de tiempo.
Normalmente, los volúmenes de líquido que en este proceso se pueden utilizar variarán, con un valor alto de aproximadamente 2 mililitros. Más típicamente se utiliza con volúmenes de menos de 1 mililitro y preferiblemente por debajo de los 0,5 mililitros (500 microlitros). Hay un límite superior al cual, debido a la suficiente altura de cabeza, la centrifugación es justamente tan rápida como el proceso a diferencial de presión constante (el nivel exacto depende entre otras cosas, del fluido utilizado y el nivel de diferencial de presión constante y centrifugación utilizados). Sin embargo, como se explicará más adelante conjuntamente con diafiltración, incluso cuando las velocidades son claramente más rápidas para la centrifugación, hay otras razones de peso para todavía utilizar el proceso de la presente invención en lugar de la centrifugación puesto que elimina o reduce la necesidad de diafiltración.
A volúmenes menores, está claro, sin embargo que el uso del diferencial de presión constante es claramente más rápido que la centrifugación. El punto al cual el proceso a diferencial de presión constante es más rápido que la centrifugación se denomina a partir de ahora como de "punto de ruptura". Cuando se utilizan volúmenes pequeños, aproximadamente 0,300 mililitros, el presente proceso es aproximadamente un 60% más rápido que la centrifugación.
El efecto obtenido puede variarse variando el nivel que el diferencial de presión constante tiene sobre el proceso. Por ejemplo, un incremento de 3,5 veces (3,5X) en el diferencial de presión constante sobre el que normalmente se aplica (1X) tiene como resultado un incremento de casi 6 veces (6X) en la velocidad de filtración. Adicionalmente, el punto de ruptura tiene lugar a aproximadamente 1 minuto con el diferencial aumentado (3,5X) en comparación con los 7 minutos a que tiene lugar con un diferencial de presión constante sin cambiar (1X).
La disminución del flujo puede ocurrir cuando se filtran materiales que tienen un alto nivel de características polarizantes. En esos casos, se puede observar alguna disminución del flujo durante la filtración mediante el presente proceso, pero esto es independiente de la altura de cabeza y tiene que ver con las propiedades inherentes al material que se está filtrando. Esto significa que se pueden utilizar menores cantidades de muestra de partida y se pueden obtener altos niveles de ultrafiltración y recuperación a velocidades satisfactorias incluso con la presencia de dichos materiales polarizantes, algo que no siempre es posible con el proceso centrífugo.
El diferencial de presión constante puede ser negativo, por ejemplo, a presión reducida (por ejemplo, por debajo de la atmosférica o un vacío) o positivo (por ejemplo, por encima de la atmosférica).
Típicamente se puede utilizar, un diferencial de presión constante negativo o una fuerza de vacío desde aproximadamente 16,9 kPa a 91,4 kPa. Más preferiblemente se puede utilizar desde 33,8 kPa hasta 91,4 kPa. El nivel de la fuerza de vacío se puede variar fácilmente por el usuario para ajustar los parámetros deseados del sistema, la velocidad de ultrafiltración deseada y la muestra que se está utilizando.
Típicamente, se puede utilizar un diferencial de presión constante positivo desde aproximadamente 35,71 kPa a aproximadamente 571,4 kPa. Se pueden utilizar mayores presiones con equipos que tengan la resistencia para soportar dichas presiones. Más preferiblemente, se puede utilizar desde aproximadamente 285,71 kPa a aproximadamente 428,57 kPa. El nivel de presión positiva se puede variar fácilmente por el usuario para ajustar los parámetros deseados del sistema, la velocidad de ultrafiltración deseada y la muestra que él o ella esté utilizando.
La cantidad de flujo de partida que va a filtrarse puede variar ampliamente. Sin embargo, este proceso se ha encontrado particularmente útil con pequeños volúmenes de líquido que típicamente no pueden generar o mantener una adecuada altura de cabeza. Dichos volúmenes generalmente están por debajo de aproximadamente 1.000 microlitros, preferiblemente menos de aproximadamente 500 microlitros e incluso pueden ser menores de 1 microlitro.
Una ventaja adicional del proceso es que la necesidad de diafiltración (reducción de sales o contaminantes por diluciones repetidas en agua ultrapura o disolvente, seguidas por filtración centrífuga para eliminar las impurezas disueltas y las sales) se puede reducir o eliminar, haciendo este proceso de particular interés para el área de investigación biológica en la que dichas etapas de diafiltración requieren mucho tiempo y, si no completamente, pueden distorsionar los resultados obtenidos.
Se ha sabido que un proceso de centrifugación en un solo paso no eliminará todas las sales y otras impurezas de una muestra biológica. Por tanto, el protocolo normal es diluir el retenido en agua ultrapura o en un disolvente y re-centrifugar el material una o más veces para eliminar un volumen suficiente de estas impurezas.
Se ha descubierto que en una centrifugación normal, cuando el volumen del líquido por encima de la membrana queda por debajo de cierto nivel, típicamente por debajo de 1 microlitro de volumen, la evaporación del líquido es el fenómeno primario responsable de la eliminación del líquido, no la ultrafiltración. Esto es debido a la baja altura de cabeza que se obtiene como resultado cuando una pequeña presión, en caso de que haya alguna, se aplica al líquido restante, teniendo lugar por tanto, una pequeña filtración, en caso de que haya alguna. A causa de esto, cualquier impureza se deshidrata simplemente sobre la superficie del filtro de diafiltración. Cuando se añade un líquido reconstituyente al retenido, estos materiales simplemente se disuelven en el líquido reconstituyente y permanecen con el retenido. Esto explica la necesidad de varias etapas de diafiltración.
Se ha descubierto que utilizando el proceso a diferencial de presión constante, la filtración sigue siendo el método dominante para la eliminación de estas impurezas (puesto que es independiente de la altura de cabeza para funcionar), provocando por tanto, que las impurezas pasen a través de la membrana y abandonen el retenido en un nivel mucho mayor al que se puede conseguir con la centrifugación. Esencialmente, todas las impurezas se eliminan con el proceso actual en un solo paso mientras que a menudo, menos del 90% de todas las impurezas se eliminan con un solo paso utilizando el proceso de centrifugación tradicional. Esto le permite a uno reducir o eliminar la necesidad de etapas de diafiltración después de la filtración y proporciona un producto más puro para su uso posterior.
Como se ha mencionado anteriormente, este proceso es particularmente útil cuando se parte de pequeños volúmenes puesto que el proceso es más rápido que la centrifugación. Adicionalmente, cuando lo que se desea es eliminar impurezas de una muestra biológica, este proceso se puede utilizar con muestras de partida mayores, incluso cuando el tiempo de filtración puede ser mayor que el de un proceso de centrifugación puesto que se tendrá como resultado un retenido más puro con menos, o ninguna, etapas de diafiltración. El ahorro de tiempo global (filtración y diafiltración) puede justificar el aparente aumento del tiempo de filtración.
El filtrado de la etapa de microfiltración contiene los plásmidos, otros componentes celulares y fluidos celulares, así como material lisado o fluidos acuosos utilizados bien en la etapa de lisado, bien en la de microfiltración.
El filtrado es a continuación sometido a un proceso de ultrafiltración. El proceso elimina sustancialmente todos los otros componentes del filtrado, dejando los plásmidos sobre la superficie de la membrana o membranas de ultrafiltración cuando se recojan para un uso posterior. Se puede utilizar cualquier proceso usado para llevar a cabo ultrafiltración, incluyendo centrifugación, presión positiva o presión negativa, sin embargo, se prefiere que se utilice un diferencial de presión constante, bien positivo o bien negativo, o una combinación de ambos.
Se pueden utilizar una o más membranas de ultrafiltración, aunque una es típicamente todo lo que se necesita.
La membrana o membranas de ultrafiltración deberían tener un peso molecular de corte nominal (los materiales por encima del peso molecular establecido permanecerán predominantemente aguas arriba de la membrana, mientras que materiales menores que el peso molecular establecido pasarán a través de la membrana) de aproximadamente 3.000 Dalton a aproximadamente 300 kiloDalton sobre el tamaño de los plásmidos u otro ADN que se desea recuperar.
Las membranas de ultrafiltración (UF) que pueden ser utilizadas en este proceso pueden estar formadas a partir del grupo que incluye, pero que no está limitado a, polisulfonas, incluyendo polisulfona, polietersulfona, polifenilsulfonas y poliarilsulfonas, fluoruro de polivinilideno, y celulosa y sus derivados, tales como nitrocelulosa y celulosa regenerada. Estas membranas incluyen típicamente una capa soporte que está formada generalmente por una estructura altamente porosa. Materiales típicos para estas capas soporte incluyen varios materiales no tejidos tales como polietileno o polipropileno spunbonded, papel o vidrio o materiales microporosos formados con el mismo o diferente polímero que el de la membrana propiamente dicha. Dichas membranas son bien conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente en una variedad de proveedores tales como Millipore Corporation of Bedford, Massachusetts.
Las membranas UF preferidas incluyen celulosa regenerada o membranas de polisulfona, tales como las membranas YM^{TM} o Biomax^{TM} disponibles en Millipore Corporation of Bedford, Massachusetts.
Tanto las membranas de microfiltración como las de ultrafiltración se pueden utilizar en la forma de una membrana o varias membranas que se pueden hacer funcionar simultáneamente. Por ejemplo, una única membrana puede sujetarse en un soporte de filtro, tal como el Soporte de Filtro de Acero Inoxidable para Análisis, nº de Catálogo XX30 012 40 de Millipore o una unidad Microcon® de Millipore. Un equipo que contiene varias membranas incluye el uso de varias unidades Microcon® o una placa de múltiples pocillos como la placa MULTISCREEN^{TM} disponible en Millipore en varios números de pocillos, típicamente de 96 ó 384 pocillos por placa. Otros diseños de unidades de membrana de múltiples pocillos pueden tener de 2 a más de 1.536 pocillos por placa. La elección entre una unidad individual y una unidad múltiple y el número de membranas en la unidad múltiple depende de la aplicación y la cantidad de plásmido que se va a recuperar. Típicamente, la cantidad necesaria es bastante más baja en volumen total y se prefieren las pequeñas unidades de filtro individual tales como una unidad MICROCON® o unidades de múltiples pocillos de 96 ó 384, tal como las placas MULTISCREEN®.
La membrana o membranas de microfiltración y la membrana o membranas de ultrafiltración pueden ser simétricas o asimétricas en cuanto a la forma de poro (morfología) a lo largo del espesor del filtro. Por simétrico se entiende que el tamaño de poro varía poco de una a otra superficie de la membrana. Por asimétrico se entiende que el tamaño de poro varía de un lado al otro de alguna forma. Las membranas asimétricas vienen en una variedad de formas y configuraciones, pero generalmente tienen una morfología de poro desde una superficie a la otra seleccionada del grupo consistente en porción simétrica, asimétrica, isotrópica seguida por porción asimétrica, porciones asimétricas divergentes tales como en las que el poro más pequeño de la membrana está en el interior del espesor de la estructura y porciones asimétricas convergentes tales como en las que el poro más pequeño está en una superficie y el tamaño de poro en la convergencia de las dos capas asimétricas es menor que los poros en cualquiera de las capas asimétricas adyacentes. Cuando se trata de la forma de tejido o de no tejido, pueden tener un tamaño de poro que varía ampliamente y que no encaja clásicamente con la definición de simétrica o asimétrica. Se clasifican a menudo como filtros en profundidad.
La Figura 2 muestra un segundo proceso preferido de la presente invención. En este proceso, las células se rompen en la etapa 20 como se trató en el proceso de la Figura 1, y se filtran en serie a través de una o más membranas de filtración MF y/o de filtración gruesa de la etapa 21 y a continuación, a través de una o más membranas UF del paso 22 mediante un diferencial de presión constante positivo. La presión positiva se puede aplicar únicamente a la membrana o membranas de filtración MF y/o de filtración gruesa y también se aplicará después a la membrana UF si se adaptan a un equipo como el mostrado en la Figura 5 y tratado más adelante. Alternativamente, la presión positiva se puede aplicar separadamente a cada etapa. Los plásmidos son después recuperados de la superficie de la etapa de filtración UF 23.
Presiones típicas apropiadas para llevar a cabo el proceso, oscilan entre 10 kPa y aproximadamente 690 kPa, preferiblemente de aproximadamente 17,00 kPa a aproximadamente 85,00 kPa. Si se utilizan aplicaciones separadas de presión en las dos etapas de filtración 21 y 22, después la presión aplicada en una etapa no necesita ser la misma que la aplicada en la otra etapa.
La Figura 3 muestra otra realización del presente proceso. En esta realización, la etapa de rotura de células 30 es idéntica a la de la realización de la Figura 1. Las etapas de microfiltración 31 y de ultrafiltración 32 se llevan a cabo ambas mediante el uso de un diferencial de presión constante negativo (DPC) en la cara aguas abajo de cada membrana. Sin embargo, a diferencia de la realización de la Figura 2, la presión negativa tiene que aplicarse separadamente a cada una de las etapas 31, 32. Esto es debido a la naturaleza de las membranas UF disponibles hoy en día, la cual no proporciona suficiente fuerza para penetrar suficientemente a través de la membrana UF y proporcionar una fuerza suficiente sobre la membrana de filtración MF y/o de filtración gruesa. Sin embargo, en caso de que una tal membrana UF fuera desarrollada para permitir que esto ocurriera, es intención de esta solicitud incluirla dentro del proceso aquí reivindicado. Plásmidos u otro ADN se recuperan en la etapa 33.
La Figura 4 muestra otro proceso preferido de la presente invención. En este método, la etapa de rotura de células 40 tiene lugar, como se muestra en la realización de la Figura 1, la etapa de microfiltración 41 se realiza por presión positiva y la etapa de ultrafiltración 42 se realiza por diferencial de presión constante negativo. Los plásmidos y otro ADN se recogen después en la etapa 43.
La Figura 5 muestra otro proceso preferido en el cual la rotura de las células 50 tiene lugar como se muestra en la realización de la Figura 1, la etapa de microfiltración 51 se realiza por un diferencial de presión constante negativo y la etapa de ultrafiltración 52 se efectúa por un diferencial de presión constante positivo. Los plásmidos u otro ADN se recuperan en la etapa 53.
Otras fuerzas de proceso tales como centrifugación también pueden aplicarse en alguna de las etapas anteriores.
La Figura 6 muestra un aparato apropiado para llevar a cabo el proceso de las Figuras 1-5. En esta figura hay una primera placa 60 y una segunda placa 61 dispuestas de tal manera que la placa 60 está por encima de la placa 61 y sellada a la misma, de forma que se puede retirar. La placa superior 60 tiene una cubierta 62 a la cual está conectada una toma 63 para la aplicación de un diferencial de presión constante positivo de una fuente (no mostrada) tal como aire comprimido. La toma se abre y cierra selectivamente a la fuente de diferencial de presión constante positivo por ejemplo, mediante una válvula 64 que se muestra adyacente a la toma 63, aunque se entiende que la válvula puede estar localizada en otras posiciones entre la cubierta y la fuente de diferencial de presión o que se pueden utilizar otros métodos conocidos para variar o parar el aporte a la toma.
La placa superior 60 contiene una o más membranas, en este ejemplo, se utiliza una membrana 65 seleccionada de membranas de filtración gruesa y membranas de microfiltración o combinaciones de ellas.
La placa inferior 61 contiene una o más membranas de ultrafiltración 66. Una junta de goma 67 forma el sello eliminable entre las placas aunque se pueden utilizar otros medios de sellado conocidos en la técnica. Como se muestra, está pegado a la placa inferior 61, aunque puede estar pegado a la placa superior 60 o puede estar separado tanto de la placa 60 como de la 61.
Un recipiente para desechos 68 se coloca por debajo de la placa inferior para recoger cualquier filtrado a través de la placa del fondo. Puede estar unido directamente a un sumidero (no mostrado) o simplemente, ser un vertedero a través del cual se pasa el filtrado y después se tira separadamente a continuación.
Se pueden utilizar grapas, tornillos u otros sistemas de sujeción para sujetar las dos placas juntas durante su uso si se desea.
Como se muestra, ambas placas 60 y 61 muestran un diseño de pocillo único. Se entiende que pueden ser usadas en su lugar, placas que tienen múltiples pocillos, conteniendo cada pocillo una membrana. Las placas que contienen 8, 12, 96, 384 y 1.536 pocillos o más están disponibles normalmente en proveedores tales como Millipore Corporation y otros y son bien conocidas.
El dispositivo se utiliza como sigue. Las células de interés son lisadas, bien en la placa superior o bien separadamente, y después transferidas a la placa superior. La placa superior ya ha sido unida a la placa inferior de forma sellada, por ejemplo mediante el uso de la junta de goma y la placa inferior se une al vertedero o sumidero. La cubierta está unida a la toma conectada a un suministrador de diferencial de presión constante positivo tal como un equipo de aire comprimido. La presión se aplica para forzar a todo el líquido y los pequeños constituyentes a través de la membrana de la placa superior y sobre la superficie de la membrana UF de la placa inferior. El constituyente líquido es después forzado a través de la membrana UF por la misma presión y los plásmidos u otro ADN quedan sobre la superficie superior de la membrana UF. La presión se corta y la cubierta y la placa superior se retiran y se desechan. Los plásmidos u otro ADN se recuperan después de la superficie superior de la membrana sobre la placa inferior, por ejemplo mediante rehidratación de los plásmidos u otro ADN y tomándolos con pipeta de la superficie de la membrana para posteriores procesos y análisis.
La configuración anterior funcionará cuando se utilice una presión positiva, bien como un diferencial de presión constante, centrifugación u otra. No funcionará con procesos que sólo utilicen presión negativa puesto que la fuerza necesaria para provocar el flujo a través de la membrana UF de la placa inferior y la placa superior sería tan grande que la membrana UF se rompería. De la misma manera, no funcionará con métodos de fuerza mixta puesto que sólo tiene una toma para el aporte de la fuerza impulsora.
La Figura 7 muestra un segundo aparato apropiado para llevar a cabo el proceso de la Figura 1-5 cuando se utilizan bien fuerzas negativas tales como vacío en ambas etapas de filtración o una mezcla de presión positiva en una etapa y presión negativa en la otra etapa. En esta figura se disponen una primera placa 80 y una segunda placa 81 de manera que la placa 80 esté por encima de la placa 81 y esté sellada, de forma que se pueda quitar, a ella aunque esto no se requiera. La placa superior 80 tiene una cubierta 82 a la cual se conecta una primera toma 83 para la aplicación de un diferencial de presión constante desde una fuente (no mostrada) tal como aire comprimido o vacío. La primera toma 83 se abre y se cierra selectivamente a la fuente del diferencial de presión constante positivo tal como a través de una válvula 84 que se muestra adyacente a la toma 83, aunque se entiende que la válvula puede estar localizada en otras posiciones entre la cubierta y la fuente del diferencial de presión o que se pueden utilizar otros sistemas conocidos para variar o interrumpir el aporte a la toma 83.
La placa superior 80 contiene una o más membranas, en este ejemplo una membrana 85 seleccionada entre membranas de filtración gruesa y membranas de microfiltración o combinaciones de ellas.
La placa inferior 81 contiene una o más membranas de ultrafiltración 86. Una junta de goma 87 forma el sello eliminable entre las placas aunque se pueden utilizar otros sistemas de sellado conocidos en la técnica. Como se muestra, está unida a la placa inferior 81, aunque se puede unir a la placa superior 80 o puede estar separada tanto de la placa 80 como de la 81.
Un receptáculo para residuos 88 se coloca debajo de la placa inferior para recoger cualquier filtrado a través de la placa del fondo. Se puede unir directamente a un drenaje (no mostrado) o simplemente ser un sumidero a través del cual se pasa el filtrado y después se elimina separadamente.
Una segunda toma 89 se conecta a la placa inferior 81 y se utiliza para proporcionar la fuerza impulsora de filtración a la placa inferior. La segunda toma 89 se abre y cierra selectivamente a la fuente del diferencial de presión constante positivo mediante por ejemplo una válvula 90 mostrada adyacente a la toma 89, aunque se entiende que la válvula puede estar localizada en otras posiciones entre la cubierta y la fuente del diferencial de presión o que se pueden utilizar otros sistemas para variar o interrumpir el aporte a la toma 89.
Las dos tomas se pueden utilizar simultáneamente o por etapas (primera toma y después la segunda toma) con fuerzas similares o diferentes (por ejemplo, ambas positivas o ambas negativas o una positiva y una negativa).
También se pueden utilizar grapas, tornillos u otros sistemas de sujeción para mantener unidas las dos placas durante su uso si se desea.
Como se muestra, las dos placas 80 y 81 muestran un diseño de un único pocillo. Se entiende que se pueden utilizar en su lugar, placas que tengan múltiples pocillos, conteniendo cada pocillo una membrana. Placas conteniendo 8, 12, 96, 384, 1.536 pocillos o más están disponibles habitualmente por proveedores tales como Millipore Corporation y otros que son bien conocidos.
El dispositivo se utiliza como sigue. Las células de interés son lisadas, bien en la placa superior, o bien de forma separada y después transferidas a la placa superior. La placa superior ya ha sido unida a la placa inferior de forma sellada, por ejemplo mediante el uso de la junta de goma y la placa inferior está unida al sumidero o drenaje. La cubierta se une y la toma se conecta a una fuente de diferencial de presión constante positivo o negativo tal como una fuente de aire comprimido o un vacío. La presión se aplica para forzar a todo el líquido y los pequeños constituyentes a través de la membrana de la placa superior y sobre la superficie de la membrana UF de la placa inferior. El constituyente líquido es a continuación forzado a través de la membrana UF mediante la fuerza impulsora de filtración suministrada a través de la segunda toma y quizá el mismo tipo de fuerza que se usa en la placa superior (por ejemplo, siendo ambas un diferencial de presión constante negativo o siendo ambas un diferencial de presión constante positivo) o diferente (por ejemplo, siendo una un diferencial de presión constante negativo y siendo la otra un diferencial de presión constante positivo). La fuerza se puede aplicar primero a la placa superior y después a la placa inferior (en serie) o se puede aplicar al mismo tiempo (simultáneamente). Los plásmidos u otro ADN se depositan sobre la superficie superior de la membrana UF. La fuerza impulsora o presión se interrumpe desde la placa inferior si se hace en serie o desde ambas placas si se hace simultáneamente y la cubierta y la placa superior se retiran y eliminan. Los plásmidos u otro ADN después se recuperan de la superficie superior de la membrana sobre la placa inferior, por ejemplo mediante rehidratación de los plásmidos u otro ADN y tomándolos con pipeta de la superficie de la membrana para posteriores procesos o análisis.
Ejemplo 1 Método de diferencial de presión constante
Se inocularon E. Coli JM109 transportando pUC19 en alícuotas de 1 mililitro de 2X LB más el antibiótico apropiado en un bloque estéril de 96 pocillos profundos (2 ml de capacidad) (Beckman-Coulter, Fullerton, CA). Las placas se cubrieron y se guardaron en una incubadora. Fueron incubados a 37ºC a 320 r.p.m. durante 20 horas.
Los cultivos del bloque de pocillos profundos se cubrieron con cinta adhesiva para placas transparente (Millipore: MATA09600), y se centrifugaron a 1.500xg durante 5 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante del cultivo se decantó inmediatamente en un contenedor para una eliminación adecuada. Las placas se invirtieron y se pegaron firmemente con cinta adhesiva sobre varias capas de toallas de papel sobre la plataforma para eliminar el sobrenadante del cultivo residual.
Los gránulos se resuspendieron en 80 \mul de Disolución I (30 mM de glucosa; 15 mM de Tris-HCl, pH 8; 30 mM Na_{2}EDTA; 60 \mug/ml de ribonucleasa A, todo disponible en Sigma, St. Louis, Mo.) Después, la Disolución II (0,2 N NaOH; 1% SDS, disponible en Sigma) se añadió y se mezcló inmediata y vigorosamente con una placa agitadora (velocidad máxima) durante 1 minuto para lisar las células. La mezcla se incubó durante 2 minutos adicionales a temperatura ambiente. Se añadieron 80 \mul de Disolución III (3,6 M potasio; 6 M acetato, pH\sim5, disponible en Sigma) y se mezclaron inmediata y vigorosamente (velocidad máxima) con una placa agitadora durante 2 minutos.
La placa UF se colocó en el fondo del colector de vacío (Millipore: MAVM 0960R, o equivalente). El lisado se eliminó después sumergiendo el extremo de la pipeta hacia abajo por los laterales de los pocillos profundos a través del lisado hasta alcanzar el fondo. El fluido se tomó con la pipeta arriba y abajo tres veces. 180 \mul de lisado, se eliminaron del fondo de cada pocillo profundo y se depositaron en el correspondiente pocillo de una placa de aclarado de lisado MultiScreen^{TM}-NA (Millipore: MANANLY50).
Penetrando en los mismos pocillos una segunda vez, se elimina cualquier lisado residual de la placa de pocillos profundos y se transfiere a los correspondientes pocillos de la placa de aclarado de lisado. La placa se colocó en la parte de arriba del colector y el vacío se ajustó a 27,0 kPa. El vacío se aplicó durante 3 minutos, extrayendo el lisado a través de la placa y hacia la placa UF. La primera placa se descartó.
La placa UF se retiró del interior del colector y se colocó en la parte superior del colector vacío y se aplicó un vacío completo (81,0 kPa) durante 8 minutos. El filtrado se envió a residuos.
Se añadieron 200 \mul de agua MilliQ® a cada pocillo de la placa. Se aplicó vacío completo durante 4 minutos con el filtrado enviado directamente a residuos. Para disolver el plásmido, se añadieron 50 \mul de tampón TE (10 mM Tris-HClm pH 8; 1 mM Na_{2}EDTA, disponible en Sigma) a cada pocillo de la placa UF. Para recuperar el plásmido, se resuspendió tomándolo con la pipeta arriba y abajo 10 veces con un trasvasador de líquidos, y se transfirió a una microplaca de fondo en v.
El rendimiento relativo del plásmido u otro ADN se cuantificó mediante ensayo fluorométrico. La calidad relativa de la secuencia se determinó mediante ET Terminator Sequencing (Amersham Pharmacia Biotech) seguido por electroforesis capilar en el sistema de secuenciación MegaBACE® 1000 (Amersham Pharmacia Biotech).
Ejemplo 2
Se inoculó E. Coli JM109 portando pUC19 en alícuotas de 1 mililitro de 2X LB más el antibiótico apropiado en bloques estériles de 96 pocillos profundos (2 ml de capacidad). Las placas se cubrieron y se guardaron en la incubadora y se incubaron a 37ºC a 320 r.p.m. durante 20 horas.
Los cultivos del bloque de pocillos profundos se cubrieron con cinta adhesiva para placas transparente (Millipore: MATA09600), y se centrifugaron a 1.500xg durante 5 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante del cultivo se decantó inmediatamente a un contenedor para eliminarlo adecuadamente. Las placas se invirtieron y se pegaron con cinta adhesiva firmemente sobre varias capas de toallas de papel sobre la plataforma para eliminar el sobrenadante del cultivo residual.
Los gránulos se resuspendieron en 80 \mul de Disolución I primero, utilizando una placa agitadora o vortex, y después mediante mezclado con pipeta. Se añadieron 80 \mul de Disolución II y se mezclaron inmediata y vigorosamente con una placa agitadora (máxima velocidad) durante 1 minuto. Después se incubó durante 2 minutos adicionales a temperatura ambiente. Se añadieron 80 \mul de Disolución III y se mezclaron inmediata y vigorosamente (máxima velocidad) con una placa agitadora durante 2 minutos.
Separadamente, se añadieron 150 \mul de Disolución Ligante a cada pocillo de una placa MultiScreen^{TM} (Millipore: MAFB N0B 50). La placa FB se colocó en el fondo de un colector de vacío (Millipore: MAVM 096 0R, o equivalente).
Para eliminar el lisado, se sumergieron los extremos de la pipeta por los laterales de los pocillos profundos a través del lisado hasta alcanzar el fondo y el lisado se tomó con la pipeta arriba y abajo tres veces. Se retiraron 180 \mul de lisado del fondo de cada pocillo profundo y se depositaron en el correspondiente pocillo de una placa de aclarado de lisado MultiScreen^{TM}-NA (Millipore: MANANLY50). Penetrando en los mismos pocillos una segunda vez, cualquier lisado residual se eliminó de la placa de pocillos profundos y se transfirió a los correspondientes pocillos de la placa de aclarado de lisado MultiScreen^{TM}.
La placa NA se colocó en la parte de arriba del colector, y el vacío se ajustó a 27,0 kPa. El vacío se aplicó durante 3 minutos, extrayendo el lisado a través de la placa NA en la placa FB llena previamente con la Disolución Ligante. La placa NA se descargó.
La placa FB se eliminó del interior del colector y el lisado aclarado se mezcló minuciosamente con la Disolución Ligante tomándolo rápidamente con pipeta arriba y abajo varias veces. La placa FB se volvió a colocar sobre la parte superior del colector vacío y se aplicó vacío completo durante 1 minuto. El filtrado se envió a residuos. En este punto el plásmido ADN se unió ahora a la placa FB.
Se añadieron 200 \mul de etanol al 80% (grado reactivo) a cada pocillo de la placa FB y se aplicó vacío completo durante 1 minuto. El filtrado se envió directamente a residuos. Esta etapa se repitió aplicando vacío durante 3 minutos.
La placa FB se eliminó del colector. El fondo de la placa se limpió sobre un material absorbente, libre de gasa y limpio. La placa FB se colocó en la parte de arriba de una placa microtiter convencional con guías de alineamiento para centrífuga (Millipore: MACF09604) y se centrifugó a 1000xg durante 10 minutos hasta sequedad. Para disolver el plásmido, se añadieron 70 \mul de tampón TE a cada pocillo de la placa FB, con la deposición del TE cerca del centro de cada pocillo. El plásmido se eluyó mediante centrifugación a 1000xg durante 5 minutos (el volumen de eluído es típicamente 45 \mul).
Resultados
Ejemplo 1 Ejemplo 2
Rendimiento relativo del plásmido
2X 1X
Resultados relativos de la secuenciación
Comparable Comparable
Tiempo total de proceso 33 minutos 50 minutos
La presente invención proporciona muchas ventajas sobre la técnica previa. Primero, reduce el número de etapas y el tiempo requerido para recuperar los plásmidos u otro ADN. Segundo, lo hace sin la introducción de contaminantes como el etanol. Adicionalmente, recuperan cantidades sustancialmente mayores de plásmido u oro ADN que el sistema previo, típicamente 20 o 30% más de media. Además, cuando se utiliza con una fuerza impulsora de diferencial de presión constante en la etapa de UF, el plásmido recuperado es más puro que el que se obtiene mediante el proceso convencional, a menudo no contiene sales u otras impurezas, eliminando así la necesidad de múltiples etapas de diafiltración. La recuperación del plásmido u otro ADN de la parte superior de la placa de ultrafiltración, y la eliminación de la centrifugación hacen a este método más apropiado para la automatización. Finalmente, a diferencia del proceso previo de retención/elución, el cual tiene una capacidad limitada por la cantidad de sitios activos formados sobre la fibra de vidrio, la presente invención tiene esencialmente capacidad ilimitada y puede sellarse hasta recoger cantidades de plásmido u otro ADN desde cantidades de femtogramo a miligramo.

Claims (23)

1. Un proceso para recuperar plásmidos u otro ADN que comprende las etapas de: a) romper las paredes de las células para liberar los componentes celulares incluyendo plásmidos u otro ADN; b) filtrar los componentes celulares a través de una o más membranas seleccionadas del grupo consistente en microfiltración, filtración gruesa y combinaciones de las mismas y recoger el filtrado; c) filtrar el filtrado de b) a través de una o más membranas de ultrafiltración para dejar los plásmidos u otro ADN como un retenido sobre la superficie superior de una o más membranas de ultrafiltración; y d) recuperar los plásmidos u otro ADN de la superficie superior de la membrana de ultrafiltración, caracterizado porque al menos una de las etapas de filtración de b) y c) se realiza mediante diferencial de presión constante.
2. El proceso de la reivindicación 1, en el que las paredes de las células se rompen mediante un proceso de lisis alcalina, y se filtran a través de una o más membranas que tienen un intervalo de tamaño de poro nominal de 0,1 micras a 50 micras y una o más membranas de ultrafiltración que tienen un punto de corte de peso molecular nominal de desde 3.000 Dalton hasta 300 kiloDalton.
3. El proceso de la reivindicación 1, en el que las etapas b) y c) se llevan a cabo mediante un diferencial de presión constante positivo.
4. El proceso de la reivindicación 1, en el que las etapas b) y c) se llevan a cabo mediante un diferencial de presión constante negativo.
5. El proceso de la reivindicación 1, en el que la etapa b) se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado del grupo consistente en centrifugación y diferencial de presión constante positivo y la etapa c) se lleva a cabo mediante diferencial de presión constante negativo.
6. El proceso de la reivindicación 1, en el que la/s una o más membrana o membranas de microfiltración están formadas a partir de un material seleccionado del grupo consistente en polímeros naturales o sintéticos, materiales cerámicos y metal y la membrana o membranas de ultrafiltración están formadas a partir de un material seleccionado del grupo consistente en polisulfonas, polietersulfonas, polifenilsulfonas, poliarilsulfonas, fluoruro de polivinilideno, celulosa y derivados celulósicos.
7. El proceso de la reivindicación 1, en el que una o más membrana o membranas de ultrafiltración tienen una morfología de poro de una superficie a la otra seleccionada del grupo consistente en porción simétrica, asimétrica, isotrópica seguida de porción asimétrica, porciones asimétricas divergentes tales que el poro más pequeño de la membrana está dentro del espesor de la estructura y porciones asimétricas convergentes tales que el poro más pequeño está en una superficie y el tamaño de poro en la convergencia de las dos capas asimétricas es menor que los poros en cualesquiera de las capas asimétricas adyacentes.
8. El proceso de la reivindicación 1, en el cual las etapas de filtración de (b) y (c) utilizan diferencial de presión constante positivo.
9. El proceso de la reivindicación 1, en el cual la etapa de filtración de (b) utiliza un diferencial de presión constante positivo y la etapa de (c) utiliza un diferencial de presión constante negativo.
10. El proceso de la reivindicación 1, en el cual la etapa de filtración de (b) utiliza un diferencial de presión constante negativo y la etapa de filtración (c) utiliza un diferencial de presión constante positivo.
11. El proceso de la reivindicación 1, en el cual las etapas de filtración de (b) y (c) utilizan un diferencial de presión constante negativo.
12. El proceso de la reivindicación 1, en el cual las etapas de filtración (b) y (c) se realizan en serie.
13. El proceso de la reivindicación 1, en el cual las etapas de filtración de (b) y (c) se realizan simultáneamente.
14. Un aparato para recuperar plásmidos que comprende un filtro superior que tiene una o más membranas seleccionadas del grupo consistente en membranas de microfiltración y membranas de filtración gruesa y un filtro inferior que tiene una o más membranas de ultrafiltración, estando el filtro superior situado por encima y adyacente al filtro inferior y medios para aplicar una o más fuerzas impulsoras a los filtros superior e inferior para efectuar la filtración, en el que al menos una de dichas fuerzas impulsoras utiliza un diferencial de presión constante.
15. El aparato de la reivindicación 14, en el cual los filtros están sellados de forma estanca para líquidos el uno al otro.
16. El aparato de la reivindicación 14, en el cual los uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora es un diferencial de presión constante.
17. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora es presión positiva.
18. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora es presión negativa.
19. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora es un diferencial de presión constante positivo.
20. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora es un diferencial de presión constante negativo.
21. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora es una fuerza positiva aplicada al filtro superior y una fuerza negativa aplicada al filtro inferior.
22. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora se aplica en serie al filtro superior y luego al filtro inferior.
23. El aparato de la reivindicación 14, en el cual el uno o más medios para efectuar una fuerza impulsora se aplica simultáneamente a los filtros superior e inferior.
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