KR20130110144A - 여과 방법 및 디바이스 - Google Patents

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Abstract

액체 샘플을 여과시키는 방법은 하나 이상의 생물학적 유기체를 포함하는 샘플을 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 이상의 수동적 물 부피 플럭스(passive water volume flux)에서 필터 막을 통해 통과시키는 단계 (여기서 필터 막은 1.0 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 포함해서 막의 표면 상에서 하나 이상의 생물학적 유기체를 보유함); 및 필터 막의 표면 상에 보유된 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

여과 방법 및 디바이스{FILTRATION METHODS AND DEVICES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참조로 삽입되는, 2010년 6월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/352,205호의 이익을 주장한다.
본 출원은 2011년 5월 25일에 제작된 파일명 서열_목록_66415WO003이 있는 서열 목록과 관계가 있고, 1,753 바이트(byte)를 함유하하며, 이는 본 명세서에서 참조로서 삽입되어 있다.
막 여과는 생물학적 유기체의 존재에 대해 액체 샘플을 분석하는 많은 방법 중 표준 단계이다. 그러한 분석은 흔히 예를 들어, 식품 안전성, 수질, 및/또는 환경적 모니터링 및/또는 연구에 흥미를 갖고 수행된다. 0.45 ㎛ 이하의 평균 기공 크기를 갖는 많은 막 (예를 들어, 셀룰로오스 아세테이트, 나일론 등의 막)은 박테리아를 포획하게 하고 적합한 매질 상에 놓였을 때 포획된 박테리아가 성장하게 할 수 있다. 그러나, 그러한 막으로부터 박테리아를 회수하는 것은 어려울 수 있다. 0.45 ㎛ 이하의 평균 기공 크기를 가짐에도 불구하고 이들 막은 전형적으로 생물학적 유기체보다 더 큰 막 표면에 상당 수의 기공을 갖고, 따라서 생물학적 유기체가 포획되게 될 수 있는 일그러진(torturous) 기공 구조를 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 액체 샘플을 여과하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 하나 이상의 생물학적 유기체를 포함하는 샘플을 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 이상의 수동적 물 부피 플럭스(passive water volume flux)에서 필터 막을 통해 통과시켜서 막의 표면 상에 하나 이상의 생물학적 유기체를 보유시키는 단계 (여기서, 필터 막은 1.0 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 포함함); 및 필터 막의 표면 상에 보유된 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계를 포함한다.
소정의 실시 양태에서, 생물학적 유기체는 필터 막 상의 제자리에서 검출될 수 있고, 한편 다른 실시 양태에서, 생물학적 유기체는 검출되기 전에 필터 막으로부터 제거될 수 있다. 그래서, 일부 실시 양태에서, 이 방법은 보유된 생물학적 유기체를 필터 막으로부터 용출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 방법은 하나 이상의 생물학적 유기체를 정량화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 방법은, 샘플이 필터 막을 통해 통과한 후 24 시간 이내에 생물학적 유기체를 검출 및/정량화하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 액체 샘플은 예를 들어, 식품 샘플, 환경적 샘플, 또는 물 샘플을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 필터 막은 흡수제 부재(member)와 기능적으로 내왕(communication)하도록 제공될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 이 방법은 액체 샘플의 부피를 50% 이상 감소시키는 단계를 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 필터 디바이스를 제공한다. 일반적으로, 필터 디바이스는 포켓 부피를 한정하는 포켓 표면을 포함하는 포켓; 포켓 표면의 적어도 일부 위에 배치된 흡수제 부재; 및 포켓 부피와 유체 내왕하는 흡수제 부재의 적어도 일부 위에 배치된 필터 막을 포함한다.
본 발명의 상기의 개요는 본 발명의 각각의 개시된 실시 양태 또는 모든 구현 형태를 기술하고자 하는 것은 아니다. 이하의 기술은 더 구체적으로 예시적인 실시 양태를 예증한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통하여 지침이 제공되며, 이 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안된다.
<도 1>
도 1 R1933-18 (초기, 0.23 ㎛) 막의 SEM 이미지. 1A 열린 측면(open side) (5000x), 1B 촘촘한 측면(tight side) (5000x), 1C 단면 (500x).
<도 2>
도 2 R1933-7 (초기, 0.34 ㎛) 막의 SEM 이미지. 2A 열린 측면 (5000x), 2B 촘촘한 측면 (5000x), 2C 단면 (500x).
<도 3>
도 3 R1933-8B (초기, 0.51 ㎛) 막의 SEM 이미지. 3A 열린 측면 (5000x), 3B 촘촘한 측면 (5000x), 3C 단면 (500x).
<도 4>
도 4 R1901-11 (초기, 0.74 ㎛) 막의 SEM 이미지. 4A 열린 측면 (5000x), 4B 촘촘한 측면 (5000x), 4C 단면 (500x).
<도 5>
도 5 PAN 막의 SEM 이미지 (10,000x). 5A PAN-1 (0.613 ㎛), 5B PAN-2 (0.531 ㎛), 5C PAN-3 (0.367 ㎛).
<도 6>
도 6 MF-밀리포어 유형 HAWP (0.4 ㎛) (6A) 및 아이소포어 폴리카르보네이트 필터 (0.4 ㎛) (6B)의 SEM 이미지 (10,000x). 막 이미지 둘다는 샘플을 수여받은 측면의 것이다.
<도 7>
도 7 여과 디바이스의 한 실시 양태의 투시도.
<도 8>
도 8 여과 디바이스의 한 실시 양태의 도식 측면도.
<도 9>
도 9 여과 디바이스의 한 실시 양태의 도식 측면도.
<도 10a>
도 10a 여과 디바이스의 한 실시 양태의 도식 측면도.
<도 10b>
도 10b 샘플-회수 포트(sample-retrieval port)가 있는 여과 디바이스의 한 실시 양태의 도식 측면도.
<도 11>
도 11 본 개시문헌에 따라 여과 디바이스의 한 실시 양태의 분해 조립 측면도.
<도 12>
도 12 도 11의 조립된 여과 디바이스의 평면도.
<도 13>
도 13 본 개시문헌에 따라, 지지체 부재가 있는 여과 디바이스의 실시 양태의 단면 도식 측면도.
[발명의 상세한 설명]
본 발명자들은, 액체 샘플이 하나 이상의 생물학적 유기체의 존재에 대해 분석될 수 있는 방법을 기술한다. 방법이 실행되는 구체적인 맥락에 따라, 방법은 1.0 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 갖는 막을 통해 액체 샘플을 통과시키는 단계를 수반할 수 있으며, 한편 상대적으로 높은 물 부피 플럭스를 제공할 수 있다.
임의로, 이 방법은 샘플의 생물학적 유기체의 상대적으로 높은 백분율은 막의 기공 내에 포매되기보다는 막의 표면 상에 보유됨을 추가로 제공할 수 있다. 그래서, 일부 실시 양태에서, 이 방법은 막의 표면 상에 보유된 생물학적 유기체의 상대적으로 높은 백분율은 막 표면으로부터 쉽게 회수될 수 있음을 추가로 제공한다. 다른 경우에, 방법은 액체 샘플의 부피가 유의하게 감소되도록 추가로 제공될 수 있다.
하기 용어는 지시된 의미를 가질 것이다.
"능동적"은, 기계적 힘 (예를 들어, 진공)이 필터 막을 통해 액체 샘플의 이동을 구동하는 여과 방법을 말한다.
"생물학적 분석물"은 유기체 내에서 발생하거나 유기체에 의해 형성되는 분자, 또는 그의 유도체를 말한다. 예를 들어, 생물학적 분석물은 아미노산, 핵산, 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 인지질, 당류, 다당류, 또는 그의 둘 이상의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 실례의 생물학적 분석물은 대사물 (예를 들어, 스타필로코칼(staphylococcal) 엔테로톡신), 알레르기원 (예를 들어, 땅콩 알레르기원), 호르몬, 독소 (예를 들어, 바실러스(Bacillus) 설사 독소, 아플라톡신(aflatoxin) 등), RNA (예를 들어, mRNA, 총 RNA, tRNA 등), DNA (예를 들어, 플라스미드 DNA, 식물 DNA 등), 태깅된(tagged) 단백질, 항체, 항원, 또는 그의 둘 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
"기포점 기공 크기"는 막의 계산된(computed) 평균 기공 크기를 말한다. 기포점 기공 크기는 액체가 표면 장력 및 모세관 힘에 의해 필터의 기공 내에 고정된다는 사실을 바탕으로 한다. 표면 장력을 극복하고 기공 밖으로 액체를 밀어내는 데 필요한 최소 압력은 기공 직경의 측정값이다. 기포점 기공 크기를 계산하는 식은:
Figure pct00001

(식 중,
P = 기포점 압력;
σ = 액체의 표면 장력 (물에 대해 72 dynes/㎝);
θ = 액체-고체 접촉각 (물에 대해서는 일반적으로 0인 것으로 가정됨); 및
D = 기공의 직경)이다.
"용출" 및 그의 변이형은 예를 들어, 중력, 수동 진탕, 또는 와동과 같은 낮은 엄격성의 물리적 방법을 사용해 필터 막으로부터 생물학적 유기체를 제거하는 것을 말한다.
"포획물(entrapped)"은 예를 들어, 생물학적 유기체가 막 내의 공간에 포착되기 때문에 필터 막으로부터 쉽게 용출되지 않는 필터 막에 의해 포착된 생물학적 유기체를 말한다.
"수동적(passive)"은, 어떠한 기계적 힘 (예를 들어, 진공)도 필터 막을 통해 액체 샘플의 이동을 구동시키지 않는 여과를 말한다. 수동적 여과 방법은 예를 들어, 필터 막을 통해 유체의 이동을 구동시키기 위해, 흡수제에 의한 유체의 중력 및/또는 흡수를 사용하는 여과를 포함한다.
"회수물"은 검출 및/또는 추가의 분석을 위한 조건에서 필터 막으로부터 용출되는 생물학적 유기체를 말한다.
"보유물" 및 그의 변이형은 여과 후에 필터 막 표면 상에 배치되고 필터 막으로부터 쉽게 용출되는 생물학적 유기체를 말한다.
"물 부피 플럭스(water volume flux)"는 단위 압력 당 단위 시간 당 막의 단위 면적을 통해 통과하는 유체의 부피를 말한다. 달리 표시되지 않는다면, 물 부피 플럭스는 평방 인치 압력 당 파운드 당 시간 당 막의 평방 미터를 통해 통과하는 액체 샘플의 리터 (L/㎡.h.psi)로서 본 명세서에서 표현된다.
"및/또는"이라는 용어는 열거된 요소 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소의 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.
용어 "포함하다" 및 그의 변이형은 이들 용어가 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 나타날 경우 제한적 의미를 갖지 않는다.
달리 특정되지 않으면, "부정관사 ("a", "an")", "정관사 ("the")", 및 "하나 이상"은 서로 바꾸어서 사용되며, 하나 또는 하나 초과를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 이내에 포함된 모든 수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
많은 시판의 막은 액체 샘플로부터 생물학적 유기체를 여과하고 제거하는 데 사용된다. 막 여과 분야는 잘 알려져 있다. 그러나, 기존의 시판의 막은 전형적으로 일그러진 통로를 갖고, 상당 수의 큰 기공을 표면에 갖는다. 이러한 특징은, 포착된 생물학적 유기체가 필터 막의 기공 내에 자리잡게 될 수 있기 때문에 여과된 생물학적 유기체를 회수하는 것을 어렵게 하고, 따라서 필터로부터 온전한 상태로 제거되는 것이 어려워서 포착된 생물학적 유기체가 분석되게 할 수 있다.
본 명세서에서, 본 발명자들은 액체 샘플이 필터 막을 사용해 여과될 수 있어서 2 개의 경쟁적 파라미터의 각각이 만족되게 하는 방법을 기술한다. 우선, 이 방법은 필터 막의 표면 상에 생물학적 유기체를 보유시켜서 보유된 생물학적 유기체가 추가의 분석을 위해 막으로부터 쉽게 용출될 수 있게 하는 단계를 수반한다. 그러나, 높은 백분율의 생물학적 유기체를 포착하도록 디자인된 기존의 방법은 매우 작은 평균 기공 크기를 갖는 막을 사용해서 그렇게 하는 것이다. 이는 본질적으로 물 플러스 부피를 제한하게 되고, 결과적으로 주어진 부피의 액체 샘플이 처리될 수 있게 하는 속도를 제한한다. 그래서, 본 명세서에서 기술된 방법은 여과 방법에서 현재 관찰되는 것보다 더 큰 물 플럭스 부피를 추가로 제공한다.
일부 경우에, 이 방법은 예를 들어, 환경적 시험, 수질 시험, 수 처리 시험, 및/또는 수선되고/되거나 복구된 수 처리 파이프(water utility pipe) 시험에 요구될 수 있는 것처럼 큰 부피 (예를 들어, 수 리터)의 액체 샘플을 여과하는 단계를 수반할 수 있다. 예를 들어, 수선되고/되거나 복구된 수도 파이프 내 수질을 시험하는 본 발명의 방법을 사용해, 수질이 수도 서비스를 복구하기에 충분하다는 것을 확신하는 데는 2 일 내지 3 일이 걸릴 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 기술된 방법을 사용해서는, 수도 서비스가 24 시간 이내에 복구될 수 있기에 충분히 신속하게 수질을 확인하는 것이 가능할 수 있다.
다른 경우에, 방법은 풍부해진 음식 샘플, 음식 처리 물 샘플, 및/또는 이동수 샘플을 여과하는 단계를 수반할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법은 그러한 시험에 필요한 시간을 2 일 이상 감소시킬 수 있다. 우선, 방법은 큰 부피의 액체 샘플이 여과 및 분석되게 할 수 있다. 둘째로, 방법은 필터 막의 표면 상에 보유될 포착된 생물학적 유기체 중 상당한 백분율이 용출에 의해 더욱 쉽게 회수되게 한다.
다른 적용에서, 방법은 더 작은 부피 (예를 들어, 1 리터 미만)의 액체 샘플을 상대적으로 빠르게 여과하는 단계를 수반할 수 있다. 이들 적용에서, 용이한 회수를 위한 상대적으로 높은 물 플럭스 부피 및 필터 막 상에서의 생물학적 유기체의 보유의 조합 역시 액체 샘플의 더욱 신속하고/하거나 더 간단한 여과를 촉진시킨다. 이들 적용 중 일부에서, 생물학적 유기체는 보유된 생물학적 유기체를 필터 막으로부터 제거하기 위해 간단한 중력을 사용해 회수될 수 있다. 다른 적용에서, 액체 샘플은 유의하게 농축될 수 있는데-즉, 전체 액체 부피보다 적은 일부 양이 필터 막을 통해 통과할 수 있다. 상당한 백분율의 생물학적 유기체가 필터 막 내에 포획되기보다는 필터 막 상에 보유되기 때문에, 본래 샘플 내 생물학적 유기체 중 더 큰 백분율이 남은 액체 부피에서 회수되어서, 추가의 규명 및/또는 다른 분석을 위해 생물학적 유기체를 농축시키게 할 수 있다.
일반적으로, 방법은 하나 이상의 생물학적 유기체를 포함하는 샘플을 1.0 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 갖는 필터 막을 통해 통과시켜서, 막의 표면 상에 하나 이상의 생물학적 유기체를 보유시키는 단계를 포함한다. 방법은 수동적 여과를 위해 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 이상의 물 부피 플럭스에서, 또는 능동적 여과를 위해 14.5689 L/㎡.h.㎪ (100 L/㎡.h.psi) 이상의 물 부피 플럭스에서 필터 막을 통해 샘플을 통과시키는 단계를 포함한다. 방법은 필터 막의 표면 상에 보유된 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
액체 샘플은 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있고, 물 샘플을 포함할 수 있다. 예시적인 물 샘플은 환경적 샘플 (예를 들어, 호수, 강, 개울, 바다, 연못 등), 물 이용/물 처리 샘플 (예를 들어, 물 공급 파이프, 수 처리 시설, 수 처리 배출, 하수 등), 이동수 샘플 (예를 들어, 병에 든 물, 우물 물) 또는 음식 샘플 (예를 들어, 액체 음식, 예를 들어 균질화에 의해 처리된 음식 샘플 등)을 포함한다. 샘플은 수합된 대로 여과될 수 있거나, 여과 및 추가의 분석 전에 어느 정도 처리될 수 있다.
생물학적 유기체는, 액체 샘플에서의 검출 및/또는 정량화가 요구될 수 있는 임의의 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 따라서, 생물학적 유기체는 예를 들어, 기생충, 또는 예를 들어, 단세포 진핵 유기체 (예를 들어, 효모), 조류, 또는 박테리아와 같은 미생물을 포함할 수 있다. 예시적인 미생물은 예를 들어, 콜리포름 박테리아(coliform bacteria)를 포함한다. 예시적인 박테리아 종은, 예를 들어, 에스케리키아 에스피피.(Escherichia spp.) (예를 들어, 이. 콜라이), 엔테로박터 에스피피.(Enterobacter spp.) (예를 들어, 이. 아에로게네스(E. aerogenes)) 엔테로코커스 에스피피.(Enterococcus spp.), (예를 들어, 이. 파에칼리스(E. faecalis)), 시트로박터 에스피피.(Citrobacter spp.), (예를 들어, 씨. 프레운디이(C. freundii)), 클레브시엘라 에스피피.(Klebsiella spp.), 시겔라 에스피피.(Shigella spp.), 살모넬라 에스피피.(Salmonella spp.) (예를 들어, 에쓰. 엔테리카), 리스테리아 에스피피.(Listeria spp), 슈도모나스 에스피피(Pseudomonas spp.) 등을 포함한다.
필터 막은 1.0 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 가질 수 있지만, 방법은 1.0 ㎛ 초과의 기포점 기공 크기를 갖는 필터 막을 사용해 수행될 수 있다. 예시적인 필터 막은 예를 들어, 0.95 ㎛ 이하, 0.9 ㎛ 이하, 0.85 ㎛ 이하, 0.8 ㎛ 이하, 0.75 ㎛ 이하, 0.7 ㎛ 이하, 0.6 ㎛ 이하, 또는 0.5 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 가질 수 있다. 적합한 기포점 기공 크기는 예를 들어, 검출되기에 바람직한 생물학적 유기체의 크기, 여과될 샘플의 부피, 및 필터 막의 기공의 깊이에 의해 적어도 부분적으로 결정될 수 있다. 다중-구역 막의 맥락에서, 기포점 기공 크기는 생물학적 유기체를 보유하도록 위치된 구역에 대해 측정된다.
예시적인 필터 막은 예를 들어, TIPS (열 유도 상 분리(thermally induced phase separation)) 과정, SIPS (용매 유도 상 분리) 과정, VIPS (증기 유도 상 분리) 과정, 연신 과정, 트랙-에칭, 또는 전기방사 (예를 들어, PAN 섬유 막)에 의해 제조될 수 있다. 적합한 막 물질은 예를 들어, 폴리올레핀 (예를 들어, 폴리에틸렌 및/또는 폴리프로필렌), 에틸렌-클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체, 폴리아크릴로니트릴, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 셀룰로오스 에스테르, 및/또는 그의 조합을 포함한다.
적합한 막은 다공성 막으로서 또는 나노섬유 막으로서 특징지어질 수 있다. 나노섬유 필터 막은 5 ㎛ 미만, 예를 들어, 1 ㎛ 미만과 같은 섬유 직경을 가질 수 있다. 나노섬유 막은 예를 들어, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 셀룰로오스 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 부티랄, 및/또는 그의 조합으로부터 제조될 수 있다.
소정의 TIPS 폴리올레핀 막은 이들이 막 구조물의 단일의 균일한 구역을 갖도록 제조될 수 있고, 각각의 구역은 상이한 기공 미세구조를 갖는다. 다른 경우에, TIPS 막은 2 개 이상의 구역을 포함하는 다중-구역 막으로서 제조될 수 있고, 각각의 구역은 상이한 기공 미세구조를 갖는다. 다중-구역 TIPS 막은 개별 구역을 함유할 수 있거나, 대안적으로는 2 개의 다른 개별 구역 사이에 전이 구역을 가질 수 있다.
예시적인 필터 막은 막들을 포함하고, 예시적인 필터 막의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,539,256 호, 미국 특허 제4,726,989 호, 미국 특허 제4,867,881 호, 미국 특허 제5,120,594 호, 미국 특허 제5,260,360 호, 국제 특허 공개 제WO2010/078234 호, 국제 특허 공개 제WO2010/071764 호, 2010 년 6 월 4 일에 출원된 명칭이 "코팅된 다공성 물질(Coated Porous Materials)"인 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/351,441 호, 및 2010 년 6 월 4 일에 출원된 명칭이 "코팅된 다공성 물질의 제조 방법(Process for Making Coated Porous Materials)"인 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/351,447 호에서 기술된다.
일부 경우에, 능동적 여과는 14.5 L/㎡.h.㎪ (100 L/㎡.h.psi) 이상의 물 플럭스 부피를 제공할 수 있지만, 이 방법은 14.5 L/㎡.h.㎪ (100 L/㎡.h.psi) 미만의 물 플럭스 부피에서 수행될 수 있다. 능동적 여과를 사용한 예시적인 물 플럭스 부피 값은 예를 들어, 36.3 L/㎡.h.㎪ (250 L/㎡.h.psi) 이상, 72.6 L/㎡.h.㎪ (500 L/㎡.h.psi) 이상, 108.9 L/㎡.h.㎪ (750 L/㎡.h.psi) 이상, 145.1 L/㎡.h.㎪ (1000 L/㎡.h.psi) 이상, 181.4 L/㎡.h.㎪ (1250 L/㎡.h.psi) 이상, 217.7 L/㎡.h.㎪ (1500 L/㎡.h.psi) 이상, 253.9 L/㎡.h.㎪ (1750 L/㎡.h.psi) 이상, 290.3 L/㎡.h.㎪ (2000 L/㎡.h.psi) 이상, 362.8 L/㎡.h.㎪ (2500 L/㎡.h.psi) 이상, 또는 435.4 L/㎡.h.㎪ (3000 L/㎡.h.psi) 이상을 포함한다. 최대 물 플럭스 속도는 필터 막을 통한 액체 샘플의 이동을 구동시키는 데 사용되는 기계화된 힘의 최대 용량, 필터 막의 강도 및/또는 내구성, 및 필터 막의 기포점 기공 크기에 의해 적어도 부분적으로 측정될 수 있다.
일부 경우에, 수동적 여과는 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 이상의 물 플럭스 부피를 제공할 수 있지만, 이 방법은 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 미만의 물 플럭스 부피에서 수행될 수 있다. 능동적 여과를 사용한 예시적인 물 플럭스 부피 값은 예를 들어, 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 이상, 2.90 L/㎡.h.㎪ (20 L/㎡.h.psi) 이상, 3.63 L/㎡.h.㎪ (25 L/㎡.h.psi) 이상, 4.64 L/㎡.h.㎪ (32 L/㎡.h.psi) 이상, 7.26 L/㎡.h.㎪ (50 L/㎡.h.psi) 이상, 8.71 L/㎡.h.㎪ (60 L/㎡.h.psi) 이상, 10.9 L/㎡.h.㎪ (75 L/㎡.h.psi) 이상, 12.8 L/㎡.h.㎪ (88 L/㎡.h.psi) 이상, 13.8 L/㎡.h.㎪ (95 L/㎡.h.psi), 또는 14.5 L/㎡.h.㎪ (100 L/㎡.h.psi) 이상을 포함한다. 최대 수동적 물 플럭스 속도는 적어도 부분적으로, 필터 막의 기포점 기공 크기 및/또는 예를 들어, 필터 막과 유체 내왕하도록 위치한 흡수제 물질에 의해 발생된 플럭스 구배에 의해 측정될 수 있어서, 이는 필터 막을 통해 유체 샘플 중 적어도 일부를 끌어낼 수 있다.
일부 실시 양태에서, 방법은, 샘플 내 생물학적 유기체 중 30% 미만이 필터 막에 의해 보유되게 하도록 수행될 수 있더라도, 샘플 내 생물학적 유기체 중 30% 이상이 필터 막에 의해 보유되게 된다. 예시적인 방법에서, 샘플 내의 생물학적 유기체 중 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 97.5% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8%, 또는 99.9% 이상이 필터 막에 의해 보유된다.
상기 나타낸 바와 같이, 일부 실시 양태는 예를 들어, 더 큰 디바이스 내에서 흡수제 부재와 기능적 내왕하는 필터 막을 포함할 수 있다. 그러한 디바이스(10)의 실시 양태는 도 7 내지 13에 제시되어 있다. 그러한 실시 양태에서, 흡수제 부재(16)는 필터 막을 가로지르고 흡수제 부재(16) 내로 액체를 끌어내기에 충분한 물 플럭스 구배를 발생시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서 (예를 들어, 도 7에서 제시된 바와 같음), 필터 막은 흡수제 부재(16)의 적어도 일부를 덮어서, 액체가 흡수제 부재(16) 내로 유동하는 것은 액체가 필터 막을 통해 유동하는 것을 필요로 할 수 있다. 이러한 방식으로, 액체 샘플 내 생물학적 유기체는 필터 막에 의해 보유될 수 있다. 디바이스(10)는 선택적인 밀폐구(13)가 있는 용기(12)를 추가로 포함한다. 용기(12)는 예를 들어 교접(interlocking) 성분(13a 및 13b)으로 이루어진 밀봉가능한 밀폐구(13)를 갖는 지프록(ZIPLOK) 브랜드 저장 백과 같은 가요성, 변형성 용기(12)를 포함할 수 있다.
도 8에서 제시된 한 특정 실시 양태에서, 흡수제 부재(16)는 디바이스(10)에서 형성되는 포켓(18)의 표면 상에 배치될 수 있다. 따라서, 포켓(18)은 액체 샘플(24)에 대한 그릇(receptacle)으로서 기능할 수 있다. 흡수제 부재(16)는, 밀봉체(26)를 형성하는 것을 도와서 흡수제 부재(16)를 용기(12)의 일부에 조이게 하는 부직포 배킹(20)을 임의로 포함할 수 있다. 밀봉체(26)는 예를 들어 접착제를 통해 또는 가열-본딩에 의해 형성될 수 있다. 필터 막(14)은 흡수제 부재(16)의 열린-포켓 표면 상에 배치될 수 있다 (즉, 포켓(18)의 내부 부피를 마주하고 있음). 사용 시, 도 9 및 10A 내지 10B에서 예시된 바와 같이, 디바이스(10)는 필터 막(14)이 일반적으로 수직 배향으로 있도록 배향될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 필터 막(14)에 의해 보유된 생물학적 유기체는 중력으로 인해 필터 막(14)으로부터 용출될 수 있다. 그래서, 액체가 흡수제 부재(16)에 의해 흡수됨에 따라, 액체 샘플(24) 내 생물학적 유기체는 농축되게 된다. 액체 샘플(24)이 원하는 농도 수준의 생물학적 유기체에 상응하는 부피에 도달할 때, 농축된 액체 샘플(24) 중 일부 (도 10A)는 예를 들어, 주사기(22)를 사용함으로써 디바이스(10)로부터 제거될 수 있다. 다음, 농축된 액체 샘플 중 제거된 부분은 추가의 분석을 받을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 농축된 액체 샘플(24) 중 일부 (도 10B)는 예를 들어, 샘플 포트(30)를 사용함으로써 디바이스(10)로부터 제거되어 농축된 액체 샘플(24)을 수득할 수 있다. 샘플 포트(30)는 탄성-변형성 스플릿 격막(elastically-deformable split septum)(40) (예를 들어, 미국 펜실베니아주 맥머리(McMurray, PA) 소재의 마이크로닉 노쓰 아메리카, 엘엘씨(Micronic North America, LLC)로부터 입수가능한 스플릿-캡 TPE 플러그 스타일 캡(split-cap TPE plug style cap))을 포함할 수 있으며, 이는 농축된 액체 샘플(24)의 전부 또는 일부를 회수하기 위해 파이펫 팁 (제시되지 않음)이 삽입될 수 있는 슬릿(42)을 포함한다. 일부 실시 양태에서 (제시되지 않음), 샘플 포트는 예를 들어, 농축된 액체 샘플 중 일부 (또는 전부)를 중력 유동에 의해 방출시키기 위해 열릴 수 있는 밸브를 포함할 수 있다.
도 13은 본 개시 내용에 따라 디바이스(10)의 또다른 실시 양태를 보여준다. 이 실시 양태에서, 필터 막(14)에 사용되는 재료는 용기(12) (예를 들어, 지프록 백) 내부에 배치된 포켓(18) (예를 들어, 필터 막 물질 두 시트의 가장자리의 일부를 제외한 전부를 함께 밀봉함으로써)을 형성하도록 배열된다. 포켓(18)은 필터 막(14)에 의해 한정된 내부 부피를 갖는다. 임의로, 포켓(18)은 필터 막(14)에 대한 구조적 지지체를 제공하기 위해 외부 부직포 배킹(20)을 추가로 포함할 수 있다. 흡수제 부재(16)는 필터 막(14)에 의해 형성된 포켓(18)의 바깥쪽에 있는 용기(12) 중 일부에 위치한다. 바람직하게는, 흡수제 부재(16)는 포켓(18)에 근접해 있다. 더욱 바람직하게는, 흡수제 부재(16)는 포켓(18)의 외부에 있는 필터 막(14)의 적어도 일부와 접촉한다. 더욱 더 바람직하게는, 흡수제 부재(16)는 포켓(18)의 외부에 있는 필터 막(14)의 적어도 일부 위에 배치된다. 일부 실시 양태에서, 흡수제 부재(16)는 필터 막과 부직포 배킹(20) 사이에 배치된다. 임의로, 디바이스(10)는 액체 샘플의 첨가 전, 동안 그리고 후에 상대적으로 가용성인 용기(12)에 대한 구조적 지지체를 제공하는 데 사용될 수 있는 지지체 부재(28) (예를 들어, 베이스가 있는 성형된 플라스틱 막대(molded plastic rod with a base))를 추가로 포함할 수 있다. 사용 시, 디바이스(10)는 (예를 들어, 수동으로 또는 지지체 부재를 통해) 고정될 수 있으며, 한편 액체 샘플 (제시되지 않음)은 포켓(18) 내로 놓여진다. 액체 샘플 중 일부가 필터 막(14)을 통해 통과한 후에, 농축된 액체 샘플 (제시되지 않음)은 예를 들어 파이펫을 사용해 포켓(18)으로부터 제거될 수 있다.
도 13에서 예시된 디바이스의 대안적 실시 양태 (제시되지 않음)는, 흡수제 부재가 포켓의 내부 부피에 배치되고 샘플은 포켓의 외부에 있는 용기 내에 침착되는 디바이스를 포함한다. 사용 시, 샘플은 포켓 내 보다는 용기 내에 침착된다. 액체 샘플 중 적어도 일부가 필터 막을 통해 통과한 후에, 용기 내의 액체 샘플의 나머지 중 모두 또는 일부는 본 명세서에서 개시된 검출 방법 중 임의의 방법을 사용해 생물학적 유기체의 검출을 위해 용기로부터 제거될 수 있다.
흡수제 부재(16)는 임의의 적합한 유체-흡수 물질로 제작될 수 있다. 일부 경우에, 흡수제 부재(24)는 하이드로겔을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "하이드로겔"은 친수성이고, 팽윤되거나 극성 용매와 팽윤될 수 있는 중합체성 물질을 말한다. 적합한 하이드로겔은 가교결합된 하이드로겔, 팽윤된 하이드로겔, 및 건조되거나 부분적으로 건조된 하이드로겔을 포함한다.
적합한 하이드로겔은 미국 특허 출원 공개 제US2004/0157971 호에서 기술된 바와 같은 카르복실산, 비닐 설폰산, 셀룰로오스계 단량체, 폴리비닐 알코올로부터 선택되는 에틸렌계 불포화 카르복실-함유 단량체 및 공단량체를 포함하는 중합체; 미국 특허 출원 공개 제US 2006/0062854 호에서 기술된 바와 같은 전분, 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 글리콜, 및 그의 공중합체를 포함하는 중합체; 국제 특허 공개 제WO 2007/146722 호에서 기술된 하이드로겔, 및 이로부터 제조된 중합체성 비드; 미국 특허 제6,861,067 호에서 기술된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜로부터 선택되는 하나 이상의 알코올과 함께 폴리우레탄 예비중합체를 포함하는 중합체; 및 미국 특허 제6,669,981 호에서 기술된 바와 같은 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 콜라겐 및 젤라틴으로부터 선택되는 친수성 중합체를 포함하는 중합체를 포함하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에서 모두 참조로서 삽입되어 있다. 다른 적합한 하이드로겔은 한천, 아가로스, 및 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 포함한다. 소정의 실시 양태에서, 하이드로겔은 가교결합된 폴리아크릴산 나트륨 염/공중합체, 폴리아크릴아미드 공중합체, 에틸렌 말레산 무수물 공중합체, 가교결합된 카르복시-메틸-셀룰로오스, 폴리비닐 알코올 공중합체, 가교결합된 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리아크릴로니트릴의 전분 그래프팅된 공중합체, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
하이드로겔은 성형된(shaped) 하이드로겔을 포함할 수 있다. 성형된 하이드로겔은 예를 들어, 비드, 시트, 리본, 및 섬유로 성형된 하이드로겔을 포함한다.
하이드로겔은 지지된 하이드로겔을 추가로 포함할 수 있다. 지지된 하이드로겔은 비드, 부직포 시트, 섬유 (예를 들어, 중공 마이크로섬유) 등 위에 그리고/또는 그 안에 배치된 하이드로겔을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 농축된 샘플의 부피는 디바이스에 첨가되는 샘플의 부피의 50% 미만일 수 있지만, 방법은 샘플의 부피를 더 적은 범위로 감소시키면서 수행될 수 있다. 부피 감소의 예시적인 정도는 예를 들어, 디바이스에 첨가되는 샘플의 부피의 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02%, 또는 0.01% 미만인 부피를 갖는 농축된 샘플을 포함할 수 있다. 한 예시적인 실시 양태에서, 225 ㎖의 초기 샘플은 대략 2 ㎖의 부피로 감소될 수 있어서, 농축된 샘플은 디바이스에 첨가되는 액체 샘플의 부피의 대략 0.09%인 부피를 갖는다.
방법은 필터 막에 의해 보유된 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 맥락에서, 필터 막에 의해 보유된 생물학적 유기체는 필터 막과 접촉되어 있는 생물학적 유기체뿐만 아니라 이어서 필터 막으로부터 회수되는 생물학적 유기체를 포함한다. 생물학적 유기체는 임의의 적합한 방법에 의해 필터 막으로부터 회수될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 방법을 수행함으로써 필터 막 상에 보유된 생물학적 유기체의 한 특징은, 보유된 생물학적 유기체는 예를 들어, 중력, 수동 진탕, 및/또는 와동과 같은 상대적으로 낮은 엄격성의 물리적 방법을 사용해 필터 막으로부터 제거될 수 있다는 점이다. 그래서, 예를 들어, 액체 샘플의 부피가 감소되는 것으로 이제 기술된 실시 양태에서, 감소된 부피의 액체 샘플 내에서 농축된 생물학적 유기체는, 생물학적 유기체가 임의의 인식가능한 시간 길이 동안 필터 막 안에 또는 그 위에 머무르지 않았더라도, 필터 막으로부터 회수되는 것으로 간주될 수 있다.
그래서, 일부 실시 양태에서, 보유된 생물학적 유기체는 여전히 필터 막과 접촉되어 있으면서 본래 장소에서 검출될 수 있다. 그러나, 다른 실시 양태에서, 보유된 생물학적 유기체는 필터 막으로부터 제거될 수 있고 그래서 회수된 생물학적 유기체가 검출될 수 있다. 필터 막으로부터의 회수 후에 또는 본래 자리에서 검출되든지 간에, 생물학적 유기체는 미생물 검출의 당업자에게 일상적인 방법을 비롯해 임의의 적합한 방법을 사용해 검출될 수 있다. 적합한 본래 장소에서의 검출 방법은 예를 들어, 항체 조성물 (예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체)의 생물학적 유기체-특이적 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 검출 방법은 예를 들어, 생물학적 유기체에 의해 생성되는 생물학적 분석물의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 검출 방법은, (예를 들어, PCR에 의해) 증폭된 생물학적 유기체-특이적 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 것, 뉴클레오타이드 서열화, 효소 어세이 (예를 들어, 탈수소효소, 글루코로니다아제, β-갈락토시다아제, 프로테아제 등의 검출), 생물인광 어세이 (예를 들어, ATP/ADP/AMP의 검출), 단백질/펩타이드의 검출, 스펙트로메트리(spectrometry), 및/또는 형광 (예를 들어, NAD/NADH, FAD/FADH, 자가형광의 검출) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 필터 막으로부터 회수된 생물학적 유기체에 대한 적합한 검출 방법은 생물학적 유기체의 본래 장소에서의 검출에 적용가능한 방법을 포함하고, 배양 중에서의 성장을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 방법은 필터 막에 의해 보유된 생물학적 유기체를 정량화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 필터 막에 의해 보유된 생물학적 유기체는 필터 막과 접촉되어 있는 생물학적 유기체뿐만 아니라 이어서 필터 막으로부터 회수되는 생물학적 유기체를 포함한다.
그래서, 일부 실시 양태에서, 보유된 생물학적 유기체는 여전히 필터 막과 접촉되어 있으면서 본래 장소에서 정량화될 수 있다. 그러나, 다른 실시 양태에서, 보유된 생물학적 유기체는 필터 막으로부터 제거될 수 있고 그래서 회수된 생물학적 유기체는 정량화될 수 있다. 본래 장소에서 정량화되거나 필터 막으로부터 회수된 이후든지 간에, 생물학적 유기체는, 예를 들어, 콜로니 형성 단위(colony forming unit, cfu) 검출, 최확수(most probable number, MPN) 분석, ATP 생물인광, 효소 어세이, PCR, 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR 등과 같이 미생물 검출의 당업계의 숙련자에게 일상적인 방법을 비롯하여 임의의 적합한 방법을 사용해 정량화될 수 있다.
생물학적 유기체가 필터 막으로부터 회수된 후에 검출 및/또는 정량화되는 실시 양태에서, 방법은 보유된 생물학적 유기체 중 50% 이상을 필터 막으로부터 용출시키는 단계를 포함하고, 그렇지만 이 방법은 보유된 생물학적 유기체 중 50% 미만을 필터 막으로부터 용출한 후에 수행될 수 있다. 예시적인 방법에서, 보유된 생물학적 유기체 중 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 97.5% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8%, 또는 99.9% 이상이 필터 막으로부터 용출된다.
일부 경우에, 보유된 생물학적 유기체는 필터 막을 재위치시킴으로써 용출되어서, 중력 힘이, 보유된 생물학적 유기체가 필터 막으로부터 떼어져서 용출되게 한다. 다른 경우에, 보유된 생물학적 유기체는 필터 막을 수동적으로 진탕시킴으로써, 보유된 생물학적 유기체를 필터 막으로부터 떼어놓아서 필터 막으로부터 용출될 수 있다. 다른 경우에, 보유된 생물학적 유기체는 필터 막을 수동적으로 와동시킴으로써, 보유된 생물학적 유기체를 필터 막으로부터 떼어놓아서 필터 막으로부터 용출될 수 있다. 다른 경우에, 생물학적 유기체는 하기 실시예 12에서 기술된 바와 같이 폼(foam) 용출에 의해 필터 막으로부터 용출될 수 있다.
소정의 기존의 방법은 생물학적 유기체 (예를 들어, 박테리아) 중 30% 이하의 회수를 제공하고, 따라서 본 명세서에서 기술된 방법을 사용해 관찰되는 바와 같은 동일한 회수 정도를 제공하지 못한다.
임의의 특정 이론에 구애되지 않기를 바라면서, 소정의 기존의 방법은, 미세다공성 필터 막이 박테리아 크기보다 더 작은 등급의 기공을 가질 때조차 막의 표면에서 큰 기공을 상당 수 갖기 때문에, 생물학적 유기체의 만족할만한 회수를 제공하지 못할 수 있다. 큰 기공은 샘플 부피가 감소되면서 생물학적 유기체를 보유하기 보다는 생물학적 유기체를 포획하는 것으로 여겨진다.
또한, 예를 들어, 필터 막의 표면에 박테리아가 비특이적으로 결합하는 것은 도전(challenge)을 만든다. 이는 적어도 부분적으로는 당연한데, 왜냐하면 액체 샘플의 부피를 더욱 신속하게 감소시키는 하나의 방법은 액체가 흡수될 수 있는 필터 막의 더 큰 표면적을 제공하기 때문이다. 그러나, 표면을 증가시키는 것은 또한 생물학적 유기체가 비특이적으로 결합할 수 있는 표면적을 증가시키기도 한다. 많은 대안방법이 조사되었다. 그러나, 막 중 어느 것도 생물학적 유기체의 높은 체류 속도 (및 따라서 높은 회수 속도), 및 (예컨대, 예를 들어, 1 시간 미만 내에 225 ㎖을 2 ㎖ 내지 3 ㎖로 농축시키기에 충분한) 양호한 물 플럭스 부피를 제공할 수 없었다.
소정의 실시 양태에서, 방법은 본래 샘플 내의 생물학적 유기체 중 70% 이상을 회수할 수 있게 하면서도 약 98.6% 내지 약 99.2%의 샘플 부피 감소를 제공할 수 있다.
개별 단계를 포함하는 본 명세서에서 개시된 임의의 방법에 대해, 단계들은 임의의 실현가능한 순서로 수행될 수 있다. 그리고, 적절하다면, 둘 이상의 단계의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 재료, 양, 및 절차는 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 본 발명의 범주 및 사상에 따라 넓게 해석되어야 한다는 것을 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1
TIPS 막의 제조
R1901-11 막
다중구역 미세다공성 폴리프로필렌 막 (본 명세서에서 R1901-11로서 지정됨)을 국제 특허 공개 제WO2010/078234 호에서 기술된 바와 같이 40 ㎜ 이축 압출기 및 25 ㎜ 이축 압출기 둘다를 사용해 제조하였다. 2 개의 압출기로부터의 용융 스트림을 다중-매니폴드 다이를 통해 단일 시트 내로 캐스팅하였다.
용융 스트림 1. 폴리프로필렌 (PP) 수지 펠렛 (미국 펜실베니아주 필라델피아(Philadelphia, PA) 소재의 서노코 케미칼즈(Sunoco Chemicals)의 F008F) 및 핵화제 (미국 사우스캐롤라이나주 스파탠버그(Spartanburg, SC) 소재의 밀리켄 케미칼즈(Milliken Chemical)의 밀라드(MILLAD) 3988)를 250 rpm의 축 속도를 유지하는 40 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제 (미국 캘리포니아주 산 레이몬(San Ramon, CA) 소재의 쉐브론 코프.(Chevron Corp.)의 미네랄 오일 슈퍼라 화이트 31(Mineral Oil SUPERLA White 31))를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 29.25%/70.7%/0.05%였다. 총 압출 속도는 약 13.6 ㎏/hr (30 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 271℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
용융 스트림 2. PP 수지 펠렛 및 밀라드 3988을 125 rpm의 축 속도를 유지하는 25 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 29.14%/70.7%/0.16%였다. 총 압출 속도는 약 2.72 ㎏/hr (6 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 271℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
다중구역 필름을 177℃로 유지시킨 다중-매니폴드 다이로부터 패턴화된 캐스팅 휠(casting wheel) 상으로 캐스팅하였다. 캐스팅 휠의 온도는 60℃에서 유지시켰고, 캐스팅 속도는 3.35 m/분 (11 ft/분)이었다. 생성 필름을 용매 내에서 일렬로 세정해서, 필름 내의 광유를 제거한 다음 공기 건조시켰다. 세정된 필름은, 제각기 길이 및 가로 방향으로 연속해서 1.8 × 2.80으로 99℃ 및 154℃에서 배향시켰다.
R1901-8B 막
다중구역 미세다공성 폴리프로필렌 막 (본 명세서에서 R1901-8B로서 지정됨)을 국제 특허 공개 제WO2010/078234 호에서 기술된 바와 같이 40 ㎜ 이축 압출기 및 25 ㎜ 이축 압출기 둘다를 사용해 제조하였다. 2 개의 압출기로부터의 용융 스트림을 다중-매니폴드 다이를 통해 단일 시트 내로 캐스팅하였다.
용융 스트림 1. 폴리프로필렌 (PP) 수지 펠렛 (미국 펜실베니아주 필라델피아 소재의 서노코 케미칼즈의 F008F) 및 핵화제 (미국 사우스캐롤라이나주 스파탠버그 소재의 밀리켄 케미칼즈의 밀라드 3988)를 250 rpm의 축 속도를 유지하는 40 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제 (미국 캘리포니아주 산 레이몬 소재의 쉐브론 코프.의 미네랄 오일 슈퍼라 화이트 31)를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 29.254%/70.7%/0.045%였다. 총 압출 속도는 약 12.2 ㎏/hr (27 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 271℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
용융 스트림 2. PP 수지 펠렛 및 밀라드 3988을 125 rpm의 축 속도를 유지하는 25 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 28.146%/70.7%/0.154%였다. 총 압출 속도는 약 4.08 ㎏/hr (9 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 271℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
다중구역 필름을 177℃로 유지시킨 다중-매니폴드 다이로부터 패턴화된 캐스팅 휠 상으로 캐스팅하였다. 캐스팅 휠의 온도는 60℃에서 유지시켰고, 캐스팅 속도는 3.52 m/분 (11.54 ft/분)이었다. 생성 필름을 용매 내에서 일렬로 세정해서, 광유 희석제를 제거한 다음 공기 건조시켰다. 세정된 필름은, 제각기 길이 및 가로 방향으로 연속해서 1.6 × 2.85로 99℃ 및 154℃에서 배향시켰다.
R1933-7 막
다중구역 미세다공성 폴리프로필렌 막 (본 명세서에서 R1933-7로서 지정됨)을 국제 특허 공개 제WO2010/078234 호에서 기술된 바와 같이 40 ㎜ 이축 압출기 및 25 ㎜ 이축 압출기 둘다를 사용해 제조하였다. 압출기로부터의 2 개의 용융 스트림을 다중-매니폴드 다이를 통해 단일 시트 내로 캐스팅하였다.
용융 스트림 1. 폴리프로필렌 (PP) 수지 펠렛 (미국 펜실베니아주 필라델피아 소재의 서노코 케미칼즈의 F008F) 및 핵화제 (미국 사우스캐롤라이나주 스파탠버그 소재의 밀리켄 케미칼즈의 밀라드 3988)를 175 rpm의 축 속도를 유지하는 40 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제 (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 브렌택 그레이트 레익스 엘씨씨(Brenntag Great Lakes LCC)의 케이돌(Kaydol) 350 광유)를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 34.247%/65.7%/0.053%였다. 총 압출 속도는 약 14.5 ㎏/hr (32 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 271℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
용융 스트림 2. PP 수지 펠렛 및 밀라드 3988을 150 rpm의 축 속도를 유지하는 25 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 29.14%/70.7%/0.16%였다. 총 압출 속도는 약 2.72 ㎏/hr (6 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 254℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
다중구역 필름을 177℃로 유지시킨 다중-매니폴드 다이로부터 패턴화된 캐스팅 휠 상으로 캐스팅하였다. 캐스팅 휠의 온도는 71℃에서 유지시켰고, 캐스팅 속도는 5.79 m/분 (19.00 ft/분)이었다. 생성 필름을 용매 내에서 일렬로 세정해서, 광유 희석제를 제거한 다음 공기 건조시켰다. 세정된 필름은, 제각기 길이 및 가로 방향으로 연속해서 1.5 × 2.70으로 99℃ 및 160℃에서 배향시켰다.
R1933-18 막
다중구역 미세다공성 폴리프로필렌 막 (본 명세서에서 R1933-18로서 지정됨)을 국제 특허 공개 제WO2010/078234 호에서 기술된 바와 같이 40 ㎜ 이축 압출기 및 25 ㎜ 이축 압출기 둘다를 사용해 제조하였다. 압출기로부터의 2 개의 용융 스트림을 다중-매니폴드 다이를 통해 단일 시트 내로 캐스팅하였다.
용융 스트림 1. 폴리프로필렌 (PP) 수지 펠렛 (미국 펜실베니아주 필라델피아 소재의 서노코 케미칼즈의 F008F) 및 핵화제 (미국 사우스캐롤라이나주 스파탠버그 소재의 밀리켄 케미칼의 밀라드 3988)를 고체 공급기를 사용해 호퍼(hopper) 내로 도입하였고, 175 rpm의 축 속도를 유지시킨 40 ㎜ 이축 압출기 내로 물질을 공급하였다. 광유 희석제 (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 브렌택 그레이트 레익스 엘씨씨의 케이돌 350 광유)를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 34.247%/65.7%/0.053%였다. 총 압출 속도는 약 14.5 ㎏/hr (32 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 271℃에서 177℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
용융 스트림 2. PP 수지 펠렛 및 밀라드 3988을 150 rpm의 축 속도를 유지하는 25 ㎜ 이축 압출기 내로 도입하였다. 광유 희석제를 저장기로부터 압출기 내로 따로 공급하였다. PP/희석제/핵화제의 중량비는 28.98%/70.7%/0.32%였다. 총 압출 속도는 약 2.72 ㎏/hr (6 lb/hr)이었고, 압출기의 8 개의 구역은 260℃에서 194℃로 감소하는 온도 프로파일을 제공하도록 설정하였다.
다중구역 필름을 177℃로 유지시킨 다중-매니폴드 다이로부터 패턴화된 캐스팅 휠 상으로 캐스팅하였다. 캐스팅 휠의 온도는 52℃에서 유지시켰고, 캐스팅 속도는 5.84 m/분 (19.15 ft/분)이었다. 생성 필름을 용매 내에서 일렬로 세정해서, 광유 희석제를 제거한 다음 공기 건조시켰다. 세정된 필름은, 제각기 길이 및 가로 방향으로 연속해서 1.7 × 2.75로 99℃ 및 160℃에서 배향시켰다.
실시예 2
TIPS 막의 표면 코팅
4-중량% 스팬20(SPAN20) (미국 델라웨어주 뉴 캐슬(New Castle, DE) 소재의 유니케마(Uniqema)) 용액은 계면활성제를 2-프로판올 (미국 메사추세츠주 와드 힐(Ward Hill, MA) 소재의 알파 아에사르(Alfa Aesar)) 내에서 용해시킴으로써 제조하였다.
TIPS 미세다공성 막은 폴리에틸렌(PE) 백 내에서 상기 계면활성제 용액으로 포화시켰다. 막은 즉시 포화되었고, PE 백을 문지름으로써 과량의 표면 용액을 제거하였다. 막은 백으로부터 제거되었고 공기에 노출되어 막을 완전히 건조시켰다. 건조된 막은 실온에서 PE 백에 보관하였다.
실시예 3
TIPS 막의 표면 개질화
TIPS 막은 2010 년 6 월 4 일에 출원된 명칭이 "코팅된 다공성 물질의 제조 방법(Process for Making Coated Porous Materials)"인 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/351,447 호에서 기술된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 코팅시켰다.
5-중량% 에발(EVAL) 스탁 용액은, 70 ℃ 내지 80℃의 온도의 수조에서 44 몰% 에틸렌 함량 (에발44, 미국 미주리주 세인트루이스(St Louis, MO, USA) 소재의 시그마-알드리치 코.(Sigma-Aldrich Co.))과 함께 에틸렌-비닐 알코올 공중합체 (EVAL)를 에탄올 (미국 켄터키주 쉘바이빌(Shelbyville, KY) 소재의 아에퍼 알코올 앤드 케미칼 코.(AAPER Alcohol and Chemical Co.))/물 용매 혼합물 (70 부피% 에탄올) 내에서 용해시켜서 제조하였다.
상기 스탁 용액으로부터, 용액은 에탄올/물 혼합물 용매 (70 부피% 에탄올) 내에 1-중량% 에발44, 2-중량% 에쓰알(SR)@610 (미국 펜실베니아주 워링톤(Warrington, PA) 소재의 사토머(Sartomer)), 1중량% 반응성 광개시제 바즈피아(VAZPIA) (2-[4-(2-하이드록시-2-메틸프로파노일)페녹시]에틸-2-메틸-2-N-프로페노일아미노 프로파노에이트, 미국 특허 제5,506,279 호에 개시된 바와 같음)를 함유하도록 제조하였다.
TIPS 미세다공성 막은 무거운 중량의 PE 백 내에서 상기 코팅 용액을 이용해 포화시켰다. 포화된 막을 PE 백으로부터 제거한 후에, 종이 타월로 닦아서 과량의 표면 용액을 제거하도록 시도하였다. 실온에서 10 시간 내지 12 시간 동안 용매 증발시켜 막이 건조되도록 하였다. 다음, 건조된 막을 20-중량% NaCl 수용액으로 포화시켰다. 그런 후, 콘베이어 벨트 상에서 H-벌브를 이용한 질소 불활성 퓨전 UV 시스템에 막을 통과시켰다. 벨트의 속도는 0.10 m/s (20 분 당 피트 (fpm))였다. 반대쪽 막의 측면은 광원과 마주하고 있으면서 막을 동일한 속도로 다시 UV 시스템을 통해 보냈다. 경화된 막 샘플을 과량의 탈이온수에서 세정하였고, 완전히 건조될 때까지 90℃에서 1 시간 내지 2 시간 동안 건조시켰다. 건조된 막은 실온에서 PE 백에 보관하였다.
실시예 4
폴리아크릴로니트릴 (PAN) 막의 제조
다양한 PAN 막을 한국 특허 출원 제KR20040040692 호에서 개시된 바와 같이 제조하였다. 10.5-중량%의 폴리아크릴로니트릴 (분자량 150,000)을 N,N-다이메틸아세트아미드(DMAC) 내에서 제조하였다. 주사기 펌프를 사용해, 일정한 유동의 PAN 중합체 용액 (50 ㎕/분/구멍)을 높은 전압원에 연결된 주사기 내로 공급하였다. 90 Kv 내지 100 Kv의 전기력을 도입하여 중합체 용액이 공기 내로 배출되게 하고 PAN 나노섬유가 형성되게 하는 전자기력을 형성시켰다. 전기방사 과정 후에, 수합된 PAN 나노섬유는 면과 유사하고 필름 및/또는 막의 벌키성과는 다른 벌키성을 가졌다. 벌키성을 감소시키고 전기방사된 PAN 나노섬유의 구조적 온전성을 증가시키기 위해, 후처리 (가열 캘린더링 과정)를 140℃ 및 10 kgf/㎤ 내지 20 kgf/㎤ 압력에서 수행하였다. PAN 나노섬유를 실온에서 PE 백에서 롤로서 보관하였다.
실시예 5
막의 특징화
a) 유수량 속도 측정
막의 47 ㎜ 디스크를 다이 펀치를 사용해 절단하였고, 막 디스크를 젤맨 자기 홀더(Gelman magnetic holder) (미국 미시간주 앤 아버(Ann Arbor, MI) 소재의 젤맨 사이언시즈 인크.(Gelman Sciences, Inc.)) 내에서 마운팅(mounting)하였다. 홀더 내 활성 막 직경은 34 ㎜였다. 100 ㎖의 물을 홀더에 첨가하였고, 약 79.6 ㎪ (23.5 인치의 수은)의 진공 압력을 진공 펌프 (미국 미시간주 벤톤 하버(Benton Harbor, MI) 소재의 개스트 매뉴펙처링 인크.(GAST Manufacturing, Inc.))를 사용해 적용하여 물이 막을 통해 끌어내지게 하였다. 물이 막을 통해 통과하는 시간을 스톱워치를 이용해 기록하였다. 유수량 속도 (플럭스)를 시간, 진공 압력, 및 막의 면적을 사용해 계산하였고, L/(㎡.h.psi)로 표현하였다.
b) 기포점 기공 크기 측정
막의 기포점 기공 크기를 ASTM-F316-03에 따라 측정하였다. 막을 아이소프로판올 또는 FC-43 (미국 미네소타주 세인트 폴(St Paul, MN) 소재의 쓰리엠 코.(3M Co.)), 또는 액체 갈윅(galwick) (미국 뉴욕주 이타카(Ithaca, NY) 소재의 포러스 머티리얼즈 인크.(Porous Materials, Inc., PMI)) 으로 예비 습윤시켰고, 테스팅 홀더 상에 마운팅하였다. 가압된 질소 기체를, 다른 면에서 검출된 기체 유동이 100%에 도달할 때까지 막의 한 쪽 면에 서서히 적용하였다. 막을 통하는 100% 기체 유동에서의 압력을 기록하였고, 이를 사용해 기포점 기공 크기를 계산하였다.
TIPS 막 가공 조건은 하기 표 1에 요약한다.
다양한 막에 대한 물 플럭스 속도 및 기포점 기공 크기를 하기 표 2에서 제시한다.
[표 1]
Figure pct00002

[표 2]
Figure pct00003

c) 막의 주사 전자 현미경
PAN 막에 대해, 샘플의 각각으로부터의 필터를 알루미늄 스터브(stub) 상에 마운팅하였다. TIPS 막에 대해, 샘플의 각각으로부터의 2 개의 부분을 제거하였고, 알루미늄 스터브 상에서 마운팅하여 "촘촘한" 표면과 "열린" 표면 둘다를 보이게 하였다. 액체 질소 하에 찢어서, TIPS 막의 각각의 단면을 또한 만들었다. 이들을 추가의 스터브 상에 마운팅하였다. 모든 표본을 금/백금으로 스퍼터 코팅시켰고, 제올 7001에프 필드 에미션 주사 전자 현미경(JEOL 7001F Field Emission Scanning Electron Microscope)을 사용해 검사하였다. 디지탈 현미경사진은 샘플의 표면 형태를 이미지화하는 데 사용되는 기법인 2차 전자 이미징(secondary electron imaging, SEI)의 산물이었다. 스터브의 표면 또는 섹션된 면에 수직인 시야각에서 (수직으로) 모든 현미경사진을 취하였다. 다양한 배율에서 이미지를 포착하였고, 배율은 제시된 이미지 상에 나타나 있다. "촘촘한" 표면과 "열린" 표면 (측면 또는 구역이라고도 함)은 각각의 단면에 대한 이미지에서 나타나 있다. 길이 표시는 또한, 도 1 내지 6의 각각의 현미경사진의 하위부에서 제시되어 있다.
실시예 6
실시예에서 사용된 박테리아
실시예에서 사용된 다양한 박테리아 (표 3)는 ATCC (미국 버지니아주 마나싸스(Manassas, VA) 소재)로부터 입수하였다.
[표 3]
Figure pct00004

박테리아 균주의 순수한 배양물을 트라입틱 쏘이 브로쓰(Tryptic Soy Broth) (TSB, 미국 뉴저지주 프랭클린 레익스(Franklin Lakes, NJ) 소재의 BD) 내에 접종시키고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 버터필드 인산염 완충액(Butterfield phosphate buffer) (미국 뉴저지주 피스카타웨이(Piscataway, NJ) 소재 와트만(Whatman))에서 단계 희석시켜, 물 샘플 내로 스파이킹(spiking)할 콜로니 형성 단위(cfu)를 ㎖ 당 원하는 양만큼 수득하였다. 박테리아를, 제조업자의 지시에 따라 3M 페트리필름(PETRIFILM) 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트(Coliform Count Plates) (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M 코.) 상에서 적절한 희석물을 플레이팅함으로써 정량화하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기 (3M 코.)를 사용해 판독하고, 콜로니 형성 단위 (cfu)를 측정하였다.
실시예 7
여과 후 직접 성장에 의한, 스파이킹된 물 샘플로부터의 이. 콜라이의 회수
트라입틱 쏘이 브로쓰 (TSB) 내, 37℃에서 이. 콜라이를 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 100 cfu를 수득하였다. 47 ㎜ 막을 시트나 디스크로부터 절단하였고, 깔때기, 프릿티드 베이스(fritted base) (미국 메사추세츠주 빌레리카(Billerica, MA) 소재의 밀리포어(Millipore))가 있는 멸균 유리 필터 홀더 조립체 상에 두었다. 필터 홀더를 4L 진공 여과 플라스크에 연결하였다. 용액을, 에어 카데트 진공/압력 스테이션(AIR CADET Vacuum/Pressure Station) (미국 일리노이주 베링톤(Barrington, IL) 소재의 버난트 컴퍼니(Barnant Company)의 모델 번호 420-3901)을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은) 의 진공 압력에서 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하였고, 혈액 한천 또는 트라입틱 쏘이 한천 플레이트 (미국 캘리포니아주 산타 마리아(Santa Maria, CA) 소재의 하디 다이아그노스틱스(Hardy Diagnostics)) 상에 두었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 막에서 성장하는 콜로니를 계수하여 콜로니 형성 단위 (cfu)를 측정하였다. 수득된 결과는 하기 표 4에서 제시된다. 시험된 모든 막은 73% 초과의 회수를 보여주었고, 더 작은 기공 크기의 막 (<0.5 ㎛)은 90% 초과의 회수를 보여주었다.
[표 4]
Figure pct00005

실시예 8
여과 후 용출에 의한, 스파이킹된 물 샘플로부터 이. 콜라이의 회수
이. 콜라이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 100 cfu를 수득하였다. 47 ㎜ 막을 시트나 디스크로부터 절단하였고, 멸균 진공 여과 장치 상에 두었다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하였고, 5 ㎖의 0.2% 트윈-20 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.)이 든 멸균 폴리스티렌 50-㎖ 원심분리 튜브 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈)에 첨가하였고, 실온에서 1 분 내지 2 분 동안 와동시켰다 (미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알(VWR)의 픽스드 스피드 볼텍스 믹서(Fixed Speed Vortex Mixer)). 용액을, 제조업자의 지시에 따라 3M 페트리필름 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트 (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M 코.) 상에 두었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기 (3M 코.)를 사용해 판독하고, 콜로니 형성 단위 (cfu)를 측정하였다. 수득된 결과는 하기 표 5에서 제시된다. 결과는 전형적인 실험의 대표이다. 약 100 cfu의 이. 콜라이로 스파이킹된 1000 ㎖의 물 샘플로부터, 회수의 범위는 28.6% 내지 72.9%였다. 처리된 TIPS 막 및 하나의 PAN 막 (PAN-3)에 대해, 회수는 45% 내지 72.9%로 다양하였다. TIPS 막 R1933-18/스팬 (0.2 ㎛)은, 그것이 1 리터의 물을 여과하는 데 25 분이 걸리는 만큼 느린 플럭스 속도를 가졌다. R1933-7/스팬 (0.34 ㎛)은 양호한 플럭스 속도를 가졌다. 두 막 모두 여과된 박테리아의 양호한 회수를 보여주었다. 2 개의 시중의 막에 대해, 회수는 28.6% 내지 35.7%의 범위였다.
[표 5]
Figure pct00006

실시예 9
여과 및 이어서 용출에 의한, 스파이킹된 물 샘플로부터 박테리아의 회수에 대한 다양한 추출용제의 효과
이. 콜라이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 100 cfu를 수득하였다. 47 ㎜ 막을 시트나 디스크로부터 절단하였고, 멸균 진공 여과 장치 상에 두었다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하였고, 5 ㎖의 다양한 추출용제가 든 멸균 폴리스티렌 50-㎖ 원심분리 튜브 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈)에 첨가하였고, 실온에서 1 분 내지 2 분 동안 와동시켰다 (미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알의 픽스드 스피드 볼텍스 믹서). 용액을 제조업자의 지시에 따라 3M 페트리필름이 콜라이/콜리포름 계수 플레이트 상에 두었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다. 수득된 결과는 하기 표 6에서 제시된다. 0.2% 트윈-20 및 인산염 완충액 (PBS, 미국 캘리포니아주 칼스바드(Carlsbad, CA) 소재의 인비트로겐(Invitrogen))의 사용은, 트리톤-X-100 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.)이나 물보다 더 양호한 회수를 보여주었다. 트윈-20을 이용한 경우, 회수 범위는 35% 내지 77%였고, 한편 PBS를 이용해서는 33% 내지 79%였다. 멸균 밀리-Q 물 (미국 메사추세츠주 빌레리카(Billerica, MA) 소재의 밀리포어 코프.) 및 트리톤-X-100을 이용하면, 회수가 단지 11% 내지 46%였다.
[표 6]
Figure pct00007

실시예 10
박테리아의 회수에 대한 트윈-20 농도의 효과
이. 콜라이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 100 cfu를 수득하였다. 47 ㎜ 막을 시트나 디스크로부터 절단하였고, 멸균 진공 여과 장치 상에 두었다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하였고, 5 ㎖의 다양한 농도의 트윈-20이 든 멸균 폴리스티렌 50-㎖ 원심분리 튜브 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈)에 첨가하였고, 실온에서 1 분 내지 2 분 동안 와동시켰다 (미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알의 픽스드 스피드 볼텍스 믹서). 용액을 제조업자의 지시에 따라 3M 페트리필름 이 콜라이/콜리포름 계수 플레이트 상에 두었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다. 수득된 결과는 하기 표 7에서 제시된다. 0.1% 또는 0.2% 트윈-20을 사용하면, 시험된 모든 막으로부터 최상의 회수를 제공하였다.
[표 7]
Figure pct00008

실시예 11
막으로부터 박테리아를 회수하는 다양한 방법의 효과
이. 콜라이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 100 cfu를 수득하였다. 47 ㎜ 막을 시트나 디스크로부터 절단하였고, 멸균 진공 여과 장치 상에 두었다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 멸균 제거하였고, 5 ㎖의 0.2% 트윈-20이 든 멸균 폴리스티렌 50-㎖ 원심분리 튜브 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈)에 첨가하였다. 튜브를 초음파분해기 (브랜슨(Branson) 2200, 미국 신시내티주 댄스버리(Dansbury, CT) 소재의 브랜슨 울트라소닉스(Branson Ultrasonics))를 사용해 5 분 동안 초음파분해하였고, 1 분 내지 2 분 동안 와동시키거나 (미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재의 브이더블유알의 픽스드 스피드 볼텍스 믹서) 오비탈 쉐이커 (뉴브런스윅 사이언티픽 진탕기, 모델 이노바 4000)에서 실온에서 10 분 동안 진탕시켰다. 용액을 제조업자의 지시에 따라 3M 페트리필름 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트 상에 플레이팅하였고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다 수득된 결과는 하기 표 8에서 제시된다.
[표 8]
Figure pct00009

실시예 12
폼 용출을 사용한 막으로부터의 박테리아의 회수
이. 콜라이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 50 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 100 cfu를 수득하였다. 25 ㎜ 막을 시트나 디스크로부터 절단하고, 25 ㎜ 스위넥스(Swinnex) 필터 홀더 (미국 메사추세츠주 빌레리카소재의 밀리포어 코프.) 내에 두었다. 필터 홀더를 진공 매니폴드 (미국 메사추세츠주 밀포드 소재의 와터스 코포레이션)에 부착시켰고, 50 ㎖ 주사기를 필터 홀더의 다른 말단에 부착시켰다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 스파이킹된 물 샘플을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막이 있는 필터 홀더를 HSC 40 벤치-탑 농축기(bench-top concentrator) (미국 미주리주 드렉셀(Drexel, MO) 소재의 이노바프렙(InnovaPrep))에 부착시켰다. 이 시스템은 추출용제 용액의 폼을 생성하였고, 박테리아는 막을 통해 폼 (1 ㎖의 0.05% 트윈-20)을 통과시켜서 용출시켰다.
추출된 용액을 제조업자의 지시에 따라 3M 페트리필름 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트 상에 플레이팅하였고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다. 수득된 결과는 하기 표 9에서 제시된다. 폼 용출 방법은 생물학적 유기체를 소 부피로 용출시키는 이점을 제공하고, 용출된 물질의 추가의 농축 없이도 핵산을 쉽게 추출할 수 있게 한다.
[표 9]
Figure pct00010

실시예 13
스파이킹된 물 샘플로부터 박테리아의 회수, 이어서 성장
이. 콜라이, 살모넬라 엔테리카 엔테리카 아종, 및 엔테로코커스 파에칼리스를 37℃에서 TBS에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 10 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 10 cfu를 수득하였다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하고, 10 ㎖의 테리픽 브로쓰(Terrific broth, TB) 또는 트라입틱 쏘이 브로쓰(TSB)가 있는 멸균 폴리스티렌 50-㎖ 원심분리 튜브 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈)에 첨가하고, 뉴브런스윅 사이언티픽 진탕기 모델 이노바 4000 내, 37℃, 300 rpm에서 2 시간 동안 교반하였다. 10 ㎖ TB 내로 약 10 cfu (100 ㎕의 102 cfu/㎖)를 스파이킹함으로써 대조군 튜브를 설정하였고 이를 유사하게 성장시켰다. 2 시간이 끝날 때쯤, 튜브의 성장 배지를 3M 페트리필름 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트 (이. 콜라이용) 및 에어로빅 계수 플레이트(Aerobic Count Plates) (에쓰. 엔테리카(S. enterica) 및 엔테로코커스 파에칼리스용)에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다. 투입 세포 수를 사용해 배수-증가를 계산하였다.
[표 10]
Figure pct00011

[표 11]
Figure pct00012

[표 12]
Figure pct00013

[표 13]
Figure pct00014

[표 14]
Figure pct00015

[표 15]
Figure pct00016

실시예 14
스파이킹된 물 샘플로부터의 콜리포름 박테리아의 회수, 이어서 성장
이. 콜라이, 엔테로박터 아에로게네스, 엔테로박터 클로아카에, 시트로바터 프레운디이, 및 시트로바터 브라아키이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 100 cfu/㎖을 수득하였고, 0.4 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 40 cfu를 수득하였다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하고, 10 ㎖의 테리픽 브로쓰(TB, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.) 또는 트라입틱 쏘이 브로쓰(TSB, 미국 캘리포니아주 산 호세)가 있는 멸균 폴리스티렌 50-㎖ 원심분리 튜브 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈)에 첨가하고, 뉴브런스윅 사이언티픽 진탕기 모델 이노바 4000 내, 37℃, 300 rpm에서 2.5 시간 또는 3 시간 동안 교반하였다. 10 ㎖ TB 내로 약 40 cfu (400 ㎕의 100 cfu/㎖)를 스파이킹함으로써 대조군 튜브를 설정하였고, 이를 유사하게 성장시켰다. 인큐베이션 기간이 끝날 때쯤, 튜브의 성장 배지를 3M 페트리필름 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다. 투입 세포 수를 사용해 배수-증가를 계산하였다.
[표 16]
Figure pct00017

[표 17]
Figure pct00018

실시예 15
PCR에 의한 이. 콜라이의 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 개발
2 가지 이. 콜라이 유전자 uidA (b-글루코로니다아제를 코딩함) 및 tufA (단백질 사슬 신장 인자 EF-Tu를 코딩함)를 표적 유전자로서 선별하였다. 진뱅크(GenBank)에서 입수가능한 모든 서열의 배열을 바탕으로 PCR 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 디자인된 프라이머는:
uidA: 포워드 프라이머 5'-TCTACTTTACTGGCTTTGGTCG-3' (서열 목록 번호:1)
리버스 프라이머 5'-CGTAAGGGTAATGCGAGGTAC-3' (서열 목록 번호:2)
프로브 5'-6-FAM-AGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGC-3'-Iowablack FQ (서열 목록 번호:3)
tufA: 포워드 프라이머: 5'-TCACCATCAACACTTCTCACG-3' (서열 목록 번호:4)
리버스 프라이머: 5'-CAGCAACTACCAGGATCGC-3' (서열 목록 번호:5)
프로브: 5'-6-FAM- TGAATACGACACCCCGACCCG-3'-Iowablack FQ (서열 목록 번호:6)이었다.
미국 아이오와주 코랄빌(Coralville, IA) 소재의 IDT DNA 테크놀로지스(IDT DNA Technologies)에 의해 프라이머 및 프로브를 합성하였다. 10 ㎕ 2x 택맨 패스트 유니버셜 마스터 믹스(TaqMan Fast Universal Master Mix) (미국 캘리포니아주 포스터 시티(Foster City, CA) 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 및 5 ㎕의 DNA 주형과 함께, 디자인된 프라이머를 250 nM 내지 500 nM에서 그리고 프로브를 125 nM 내지 250 nM에서 사용하였다. 또한, 영국 사우스햄스턴(Southampton, UK) 소재의 프라이머 디자인 엘티디(Primer Design Ltd) 및 미국 알라바마주 버밍험(Birmingham, Alabama) 소재의 바이오지엑스(BioGx) (이. 콜라이 종 스콜피온스)로부터 이. 콜라이 검출용의 시판의 시약 (이. 콜라이 표준 키트의 정량화)을 제조업자의 지시에 따라 사용하였다.
이. 콜라이 세포를 버터필드 인산염 완충액 내에서 단계 희석시켰고, 100 ㎕의 프렙맨(PrepMan) 울트라 샘플 프렙 시약 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 25 ㎕의 박테리아 희석액과 함께 혼합하고 10 분 동안 끓임으로써 DNA 주형을 제조하였다. 끓여진 현탁액을 냉각시키고, 14,000 RPM에서 2 분 동안 회전시켰고, 상층액을 깨끗한 튜브에 옮겼다. 5 ㎕의 DNA 샘플을 20 ㎕의 반응 혼합물 (프라이머, 프로브, 및 효소 혼합물)이 든 96-웰 PCR 플레이트에 첨가하였다. 하기 조건에 따라 ABI 7500 서열 검출 시스템을 사용해 열 순환을 수행하였다: 변성을 위해 95℃에서 2 분, 및 이어서: 95℃에서 20 초 그리고 60℃에서 1 분의 40 순환. 하기 제시된 바와 같이, PCR을 이용한 검출의 한계는 약 100 cfu였다.
[표 18]
Figure pct00019

실시예 16
PCR 에 의한, 스파이킹된 물 샘플로부터의 박테리아의 검출
이. 콜라이를 37℃에서 TBS 내에서 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석시켜서 대략 10 cfu/㎖을 수득하였고, 1 ㎖의 용액을 1000 ㎖의 멸균수에 첨가해서 대략 10 cfu를 수득하였다. 에어 카데트 진공/압력 스테이션을 사용해 약 67.7 ㎪ (20 인치의 수은)의 진공 압력에서 이 용액을 다양한 막을 통해 여과시켰다. 막을 무균 제거하고, 10 ㎖의 TB (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.)가 있는 50-㎖ 튜브에 첨가하고, 뉴브런스윅 사이언티픽 진탕기, 모델 이노바 4000 내에서 37℃, 300 rpm에서 2 시간 동안 진탕시켰다. 10 ㎖ TB 내로 약 10 cfu (100 ㎕의 102 cfu/㎖)를 스파이킹함으로써 대조군 튜브를 설정하였고 이를 유사하게 성장시켰다. 모든 샘플을 이중으로 설정하였다. 두 시간이 끝날 때쯤, 한 세트의 튜브의 성장 배지를 3M 페트리필름 이. 콜라이/콜리포름 계수 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3M 페트리필름 플레이트 판독기를 사용해 판독하였고, 콜로니 형성 단위(cfu)를 측정하였다.
다른 설정의 튜브로부터, 세포를 함유하는 성장 배지를 5000 rpm에서 20 분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화시켰다. 키아젠 미니(Qiagen Mini) DNA 추출 키트를 사용해 제조업자의 지시에 따라 DNA를 추출하였고, DNA를 10 ㎕에서 용출하였다. 5 ㎕의 추출된 DNA를 20 ㎕ PCR 어세이 혼합물에 첨가하였고, PCR을 상기 기술된 바와 같이 uidA 유전자용 프라이머 및 프로브 (프라이머 디자인 키트)를 이용해 수행하였다. 여과 및 이어서 성장 그리고 PCR에 의한 검출까지의 전체 과정은 약 4 시간 걸렸다.
하기 제시된 바와 같이, 배수-증가는 5 배 내지 18 배로 다양하였다. 10 cfu의 이. 콜라이를 이용해 스파이킹된 1000 ㎖ 물 샘플로부터, 개질된 TIPS 막은 9 배 내지 18 배 증가를 보여주었고, PCR에 의해 양성으로 나타났다. 시중의 막은 단지 5 배 내지 6 배 증가를 보여주었고, 표적 DNA의 어떠한 증폭도 나타내지 않았다.
[표 19]
Figure pct00020

실시예 17
폴리프로필렌 막을 이용한 백( bag )의 제조 및 평가
2-프로판올 (미국 메사추세츠주 와드 힐 소재의 알파 아에사르) 내에서 소르비톨 모노라우레이트 (미국 델라웨어주 뉴 캐슬 소재의 크로다로부터 입수가능한 스팬 20)을 용해시킴으로써 4 중량% 계면활성제 용액을 제조하였다. R1930-10, R1901-11, 및 R1901-8B 막 (표 1)을 충분한 계면활성제 용액이 있는 폴리에틸렌 (PE) 백에 따로 두어서 이들을 포화시켰다. 막은 즉시 포화되었다. 백을 문질러서 과량의 계면활성제 용액을 제거하여, 백 밖으로 용액을 짜 내었다. 막을 백으로부터 제거하고, 실온에서 공기 건조시켰다. 처리 막 및 미처리 막에 대한 특성을 표 2에서 제시된 특성에 대해 특징화하였다. 촘촘한 구역 두께는 더 작은 기공 크기를 갖는 층의 대략적인 두께를 말한다. 건조된 막을 사용할 때까지 플라스틱 백에 보관하였다.
도 11 및 12에서 제시된 디바이스와 유사한 백 농축 디바이스로서 막을 제작하였다. 각각의 막을 포함하는 백을 동일한 방식으로 제작하였다. 20.3 ㎝ × 20.3 ㎝ (8 인치 × 8 인치) 지프락 폴리에틸렌 백 (미국 위스콘신 주 레이신(Racine, WI) 소재의 S.C.존슨 & 선 인크.(S.C.Johnson & Son, Inc.))을 밀봉된 가장자리를 따라 절단하고, 2 조각으로 분리하였다. 건조된 막의 단일 층을 3 개의 직각 12.7 ㎝ (5 인치) 측면 및 약 6.9 ㎝ (2.7 인치)인 2 개의 등변 측면을 갖는 오각형 모양으로 절단하였다. 막을, 부직포 시트과 마주하고 있는 다중구역 막의 열린 측면과 동일한 치수를 갖는 폴리프로필렌 부직포 시트 (미국 사우스캐롤라이나 찰스톤(Charleston, SC) 소재의 리메이 인크.(Reemay Inc)의 타이파(TYPAR)) 위에 쌓았다. 다음, 적층물을 지프락 밀봉체와 마주하는 정사각형 모양 및 백의 바닥 근처에서 v-모양을 형성하는 삼각형을 갖는 지프락 백의 한 조각의 내부 표면 상에, 그리고 백의 내부면과 마주하는 막의 촘촘한 면에 두었다. 도 11은 하기 성분을 갖는 백 농축 디바이스(10)의 분해도를 보여준다: 지프락 백 시트 (밀폐구 성분(13a 및 13b)과 교합하고 있는 용기 성분(12a 및 12b)), 폴리프로필렌 부직포 시트 (부직포 배킹(20)), 필터 막(14), 및 초강력흡수제 입자 (흡수제 부재(16)). 막 및 부직포 펜타곤의 4 개의 모서리를 지프락 백에 가열 밀봉시켜서 도 12에서 제시된 바와 같이 열린 채 있는 백의 최상부에서 지프락 밀봉체와 마주하고 있는 펜타곤의 12.7 ㎝ (5 인치) 면과 함께 파우치를 형성하였다. 다음, 지프락 백의 2 개의 면을 가열 밀봉시켜서 (밀봉체(26)), 부직포가 도 8에서 제시된 하나의 백과 유사한 농축 백을 형성하는 백의 반대쪽 벽과 마주하게 하였다.
3.8 g의 초강력흡수제 하이드로 겔 입자 (폴리아크릴레이트-폴리알코올)를 파우치 외부의 각각의 백 내로 두어서, 각각의 백을 평가하였다. 각각의 시험에 대해, 1.125 ㎖의 에틸렌 옥사이드/프로필렌 옥사이드 계면활성제 플루로닉(Pluronic) L64 (PL64, 미국 뉴저지주 마운트 올리브 소재의 바스프로부터 입수가능함)를 첨가함으로써 브로쓰를 제조하였고, 0.45 g의 소 혈청 알부민 (BSA, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.)을 0.5% PL64 및 0.2% BSA의 최종 농도가 되게 퀵-인리치(Quick-Enrich) TSB (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M 코.)로서 수득된 225 ㎖의 멸균된 트라입틱 쏘이 브로쓰 (TSB)에 첨가하였다. 다음, 브로쓰에 대략 105 cfu (콜로니 형성 단위)/㎖의 리스테리아 이노쿠아 (ATCC 33090)가 함유된 225 ㎕의 버터필드 인산염 완충액을 접종하였다. 다음, 박테리아 브로쓰를 농축 백 파우치 (막의 촘촘한 측면) 내에 부었고, 약 3 ㎖의 용액이 파우치 내에 머무를 때까지 (20 분 내지 30 분) 실온에서 벤치에서 위쪽으로 받쳐 두었고 흡수 시간을 기록하였다. 남은 액체를 파이펫으로 제거하였고, 15 ㎖의 눈금이 매겨진 원심분리 튜브에 옮겨서 부피를 측정하였다. 다음, 각각의 농축된 샘플을 버퍼필드 완충액으로 10 배 희석시켰고, 100 ㎕의 희석액을 모디파이드 옥스포드 매질 플레이트 (미국 캘리포니아주 산타 마리아(Santa Maria, CA) 소재의 하디 다이아그노스틱스(Hardy Diagnostics) 소재의 목스 플레이트(MOX plate)) 상에 두었고, 37℃에서 24 시간 인큐베이션시켰다.
대조군은 초기 농도를 나타낸다. 농축되지 않는 점을 제외하고는 평가 어세이와 동일한 방식으로 대조군 샘플을 제조하였다. 개별 대조군을 각각의 세트의 막으로 시험하였는데, 예를 들어 대조군 1은 스팬 20 처리된 막과 동일한 시간에 시험하였고, 대조군 2는 PEG 처리된 막과 동일한 시간에 시험하였다.
각각의 평가는 2 회 반복하였고, 박테리아 농도는 농축 후의 2 개의 상이한 개별 계수를 나타낸다. 농도 인자는 박테리아의 초기 농도로 나눈 최종 농도이다. 스팬 20 처리가 된 막에 대한 시험 결과는 표 20에서 제시된다.
[표 20]
Figure pct00021

실시예 18
폴리프로필렌 막을 이용한 백의 제조 및 평가
70℃ 내지 80℃의 온도의 수조에서 에탄올 (미국 켄터키주 쉘바이빌 소재의 아에퍼 알코올 앤드 케미칼 코.)/물 용매 혼합물 (70 부피% 에탄올) 내에서 44 몰% 에틸렌 함량 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.로부터 제품 번호 414107 하에 수득되는 44 % 에틸렌 함량 폴리(비닐알코올 코-에틸렌 중합체))을 갖는 에틸렌-비닐 알코올 공중합체 (에발44)를 용해시킴으로써 에틸렌 비닐 알코올 공중합체의 5 중량% 스탁 용액을 제조하였다.
상기 스탁 용액으로부터, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 코팅 용액은 에탄올/물 혼합물 용매 (70 부피% 에탄올) 내에 1 중량% 에발44, 2 중량% 폴리에틸렌 글리콜 (600) 다이아크릴레이트 (미국 펜실베니아주 워링톤 소재의 사토머로부터 제품 번호 SR610 하에 수득됨), 1 중량% 반응성 광개시제 바즈피아 (2-[4-(2-하이드록시-2-메틸프로파노일)페녹시]에틸-2-메틸-2-N-프로페노일아미노 프로파노에이트, 미국 특허 제5,506,279 호에서 개시된 바와 같음)를 함유하도록 제조하였다.
미세다공성 막 R1933-7 및 R1933-18 (표 1)을 무거운 중량의 PE 백 내에서 PEG 코팅 용액을 이용해 포화시킨 다음, 백으로부터 제거하였다. 포화된 막의 표면을 종이 타월로 닦아서 과량의 용액을 제거하였다. 막을 실온에서 10 시간 내지 12 시간 동안 공기 건조시켰다. 다음, 건조된 막을 20 중량% NaCl 수용액을 이용해 포화시켰고, 과량의 용액을 제거하였다. 다음, 막을 UV 경화 시스템 (미국 메릴랜드주 게이터스버그(Gaithersburg, MD) 소재의 퓨전 UV 시스템즈, 인크.(Fusion UV Systems, Inc.)의 H-벌브가 있는 퓨전 UV 시스템(Fusion UV system with H-bulb))의 컨베이어 벨트 상에 두었고, 불활성 질소 분위기 챔버 내에서 경화시켰다. 벨트의 속도는 0.10 m/s (20 분 당 피트 (fpm))였다. 막을 뒤집었고, 광원을 마주하고 있는 반대쪽 막 측면과 동일한 속도로 두 번 UV 시스템을 통해 진행되었다. 경화된 막을 과량의 탈이온수에서 세정하였고, 완전히 건조될 때까지 90℃에서 1 시간 내지 2 시간 동안 건조시켰다. 영구 처리된 건조된 막을 실온에서 PE 백 내에 보관하였다.
백 농축 디바이스를 실시예 17에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 19
폴리아크릴로니트릴 막을 이용한 백의 제조 및 평가
다양한 폴리아크릴로니트릴 (PAN) 중합체 막 (PAN-1, PAN-2, PAN-3, PAN-4, 및 PAN-5)을 한국 특허 출원 제KR20040040692 호에서 개시된 바와 같이 제조하였다. N,N-다이메틸아세트아미드 (DMAC) 내 폴리아크릴로니트릴 (MW. 150,000) 중합체의 10.5-중량% 용액은 액체 내에 이 중합체를 분산시킴으로써 제조하였다. PAN 중합체 용액의 일정 유동 (50㎕/분/홀)을 고 전압원에 연결된 주사기로 펌핑하였다. 90 Kv 내지 100 Kv의 전기력은, 중합체 용액이 공기 내로 배출되게 야기한 주사기에 도입되어, 전기방사된 PAN 나노섬유를 형성하였다. 섬유를 웨브 상에서 수합해서 벌키 배트(bulky batt)를 형성하였다. 이 전기방사된 PAN 나노섬유의 벌키성을 감소시키고 구조적 온전성을 증가시키기 위해, 약 10 kgf/㎤ 내지 20 kgf/㎤의 압력과 140℃에서 캘린더링함으로써 후처리를 수행하였다. 다른 후속 처리는 사용하지 않았다. 막을 실온에서 PE 백 내에 보관하였다. 막은 PAN-4, PAN-2, 및 PAN-5 막 제각각에 대해 0.2 ㎛, 0.53 ㎛, 및 0.73 ㎛의 기공 크기를 가졌다. 백 농축 디바이스를 실시예 17에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
3.9 그램의 하이드로겔을 각각의 백에서 사용하는 점을 제외하고는, 실시예 17에서 기술된 바와 동일한 절차에 따라 백을 평가하였다. 시험 결과가 표 21에 나타나 있다.
[표 21]
Figure pct00022

실시예 20
나일론 막을 이용한 백의 제조
나일론 막 액체 필터 제품 번호 080ZN (0.8 ㎛) 및 0606SN (0.6 ㎛)을 미국 신시내티주 메리덴(Meriden, CT) 소재의 3M 퓨리피케이션 인크.(3M Purification Inc.)로부터 수득하였다.
백 농축 디바이스를 실시예 17에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 21
폴리카르보네이트 막을 이용한 백의 제조
0.8 ㎛ 및 0.6 ㎛ 폴리카르보네이트 막 필터를 GE 오스모닉스(GE Osmonics) (미국 미네소타주 홉킨스(Hopkins, MN) 소재)로부터 수득하였다. 백 농축 디바이스를 실시예 17에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 22
폴리에테르 / 폴리설폰 ( PES ) 막을 이용한 백의 제조
0.8 ㎛ 및 0.6 ㎛ 폴리에테르/폴리설폰 (PES) 막을 GE 오스모닉스 (미국 미네소타주 홉킨스 소재)로부터 수득하였다. 백 농축 디바이스를 실시예 17에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 23
막의 평가
0.6 ㎛ 나일론 막을 함유하는 백 (실시예 20) 및 0.8 ㎛ 폴리카르보네이트 막을 함유하는 백 (실시예 21)은, 4.0 그램의 하이드로겔을 각각의 백에서 사용하는 점을 제외하고는, 실시예 17에서 기술된 절차에 따라 평가하였다. 0.6 ㎛ 나일론 막을 함유하는 백을 또한, 사용된 계면활성제가 플루로닉 L64 대신에 0.01% 플루오로계면활성제 (3M 노벡(Novec) FC-4430, 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M 코.)를 사용하는 점을 제외하고는, 상기 기술된 바와 같이 제조된 TSB 브로쓰를 사용해 평가하였다. 시험 결과는 하기 표 22에 나타나 있다.
[표 22]
Figure pct00023

0.8㎛ 나일론 막을 함유하는 백 (실시예 20) 및 0.8㎛ PES 막을 함유하는 백 (실시예 22)을 하기를 제외하고는 실시예 17에서 기술된 절차에 따라 평가하였다. 각각의 백에서 사용된 하이드로겔의 양은 약 4.0 그램이었다. 백의 내부를 아이소프로필 알코올로 분무하고 백을 열어둔 채로 두고 자외선 광으로 백을 45 분 동안 조사시켜서 백의 내부를 멸균시켰다. 트라입틱 쏘이 브로쓰는, 1 리터의 탈이온수에서 3 그램의 효모 추출물과 함께 30 그램의 TSB를 용해시켜서 제조된 0.6%의 효모 추출물을 함유하였다. 표 23에서 나타낸 바와 같이, 2 가지 계면활성제 중 하나는 브로쓰 - 0.2% (w/v) 플루로닉 L64 및 0.2% 트윈 80 (v/v) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코.)에 첨가하였다. 생성 브로쓰 (225 ㎖)에, 1x107 cfu/㎖의 리스테리아 이노쿠아 (ATCC 33090)를 함유하는 버터필즈 완충액 225 ㎕를 접종하였고 잘 혼합하였다. 다음, 브로쓰를 샘플 농축 백의 파우치 내에 부었고 50 분 내지 90 분 동안 위쪽으로 향하도록 두었다. 농축된 샘플을 수합하였고, 측정하였고, 3 ㎖에서 연속해서 버터필즈 완충액 내에서 10 배 희석시켰다. 다음, 각각의 샘플의 제3 희석액 중 1 ㎖을 AC 페트리필름 플레이트 (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M 코.) 상에 두었다. 플레이트를 37oC에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰고, 콜로니를 계수하였다. 표 23은 박테리아 회수 결과를 제시한다.
[표 23]
Figure pct00024

실시예 24
플로트(float) 밸브 및 용기가 있는 대용량 물 샘플 수합 시스템
15.1 L (4 갤런) 플라스틱 카보이(plastic carboy) (P/N 073004, 미국 오하이오주 리마(Lima OH) 소재의 US 플라스틱 코포레이션(US Plastic Corporation))를 사용해 대용량 샘플 부피 수합 시스템을 구축하였다. 적절한 파이프 피팅(pipe fitting) (미국 미네소타주 스틸와터(Stillwater, MN) 소재의 메나즈(Menards))을 사용해 47 ㎜ 필터 홀더 (Cat # EW-06623-22, 미국 일리노이주 버논 힐즈(Vernon Hills, IL) 소재의 콜-파머 인스트루먼트 코.(Cole-Parmer Instrument Co.))를 1.27 ㎝ (½") 플로트 밸브 (미국 캘리포니아주 베이커스필드(Bakersfield, CA) 소재의 허드슨 밸브 컴퍼니(Hudson Valve Company))에 부착하였다. 플로트 밸브를 카보이의 개구 내로 맞추어서, 필요한 양이 도달했을 때 플로트가 물 유동을 중단시키게 될 것이다. 필터 홀더의 다른 말단에 적절한 파이프 피팅을 부착해서, 필터 홀더가 수원(water source)에 부착될 수 있게 된다. 47 ㎜ 막 필터를 필터 홀더에 두었고, 디바이스를 수원 (탭(tap))에 부착하였다. 수원을 켰고, 물이 막을 통해 여과되게 하였다. 용기가 찼을 때 (10 리터), 플로트 밸브를 닫아서 물 유동을 중지시켰다. 탭을 껐고, 필터 홀더를 탈착시켰고, 막 필터를 제거하였고 추가의 분석을 위해 처리하였다. 막을 혈액 한천 (미국 캘리포니아주 산타 마리아 소재의 하디 다이아그노스틱스) 또는 트라입틱 쏘이 한천 플레이트 (하디 다이아그노스틱스) 상에 두었고, 플레이트를 37℃에서 16 시간 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 콜로니 형성 단위를 계수해서, 10 리터의 물 내의 박테리아의 수준을 측정하였다.
실시예 25
유량계가 있는 대용량 물 샘플 수합 시스템
적절한 파이프 피팅 (미국 미네소타주 스틸아터 소재의 메나즈)을 사용해 47 ㎜ 필터 홀더 (Cat # EW-06623-22, 콜-파머.)에 유량계 (Cat. # WU-05610-01, 미국 일리노이주 버논 힐즈 소재의 콜-파머 콜-파머 인스트루먼트 코.)를 부착시켜서 대용량 샘플 부피 수합 시스템을 구축하였다. 필터 홀더의 다른 말단에 적절한 파이프 피팅을 부착해서, 필터 홀더가 수원에 부착될 수 있게 된다. 47 ㎜ 막 필터를 필터 홀더에 두었고, 디바이스를 수원 (탭)에 부착하였다. 수원을 켰고, 물이 막을 통해 여과되게 하였다. 유량계 상에서의 판독을 사용하여, 필터를 통해 유동하는 물의 양을 측정하였고, 물 유량이 필요한 양 (10 리터)에 도달했을 때 물 유량을 수동으로 닫았다. 필터 홀더를 탈착시켰고 막 필터를 제거하였고 추가의 분석을 위해 처리하였다. 막을 혈액 한천 (미국 캘리포니아주 산타 마리아 소재의 하디 다이아그노스틱스) 또는 트라입틱 쏘이 한천 플레이트 (하디 다이아그노스틱스) 상에 두었고, 플레이트를 37℃에서 16 시간 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 콜로니 형성 단위를 계수해서, 10 리터의 물 내의 박테리아의 수준을 측정하였다.
실시예 26
파이프 갱생( pipe rehabilitation ) 방법에 대한 설명
1 리터 내지 10 리터의 물 샘플을 바람직한 막 필터를 사용해 처리한다. 보유된 박테리아를 PCR, 등열 증폭, 면역어세이 등과 같은 어세이에 의해 검출하기 위해 추가로 용출하거나 성장시킬 수 있다. 신속한 검출은 단시간 (예를 들어, 8 시간 미만) 내에 박테리아의 존재 또는 부재를 측정할 수 있게 해서, 복원되는 파이프의 복구 서비스를 더 빠르게 할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 및 전자적으로 이용가능한 재료 (예를 들어, 예를 들어, 진뱅크(GenBank) 및 레프시크(RefSeq)에서 예를 들어 뉴클레오타이드 서열 제출물, 및 예를 들어, 스위스프로트(SwissProt), PIR, PRF, PDB에서의 아미노산 서열 제출물, 및 진뱅크 및 레프시크에서 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역물)의 완전한 공개 내용은 그 전체가 참조로서 삽입되어 있다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참조로 포함된 임의의 문서의 개시 내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 좌우할 것이다. 상기 상세한 설명 및 예들은 단지 명확한 이해를 위해 주어졌다. 이로부터 어떠한 불필요한 제한 사항도 이해되지 않을 것이다. 당업자에게 자명한 변화가 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 도시되고 설명된 정확한 상세 사항으로 제한되지 않는다.
달리 표시되지 않는다면, 본 명세서 및 청구의 범위에 성분의 양, 분자량 등을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 한정되는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표시하지 않는다면, 본 명세서 및 청구의 범위에 설명된 수치적 파라미터는 본 발명에 의해 수득되고자 하는 원하는 특성에 따라 다양할 수 있는 근사치이다. 최소한, 그리고 특허청구범위의 범주와 등가인 이론을 한정하려는 시도로서는 아니면서, 각각의 파라미터 수치는 적어도 보고된 유효 자리수의 숫자 관점에서 그리고 보통의 반올림 기법에 의해 해석되어야 한다.
넓은 범주의 본 발명을 설명하는 수치적 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 구체적인 실시예에 설명된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치 값은 본래, 이들 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 필연적으로 생기는 범위를 포함한다.
모든 표제는 독자의 편리함을 위한 것이며, 그렇게 특정되지 않는 한 표제 이후의 본문의 의미를 한정하기 위하여 사용되어서는 안된다.

Claims (34)

  1. 하나 이상의 생물학적 유기체를 포함하는 샘플을 1.45 L/㎡.h.㎪ (10 L/㎡.h.psi) 이상의 수동적 물 부피 플럭스(passive water volume flux)에서 필터 막을 통해 통과시켜서 막의 표면 상에 하나 이상의 생물학적 유기체를 보유시키는 단계 (여기서, 필터 막은 1.0 ㎛ 이하의 기포점 기공 크기를 포함함); 및
    필터 막의 표면 상에 보유된 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 수동적 물 부피 플럭스는 4.64 L/㎡.h.㎪ (32 L/㎡.h.psi) 이상인 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 수동적 물 부피 플럭스는 12.8 L/㎡.h.㎪ (88 L/㎡.h.psi) 이상인 방법.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 기포점 기공 크기는 0.8 ㎛ 이하인 방법.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 기포점 기공 크기는 0.2 ㎛ 이하인 방법.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 생물학적 유기체 중 30% 이상이 필터 막의 표면 상에 보유되는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 생물학적 유기체 중 70% 이상이 필터 막의 표면 상에 보유되는 방법.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 생물학적 유기체 중 90% 이상이 필터 막의 표면 상에 보유되는 방법.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 생물학적 유기체 중 99% 이상이 필터 막의 표면 상에 보유되는 방법.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 생물학적 유기체 중 99.5% 이상이 필터 막의 표면 상에 보유되는 방법.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 유기체는 필터 막의 표면 상의 본래 자리에서(in situ) 검출되는 방법.
  12. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 필터 막의 표면 상에 보유된 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계는 검출 어세이를 수행하기 전에 막의 표면으로부터 보유된 생물학적 유기체를 용출시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 보유된 생물학적 유기체 중 50% 이상이 필터 막의 표면으로부터 용출되는 방법.
  14. 제13 항에 있어서, 보유된 생물학적 유기체 중 90% 이상이 필터 막의 표면으로부터 용출되는 방법.
  15. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 유기체를 검출하는 단계는:
    생물학적 유기체를, 생물학적 유기체에 특이적으로 결합하는 항체 조성물과 접촉시키는 단계;
    생물학적 유기체의 효소 활성을 검출하는 단계;
    생물학적 유기체의 생물학적 분석물을 검출하는 단계;
    생물학적 유기체에 의해 생성되는 생물학적 분석물을 검출하고, 이어서 핵산의 일부를 생물학적 유기체로부터 검출하는 단계;
    핵산 분자 중 적어도 일부를 생물학적 유기체로부터 증폭시키는 단계; 및
    생물학적 유기체의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 필터 막은 폴리올레핀 다공성 막, 에틸렌-클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체 다공성 막, 폴리아크릴로니트릴 다공성 막, 폴리카르보네이트 다공성 막, 폴리에스테르 다공성 막, 셀룰로오스 에스테르 다공성 막, 폴리아미드 다공성 막, 폴리에테르설폰 다공성 막, 폴리설폰 다공성 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 다공성 막, 폴리아크릴로니트릴 나노섬유 막, PVDF 나노섬유 막, 셀룰로오스 에스테르 나노섬유 막, 폴리비닐 아세테이트 또는 알코올 나노섬유 막, 또는 폴리비닐 부티랄 나노섬유 막을 포함하는 방법.
  17. 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 필터 막은 TIPS(TIPS) 막 또는 나노섬유 막을 포함하는 방법.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 유기체는 샘플이 필터 막을 통과한 후 24 시간 이내에 검출되는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 유기체는 샘플이 필터 막을 통과한 후 12 시간 이내에 검출되는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 하나 이상의 생물학적 유기체는 샘플이 필터 막을 통과한 후 3 시간 이내에 검출되는 방법.
  21. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 음식을 포함하는 방법.
  22. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 환경 샘플을 포함하는 방법.
  23. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 물 샘플을 포함하는 방법.
  24. 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 필터 막은 흡수제 부재(member)와 기능적으로 내왕(communication)하는 방법.
  25. 제24 항에 있어서, 흡수제 부재는 필터 막에 의해 피복되는 방법.
  26. 제1 항 내지 제10 항 또는 제12 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 필터 막의 표면으로부터 회수된 검출된 생물학적 유기체를 정량화하기 위한 어세이를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제1 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포켓 부피를 한정하는 포켓 표면을 포함하는 포켓;
    포켓 표면의 적어도 일부 위에 배치된 흡수제 부재; 및
    포켓 부피와 유체 내왕하는 흡수제 부재의 적어도 일부 위에 배치된 필터 막을 포함하는 디바이스를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서;
    여기서, 하나 이상의 생물학적 유기체를 포함하는 샘플이 필터 막을 통해 통과하는 단계는:
    샘플을 포켓 부피에 첨가하는 단계; 및
    흡수제 부재가 샘플 부피 중 50% 이상을 흡수하도록 허용하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 포켓 부피를 한정하는 포켓 표면을 포함하는 포켓;
    포켓 표면의 적어도 일부 위에 배치된 흡수제 부재; 및
    포켓 부피와 유체 내왕하는 흡수제 부재의 적어도 일부 위에 배치된 필터 막을 포함하는, 필터 디바이스.
  29. 용기;
    외부 표면, 내부 표면, 및 내부 표면에 의해 한정되는 내부 부피를 갖는 포켓을 형성하는 필터 막; 및
    흡수제 부재를 포함하는 필터 디바이스로서;
    여기서, 필터 막 및 흡수제 부재 둘다는 용기 내에 배치되며;
    흡수제 부재는 내부 부피의 외부에 있는 용기 내에 배치되는, 필터 디바이스.
  30. 제29 항에 있어서, 용기는 가요성, 변형성 용기를 포함하는 필터 디바이스.
  31. 제29 항 또는 제30 항에 있어서, 포켓은 필터 막의 외부 표면에 인접해서 배치된 부직포 배킹(backing)을 추가로 포함하는 필터 디바이스.
  32. 제29 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 흡수제 부재는 외부 표면의 적어도 일부 위에 배치되는 필터 디바이스.
  33. 제29 항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 내에 배치된 지지체(support) 부재를 추가로 포함하는 필터 디바이스.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 포켓은 샘플 포트(port)를 추가로 포함하는 필터 디바이스.
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