JP2016220668A - 試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌の中から、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法の提供。
【解決手段】試験試料２０２が植物病原性卵菌２０２ａを含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する植物病原性卵菌の判定方法。（ａ）７．０６５μｍ^２を超えて１９．６２５μｍ^２以下の断面積を有する貫通孔１０４Ｃを具備するフィルム１０４の表側１０４ａの面に、試験試料２０２を配置する工程、（ｂ）工程（ａ）の後、試験試料２０２を静置する工程、（ｃ）工程（ｂ）の後、フィルム１０４の裏面１０４ｂを観察する工程、および（ｄ）工程（ｃ）においてフィルム１０４の裏面に卵菌２０２ａが見いだされた場合には、試験試料２０２は植物病原性卵菌２０２ａを含有すると判定する工程
【選択図】図９

Description

本発明は、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法に関する。

特許文献１は、糸状菌計量方法を開示している。図１５は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。特許文献１に開示された糸状菌計量方法は、被験材料中の糸状菌数を計量するのに短時間の培養で糸状菌を計量し、また、正確な糸状菌を計量することができる糸状菌計量方法を提供することを目的としている。この糸状菌計量方法は、液体培養で培養した糸状菌１３、または微多孔膜支持体４の微多孔膜１上で培養した糸状菌１３の複数に伸びた偽菌糸を撮像５した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段１０で認識し解析させることにより、糸状菌１３を短時間の培養で計量できるという作用を有する。微多孔膜１は、押さえリング２およびベース３の間に挟まれている。

特開２００５−２８７３３７号公報

本発明の目的は、植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌の中から、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供することである。

本発明は、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） ７．０６５平方マイクロメートルを超えて１９．６２５平方マイクロメートル以下の断面積を有する貫通孔を具備するフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ） 工程（ａ）の後、前記試験試料を静置する工程、
（ｃ） 工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ） 工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に卵菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性卵菌を含有すると判定する工程。

本発明は、植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌の中から、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供する。

図１は、容器の断面図を示す。 図２は、フィルムの断面図を示す。 図３は、試験試料が供給された容器の断面図を示す。 図４は、植物病原性卵菌が表面に配置されたフィルムの断面図を示す。 図５は、植物病原性卵菌がフィルムを貫通した様子を示す断面図である。 図６は、卵菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。 図７は、図６に続き、卵菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。 図８は、フィルムの裏面から卵菌を観察する様子を示す断面図である。 図９は、フィルムの裏面から卵菌を観察する様子を示す断面図である。 図１０は、実施例１Ａにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。 図１１は、実施例１Ｂにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。 図１２は、比較例１Ａにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。 図１３は、比較例１Ｂにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。 図１４は、参考例１Ａにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。 図１５は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。

まず、卵菌が説明される。卵菌は、植物病原性卵菌および植物非病原性卵菌の２種類の卵菌に大別される。植物病原性卵菌の例は、Pythium helicoidesまたはPythium aphanidermatumである。これらの植物病原性卵菌は、赤焼病および根腐れ病を引き起こす。これらの植物病原性卵菌は、まず、植物の根に感染する。次いで、これらの植物病原性卵菌は根を腐らせる。最終的には、これらの植物病原性卵菌は、植物を枯らす。植物非病原性卵菌の例は、Pythium dissotocum、Pythium catenulatum、Pythium torulosum、またはPythium inflatumである。Pythium dissotocumは、植物弱病原性卵菌として分類され得る。本明細書においては、植物弱病原性卵菌は、植物非病原性卵菌に分類される。言い換えれば、用語「植物非病原性卵菌」は、植物弱病原性卵菌を含む。用語「植物病原性卵菌」は、植物弱病原性卵菌を含まない。

用語「植物病原性」とは、植物に対して病原性を有していることを意味する。用語「植物非病原性」とは、植物に対して病原性を有していないことを意味する。卵菌が病原性を有しているとしても、植物に対して病原性を有していないのであれば、その卵菌は「植物非病原性」である。言い換えれば、卵菌が植物に対して悪影響を与えないのであれば、その卵菌は「植物非病原性」である。用語「植物非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「植物」を修飾しない。接頭語「非」は「病原性」を修飾する。

以下、本発明の実施形態が図面を参照しながら詳細に説明される。

（工程（ａ））
工程（ａ）では、７．０６５平方マイクロメートルを超えて１９．６２５平方マイクロメートル以下の断面積を有する貫通孔を具備するフィルムの表側の面に、試験試料が配置される。

具体的には、図１に示されるように、容器１００が用意される。容器１００は、上端にフランジ１０２を具備していることが望ましい。容器１００の底面は、フィルム１０４から形成されている。フィルム１０４の材料の例は、ポリエチレンテレフタラートのような有機樹脂である。

図２は、フィルム１０４の断面図を示す。フィルム１０４は、表面１０４ａ、裏面１０４ｂ、および貫通孔１０４ｃを有する。本発明の特徴の１つは、貫通孔１０４ｃの断面積である。

貫通孔１０４ｃは、７．０６５平方マイクロメートルを超えて１９．６２５平方マイクロメートル以下の断面積を有する。具体的には、貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルを超えて５マイクロメートル以下の直径を有する円筒の形状を有することが望ましい。これらの断面積または直径の重要性は後述される。

図３に示されるように、この容器１００の内部に、試験試料２００が供給される。このようにして、フィルム１０４の表面１０４ａ上に試験試料２００が配置される。試験試料２００が植物病原性卵菌２０２を含有している場合、図４に示されるように、フィルム１０４の表面１０４ａ上に植物病原性卵菌２０２が配置される。

試験試料２００は、固体、液体、または気体である。試験試料２００は、固体または液体であることが望ましい。固体の試験試料２００の例は、土壌または破砕された植物である。他の例は、バーミキュライト、ロックウール、またはウレタンのような農業資材である。液体の試験試料２００の例は、農業用水、水耕栽培のために用いられた溶液、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、または作業者の衣類あるいは靴を洗浄するために使用した後の液体である。

（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）の後、試験試料２００が所定時間の間、静置される。貫通孔１０４ｃの断面積または直径の重要性が以下、説明される。

工程（ｂ）においては、試験試料２００に含有される様々な卵菌が成長する。後述される実施例および比較例においても実証されているように、貫通孔１０４ｃが７．０６５平方マイクロメートルを超えて１９．６２５平方マイクロメートル以下の断面積を有する場合、植物病原性卵菌２０２は、図５に示されるように、貫通孔１０４ｃを貫通するように成長する。その結果、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性卵菌２０２が現れる。一方、この断面積の範囲内では、植物非病原性卵菌は、貫通孔１０４ｃを貫通しない。そのため、植物非病原性卵菌は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このようにして、植物病原性卵菌２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。

後述される参考例において実証されているように、貫通孔１０４ｃが１マイクロメートルの直径を有する場合、すなわち、貫通孔１０４ｃが０．７８５平方マイクロメートルの断面積を有する場合、植物病原性卵菌のみが選択的に貫通孔１０４ｃを貫通する。表７を参照せよ。

後述される実施例において実証されているように、貫通孔１０４ｃが３マイクロメートルの直径を有する場合、すなわち、貫通孔１０４ｃが７．０６５平方マイクロメートルの断面積を有する場合、植物病原性卵菌のみが選択的に貫通孔１０４ｃを貫通する。表３を参照せよ。

後述される実施例において実証されているように、貫通孔１０４ｃが５マイクロメートルの直径を有する場合、すなわち、貫通孔１０４ｃが１９．６２５平方マイクロメートルの断面積を有する場合、植物病原性卵菌だけでなく植物非病原性卵菌も貫通孔１０４ｃを貫通し得る。しかし、貫通孔１０４ｃを貫通する植物病原性卵菌の数は、貫通孔１０４ｃを貫通する植物非病原性卵菌の数よりもずっと大きい。従って、植物病原性卵菌が選択的に貫通孔１０４ｃを貫通する。表４を参照せよ。

後述される比較例において実証されているように、貫通孔１０４ｃが０．４マイクロメートルの直径を有する場合、すなわち、貫通孔１０４ｃが０．１２５６平方マイクロメートルの断面積を有する場合、植物非病原性卵菌だけでなく植物病原性卵菌も貫通孔１０４ｃを貫通しない。表５を参照せよ。

後述される比較例において実証されているように、貫通孔１０４ｃが８マイクロメートルの直径を有する場合、すなわち、貫通孔１０４ｃが５０．２４平方マイクロメートルの断面積を有する場合、植物病原性卵菌だけでなく植物非病原性卵菌も貫通孔１０４ｃを貫通する。表６を参照せよ。

このように、貫通孔１０４ｃが０．７８５平方マイクロメートル以上かつ７．０６５平方マイクロメートル以下の断面積を有する場合、完全な選択性が実現される。貫通孔１０４ｃが７．０６５平方マイクロメートルを超えてかつ１９．６２５平方マイクロメートル以下の断面積を有する場合、高い選択性が実現される。本願では、完全な選択性が実現される範囲ではなく、高い選択性が実現される範囲がクレームされる。

植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる限り、フィルム１０４の厚みは限定されない。フィルム１０４は、１０マイクロメートル以上１００マイクロメートル以下の厚みを有し得る。図３〜図５に示されるように、フィルム１０４は複数の貫通孔１０４ｃを有することが望ましい。

卵菌の培養を加速させるために、試験試料２００に培地が供給され得る。具体的には、試験試料２００を含有する容器１００の内部に培地が供給され得る。培地は液体であることが望ましい。培地は、工程（ｂ）において供給され得る。これに代えて、培地は工程（ｂ）よりも前に供給され得る。言い換えれば、培地は工程（ａ）において供給され得る。培地は工程（ａ）の前に容器１００の内部に供給されても良い。

図６は、卵菌の培養を加速させる他の方法を示す。図６に示されるように、フィルム１０４の裏面１０４ｂを液体の培地３０２に接触させることが望ましい。まず、液体の培地３０２を内部に有する第２容器３００が用意される。以下、第２容器３００から区別するため、容器１００は「第１容器１００」と呼ばれる。フランジ１０２の下面が第２容器３００の上端に接触するように、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる。言い換えれば、第１容器１００が第２容器３００の上端によって支持される。このようにして、液体の培地３０２がフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に挟まれる。

あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、フィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に液体の培地３０２が供給されても良い。

液体の培地３０２は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに接しているので、液体の培地３０２は貫通孔１０４ｃを通って毛細管現象により吸い上げられる。液体の培地３０２に代えて、粘性を有する固体の培地も用いられ得る。この場合、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる時に、粘性を有する固体の培地が変形して貫通孔１０４ｃに浸透する。このようにして、培地３０２が容器１００の内部に到達する。容器１００の内部に到達した培地３０２により、卵菌の培養が加速される。図６に示されるように、固体の培地３０４および液体の培地３０２の両者が用いられ得る。この場合、液体の培地３０２が固体の培地３０４およびフィルム１０４の間に挟まれる。

（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）の後、フィルム１０４の裏面１０４ｂが観察される。光学顕微鏡を用いて裏面１０４ｂが観察されることが望ましい。

工程（ｂ）において説明されたように、植物病原性卵菌２０２は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れる。一方、植物非病原性卵菌は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このように、本発明では、植物病原性卵菌２０２は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに選択的に現れる。

言い換えれば、植物病原性卵菌２０２は、貫通孔１０４ｃを貫通する。一方、植物非病原性卵菌は、貫通孔１０４ｃを貫通しない。そのため、植物非病原性卵菌は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このようにして、植物病原性卵菌２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性卵菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。

工程（ｃ）では、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性卵菌２０２が現れているかどうかが観察される。

具体的には、以下のようにして、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性卵菌２０２が現れているかどうかが観察される。

まず、試験試料がゲル化される。より詳細には、アガロース水溶液が第１容器１００に供給される。次いで、試験試料を含有するアガロース水溶液は撹拌される。最後に、室温で試験試料が静置される。このようにして、試験試料がゲル化される。

次に、第１容器１００が第２容器３００から引き上げられる。ゲル化の前に、第１容器１００は第２容器３００から引き上げられても良い。

第２容器３００から液体の培地３０２および固体の培地３０４が除去される。次いで、第２容器３００の内部に、菌体結合性蛍光剤４０２が添加される。次いで、図７に示されるように、第１容器１００は、菌体結合性蛍光剤４０２を内部に有する第２容器３００に重ね合わされる。あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、フィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に菌体結合性蛍光剤４０２が供給されても良い。

フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた植物病原性卵菌２０２の一部分は、菌体結合性蛍光剤４０２により染色される。試験試料２００はゲル化されているので、菌体結合性蛍光剤４０２は第１容器１００の内部には広がらない。従って、第１容器１００に含有されている植物非病原性卵菌は、菌体結合性蛍光剤４０２により染色されない。

図８に示されるように、フィルム１０４の表面１０４ａ上に配置された光源５００を用いてフィルム１０４に光を照射しながら、フィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された顕微鏡６００を用いて、染色されている植物病原性卵菌２０２が観察される。

菌体結合性蛍光剤４０２に代えて、卵菌蛍光剤も用いられ得る。この場合、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた植物病原性卵菌２０２の一部分２０２ａは、卵菌蛍光剤により染色される。図９に示されるように、フィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された顕微鏡６００を用いて、卵菌蛍光剤により染色されている植物病原性卵菌２０２が観察される。

（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、工程（ｃ）においてフィルム１０４の裏面１０４ｂに卵菌が見いだされた場合には、試験試料は植物病原性卵菌を含有すると判定される。言うまでもないが、工程（ｃ）においてフィルム１０４の裏面１０４ｂに卵菌が見いだされなかった場合には、試験試料は植物病原性卵菌を含有しないと判定される。

（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。

（Pythium helicoidesの培養）
植物病原菌の一種であるPythium helicoidesが、乾燥芝草とともにコーンミール寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で２４時間静置された。Pythium helicoidesは岐阜大学流域圏科学研究センターに所属する景山教授より与えられた。乾燥芝草は、高温高圧滅菌法で滅菌された高麗芝を摂氏６０度でおよそ２４時間かけて乾燥することにより得られた。

次いで、偽菌糸が付着した乾燥芝草を培地からつまみ出した。つまみ出された乾燥芝草は、ペトリ皿に含まれる純水の上面上に浮かべた。純水の容積は２０ミリリットルであった。

１８時間後、ペトリ皿に含まれる水が光学顕微鏡で観察された。その結果、ペトリ皿に含まれる水にPythium helicoidesの胞子が放出されていることが確認された。このようにして、Pythium helicoidesを含有する水溶液が得られた。以下、この水溶液は、「植物病原菌水溶液」と呼ばれる。

（培地の用意）
高温で融解されたポテトデキストロース寒天培地が第２容器３００に添加された。ポテトデキストロース寒天培地は、２５０マイクロリットルの容積を有していた。次いで、ポテトデキストロース寒天培地は室温でゲル化された。このようにして、ポテトデキストロース寒天培地ゲルが、固体の培地３０４として得られた。

ポテトデキストロース寒天培地ゲルを含有する第２容器３００に、３５０マイクロリットルの水耕栽培溶液（大塚ＳＡ混合溶液）が液体の培地３０２として添加された。このようにして、液体の培地３０２および固体の培地３０４を含む第２容器３００が用意された。

（実施例１Ａ）
図１に示される第１容器１００が用意された。この第１容器１００は、プラスチック製であった。図２に示されるように、第１容器１００の底面はポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（ミリポア社より入手、商品名：Millicell PISP 12R 48）から形成されていた。このポリエチレンテレフタラートフィルム１０４は、３マイクロメートルの直径を有する複数の貫通孔１０４ｃを具備していた。複数の貫通孔１０４ｃは、フィルム１０４にランダムに設けられていた。

次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。フィルム１０４の裏面１０４ｂは、液体の培地３０２に接していた。続いて、第１容器１００の内部に、２００マイクロリットルの体積を有する水耕栽培溶液が添加された。さらに、２００個のPythium helicoidesの胞子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。

第１容器１００は、摂氏２５度の温度で６時間静置された。

その後、第１容器１００が第２容器３００から分離された。第１容器１００の内部に含まれる植物病原菌水溶液が除去された。次いで、第１容器１００の内部に、２％の濃度を有するアガロース水溶液が添加された。アガロース水溶液は室温でゲル化された。

６００ミリリットルの体積を有する菌体結合性蛍光剤（商品名：Calcofluor White (BD261195)会社名：ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）が、第２容器３００の内部に添加された。菌体結合性蛍光剤の終濃度は０．００５％であった。

次に、再度、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。フィルム１０４の裏面１０４ｂは、菌体結合性蛍光剤に接していた。第１容器１００は、摂氏２５度で１０分間静置された。ゲルが第１容器１００の内部に位置しているので、菌体結合性蛍光剤は第１容器１００の内部には広がらなかった。

その後、第１容器１００が第２容器３００から分離された。第２容器３００の内部に含まれる菌体結合性蛍光剤が除去された。次いで、第２容器３００の内部に、緩衝液が添加された。以下の表１は、この緩衝液に含有される成分および濃度を示す。

図９に示されるように、蛍光顕微鏡６００（モレキュラーデバイスジャパン株式会社より入手、商品名：ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ＭＩＣＲＯ）を用いて、フィルム１０４の裏面１０４ｂが観察された。表２は、蛍光顕微鏡６００に用いられたフィルタおよびレンズを示す。

図１０は、実施例１Ａにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１０に見られるように、Pythium helicoidesの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れている。これは、Pythium helicoidesの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通したことを意味する。

裏面１０４ｂに現れたPythium helicoidesの偽菌糸の数が目視により数えられた。実施例１Ａは２回〜３回繰り返された。その結果、裏面１０４ｂに現れたPythium helicoidesの偽菌糸の数の平均値は１８．０個であった。

（実施例１Ｂ）
貫通孔１０４ｃの直径が５マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIMP 12R 48）が用いられた。

図１１は、実施例１Ｂにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１１に見られるように、Pythium helicoidesの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れている。これは、Pythium helicoidesの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通したことを意味する。

（比較例１Ａ）
貫通孔１０４ｃの直径が０．４マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIHT 12R 48）が用いられた。

図１２は、比較例１Ａにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１２に見られるように、Pythium helicoidesの偽菌糸は裏面１０４ｂに現れなかった。これは、Pythium helicoidesの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通しなかったことを意味する。

（比較例１Ｂ）
貫通孔１０４ｃの直径が８マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIEP 12R 48）が用いられた。

図１３は、比較例１Ｂにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１３に見られるように、Pythium helicoidesの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れている。これは、Pythium helicoidesの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通したことを意味する。

（参考例１Ａ）
貫通孔１０４ｃの直径が１マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIRP 12R 48）が用いられた。

（実施例２Ａ）
実施例２Ａ〜実施例２Ｂおよび比較例２Ａ〜比較例２Ｂでは、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium myliotaerumの胞子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium helicoidesと同様、Pythium myliotaerumもまた、植物病原菌の１種である。Pythium myliotaerumの胞子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。

実施例２Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。

（実施例２Ｂ）
実施例２Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例２Ａ）
比較例２Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、比較例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例２Ｂ）
比較例２Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、比較例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。

（参考例２Ａ）
参考例２Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、参考例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。

（実施例３Ａ）
実施例３Ａ〜実施例３Ｂおよび比較例３Ａ〜比較例３Ｂでは、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium aphanidermatumの胞子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium helicoidesと同様、Pythium aphanidermatumもまた、植物病原菌の１種である。Pythium aphanidermatumの胞子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。

実施例３Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。

（実施例３Ｂ）
実施例３Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例３Ａ）
比較例３Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、比較例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例３Ｂ）
比較例３Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。

（参考例３Ａ）
参考例３Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、参考例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。

（実施例４Ａ）
実施例４Ａ〜実施例４Ｂおよび比較例４Ａ〜比較例４Ｂでは、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Phytophthora nicotianaeの胞子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium helicoidesと同様、Phytophthora nicotianaeもまた、植物病原菌の１種である。Phytophthora nicotianaeの胞子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。

実施例４Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPhytophthora nicotianaeを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。

（実施例４Ｂ）
実施例４Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPhytophthora nicotianaeを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例４Ａ）
比較例４Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPhytophthora nicotianaeを含有していたこと以外は、比較例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例４Ｂ）
比較例４Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPhytophthora nicotianaeを含有していたこと以外は、比較例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。

（参考例４Ａ）
参考例４Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium nicotianaeを含有していたこと以外は、参考例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例５Ａ）
比較例５Ａ〜比較例５Ｄでは、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium torulosumの胞子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium helicoidesとは異なり、Pythium torulosumは、植物非病原菌の１種である。Pythium torulosumの胞子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。

比較例５Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium torulosumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例５Ｂ）
比較例５Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium torulosumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例５Ｃ）
比較例５Ｃでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium torulosumを含有していたこと以外は、比較例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例５Ｄ）
比較例５Ｄでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium torulosumを含有していたこと以外は、比較例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。

（参考比較例５Ａ）
参考比較例５Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium torulosumを含有していたこと以外は、参考例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例６Ａ）
比較例６Ａ〜比較例６Ｄでは、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium catenulatumの胞子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium helicoidesとは異なり、Pythium catenulatumは、植物非病原菌の１種である。Pythium catenulatumの胞子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。

比較例６Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例６Ｂ）
比較例６Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例６Ｃ）
比較例６Ｃでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、比較例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例６Ｄ）
比較例６Ｄでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。

（参考比較例６Ａ）
参考比較例６Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、参考例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例７Ａ）
比較例７Ａ〜比較例７Ｄでは、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液に代えて、Pythium inflatumの胞子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium helicoidesとは異なり、Pythium inflatumは、植物非病原菌の１種である。Pythium inflatumの胞子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium helicoidesの胞子を含有する植物病原菌水溶液と同様に調製された。

比較例７Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例７Ｂ）
比較例７Ｂでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例７Ｃ）
比較例７Ｃでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、比較例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。

（比較例７Ｄ）
比較例７Ｄでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｂと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。

（参考比較例７Ａ）
参考比較例７Ａでは、水溶液が、Pythium helicoidesではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、参考例１Ａと同様の実験が行われた。貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。

以下の表３〜表７は、上記の実施例、比較例、参考例、および参考比較例において貫通孔１０４ｃを貫通した偽菌糸の数を示す。

表３〜表４から明らかなように、貫通孔１０４ｃが３マイクロメートル以上５マイクロメートル以下の直径を有する場合、植物病原性卵菌の侵入点数は、植物非病原性の侵入点数よりもずっと大きい。

表５から明らかなように、貫通孔１０４ｃが０．４マイクロメートルの直径を有する場合、植物非病原性卵菌だけでなく、植物病原性卵菌もまた、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。

表６から明らかなように、貫通孔１０４ｃが８マイクロメートルの直径を有する場合、植物非病原性卵菌の侵入点数の方が、植物病原性卵菌の侵入点数よりも高くなり得る。比較例３Ｂ、比較例４Ｂ、および比較例７Ｂを参照せよ。

本発明は、農業用水または土壌のような試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを簡単に判定するために用いられ得る。

１００ 第１容器
１０２ フランジ
１０４ フィルム
１０４ａ 表面
１０４ｂ 裏面
１０４ｃ 貫通孔
２００ 試験試料
２０２ 植物病原性卵菌
２０２ａ 植物病原性卵菌の一部分
３００ 第２容器
３０２ 液体の培地
３０４ 固体の培地
４０２ 菌体結合性蛍光剤
５００ 光源
６００ 顕微鏡

Claims (16)

1. 試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
   （ａ） ７．０６５平方マイクロメートルを超えて１９．６２５平方マイクロメートル以下の断面積を有する貫通孔を具備するフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
   （ｂ） 工程（ａ）の後、前記試験試料を静置する工程、
   （ｃ） 工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
   （ｄ） 工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に卵菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性卵菌を含有すると判定する工程。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   前記植物病原性卵菌は、植物病原性フハイカビである。
3. 請求項１に記載の方法であって、
   前記植物病原性卵菌は、Pythium helicoides、Pythium myliotaerum、Pythium aphanidermatumおよびPhytophthora nicotianaeからなる群から選択される少なくとも１つである。
4. 請求項１に記載の方法であって、
   前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）の間に、前記フィルムの裏面を菌体結合性蛍光剤に接触させる工程をさらに具備する。
5. 請求項４に記載の方法であって、
   前記フィルムの裏面が菌体結合性蛍光剤に接触される前に、前記試験試料をゲル化させる工程をさらに具備する。
6. 請求項１に記載の方法であって、
   前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程をさらに具備する。
7. 請求項６に記載の方法であって、
   前記培地が液体培地である。
8. 請求項６に記載の方法であって、
   前記工程（ｂ）において、前記フィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置される。
9. 請求項６に記載の方法であって、
   前記培地が固体培地である。
10. 請求項１に記載の方法であって、
    前記フィルムが、１０マイクロメートル以上１００マイクロメートル以下の厚みを有する。
11. 請求項１に記載の方法であって、
    前記フィルムが、複数の前記貫通孔を具備する。
12. 請求項１に記載の方法であって、
    前記試験試料が固体である。
13. 請求項１２に記載の方法であって、
    前記固体が、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである。
14. 請求項１に記載の方法であって、
    前記試験試料が液体である。
15. 請求項１４に記載の方法であって、
    前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである。
16. 請求項１に記載の方法であって、
    前記植物病原性卵菌は、疫病菌である。
    

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