JPWO2018138935A1 - 試験試料が植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 貫通孔を具備する基板の表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、
前記基板は、セルロースフィルムを、その裏側の面に具備しており、
前記セルロースフィルムは貫通孔を有しておらず、
前記セルロースフィルムは、2マイクロメートルを越えて、3.7マイクロメートル以下の厚みを有しており、かつ
前記貫通孔は、7.065マイクロ平方メートル以上19.625マイクロ平方メートル以下の断面積を有しており、
(b) 工程(a)の後、前記試験試料を静置する工程、
(c) 工程(b)の後、前記セルロースフィルムの裏面を観察する工程、および
(d) 工程(c)において、前記セルロースフィルムを貫通した真菌が前記フィルムの裏面に見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性真菌を含有すると判定する工程。
工程(a)では、貫通孔172を具備する基板170の表側の面に試験試料が配置される。基板170の裏側の面170bには、セルロースフィルム104が貼付されている。言い換えれば、セルロースフィルム104の表側の面104aは、基板170の裏側の面170bに接している。
工程(b)では、工程(a)の後、試験試料200が所定の培養時間、静置される。望ましくは、試験試料200は、24時間静置される。このようにして、真菌は培養される。言い換えれば、培養時間はおおよそ24時間であることが望ましい。以下、セルロースフィルム104の厚みおよび貫通孔172の大きさの重要性が以下、説明される。
条件(I) セルロースフィルム104が、2マイクロメートル以上、3.7マイクロメートル以下の厚みを有すること。
条件(II) 貫通孔172が、7.065マイクロ平方メートル以上19.625マイクロ平方メートル以下の断面積を有していること。
工程(c)では、工程(b)の後、セルロースフィルム104の裏面104bが観察される。光学顕微鏡を用いて裏面104bが観察されることが望ましい。
工程(d)では、工程(c)においてセルロースフィルム104の裏面104bに真菌が見いだされた場合には、試験試料は植物病原性真菌を含有すると判定される。言うまでもないが、工程(c)においてセルロースフィルム104の裏面104bに真菌が見いだされなかった場合には、試験試料は植物病原性真菌を含有しないと判定される。
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。
(Fusarium oxysporumの培養)
植物病原菌の一種であるFusarium oxysporumが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏25度の温度下で1週間静置された。Fusarium oxysporumは岐阜大学応用生物科学部に所属する清水准教授より与えられた。
第2容器300に、650マイクロリットルのポテトデキストロース培地が液体の培地302として添加された。このようにして、液体の培地302を含む第2容器300が用意された。
実験例1は、実施例1A〜実施例1D、参考例1E〜参考例1F、および比較例1G〜比較例1Tからなる。
図1に示される第1容器100が以下のように用意された。
実施例1Bでは、貫通孔172の直径が5マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。5マイクロメートルの直径を有する貫通孔を具備する底面を有する容器は、ミリポア社より商品名:PIMP 12R 48として入手した。
実施例1Cでは、セルロース溶液が3.0%の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム104が、3.7マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
実施例1Dでは、セルロース溶液が3.0%の濃度を有していたこと、セルロースフィルム104が、3.7マイクロメートルの厚みを有していたこと、および貫通孔172の直径が5マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
参考例1Eでは、セルロース溶液が1.0%の濃度を有していたこと、セルロースフィルム104が、0.5マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
参考例1Fでは、(i)セルロース溶液が1.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、0.5マイクロメートルの厚みを有していたこと、(iii)貫通孔172の直径が5マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。S
比較例1Gでは、セルロースフィルム104が形成されなかった(すなわち、セルロースフィルム104は0マイクロメートルの厚みを有していた)こと、および貫通孔172の直径が1マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。1マイクロメートルの直径を有する貫通孔を具備する底面を有する容器は、ミリポア社より商品名:PIRP 12R 48として入手した。
比較例1Hでは、セルロースフィルム104が形成されなかった(すなわち、セルロースフィルム104は0マイクロメートルの厚みを有していた)こと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Iでは、セルロースフィルム104が形成されなかった(すなわち、セルロースフィルム104は0マイクロメートルの厚みを有していた)こと、および貫通孔172の直径が5マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Jでは、セルロースフィルム104が形成されなかった(すなわち、セルロースフィルム104は0マイクロメートルの厚みを有していた)こと、および貫通孔172の直径が8マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。8マイクロメートルの直径を有する貫通孔を具備する底面を有する容器は、ミリポア社より商品名:PIEP 12R 48として入手した。
参考比較例1Kでは、(i)セルロース溶液が1.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、0.5マイクロメートルの厚みを有していたこと、および(iii)貫通孔172の直径が1マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
参考比較例1Lでは、(i)セルロース溶液が1.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、0.5マイクロメートルの厚みを有していたこと、および(iii)貫通孔172の直径が8マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
参考比較例1Mでは、貫通孔172の直径が1マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
参考比較例1Nでは、貫通孔172の直径が8マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Oでは、(i)セルロース溶液が3.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、3.7マイクロメートルの厚みを有していたこと、(iii)貫通孔172の直径が1マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Pでは、(i)セルロース溶液が3.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、3.7マイクロメートルの厚みを有していたこと、(iii)貫通孔172の直径が8マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Qでは、(i)セルロース溶液が4.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、4.4マイクロメートルの厚みを有していたこと、(iii)貫通孔172の直径が1マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Rでは、セルロース溶液が4.0%の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム104が4.4マイクロメートルの厚みを有していたこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Sでは、(i)セルロース溶液が4.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、4.4マイクロメートルの厚みを有していたこと、(iii)貫通孔172の直径が5マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
比較例1Tでは、(i)セルロース溶液が4.0%の濃度を有していたこと、(ii)セルロースフィルム104が、4.4マイクロメートルの厚みを有していたこと、(iii)貫通孔172の直径が8マイクロメートルであったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。
実験例2では、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液に代えて、Saccharomyces cerevisiaeの胞子を含有する植物非病原性真菌水溶液が用いられた。Fusarium oxysporumとは異なり、Saccharomyces cerevisiaeは、植物非病原真菌の1種である。Saccharomyces cerevisiaeの胞子を含有する植物非病原性真菌水溶液は、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液と同様に調製された。実験例2は、比較例2A〜比較例2Tからなる。異なる真菌が用いられたこと以外は、比較例2A〜比較例2Lは、実施例1A〜比較例1Tと同様である。
実験例3では、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液に代えて、Pyricularia griseaの胞子を含有する植物病原性水溶液が用いられた。Fusarium oxysporumと同様、Pyricularia griseaもまた、植物病原菌の1種である。Pyricularia griseaの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液は、以下のように調製された。
まず、植物病原菌の一種であるPyricularia griseaが、ショ糖2%を含むオートミール寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏25度の温度下で1週間静置された。続いて、近紫外線下で4日間静置された。
実験例4では、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液に代えて、Colletotrichum gloeosporioidesの胞子を含有する植物病原性水溶液が用いられた。Fusarium oxysporumと同様、Colletotrichum gloeosporioidesもまた、植物病原菌の1種である。Colletotrichum gloeosporioidesの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液は、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液と同様に調製された。実験例4は、実施例4A〜実施例4D、参考例4E〜参考例4F、および比較例4G〜比較例4Tからなる。異なる真菌が用いられたこと以外は、実施例4A〜実施例4D、参考例4E〜参考例4F、および比較例4G〜比較例4Tは、それぞれ、実施例1A〜実施例1D、参考例1E〜参考例1F、および比較例1G〜比較例1Tと同様である。
実験例5では、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液に代えて、Penicillium chysogeumの胞子を含有する植物非病原性真菌水溶液が用いられた。Fusarium oxysporumとは異なり、Penicillium chysogeumは、植物非病原真菌の1種である。Penicillium chysogeumの胞子を含有する植物非病原性真菌水溶液は、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液と同様に調製された。実験例5は、比較例5A〜比較例5Tからなる。異なる真菌が用いられたこと以外は、比較例5A〜比較例5Tは、実施例1A〜比較例1Tと同様である。
実験例5では、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液に代えて、Aspergillus oryzaeの胞子を含有する植物非病原性真菌水溶液が用いられた。Fusarium oxysporumとは異なり、Aspergillus oryzaeは、植物非病原真菌の1種である。Aspergillus oryzaeの胞子を含有する植物非病原性真菌水溶液は、Fusarium oxysporumの胞子を含有する植物病原性真菌水溶液と同様に調製された。実験例6は、比較例6A〜比較例6Tからなる。異なる真菌が用いられたこと以外は、比較例6A〜比較例6Tは、実施例1A〜比較例1Tと同様である。
条件(I) セルロースフィルム104が2マイクロメートル以上、3.7マイクロメートル以下の厚みの厚みを有すること。
条件(II) 貫通孔172の直径が3マイクロメートル以上5マイクロメートル以下であること。
102 フランジ
104 セルロースフィルム
104a 表側の面
104b 裏側の面
170 基板
170a 表側の面
170b 裏側の面
200 試験試料
202 植物病原性真菌
202a 植物病原性真菌の一部分
300 第2容器
302 液体の培地
304 固体の培地
402 真菌染色液
500 光源
600 顕微鏡
Claims (16)
- 試験試料が植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する:
(a) 貫通孔を具備する基板の表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、
前記基板は、セルロースフィルムを、その裏側の面に具備しており、
前記セルロースフィルムは貫通孔を有しておらず、
前記セルロースフィルムは、2マイクロメートルを越えてかつ、3.7マイクロメートル以下の厚みを有しており、かつ
前記貫通孔は、7.065マイクロ平方メートル以上19.625マイクロ平方メートル以下の断面積を有しており、
(b) 工程(a)の後、前記試験試料を静置する工程、
(c) 工程(b)の後、前記セルロースフィルムの裏面を観察する工程、および
(d) 工程(c)において、前記セルロースフィルムの裏面に前記セルロースフィルムを貫通した真菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性真菌を含有すると判定する工程。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記植物病原性真菌は、fusarium属、pyricularia属、およびcolletotrichum属からなる群から選択される少なくとも1つの属に属している。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記植物病原性真菌は、Fusarium oxysporum、Pyricularia grisea、およびColletotrichum gloeosporioidesからなる群から選択される少なくとも1つである。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記工程(b)および前記工程(c)の間に、前記セルロースフィルムの裏面を真菌染色液に接触させる工程をさらに具備する。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記工程(b)の前に、前記試験試料に培地を供給する工程をさらに具備する。 - 請求項5に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である。 - 請求項5に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記工程(b)において、前記セルロースフィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置される。 - 請求項8に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である。 - 請求項8に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である。 - 請求項11に記載の方法であって、
前記固体が、植物体の一部、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも1つである。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である。 - 請求項13に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも1つである。 - 試験試料が植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する:
(c) セルロースフィルムの裏面を観察する工程、
ここで、セルロースフィルムは、基板の裏側の面に具備されており、
前記基板は、貫通孔を具備しており、
前記セルロースフィルムは貫通孔を具備しておらず、
前記試験試料は、基板の表側の面に配置されており、
セルロースフィルムは、2マイクロメートルを越えてかつ、3.7マイクロメートル以下の厚みを有しており、かつ
前記貫通孔は、7.065マイクロ平方メートル以上19.625マイクロ平方メートル以下の断面積を有しており、
(d) 工程(c)において、前記セルロースフィルムの裏面に前記セルロースフィルムを貫通した真菌が見いだされた場合には、前記試験試料は前記植物病原性真菌を含有すると判定する工程。 - 底面を有する容器であって、
前記底面は基板から形成され、
前記底面の外側の面にはセルロースフィルムが貼付されており、
前記セルロースフィルムは、2マイクロメートルを超えて、かつ3.7マイクロメートル以下の厚みを有しており、
前記基板は貫通孔を具備し、
前記セルロースフィルムは貫通孔を具備しておらず、かつ
前記貫通孔は、7.065マイクロ平方メートル以上19.625マイクロ平方メートル以下の断面積を有している、容器。
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KADER D. A. A. ET AL.: "Determination of Cellulase Enzyme Activities of Pathogenic and Non-pathogenic Fungi", AGROKEMIA ES TALAJTAN (AGROCHEMISTRY AND SOIL SCIENCE), vol. 31, JPN6017019713, 1982, pages 397 - 404, XP009515410, ISSN: 0004469798 * |
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