CN103657145A - 用于物质的纯化、分离、脱盐或缓冲液/溶剂交换的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

一种旋转柱装置，包含刚性多孔过滤器，该刚性多孔过滤器在离心分离过程中仍保持其形状；层析方法，使用上述装置将所需物质例如生物分子从混合物中的其它物质中分离；以及套件，包含具有用于上述方法中的一种或多种试剂的装置。

Description

用于物质的纯化、分离、脱盐或缓冲液/溶剂交换的装置和方法
背景技术
在化学、生物或材料的化验过程中，常常有必要将所需的物质从其它物质中分离或纯化。各种类型的柱层析通常用于这样的过程。具体地，常常采用简单形式的层析即旋转柱层析来富集分析物、减少或去除干扰或用于这些目的的组合。这种旋转柱具有简单的设计并且通常包含分离介质，如交联葡聚糖或聚丙烯酰胺、离子交换树脂或各种类型的硅胶。
一般地，通过使分离介质悬浮在旋转柱内的缓冲液或有机溶剂中来准备旋转柱装置。在离心分离之前，分离介质在旋转柱中具有实质上均匀的分布，并且当垂直于分离介质的表面观察时，该分离介质具有圆形横截面。通常，使旋转柱在离心机中预旋转，其中该离心机优选地配备有“摇摆斗”旋转器以阻止位于柱内的大块分离介质倾斜，并且维持与柱壁平行的用于悬浮介质及试样材料的均匀流路。在“摇摆斗”旋转器中进行离心分离之后，分离介质在旋转柱中具有实质上均匀的分布，并且当垂直于分离介质的表面观察时，该分离介质具有圆形的横截面。有时使用定角旋转器，但是柱介质进行转移且形成倾斜表面。在“定角”旋转器中进行离心分离之后，分离介质在旋转柱中具有不均匀的分布，并且当垂直于分离介质的表面观察时，分离介质具有椭圆或卵形横截面。然后应用的样本以一角度流过分离介质且不与柱壁平行。
无论使用哪种类型的旋转器，优选地必须将应用的样本装载于介质的中心处。常常使旋转柱预旋转以迫使悬浮有分离介质的液体通过柱，从而将多余液体从旋转柱中去除并且使分离介质压紧。然后，将样本小心地装载于位于旋转柱中的分离介质的顶部中心处，在收集管中对旋转柱进行离心操作，并且将所需的材料收集在收集管中。如果已经使旋转柱预旋转，则必须当心在旋转柱处于与其在预旋转过程中相同的定向，否则介质和应用的样本可能在离心分离过程中重新分配，并且所需的分离/过滤可能不足或受损。
在一些情况下，所需的材料保留在位于旋转柱内的分离介质上且随后被洗提，有时在冲洗之后被洗提，以去除不需要材料，并且因条件的一些改变而使所需的材料从位于旋转柱内的分离介质的离开有助于该所需的材料与柱分离介质脱离，有时所需的材料未与分离介质结合，而干扰物（interferences）与分离介质结合。
有许多旋转柱的使用的示例，例如实现蛋白质如抗体的缓冲液交换，或将未包含放射性核苷酸从已包含放射性标记的多核苷酸中分离，例如在DNA的放射性磷酸化之后用作来自γ-32P-ATP的探针。本领域中还有许多其它的公知示例，并且在描述分子生物学、标记、纯化或其它技术的许多手册或网站中也进行了描述。为了获得微柱DNA制备的描述，例如参见万维网上的CSH协议（Protocols）（网址为http://www.cshprotocols.org/）或维基网（Wikipedia）位置（网址为http://en.wikipedia.org/wiki/Minicolumn_purification）。
其它有用的指导为：
Protein analysis and purification:benchtop techniques（蛋白质分析 和纯化：台式技术）,Ian M Rosenberg,Birkhauser,2005,2nd edpp337-339,其描述了使用旋转柱来实现缓冲液交换;
Affinity Chromatography:Methods and Protocols（亲和层析：方法 和协议），Michael Zachariou，Springer，New York，2007，pp.156-157，其描述了使用旋转柱并通过离心机以及通过真空对细胞裂解液进行亲和纯化;
Hoyt PR,Doktycz MJ,Warmack RJ,Allison DP.,Spin-columnisolation of DNA-protein interactions from complex protein mixtures forAFM imaging.（来自复杂蛋白质混合物的DNA-蛋白质相互作用的旋转柱分离以用于AFM成像）,Ultramicroscopy.2001Jan;86(1-2):139-43;以及
Nickoloff JA,Sepharose spin column chromatography（琼脂糖旋转柱层析）.A fast,nontoxic replacement for phenol:chloroformextraction/ethanol precipitation（苯酚的快速、无毒替换：氯仿抽取/乙醇沉淀）.Mol Biotechnol.1994Feb;1(1):105-8.
通常，为了获得适当的分离，必须对旋转柱装置在摇摆斗型的旋转器中进行离心操作，从而阻止介质倾斜以及使分离过程不正常。当分离介质在定角旋转器中旋转时，分离介质变得扭曲或变得倾斜，并且应用的样本材料和液体经历各种分离路径长度或穿过柱的沟道效应（channeling），并且位于倾斜的介质的较低一面的样本材料经历短的分离路径，而位于斜面的高端处的样本材料经历较长的分离路径。应用的样本材料的这种性态与良好的分离性能冲突。理想地，如在层析理论和实践中所公知的那样，分离介质在分离介质的整个直径上以及沿着分离介质的长度或深度应具有相似的有效分离路径；然而，分离路径的沟道效应或显著歪曲极大地损害、显著地改变以及不利地影响了分离过程的性能。因此，需要更方便、有效率且有效的旋转柱装置，其克服当前旋转柱装置的沟道效应、特殊离心机旋转器、居中样本装载、和单一用途的问题。
发明内容
根据本发明的一个实施方式，提供了一种旋转柱组件，其包括：旋转柱装置，旋转柱装置包括：1）柱，柱具有内部直径和上开口，以及2）下端部，下端部包含流出口，其中流出口包括开口，开口足够小以阻挡或阻止固体或颗粒物质从旋转柱装置离开，但是开口足够大以允许流出液体通过；分离介质，分离介质包含在旋转柱装置内，分离介质具有上表面；以及刚性多孔过滤器，刚性多孔过滤器置于旋转柱装置内并且位于分离介质上方且与柱的分离介质的上表面紧密接触，多孔过滤器具有约等于旋转柱的内部直径的直径以及大于柱内部直径一半的高度。
在一个实施方式中，刚性多孔过滤器的高度约等于柱内部直径。在优选的实施方式中，刚性多孔过滤器具有足够的挠性以在离心分离过程中维持其形状。
在旋转过滤器组件的一个实施方式中，刚性多孔过滤器包括选自纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维、聚乙烯、尼龙和
Figure BDA0000421660370000041
的纤维。在旋转过滤器组件的另一实施方式中，刚性多孔过滤器包括选自塑料、陶瓷和金属的烧结的材料。
在旋转过滤器组件的一个实施方式中，分离介质选自交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素颗粒、离子交换树脂、二氧化硅颗粒、硅胶和亲和层析介质。
在旋转过滤器组件的一个实施方式中，旋转柱装置包括塑料、玻璃或经处理的纸。
在旋转过滤器组件的一个实施方式中，流出口包括滤网。
在旋转过滤器组件的一个实施方式中，包括介质支撑，介质支撑位于下端部上方以及分离介质下方。在优选的实施方式中，介质支撑是聚乙烯熔块、滤纸或膜。
在一个实施方式中，旋转过滤器组件还包括用于收集柱流出物的收集容器。
旋转过滤器组件的一个实施方式包括研磨或粉化剂由陶瓷、玻璃或金属制成的珠子或这类珠子的组合。在优选的实施方式中，研磨或粉化剂置于刚性多孔过滤器上方。在另一实施方式中，保护性熔块置于研磨或粉化剂与刚性多孔过滤器之间。
旋转过滤器组件的一个实施方式包括盖，盖覆盖旋转柱装置的上开口。
旋转过滤器组件的一个实施方式包括堵塞流出口的封闭件。
旋转过滤器组件的一个实施方式包括体积控制装置，体积控制装置置于旋转控制装置的上开口内以及刚性多孔过滤器上方，体积控制装置包括：a）外柱；b）基座，基座附接于外柱下面，基座包含孔，其中基座中的孔在正常重力下由于表面张力作用阻止或防止流体流动，但是在较高的重力或其它力下允许流体流过孔；c）中空内圆筒，中空内圆筒附接至基座且位于外部圆筒形柱内，内圆筒具有高度和内部直径；d）第一腔，第一腔位于中空内圆筒内以及基座上方并具有固定容积，其中内圆筒的高度和内部直径确定固定容积；以及e）第二腔，第二腔位于内圆筒外但是位于外柱内以及基座上方。
在旋转柱组件的一个实施方式中，体积控制装置包括对液体不可渗透的刚性、惰性材料，如金属、玻璃、塑料或浸渍有聚合物的纸。在优选的实施方式中，体积控制装置通过喷射模塑并由塑料制成。
一种简单类型的旋转柱组件包括：a）旋转柱装置，所述旋转柱装置包括：1）柱，柱具有内部直径和上开口；以及2）下端部，下端部附接至柱，下端部包含流出口，其中流出口包括开口以允许流出液体通过；以及b）刚性多孔过滤器，刚性多孔过滤器置于旋转柱装置内并位于下端部上方，多孔过滤器具有约等于旋转柱的内部直径的直径以及大于柱内部直径一半的高度，其中刚性多孔过滤器包括嵌有活性炭、离子交换颗粒的纤维素或醋酸纤维素纤维或者它们的组合。
本发明的一个实施方式提供了一种单体HGR过滤器组件，该单体HGR过滤器组件包括：多个圆筒形元件，每个圆筒形元件具有弯曲的外表面，圆筒形元件包括：1）第一过滤器元件；以及2）分离介质元件，其中，多个圆筒形元件彼此邻近排列且通过外罩保持在一起，所述外罩包覆圆筒形元件的弯曲的外表面。优选地，外罩由不可渗透的材料或仅对于液体是略微不可渗透的材料如玻璃纸或聚氯乙烯膜制成。在单体HGR过滤器组件的优选实施方式中，第一过滤器元件包括纤维或烧结的过滤器材料，分离介质元件包括分离介质或浸渍有或涂覆有分离介质的纤维。在单体HGR过滤器组件的一个实施方式中，多个圆筒形元件还包括第二过滤器元件，其中，分离介质元件邻近第一过滤器和第二过滤器元件并位于第一过滤器与第二过滤器元件之间。优选地，第二过滤器元件包括纤维或烧结的过滤器材料。
另一实施方式提供了一种旋转柱组件，该旋转柱组件包括：a）旋转柱装置，具有内部直径和内部半径；以及b）插入旋转柱装置内的单体HGR过滤器组件，过滤器组件具有约等于旋转柱装置的内部直径的直径以及大于旋转柱装置的内部半径的高度。
本发明的一个实施方式涉及一种将所需物质从样本中的其它物质中分离的方法，该方法包括以下步骤：a）提供样本，样本包括含有所需物质的溶液或悬浮液；b）将样本装载在包含HGR-过滤器的旋转柱组件上；c）将旋转柱组件置于适合的收集容器中；d）向旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使样本中的流体穿过流出口并进入收集容器；e）从旋转柱组件中洗提所需物质；以及f）在收集容器中收集洗提的物质。在优选的实施方式中，所需物质是选自DNA、RNA、蛋白质或糖蛋白的感兴趣的生物分子。在另一实施方式中，样本包括悬浮在溶解缓冲液中的分裂的细胞或组织。在一些实施方式中，通过重力、压力、真空或离心作用向旋转柱组件和收集容器施加充分的力。在优选的实施方式中，在定角旋转器中通过离心分离作用向旋转柱组件和收集容器施加充分的力。
本发明的另一实施方式涉及一种将感兴趣的生物分子从样本中的其它物质中分离的方法，该方法包括以下步骤：a）提供样本，样本包括含有感兴趣的生物分子的溶液或悬浮液；b）获取包含研磨或粉化剂的旋转柱组件；c）在旋转柱组件中将样本与研磨或粉化剂混合；d）将旋转柱组件置于适合的收集容器中；e）向旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使样本中的流体穿过流出口并进入收集容器；e）从旋转柱组件中洗提感兴趣的生物分子；以及f）在收集容器中收集洗提的感兴趣的生物分子。在该方法的一个实施方式中，混合步骤包括在将旋转柱组件置于适合的收集容器中之前或之后进行旋转柱组件的机械搅拌。
一个实施方式提供了一种套件，该套件包括：a）旋转柱组件；以及b）用于分离或纯化过程中的至少一种或多于一种试剂，试剂选自溶解缓冲液、冲洗缓冲液、洗提缓冲液和用于制备这些缓冲液的原液。
另一实施方式提供了一种套件，该套件包括：a）一个或多于一个旋转柱装置，旋转柱装置具有内部直径和内部半径；以及b）一个或多于一个单体HGR过滤器组件，过滤器组件具有约等于旋转柱装置的内部直径的直径以及大于旋转柱装置的内部半径的高度。
附图说明
通过以下描述、所附的权利要求书、以及附图，可以更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中：
图1示出旋转过滤器组件的实施方式；
图2示出包含粉化或研磨剂的旋转过滤器组件的实施方式；
图3示出旋转过滤器组件的另一简单的实施方式；
图4描绘了将圆筒形过滤器和分离介质部件进行组装以生产单体HGR过滤器组件；
图5示出用于对输送至旋转柱组件表面的流体的体积进行调节的装置；
图6示出通过使用旋转过滤器组件分离的核糖体RNA的存在的凝胶电泳指示；以及
图7示出质粒DNA分离以及用于Bam HI分解的分离的适合度的凝胶电泳指示。
具体实施方式
如本公开中所使用的那样，除非上下文另有所指，否则用语“comprise（包括）”及该用语的变形如“comprising”、“comprises”、和“comprised”并不旨在排除其它添加、部件、物品或步骤。
发明人发现，使用本文中被称为HGR-过滤器（其中HGR代表高度（Height）大于(Greater than)或等于直径（Radius））的刚性多孔过滤器或熔块使得旋转柱能够被用在摇摆斗（swing bucket）型旋转器或者不产生分离材料倾斜或其它扭曲的定角（fixed type）型旋转器中，其中，刚性多孔过滤器或熔块置于在旋转柱分离或填充（packing）介质上方且与旋转柱分离介质的上表面紧密接触。这种过滤器应具有等于旋转柱的内部直径的直径，且应具有大于旋转柱的内部柱直径一半或大于旋转柱的内部半径的高度。此外，HGR-过滤器提供这样的穿过分离介质的液体流，与不具有该HGR-过滤器的旋转柱或具有高度较短的熔块的那些旋转柱相比，该液体流更平行于离心力。
此外，发明人还发现这种装置可被配置成在位于上述HGR-过滤器上方的区域中实现样本分裂（disruption），这样例如可便于多核苷酸或蛋白质与细胞或组织分离，例如在用于临床、调查性研究、质量控制或其它形式的分析的样本准备中节省大量的样本准备时间和费用并且显著地降低复杂的操作。
此外，从柱洗提样本的装置除了利用离心分离之外还可利用重力、压力或真空应用，来捕获、冲洗、洗提或以其它方式从本文公开的HGR-装置重新获得所需的样本材料，因此独自地提供用途比其它旋转柱装置或传统的柱形装置利用范围都要广泛的装置。
重要的是，发明人发现了HGR-装置的其它有用的配置，将在以下公开中对此更详细地进行描述。
图1示出本文被称为旋转柱组件的本发明的一个实施方式。根据本发明构建的旋转柱组件包括若干部件，其中包括被称为旋转柱装置10的装置，旋转柱装置10包括由塑料、玻璃或处理过的纸制成的柱，该柱具有上开口11和下端部18，下端部具有流出口17，流出口17阻挡或阻止固体物质或颗粒物质离开但允许流出液体通过。通常该装置包含介质支撑16如熔块，介质支撑16安装在装置的底端上方支撑以进一步防止分离介质从旋转柱装置10中失去。该装置还包含位于柱内的分离介质15，分离介质15装载于介质支撑上方。刚性多孔过滤器14即HGR-过滤器具有等于或大于所选旋转柱装置的内部半径的高度、以及优选地仅略小于旋转柱装置的内部直径的直径，该过滤器插在旋转柱装置内并位于填充或过滤介质15上方。任选地，组件还可包括：用于封住上开口的盖；以及用于流出口17的封闭件，防止污染物进入或材料从旋转柱装置中失去。旋转柱装置10通常具有足以装配在收集容器19如1.5-2ml的微量离心管（microfuge tube）或15-50ml的锥形离心管内的直径，这种离心管用作在其中收集来自旋转柱的流出物的收集容器19。这些部件与HGR-过滤器的组件被称为HGR-旋转柱组件或被称为HGR-装置。还应注意，HGR-过滤器可单独地充当熔块、过滤器或分离介质、或者具有作为HGR-过滤器的组合的单一HGR-过滤器中的这些或其它功能性，下面将对此进行描述。HGR-装置可被配置成单一样本装置或被配置为并行处理多个样本的多孔HGR-装置。
图2示出本发明的优选实施方式，其可用于将材料从样本释放，如使细胞溶解以释放其组分。旋转柱装置20除了具有上开口21、下端部28和流出口27以外，该旋转柱装置从下至上还包含介质支撑26、分离或填充介质25和HGR-过滤器24。旋转柱装置20通常具有足以装配在收集容器29如1.5-2ml的微量离心管或15-50ml的锥形离心管内的直径，这种离心管用作在其中收集来自旋转柱的流出物的收集容器29。此外，位于HGR-过滤器上方的区域包含研磨或粉化剂22，如珠子，诸如由陶瓷、玻璃或金属制成的珠子或这类珠子的组合。在待进行样本分裂的实施方式中，希望保护HGR-过滤器24的上表面，以防止其因研磨/粉化剂22的作用而侵蚀。在此情况下，HGR-过滤器24的上部由薄的保护性熔块23或抵抗粉化剂22作用的其它多孔材料所覆盖，其中，粉化剂22被利用来实现样本的溶解和/或样本的机械破坏。适合的珠子在本领域中是公知的，并且可选自微米至毫米尺寸的硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃、陶瓷颗粒如氧化锆、二氧化硅、氧化铝等等、或金属球如具有各种合金成分和金属丝（tinsel）强度的不锈钢。平均尺寸处于微米至毫米尺寸范围内的珠子取决于自然成分和要分裂的样本组分。例如，0.5mm的氧化锆/二氧化硅颗粒适用于大多数细胞和大多数软组织，而1-5mm的不锈钢珠子更适用于较坚硬的材料如植物组织，诸如谷物、小麦、大豆等等，这种选择在本领域是公知的。
图3示出旋转柱组件的可替换实施方式，其中具有下端部38和流出口37的旋转柱装置30仅包含：介质支撑36如熔块，安装在装置的底端上方支撑；以及支撑刚性多孔过滤器34即HGR-过滤器，位于介质支撑36的顶部上的。这种类型的旋转柱组件还可包括：盖31，覆盖装置的顶部；以及封闭件39，用于堵塞并且防止从流出口37泄露。
图4示出本文被称为单体HGR-过滤器组件的本发明的一个实施方式，其可插入另一装置如本文所述的旋转柱装置。单体HGR-过滤器组件40包括多个圆筒形元件，例如第一过滤器元件42、第二过滤器元件46、以及位于第一过滤器元件与第二过滤器元件之间的分离介质元件44，第一过滤器元件42、第二过滤器元件46和分离介质元件44被保持在一起并且如通过图4所示的滚动以用提供外罩48的薄的表面元件如玻璃纸或聚氯乙烯膜来包覆。外罩48用于将组件保持在一起并且是不可渗透的或仅对于包含在由分离介质捕获的样本中的液体介质是略微不可渗透的。在优选实施方式中，第一过滤器元件42和第二过滤器元件46包括纤维或烧结过滤器材料，分离介质元件44包括分离介质或纤维，其中纤维浸渍有或涂有分离介质，如交联葡聚糖、纤维素颗粒、离子交换树脂、硅石颗粒或各种类型的硅胶或亲和层析介质。
图5示出体积控制装置50的俯视图，体积控制装置50用于对输送至旋转柱组件的上表面和中心处的流体的体积进行调节。体积控制装置可置于位于刚性多孔过滤器顶部的旋转控制装置的上开口内。体积控制装置50包括较大的外柱51和基座56，在基座56中具有小孔或小开口52，在正常重力下，小孔或小开口52由于表面张力作用而阻挡或防止流体流动，但是在较高的重力载荷或其它力下，小孔或小开口52允许流体流过开口52。内中空圆筒53附接于基座56并安置在该外圆筒形柱51内，内中空圆筒53的高度和内部直径确定固定体积的流体。如果过量流体被输送至在中空内圆筒53和基座56内限定的第一腔54，则该过量流体可溢出并保留在由内圆筒53的壁、外柱51和基座56限定的第二腔55内，而不被输送至旋转柱组件的上表面，并且仅处于第一腔54中的流体可经过下开口52而到达接收旋转柱组件上。体积控制装置包括对液体不可渗透的刚性、惰性材料，如金属、玻璃、塑料或浸渍有聚合物的纸。体积控制装置50的优选实施方式通过喷射模塑并由塑料制成。
用于HGR-装置的旋转柱装置的选择：
通常，旋转柱装置包括由塑料、玻璃等构成的柱，其中塑料通常是聚合物如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯。旋转柱装置通常具有足以装配在收集容器如1.5-2ml的微量离心管或15-50mil的锥形离心管内的直径，这种离心管用作在其中收集来自旋转柱的流出物的容器。上开口通常在旋转柱的整个长度上具有同一直径；然而，旋转柱的下端部通常具有通道，该通道基本上小于旋转柱的本体的直径，并且该通道用作从旋转柱流出的流体用的排出口或排放口。旋转柱的下端部用作多孔熔块、过滤器或其它支撑的支撑，该熔块、过滤器或其它支撑允许流出流体从其中经过但是能够保留且阻挡或防止颗粒或凝胶分离介质从旋转柱中经过或离开。一些柱具有上熔块，而许多柱则没有。适用于生产根据本公开的HGR-装置用的空的旋转柱装置可在商业上从各种来源获得，来源诸如Thermo-Fisher Scientific(Waltham,MA)、Sigma Aldrich(Saint Louis,MO)、Axygen Biosciences(Union City,CA),BioRad(Hercules,CA),Pierce Chemical Co(Rockford,IL)、以及其它供应商。
旋转柱装置可选自各种尺寸的柱内容积，从约200μl至几十毫升的柱内容积。优选地，旋转柱装置的流出口应具有折断（snap off）突起或一些其它端部封闭件以防止液体或材料从位于其基座处的流出孔不慎失去，并且旋转柱装置的流出口还应具有用于装置上面的盖或其它封闭件来同样地防止材料从柱中失去。这种突起或封闭件还将装置的不慎污染或其它污染降至最低。旋转柱装置的下部可具有熔块或其它多孔或半透支撑材料，如半透膜、网或滤纸，其用作将分离或过滤介质保留在组装的旋转柱内并且当柱受到适当的离心力即压力或真空作用时允许液流从中通过，以使流体移动经过柱并离开该柱且进入收集装置。例如，一标准熔块材料为具有20μm的孔尺寸的1.5mm厚的疏水性聚乙烯。在另一实施方式中，旋转柱不是如上述的单一的管，而是具有多孔形式，其适合与作为收集容器具有96孔或384孔板一起使用。这种旋转过滤器板可广泛地获得，其可在每个板孔中容许小容积，如10μl直至以几十毫升计的相当大的容积。在该实施方式中，孔可具有圆形、正方形、矩形横截面形状或具有其它横截面形状。旋转柱的前述选择方面也应用于这种多孔形式。
用于HGR-装置的分离或过滤介质的选择：
分离介质可选自本领域中公知的各种材料并且取决于装置使用所采取的纯化类型。在各实施方式中，该介质可包括交联葡聚糖如
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系列（GE Health Care;Cardiff,United Kingdom）、聚丙烯酰胺如
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系列（BioRad）、纤维素颗粒、离子交换树脂如
Figure BDA0000421660370000113
（(Rhom and Haas Chemicals，LLC；Philadelphia,PA）、
Figure BDA0000421660370000121
（Dow Chemical Company;Midland,MI）以及可在商业上从各分销商和经销商获得的其它。在其它实施方式中，各种类型的二氧化硅颗粒或硅胶或亲和层析介质可被用作HGR-装置用的分离或过滤介质，这种介质和用途在本领域中是公知的。可以使介质预膨胀并将其添加至旋转柱装置，或更优选地将介质干燥地添加至柱并在现场通过添加适合的膨胀剂来使其膨胀，例如添加诸如用于
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材料的水，这种过程对于本领域技术人员来说是公知的。
用于HGR-装置的HGR-过滤器的选择：
本公开的HGR-过滤器应为多孔的但却具有足够刚性，从而在相关的纯化、分离、脱盐或物质的缓冲液/溶剂交换的过程中可能施加任意范围的压力、真空力、离心力或重力情况下保持其形状。优选地，刚性多孔HGR-过滤器具有充分挠性，从而在施加约1,000xg至约12,000xg或更多的离心力的情况下保持其形状。
用于HGR-过滤器的适合的材料包括纤维，该纤维包括纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚乙烯、尼龙、特氟
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等等。在另一实施方式中，HGR-过滤器包括烧结的材料如塑料、陶瓷或金属等等。HGR-过滤器可以被制造以使得纤维相对于HGR-过滤器的轴线以圆形、平行、垂直、螺旋形或随机排列。在某些实施方式中，HGR-过滤器可在其尺寸上浸渍有：分离介质，如离子交换树脂或颗粒、二氧化硅颗粒；亲和分离介质，诸如，例如涂覆有抗生蛋白链球菌的颗粒；以及凝胶渗透介质，如交联葡聚
Figure BDA0000421660370000124
等等。在其它实施方式中，HGR-过滤器材料的表面被改变以通过以下来提供分离功能性：例如涂覆或衍生化（derivatization）如亲水涂层或疏水涂层来给予这样的功能性；或者将亲和配体如生物素或链球菌附接至HGR-过滤材料表面。在一个实施方式中，HGR-过滤器可通过纤维素或醋酸纤维素过滤器来准备，其中纤维素或醋酸纤维素过滤器常常用作香烟过滤嘴并且可在几个品牌下获得，如：Rayo,Escort,Joker，或由Imperial Tobacco及其子公司如美国的Robert Burton Associates Ltd.或其它供应商提供的其它品牌。Filrona(Richmond,VA)广泛地提供这种过滤器并且包括具有嵌入材料如活性炭、离子交换颗粒及其组合的一些过滤器，其例如作为
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过滤器等等进行销售。这种过滤器的预期用途是从香烟烟雾中去除颗粒和其它不良物质，以从烟雾中去除或减少许多不良物质如致癌物中的一些。在本公开中，这些过滤器的应用是一种新用途，并且以发明人所知的极限，是制造商不曾预料到的。此外，表面活化纤维和塑料材料也可从Filtrona或其子公司或部门以及其它销售商处获得。用于HGR-过滤器准备的适合的材料如具有塑料成分的烧结、编织或压缩的材料等等也可从Filtrona或Porex Technologies(Fairburn,GA)或其它销售商处获得。
用于HGR-装置生产的HGR-过滤器的尺寸特征是，HGR-过滤器的高度等于或大于上面记载的所选择旋转柱装置的内部尺寸的径向尺寸。此外，HGR-过滤器的直径仅略小于所选择旋转柱装置的内部直径。HGR-过滤器可被准备成使得其尺寸符合大于或等于所选择旋转柱装置的内部半径的高度并且具有约等于旋转柱装置的内部直径的直径。在另一实施方式中，在HGR-过滤器用于多孔板如96孔或384孔板配置中的情况下，对于圆形孔的尺寸考虑与对于上述的柱的尺寸考虑相同。然而，当多板的孔的横截面为方形、矩形或六角形等等时，则HGR-过滤器的高度优选地等于或大于孔的横截面尺寸的最短侧的高度，HGR-过滤器的横截面与其要置入的孔的横截面的尺寸和形状实质上匹配或紧密地对应。
在特别优选的实施方式中，HGR-过滤器要么包覆有不渗透或渗透的涂层或层如致密的纸或塑料要么包覆有聚合物涂层，该聚合物涂层关于其表面特性可以是疏水的或亲水的，其中涂层应用在HGR-过滤器外表面上，并且HGR-过滤器的外表面关于其在旋转柱装置内的对准方面大体上平行于过滤器的长轴或竖直轴。例如，在HGR-过滤器为圆筒形的实施方式中，圆筒形HGR-过滤器的弯曲表面包覆有不渗透或渗透的涂层，而位于HGR-过滤器的顶部和底部的平坦表面则维持没有涂层。
用以生产和使用HGR-装置的部件的组装：
根据上述讨论的标准并且根据待处理样本的体积和匹配的收集装置选择旋转柱装置，该匹配的收集装置适合于对HGR-装置和预期从待制造的HGR-装置中收集的具有期望流出体积的流体进行保持。在优选的实施方式中，HGR-过滤器应具有大致等于旋转柱的内部直径的直径。该HGR-过滤器应具有大于柱内部直径0.5倍或者等于或大于旋转柱装置的内部半径的高度或长轴。在一个实施方式中，HGR-过滤器用于稳定下面的柱填充或分离介质，特别是当其用在定角离心机旋转器中时，从而当介质在该装置中旋转时防止该介质倾斜。在另一实施方式中，HGR-过滤器用作预滤网（pre-screen）以去除可能阻挡流过柱填充/分离介质的颗粒或其它物质。HGR过滤器可选自多种材料，如纤维素纤维、醋酸纤维素纤维、塑料纤维，其可由烧结的材料如塑料、陶瓷、玻璃或金属来准备，此外，其还可具有包括上述材料的网状材料。HGR-过滤器可具有成固定定向如平行于长轴、垂直于长轴或者相对于长轴线为螺旋的纤维，或者过滤器的材料或纤维可具有随机定向，这种选择和配置可取决于装置的预期用途和目的来选择。
HGR-装置的几个宽泛的实施方式使可能的，例如，旋转柱装置在其底部具有熔块，而其上方的空间填充有部分填充装置的分离介质，HGR-过滤器插在分离介质的顶部。在准备HGR-装置的另一实施方式中，旋转柱不具有任何熔块，并且HGR-过滤器插入以与旋转过滤器装置的底面接触。在HGR-装置的另一实施方式中，HGR-过滤器插入可其底部具有或不具有熔块的旋转柱中，分离介质填加在HGR-过滤器上方，另一HGR-过滤器插在分离介质的顶部，从而形成了分离介质位于两个HGR-过滤器之间的夹层形式。本领域技术人员从本公开的教导中可容易地想到，HGR-装置的许多其它实施方式随HGR-过滤器和分离或溶解（lysing）介质在旋转柱装置内的组装顺序而变化。
使用方法：
包含刚性多孔HGR过滤器的旋转柱组件的使用在用于将所需物质从其它物质中分离或纯化的层析过程中提供了许多优点，特别是当所需物质是包含在细胞或组织内的生物分子如DNA、RNA、蛋白质或糖蛋白时。过滤器的刚性和尺寸允许离心分离过程使用定角旋转器。此外，过滤器能够用作截留颗粒物质的预过滤（screen），允许在单一装置中执行样本准备和随后的层析步骤，避免在样本装载至分离介质之前还需要准备样本的附加预处理步骤。此外，旋转过滤器组件的包括粉化剂如玻璃珠的实施方式允许在同一装置中进行细胞或组织的破坏和或溶解，无需附加的耗时步骤来准备用于分离的样本。
本发明的一个实施方式涉及将所需物质从样本中的其它物质中分离的方法，包括以下步骤：a）提供样本，该样本包括含有所需物质的溶液或悬浮液；b）将样本装载在包含HGR-过滤器的旋转柱组件上；c）将旋转柱组件置于适合的收集容器中；d）向旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使样本中的流体穿过流出口并进入收集容器；e）从旋转柱组件中洗提所需物质；以及f）在收集容器中收集洗提的物质。在优选的实施方式中，所需物质是感兴趣的生物分子如DNA、RNA、蛋白质或糖蛋白。在另一实施方式中，样本包括悬浮在溶解缓冲液中的分裂的细胞或组织。在一些实施方式中，通过重力、压力、真空或离心作用向旋转柱组件和收集容器施加充分的力。在优选的实施方式中，通过定角旋转器中的离心作用向旋转柱组件和收集容器施加充分的力。
本发明的另一实施方式涉及将感兴趣的生物分子从样本中的其它物质中分离的方法，其包括以下步骤：a）提供样本，该样本包括含有感兴趣的生物分子的溶液或悬浮液；b）获取包括研磨或粉化剂的旋转柱组件；c）在旋转柱组件中将样本与研磨或粉化剂混合；d）将旋转柱组件置于适合的收集容器中；e）向旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使样本中的流体穿过流出口并进入收集容器；e）从旋转柱组件中洗提感兴趣的生物分子；f）在收集容器中收集洗提的感兴趣的生物分子。在方法的一个实施方式中，混合步骤包括：在将旋转柱组件置于适合的收集容器中之前或之后进行旋转柱组件的机械搅拌。
可通过在存在适合的缓冲液或提取液的情况下将样本装载至柱中的上部空间中来实现样本的分裂。例如，适合的缓冲液或提取液可包括：洗涤剂，如0.1%的十二烷基硫酸钠或
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X100、
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含氟-表面活性剂或类似；适合的缓冲剂，如Tris或MOPS或磷酸盐缓冲盐水；提供从0-14的适合pH的pH调节剂，如10-500mM的NaOH；或一些示例中的强离液剂，如饱和的或六摩尔的硫氰酸胍，用于细胞如植物物质、组织或细菌培养液、活检标本或整个组织的分裂，其可能通过或可能没有通过试剂如福尔马林来保存。根据目的对这种溶解剂进行选择，对本领域技术人员来说是公知的。
通过以下实现溶解：向柱顶添加封闭件以防止材料从柱中离出；以及以充分的力进行柱的机械搅拌来将样本与溶解剂混合；以及以充分的力使试剂与珠子溶解以分裂样本，将其组成成分释放至周围的介质，因此产生了样本和介质以及珠子的实质上均匀的混合悬浮液。可通过涡旋（vortexing）、摇摆、振动或声波降解或涡旋、摇摆、振动和声波降解的组合来实现机械搅拌，这些手段对本领域中的从业者是公知的。在将端盖或封闭件从装置如试管或其它适合的收集装置的排出口移除之后，通过将HGR-装置置于适合的接收器支撑装置中来获取溶解的样本成分。将组装的HGR-装置和收集装置插入适合于容纳组装的装置的尺寸的离心机旋转器，并且以适合于迫使流体穿过柱以离开柱并进入接收装置的速度对进行组装的HGR-装置和收集装置进行离心作用。
HGR-装置中的分离介质可确定溶解产物的哪些成分可从处理中被回收，例如，如果使用凝胶渗透分离介质，则通常小分子将被HGR-装置保留，而可溶解的较大的且较高分子质量的内容物将被收集在排放至收集装置中的流出物中。
亲和层析常常用于选择性地将独特的物质从非常复杂的混合物如表示的（expressed）或克隆的蛋白质中分离，其中表示的（expressed）或克隆的蛋白质来自其可被表示的细胞，并且该实践和用于纯化的方法是本领域的从业者公知的。通过在本申请中所述的旋转柱中包括适当的或合适的亲和基质作为分离介质或者与其它介质相结合，具体的物质可选自混合物的其它成分，其中这些物质是可在该混合物中发现。例如，分离介质可包括涂覆有蛋白A的珠子，所需物质为IgG，其能够通过固定化蛋白A结合在本申请中所记载的旋转柱装置内。对装置应用含有免疫球蛋白的血清以及其随后通过装置的处理将导致应用的IgG被蛋白A亲和基质保留在柱中。在不释放结合的IgG但去除残余的血清成分的条件下进行附加的冲洗，之后应用缓冲液来释放结合的IgG，提供了将浓缩的IgG部分从血清中分离的简单方法。与本领域中公知的类似，蛋白质可用各种标签或信息基团选择性地表示以便于其纯化。例如，包括六配组氨酸标签序列（motif）的蛋白质编码序列可被克隆并被表示在细胞中。所表示的六配组氨酸标签的蛋白可由所述的旋转柱装置捕获，其中该旋转柱装置包含六配组氨酸金属亲和树脂珠子，而干扰或非结合（unbound）材料被冲走，然后，所需的六配组氨酸标签的蛋白可被洗提且以高浓缩形式被收集。同样地，糖基化蛋白或碳水化合物或多糖可类似地通过使用如本文所述的亲和装置来获取。
套件：
在本发明的一个实施方式中，提供了一种套件，其包含旋转柱组件以及用于所需物质的分离中的一种或多于一种试剂，如溶解缓冲液、冲洗缓冲液、洗提缓冲液或用于制备这些缓冲液的原液。
在另一实施方式中，提供了一种套件，其包括a）具有内部直径和内部半径的一个或多个旋转柱装置；以及b）一个或多个单体HGR过滤器组件，过滤器组件具有约等于旋转柱装置的内部直径的直径以及大于旋转柱装置的内部半径的高度。
除了上述的各实施方式外，下面的示例将说明通过本公开的HGR-装置和HGR-过滤器对象所实现的与目前通常使用的那些相比的对旋转柱的改进的效用。
示例1
本公开的旋转柱的各实施方式的准备
从Axygen(Union City,CA)取得空的旋转柱，例如AxySpinTM微型旋转柱,或从Pierce Chemical Company(Rockford,IL)取得空的旋转柱,例如未填充或填充的ZebaTM800μl旋转柱。
在一个实施方式中，HGR-装置根据前述的公开准备如下。从Axygen(Union City,CA)取得8个旋转柱，即AxySpinTM微型，并通过使用已在水中膨胀整夜的666μl的G-50（在水中以体积计～80％的固体，并具有0.1％的叠氮化钠作为防腐剂）来填充。允许
Figure BDA0000421660370000182
悬浮液在每个旋转柱中沉淀～1小时，然后将包括0.5cm的Rayo醋酸纤维素香烟过滤嘴（Uptown's Smoke Shop;Nashville,TN）的HGR-过滤器与每个柱中的
Figure BDA0000421660370000183
层的上表面接触放置。过滤器吸收了上方的液体，并且用作吸收和/或扩散屏障来限制接下来在离心分离之前添加至旋转柱的液体渗透。例如，对于将质粒DNA从细胞培养物中分离而言，该实施方式是有用的，并且该实施方式由图1表示。
在另一实施方式中，HGR-装置根据前述的公开准备如下。从Axygen Biosciences(Union City,CA)取得旋转柱，即AxySpinTM微型柱，并通过使用已在水中膨胀整夜的400μl的
Figure BDA0000421660370000185
G-50（在水中以体积计～80％的固体，并具有0.1％的叠氮化钠作为防腐剂）来填充。允许
Figure BDA0000421660370000186
悬浮液在每个旋转柱中沉淀～1小时，然后，将包括0.5cm的Rayo醋酸纤维素香烟过滤嘴（Uptown's Smoke Shop;Nashville,TN）的HGR-过滤器与每个柱中的层的上表面接触放置。过滤器吸收了
Figure BDA0000421660370000188
上方的液体，并且用作吸收和/或扩散屏障来限制接下来在离心分离之前添加至旋转柱的液体渗透。接下来，将0.5克的0.5mm氧化锆/二氧化硅珠子（BioSpec Products;Bartlesville,OK）添加至每个旋转柱中的HGR-过滤器顶部以用作机械溶解辅助。
在另一实施方式中，HGR-装置根据前述的公开准备如下。从Axygen Biosciences(Union City,CA)取得旋转柱，即AxySpinTM微型柱，然后，将包括2.0cm的Rayo醋酸纤维素香烟过滤嘴（Uptown'sSmoke Shop;Nashville,TN）的HGR-过滤器与每个柱中的下部熔块的上表面接触放置，并且图3中示出了该HGR-过滤器。
图1-3中示出的具有各种配置的类似的柱由填充和未填充的800μl容量的ZebaTM型旋转柱（Pierce Chemical Company）这二者同样成功地准备。
示例2
从微生物培养液中分离核糖体RNA
大肠杆菌菌株ATCC8739(American Type Culture Collection;Manassas,VA)和葡萄球菌菌株ATCC12228,(American Type CultureCollection)在100ml的TerrificTM培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中均发展至汇集处（conflunence）（约48小时）。HGR-装置根据前述的公开准备如下。从Axygen(Union City,CA)获取旋转柱，并且通过使用已在水中膨胀整夜的400μl的
Figure BDA0000421660370000191
G-50（在水中以体积计80％的固体，并具有0.1％的叠氮化钠作为防腐剂）来填充。允许
Figure BDA0000421660370000192
悬浮液在每个旋转柱中沉淀～1小时，然后，将包括0.5cm的Rayo醋酸纤维素香烟过滤嘴（Uptown's Smoke Shop;Nashville,TN）的HGR-过滤器与每个柱中的
Figure BDA0000421660370000193
层的上表面接触放置。过滤器吸收了
Figure BDA0000421660370000194
上方的液体，并且用作吸收和/或扩散屏障来限制接下来在离心分离之前添加至旋转柱的液体渗透。接下来，将0.5克的0.5mm氧化锆/二氧化硅珠子（BioSpec Products;Bartlesville,OK）添加至每个旋转柱中的HGR-过滤器顶部以用作机械溶解辅助。
通过将2ml的适合培养液移至2ml离心管并在2000xg下离心分离3分钟，从上述复制的两个过夜培养液中获取细胞团块（pellet）。将附在上层的介质丢弃，使每个细胞团块重新悬浮在500μL的溶解缓冲液中，该500μL的溶解缓冲液包括100mM的MOPS（Sigma Aldrich,Saint Louis,MO)、l0mM的EDTA(EMD Chemicals;VWR;West Chester,PA)、1%SDS(EMD Chemicals;VWR)、5mM的DTT(Amresco)、0.5%的防沫剂A(Sigma Aldrich)、0.5%的防沫剂Y(Sigma Aldrich)、pH为～7.0-7.2的50μM的金精三羧酸（aurinetricarboxylic acid）(SigmaAldrich)。然后，将溶解缓冲液中的细胞悬浮转移至该示例中的上述HGR-装置的上部存贮区域，并且都通过旋转柱设有的盖封盖，使位于旋转柱末端的流出物封闭件不被触碰。然后，将这些装载的HGR-装置置于脉冲涡旋混合器（Pulsing Vortex Mixer）(ThermoFisher Scientific;Waltham,MA)中，并且通过使用3000的“脉冲（pulse）”设定处理10分钟。然后，将盖移除并向每个涡旋的HGR-装置添加pH为5.2的50μl的400mM乙酸钾缓冲液，重新应用盖，然后对HGR-装置进行短暂的涡旋来混合，并将HGR-装置置于环境温度（～23℃）下培养3分钟。在每个HGR-装置的末端将流出物封闭件破坏，然后将装置的每一个都插入75mm的聚碳酸酯收集管中，然后将该收集管装载至配备有C1015定角旋转器（Beckman Coulter;Fullerton,CA）的AllegraTM离心机的定角旋转器中，并且在1500xg条件下离心分离2分钟。可以发现，柱中液体的全部并未被转移至收集管。因此，将旋转柱和收集管组件在1500xg条件下离心分离附加的2分钟，然后在300xg条件下进行附加的离心分离3分钟，此时，可以发现旋转柱中的所有可见液体都转移至收集管中，并且对于葡萄球菌复制品而言回收约500μl，对于大肠杆菌样本复制品而言回收约700μl。然后，将旋转柱转移至新的收集管，将100μl的pH为～6.8的10mM柠檬酸钠添加至每个旋转柱，然后在3000xg条件下进行离心分离5分钟，这导致实质上回收了应用至每个柱的全部100μl缓冲液体积。使用Lonza RNA闪胶系统（Lonza;Rockland,ME）并遵循制造商建议且通过使用4μl的每个柱流出物来进行用于核糖体RNA存在的凝胶电泳。电泳清晰地指示从每个样本中以及在附加的柱冲洗中存在核糖体RNA。所观察到的带与来自原核细菌细胞的16S和23S核糖体RNA一致，并且还随已知的核糖体RNA的控制而共移。该结果指示，细胞溶解和核糖体RNA的分离可在根据本公开配备的单一管旋转柱装置中进行。通过使用Kodak凝胶逻辑成像系统(Kodak;Rochester,NY)获取凝胶的图像。图6示出凝胶的结果图像及其注解，其中，箭头指示核糖体RNA的区域和包含在以下样本中的电泳道（lane）：
电泳道 样本
1 4μl的大肠杆菌管1（第一过滤器旋转）
2 4μl的大肠杆菌管1（第一过滤器旋转）
3 4μl的大肠杆菌管2（100μl的第二旋转）
4 4μl的大肠杆菌管2（100μl的第二旋转）
电泳道 样本
5 4μl的葡萄球菌管1（第一过滤器旋转）
6 4μl的葡萄球菌管1（第一过滤器旋转）
7 4μl的葡萄球菌管2（100μl的第二旋转）
8 4μl的葡萄球菌管2（100μl的第二旋转）
9 控制RNA
示例3
将质粒从细胞培养液中分离
携带长度为～3Kb核苷酸(实际为2998bp)的pGEM7Zf-质粒的大肠杆菌菌株DH5α(Promega;Madison,WI)在补充有100μg/ml氨比西林（Sigma Aldrich）的100ml的
Figure BDA0000421660370000211
介质（MP Biomedicals,LLC.;Solon,OH）中并在～37℃条件下发展至位于C25型号培养摇动器（Incubator Shaker）(New Brunswick Scientific;Edison,NJ)中的汇集处。将培养液的复制品1ml试样量转移至2ml离心管(Sarstedt;Newton,NC)，通过在IEC MicroMax射频离心机中(IEC;Thermo Scientific;Waltham,MA)且在2000xg条件下离心分离3分钟使细菌粒化为团块。将介质从细胞团块中丢弃，使团块重新悬浮在200μl的S1水性（aqueous）缓冲液中，该200μl的S1水性缓冲液包括50mM的Tris-HCl、l0mM EDTA、100μg/ml的RNase A(Macherey-Nagel;Bethlehem,PA)，然后，将包括200mM的NaOH、1%的SDS(Macherey-Nagel)的200μl的S2水缓冲液添加至细胞悬浮液。将混合物置于环境温度（23℃）下培养3分钟。HGR-装置被准备成包括AxygenBiosciences AxySpin与在水中膨胀的400μl的以体积计80％的固体悬浮液的
Figure BDA0000421660370000212
G-50（Sigma Aldrich），并且具有0.1％的叠氮化钠作为防腐剂，且包括0.5cm的Rayo醋酸纤维素过滤器（Uptown'sSmoke Shop;Nashville,TN）的HGR-过滤器置于G-50凝胶顶部，包括pH为5.1的2.8M乙酸钾（Macherey-Nagel）的200μl的S3水性缓冲液添加至过滤器。将细菌的溶解溶液应用于经处理的旋转柱并短暂混合以允许沉淀物形成。然后，将旋转柱置于75mm聚苯乙烯管（Sarstedt）中，将组件在配备有C1015旋转器（Beckman Coulter;Fullerton,CA）的AllegraTM21中并在1000xg条件下离心分离5分钟。将HGR-装置丢弃，对估计为～500μl的收集的过滤物的每一个对其A260和A280值进行分析以确定DNA浓度，并且使用
Figure BDA0000421660370000221
ND-l000仪器(Thermo Scientific)估计其纯度。所获得的值对于第一复制品而言为～143ng/μl，而对于第二复制品而言为～256ng/μl，并且相应的A260/A280的比率为2.11和2.05，指示了优异的质粒产出和纯度。为了表明所分离的质粒的适合度，以进行下游的应用如测序、克隆、聚合酶链反应（PCR）等等。将回收的质粒溶液传递至2ml的Sarstedt离心管并通过1ml的异丙醇进行处理。发现DNA几乎立即沉淀在该添加物上。在室温下培养5分钟之后，并通过在具有851旋转器（IEC;Thermo Scientific）的MicroMax射频离心机中且在12000xg条件下离心分离5分钟使DNA粒化为团块。将异丙醇相取出，并且用500μl的95%的乙醇对每个团块进行清洗，然后在MicroMax离心机中且在12,000xg的条件下离心分离1分钟。将乙醇从团块中移除，将团块在
Figure BDA0000421660370000222
(Savant;Thermo Scientific)中且在真空条件下干燥5分钟。将团块均重新悬浮在100μl的0.1X TE、pH为8.0的2%乙腈缓冲液中。然后，将每份质粒溶液的20μl的试样量在37℃条件下、用10单位的限制酶Bam HI、通过由添加2.2μl的SureCut缓冲液B(RocheMolecular;Indianapolis,IN)的缓冲作用来分解1小时。此后，通过使用分离的未分解的质粒和Bam HI分解的质粒这二者的5μl的两个复制品进行电泳分析，其中通过使用8孔预计算（pre-cast）1％的琼脂糖凝胶(Lonza;Rockland,ME)来对分离的未分解的质粒和Bam HI分解的质粒进行应用和电泳，通过用Kodak凝胶逻辑成像系统(Kodak;Rochester,NY)成像的溴化乙锭凝胶对与10KB的分子尺寸标准(Bio Ventures,Inc;Murfreesboro,TN)进行比较。所获得图像以下如图7所示，其中箭头指示3KB线性DNA区域和包含在以下样本中的电泳道：
电泳道 样本
1 空
2 通过单一管分离的5μl的3kb质粒
3 5μl的Bam HI分解的质粒
4 通过单一管分离的5μl的3kb质粒
5 5μl的Bam HI分解的质粒
6 5μl的10KB标记
7 空
8 空
复制的质粒分离清晰地指示出通过Bam HI进行了实质上100%的切断（cutting），以基于在质粒中的单一Bam HI限制性位置产生～3Kb的线性DNA。因此，分离的质粒对于许多下游应用而言是有用的。
示例4
比较RNA分离方法的示例
通过两种商业的RNA分离方法进行的旋转柱装置的应用的的时间和产出的比较。在振荡培养箱中且在31℃和200RPM的条件下，大肠杆菌经过整夜发展至25毫升的无菌Letheen培养基（Broth）中的汇集处。通过以下对培养液的适合的试样量进行处理：通过示例2的用于本旋转过滤器装置的方法，还通过使用MoBio超洁净微生物（Ultra Clean Micorbial）RNA分离套件并遵循制造商的协议以及使用Qiagen RNeasy微型套件（minikit）并遵循制造商的协议除省去DNase处理之外。所有的过程产出rRNA和总RNA，其适用于通过对从细菌培养液获取的RNA电泳分析而进行的下游分析。然而，由示例2采用的旋转柱装置需要仅约为5分钟的非常少的传递时间，回收RNA的总时间少于20分钟，其包括传递和处理中所涉及的传递时间。对比来说，两种商用套件需要超过40分钟的执行时间以及附加的约5分钟的处理和操作时间，二者在约总计45分钟的时间内完成。因此，本申请的方法和装置用两种常用的商用RNA分离装置的时间的一半即可完成。当比较多个样本时，对于本旋转过滤器装置而言，与上述商用套件相比，注意到甚至更多的时间节省以及操作和传递的实质性减少。示例2的装置和过程需要最多5个步骤：（1）将细胞粒化为团块，（2）通过溶解缓冲液使细胞悬浮微粒重新悬浮，（3）将细胞装载在溶解旋转柱组件上，（4）在旋转柱中溶解细胞，（5）旋转柱的离心分离以及在适合的收集装置（管）中收集过滤物。MoBio协议需要至少16个分离步骤，而Qiagen协议就算省去了DNase分解步骤仍需要18个分离步骤。从具有添加有机物的培养液进行的类似制备也有同样良好的比较结果。
在包括摘要和附图的说明书中公开的所有特征以及所公开的任何方法或过程中的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了这些特征和/或步骤中至少一些是互相排斥的组合。包括摘要和附图的说明书中公开的每个特征均可由提供相同、等价或类似用途的可替换特征取代，除非明确另外说明。因此，除非明确说明，否则公开的每个特征仅为普通系列的等价或类似特征的一个示例。
已参照某些优选实施方式且相当详细地讨论了本发明，其它实施方式也是可能的。因此，所附的权利要求书的范围不应限于包含在本公开中的优选实施方式的描述。将本文中引用的所有参考文献的全部内容通过引用并入本文。

Claims (53)

1.一种旋转柱组件，包括：
a）旋转柱装置，所述旋转柱装置包括：
1）柱，所述柱包括内部直径和上开口，
2）下端部，所述下端部包括流出口；
b）刚性多孔过滤器，所述刚性多孔过滤器置于所述旋转柱装置内，所述刚性多孔过滤器包括不大于或等于所述柱的内部直径的过滤器直径以及大于所述柱的内部直径一半的过滤器高度；
c）研磨剂或粉化剂，置于所述刚性多孔过滤器上方；以及
d）体积控制装置，用于对输送至所述旋转柱组件的流体的体积进行调节，所述体积控制装置置于旋转柱装置的上开口内以及所述研磨剂或粉化剂上方，所述体积控制装置包括：
1）外柱；
2）基座，所述基座附接于所述外柱下面，所述基座包括孔，其中所述基座中的孔在正常重力下由于表面张力作用阻止或防止流体流动，但是在较高的重力或其它力下允许流体流过所述孔；
3）中空内圆筒，所述中空内圆筒附接至所述基座且位于外部圆筒形柱内，内圆筒包括高度和内部直径；
4）第一腔，所述第一腔位于所述中空内圆筒内以及所述基座上方并包括固定容积，其中所述内圆筒的高度和内部直径确定所述固定容积；以及
5）第二腔，所述第二腔围绕所述内圆筒但是位于所述外柱内以及所述基座上方，
其中，任何被输送至所述第一腔的过量流体将溢出并保留在所述第二腔内，而不被输送至所述旋转柱装置，并且仅处于所述第一腔中的流体将经过所述基座中的孔而到达所述旋转柱装置上。
2.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述刚性多孔过滤器的过滤器高度等于所述柱的内部直径。
3.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述刚性多孔过滤器具有足够的挠性以在施加约1,000xg的离心力的情况下维持其形状。
4.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述刚性多孔过滤器包括选自纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维、聚乙烯、尼龙和聚四氟乙烯（PTFE）的纤维。
5.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述刚性多孔过滤器包括选自塑料、陶瓷和金属的烧结的材料。
6.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述旋转柱装置包括塑料、玻璃或经处理的纸。
7.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述流出口包括滤网。
8.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述流出口包括开口，所述开口足够小以阻挡或阻止固体或颗粒物质从所述旋转柱装置离开，但是所述开口足够大以允许流出液体通过。
9.如权利要求1所述的旋转柱组件，还包括介质支撑，所述介质支撑位于所述下端部上方以及所述刚性多孔过滤器下方。
10.如权利要求9所述的旋转柱组件，其中，所述介质支撑包括聚乙烯熔块、滤纸或膜。
11.如权利要求1所述的旋转柱组件，还包括柱流出物收集容器。
12.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述研磨剂或粉化剂包括多个珠子，所述珠子由陶瓷、玻璃、或金属或其组合制成。
13.如权利要求12所述的旋转柱组件，还包括置于所述刚性多孔过滤器与所述研磨剂或粉化剂之间的保护性熔块。
14.如权利要求12所述的旋转柱组件，其中，所述研磨剂或粉化剂包括氧化锆/二氧化硅珠子。
15.如权利要求1所述的旋转柱组件，还包括盖，所述盖覆盖所述旋转柱装置的上开口。
16.如权利要求1所述的旋转柱组件，还包括堵塞所述流出口的封闭件。
17.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述体积控制装置包括对液体不可渗透的刚性、惰性材料。
18.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述体积控制装置包括浸渍有聚合物的纸、金属、玻璃或塑料。
19.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述体积控制装置包括喷射模塑的塑料。
20.如权利要求1所述的旋转柱组件，其中，所述旋转控制装置具有内容积，其中，柱内容积为200μl至20ml。
21.一种旋转柱组件，包括：
a）旋转柱装置，包括：
1）柱，所述柱包括内部直径和上开口，
2）下端部，附接于所述柱，所述下端部包括流出口；
b）分离介质悬浮液，所述分离介质悬浮液包含在所述旋转柱装置内，所述分离介质悬浮液包括上表面；
c）刚性多孔过滤器，所述刚性多孔过滤器置于所述旋转柱装置内并且位于所述分离介质悬浮液上方且与柱的分离介质悬浮液的上表面紧密接触，所述多孔过滤器包括不大于或等于旋转柱装置的内部直径的直径以及大于旋转柱装置的内部直径一半的高度；
d）研磨剂或粉化剂，置于所述刚性多孔过滤器上方；以及
e）体积控制装置，用于对输送至所述旋转柱组件的上表面和中心处的流体的体积进行调节，所述体积控制装置置于旋转柱装置的上开口内以及所述研磨剂或粉化剂上方，所述体积控制装置包括：
1）外柱；
2）基座，所述基座附接于所述外柱下面，所述基座包括孔，其中所述基座中的孔在正常重力下由于表面张力作用阻止或防止流体流动，但是在较高的重力或其它力下允许流体流过所述孔；
3）中空内圆筒，所述中空内圆筒附接至所述基座且位于外部圆筒形柱内，内圆筒包括高度和内部直径；
4）第一腔，所述第一腔位于所述中空内圆筒内以及所述基座上方并包括固定容积，其中所述内圆筒的高度和内部直径确定所述固定容积；以及
5）第二腔，所述第二腔围绕所述内圆筒但是位于所述外柱内以及所述基座上方，
其中，任何被输送至所述第一腔的过量流体将溢出并保留在所述第二腔内，而不被输送至所述旋转柱装置，并且仅处于所述第一腔中的流体将经过所述基座中的孔而到达所述旋转柱装置上。
22.如权利要求21所述的旋转柱组件，其中，所述分离介质悬浮液选自交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素颗粒、离子交换树脂、二氧化硅颗粒、硅胶和亲和层析介质。
23.一种将所需物质从样本中的其它物质中分离的方法，包括：
a）在含有所需物质的溶液或悬浮液中提供样本；
b）将所述样本装载在如权利要求1所述的旋转柱组件上；
c）将所述旋转柱组件置于适合的收集容器中；
d）向所述旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使所述样本中的流体穿过流出口并进入所述收集容器；
e）从所述旋转柱组件中洗提所需物质；以及
f）在所述收集容器中收集洗提的物质。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所需物质是选自DNA、RNA、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、多聚糖的感兴趣的生物分子。
25.如权利要求23所述的方法，其中，通过重力、压力、真空或离心作用向所述旋转柱组件和所述收集容器施加步骤（d）的充分的力。
26.如权利要求23所述的方法，其中，在定角旋转器中通过离心分离作用向所述旋转柱组件和所述收集容器施加步骤（d）的充分的力。
27.一种套件，包括：
a）根据权利要求1所述的旋转柱组件；以及
b）用于分离或纯化过程中的一种或多于一种试剂，试剂选自溶解缓冲液、冲洗缓冲液、洗提缓冲液和用于制备前述这些缓冲液的原液。
28.一种将所需物质从样本中的其它物质中分离的方法，包括：
a）在含有所需物质的溶液或悬浮液中提供样本；
b）将所述样本装载在旋转柱组件上，所述旋转柱组件，包括：
1）旋转柱装置，所述旋转柱装置包括：
i）柱，所述柱包括内部直径和上开口；以及
ii）下端部，所述下端部包括流出口；
2）刚性多孔过滤器，所述刚性多孔过滤器置于所述旋转柱装置内，所述刚性多孔过滤器包括不大于或等于所述柱的内部直径的过滤器直径以及大于所述柱的内部直径一半的过滤器高度，所述刚性多孔过滤器还包括：
i）第一过滤器元件；
ii）分离介质元件，所述分离介质元件还包括分离介质，所述分离介质选自交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素颗粒、离子交换树脂、二氧化硅颗粒、硅胶、亲和层析介质以及它们的组合；以及
iii）第二过滤器元件；
3）不可渗透材料，所述不可渗透材料围绕所述刚性多孔过滤器：以及
4）研磨剂或粉化剂，置于所述刚性多孔过滤器上方；
c）将所述旋转柱组件置于适合的收集容器中；
d）机械搅拌所述旋转柱组件，其中，机械搅拌将所述样本分裂；
e）向所述旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使所述样本中的流体穿过流出口并进入所述收集容器；
f）从所述旋转柱组件中洗提所需物质；以及
g）在所述收集容器中收集洗提的物质。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所需物质是选自DNA、RNA、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、多聚糖的感兴趣的生物分子。
30.如权利要求28所述的方法，其中，通过重力、压力、真空或离心作用向所述旋转柱组件和所述收集容器施加步骤（e）的充分的力。
31.如权利要求28所述的方法，其中，在定角旋转器中通过离心分离作用向所述旋转柱组件和所述收集容器施加步骤（e）的充分的力。
32.如权利要求28所述的方法，其中，所述第一过滤器元件、所述第二过滤器元件、或者所述第一过滤器元件和所述第二过滤器元件二者都包括选自纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维、聚乙烯、尼龙和聚四氟乙烯（PTFE）的纤维。
33.如权利要求28所述的方法，其中，所述第一过滤器元件、所述第二过滤器元件、或者所述第一过滤器元件和所述第二过滤器元件二者都包括选自塑料、陶瓷和金属的烧结的材料。
34.如权利要求28所述的方法，其中，所述流出口包括滤网。
35.如权利要求28所述的方法，其中，所述流出口包括开口，所述开口足够小以阻挡或阻止固体或颗粒物质从所述旋转柱装置离开，但是所述开口足够大以允许流出液体通过。
36.如权利要求28所述的方法，其中，所述旋转柱组件还包括介质支撑，所述介质支撑位于所述柱的所述下端部上方以及所述刚性多孔过滤器下方。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述介质支撑包括聚乙烯熔块、滤纸或膜。
38.如权利要求28所述的方法，其中，所述研磨剂或粉化剂包括多个珠子，所述珠子由陶瓷、玻璃、金属或其组合制成。
39.如权利要求28所述的方法，其中，所述旋转柱组件还包括置于所述刚性多孔过滤器与所述研磨剂或粉化剂之间的保护性熔块。
40.如权利要求28所述的方法，其中，所述旋转柱组件还包括分离介质悬浮液，所述分离介质悬浮液包含在所述旋转柱装置内。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述分离介质悬浮液选自交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素颗粒、离子交换树脂、二氧化硅颗粒、硅胶和亲和层析介质。
42.一种将所需物质从样本中的其它物质中分离的方法，包括：
a）在含有所需物质的溶液或悬浮液中提供样本；
b）将所述样本装载在旋转柱组件上，所述旋转柱组件，包括：
1）旋转柱装置，所述旋转柱装置包括：
i）柱，所述柱包括内部直径和上开口；以及
ii）下端部，所述下端部包括流出口；
2）刚性多孔过滤器，所述刚性多孔过滤器置于所述旋转柱装置内，所述刚性多孔过滤器包括不大于或等于所述柱的内部直径的过滤器直径以及大于所述柱的内部直径一半的过滤器高度，所述刚性多孔过滤器还包括：
i）第一过滤器元件；
ii）分离介质元件，所述分离介质元件还包括分离介质，所述分离介质选自交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素颗粒、离子交换树脂、二氧化硅颗粒、硅胶、亲和层析介质以及它们的组合；以及
iii）第二过滤器元件；以及
3）不可渗透材料，所述不可渗透材料围绕所述刚性多孔过滤器：
c）将所述旋转柱组件置于适合的收集容器中；
d）向所述旋转柱组件和收集容器施加充分的力以驱使所述样本中的流体穿过流出口并进入所述收集容器；
e）从所述旋转柱组件中洗提所需物质；以及
f）在所述收集容器中收集洗提的物质。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所需物质是选自DNA、RNA、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、多聚糖的感兴趣的生物分子。
44.如权利要求42所述的方法，其中，通过重力、压力、真空或离心作用向所述旋转柱组件和所述收集容器施加步骤（d）的充分的力。
45.如权利要求42所述的方法，其中，在定角旋转器中通过离心分离作用向所述旋转柱组件和所述收集容器施加步骤（d）的充分的力。
46.如权利要求42所述的方法，其中，所述第一过滤器元件、所述第二过滤器元件、或者所述第一过滤器元件和所述第二过滤器元件二者都包括选自纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维、聚乙烯、尼龙和聚四氟乙烯（PTFE）的纤维。
47.如权利要求42所述的方法，其中，所述第一过滤器元件、所述第二过滤器元件、或者所述第一过滤器元件和所述第二过滤器元件二者都包括选自塑料、陶瓷和金属的烧结的材料。
48.如权利要求42所述的方法，其中，所述流出口包括滤网。
49.如权利要求42所述的方法，其中，所述流出口包括开口，所述开口足够小以阻挡或阻止固体或颗粒物质从所述旋转柱装置离开，但是所述开口足够大以允许流出液体通过。
50.如权利要求42所述的方法，其中，所述旋转柱组件还包括介质支撑，所述介质支撑位于所述柱的所述下端部上方以及所述刚性多孔过滤器下方。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述介质支撑包括聚乙烯熔块、滤纸或膜。
52.如权利要求42所述的方法，其中，所述旋转柱组件还包括分离介质悬浮液，所述分离介质悬浮液包含在所述旋转柱装置内。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述分离介质悬浮液选自交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素颗粒、离子交换树脂、二氧化硅颗粒、硅胶和亲和层析介质。
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