DE4422040A1 - Verfahren zur Isolierung und Reinigung von PCR-Produkten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von PCR- Produkten in einem breiten Molekulargewichtsspektrum.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt eine bedeutendes Verfahren dar, welches für eine Vielzahl von Fragestellungen auf molekularbiologischem, molekulargenetischem, medizinischem sowie kriminalistischem Gebiet genutzt wird. Das Verfahren dient der Anreicherung von DNA, der Klonierung von cDNA oder genomischer DNA, der in vitro Mutagenese, der Erzeugung von rekombinanter DNA u. a.. Die Möglichkeit der Vervielfachung bestimmter DNA-Fragmente aus einer äußerst geringen Menge an Ausgangsmolekülen machen die PCR auch zu einer bedeutenden Methode in der Diagnostik von genetischen Erkrankungen, von Virus-, Bakerien-, Protozoen oder Pilzinfektionen, wie auch zum Nachweis von biologischen Kontaminationen in Lebensmitteln, Trinkwasser oder auch anderen Quellen.

In diesem Zusammenhang ist aus dem internationalen Schrifttum bekannt, daß amplifizierte PCR-Fragmente weiteren experimentellen Methoden zugänglich sein müssen, da allein die Länge eines amplifizierten PCR-Fragmentes zur Überprüfung der Spezifität in einer Vielzahl der Fälle nicht mehr ausreichend ist (Ehrlich, G.D. und Greenberg, S.J., 1994, Blackwell Scientific Publications, PCR-Based Diagnostics in Infectious Disease). Solche weiteren experimentellen Verfahren sind z. B. die Sequenzierung von PCR-Amplifikaten ebenso wie eine Subklonierung dieser, wie auch die Durchführung von entsprechenden Hybridisierungsverfahren. Alle diese Verfahren erfordern das Vorliegen von PCR-Fragmenten, welche frei von Kontaminanten wie Primern, Nukleotiden, Taq Polymerase, Salzen und Mineralöl sind.

Bisher durchgeführte gängige Verfahren zur Aufreinigung von PCR-Produkten beinhalten u. a. Proteaseverdauungen, Extraktionsschritte mit organischen Lösungsmitteln, gelelektrophoretische oder chromatografische Reinigungen und sind in diesem Zusammenhang extrem zeitaufwendig sowie mit erheblichen Verlusten an Amplifikat verbunden.

Ein kommerziell verfügbares Verfahren zur Aufreinigung von PCR-Produkten besteht in der Adsorption des PCR-Produktes an Säulenmaterial, wobei in einem sich anschließenden Waschschritt eine Reinigung des PCR-Produktes erreicht werden soll. Die Elution des PCR-Produktes erfolgt in einem Salzpuffer geringer Ionenstärke.

Solche Anwendungsprinzipien der Reinigung von DNA-Fragmenten in säulenchromatographischen Verfahren ermöglichen jedoch kein intensives Waschen des gebundenen PCR-Produktes. Vor allem Verunreinigungen mit chaotropen Salzen können mit solchen Verfahren nicht in ausreichenden Maße entfernt werden. Gerade für solche Salze ist jedoch bekannt, daß sie potente Inhibitoren von Enzymaktivitäten darstellen. Damit können solche Kontaminationen eine weiter Verwendung des PCR-Produktes unmöglich werden lassen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat das Ziel, PCR-Produkte in einem breiten Molekulargewichtsspektrum aus einem PCR-Reaktionsansatz von Primern, Nukleotiden, Salzen, Polymerase sowie Mineralöl zu reinigen. Dabei soll die Qualität des gereinigten PCR-Produktes eine weitere experimentelle Bearbeitung ermöglichen.

Das Reinigungsverfahren soll sehr einfach handhabbar sein, eine nur geringe apparative Ausrüstung benötigen, auf Phenol-Chloroform-Extraktionen sowie Ethanolpräzipitationen verzichten sowie mit geringem zeitlichen Aufwand realisierbar sein. Dabei soll soll ein großer Probenumfang bearbeitet werden können.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das PCR-Produkt mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger inkubiert, der Träger mit dem gebundenen PCR-Produkt abgetrennt und mit Pufferlösung gewaschen und nachfolgend das PCR-Produkt mit einem Puffer geringer Salzkonzentration vom Träger abgelöst.

Die Fixierung des PCR-Produktes erfolgt unter Anwesenheit chaotroper Salze hoher Ionenstärken. Dabei besitzt das verwendete Reinigungsverfahren und das verwendete Trägermaterial einen entscheidenden Vorteil gegenüber einer säulenchromatographischen Reinigung. Durch die direkte Exponierung trägerfixierter DNA-Fragmente auf der Oberfläche der SiO₂-Partikel können Kontaminationen in intensiven Waschschritten vollständig vom PCR-Produkt beseitigt werden.

Das am Träger fixierte PCR-Produkt wird vorzugsweise mit einem Waschpuffer aus 50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v mehrmals gewaschen. Eine solche Pufferzusammensetzung erlaubt dabei ein sehr intensives Waschen des PCR- Fragmentes ohne Verlust an Nukleinsäure.

Die Elution des PCR-Produktes erfolgt vorzugsweise in einem Elutionspuffer aus 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA) bei einer Temperatur von vorzugsweise 52°C innerhalb von 5 Minuten.

Mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Reinigung von PCR-Produkten von 100 Basenpaaren bis <20 Kilobasenpaaren sehr einfach und mit sehr geringem Zeitaufwand realisiert werden. Gerade die Aufreinigung von PCR-Fragmenten geringen Molekulargewichts ist mit einer Vielzahl von Methoden nicht möglich oder mit erheblichen Verlusten verbunden.

Eine besondere apparative Ausrüstung wie auch eine Verwendung mit gesundheitsgefährdenden organischen Lösungsmitteln ist nicht notwendig. Die Einfachheit des Verfahrens gestattet es darüber hinaus, auch sehr große Probenumfänge schnell zu bearbeiten.

Das gereinigte PCR-Produkt ist für eine Vielzahl weiterer molekularbiologischer bzw. biochemischer Methoden verfügbar, wie z. B. Spaltung mit Restriktionsendonukleasen, Klonierungen, Sequenzierungen, radioaktiven Markierungen, Hybridisierungsverfahren u. a.
Die Erfindung soll im folgenden durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Beispiel 1

Die Aufreinigung von PCR-Produkten geschieht wie folgt:
Ein 50 µl-PCR-Ansatz, einschließlich enthaltenem Mineralöl, wird in ein 1,5-ml- Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, mit 150 µl einer Lösung, bestehend aus chaotroper Salzlösung (6 M Natriumjodid) und Trägermaterial, versetzt und für 3 bis 5 Minuten auf Eis inkubiert. Der Träger mit den gebundenen Nukleinsäuren wird nachfolgend durch ein kurzes Zentrifugieren pelletiert und der Überstand verworfen. Es erfolgt dann ein dreimaliges Waschen mit jeweils 1 ml Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v), wobei jeder Waschvorgang ein kräftiges Vortexen einschließt. Nach durchgeführtem letzten Waschschritt wird soviel wie möglich Überstand vom Pellet entfernt und das geöffnete Reaktionsgefäß für 1 bis 2 Minuten in einem Wasserbad bei 52°C zum Entfernen von Ethanol aufbewahrt. Die Elution des PCR-Produktes erfolgt durch Zugabe von 50 µl Elutionspuffer (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA) für 5 Minuten bei 52°C, wobei das Pellet durch kurzes Vortexen im Elutionspuffer suspensiert wird. Nach einem abschließenden Zentrifugieren für 2 Minuten zur Pelletierung der Trägerpartikel wird der das PCR-Produkt enthaltende Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und steht nun einer weiteren Verwendung (Sequenzierung; Restriktionsenzymspaltung; Ligation u. a.) zur Verfügung.

Claims (10)

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von PCR-Produkten in einem breiten Molekulargewichtsspektrum, dadurch gekennzeichnet, daß der das PCR-Produkt enthaltende PCR-Reaktionsansatz mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂- Träger inkubiert, der Träger mit dem gebundenen PCR-Produkt abgetrennt und mit Pufferlösung gewaschen und nachfolgend das PCR-Produkt mit einem Puffer geringer Salzkonzentration vom Träger abgelöst wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des PCR- Produktes an den Träger unter Puffern erfolgt, welche chaotrope Salze hoher Ionenstärke enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke < 5 molar ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Salz Kaliumjodid, Natriumperchlorat oder vorzugsweise Natriumjodid eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das trägerfixierte PCR-Produkt mit einem Waschpuffer, vorzugsweise bestehend aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70% v/v Ethanol, gewaschen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das trägerfixierte PCR-Produkt vorzugsweise mit einem Puffer niedriger Ionenstärke (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) bei einer Temperatur 52°C eluiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es als batch-Verfahren durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.

9. Mittel zur Trennung von PCR-Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß es aus hochdispersen, nichtporösen SiO₂-Partikeln mit einer Korngröße von 7-40 nm, vorzugsweise 40 nm bei einer spezifischen Oberfläche von 50-300 m²/g, vorzugsweise 50 m²/g, besteht.

10. Mittel zur Trennung von Nukleinsäuren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es an unterschiedlichen Klebe- bzw. Chromatographiematerialien fixiert ist.