JPH07501223A - 核酸を単離する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸を単離する装置及び方法 本発明はプラスミド又はゲノムＤＮＡのような核酸を細胞及び他の原料から単離 及び精製する方法、並びに請求項１６のプレアンブルに記載の方法を実施するた めの装置に関する。

核酸の調製においては、例えばプロテイナーゼＫ及びリゾチームのような酵素； ＳＤＳ　、　Ｂｒ１ｊ、トライトン−Ｘ−１００、トウイーン２０、及び［ｌＯ Ｃのような洗剤；並びに水酸化ナトリウム、塩酸グアニジン、及びグアニジンイ ソチオシアネートのような化学物質を用いて最初に細胞を消化（ｄｉｇｅｓｔ　 １ｏｎ）　Ｌ／なければならない。実験者は、核酸を精製する前に細胞の破片を 除去して、その後細胞溶解物から核酸又は核酸分画を単離するという問題に直面 する。さらに、プラスミドＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを調製する際に、５ＤＳ（ド デシル硫酸ナトリウム）のような使用頻度の高い洗剤は除去する必要がある。Ｓ ＯＳを使用する場合のほとんどにおいて、ＳＯＳカルシウム塩が水溶性に乏しい ことから酢酸カルシウムでの沈殿によりこの除去が行われる。その後、細胞の破 片が沈殿したＳＤＳと共に遠心分離される。該溶解物中の成分が非常に大量かつ 泥状のゲル様ペレットを作りだすために、当該破片の除去は高速遠心分離におい ても困難である。通常、細胞破片の除去は５．０００ｇ〜２ｏ、ｏｏｏｇて１５ 〜６０分間遠心分離をすることにより行われる。この方法は、非常に多くの時間 と労力の投入を必要とし、自動化できないという欠点を持つ。

ＤＥ−Ａ−３６３９９４９は、長鎖核酸でない体液の成分と同様に、体液だけで なく、バクテリア、ウィルス、動物及び植物の組織及び細胞からのその他の物質 、特に細胞成分及び／又はそれらの分解産物からの長鎖核酸の単離及び精製の方 法を開示している。ここては、緩やかな消化並びに細胞破片及び他の不溶性成分 の除去に次いて、長鎖核酸が陰イオン交換体に固定され、一方分離すべき物質は 洗い出される。その後、固定された核酸を高イオン強度のバッファーを用いてマ ド１ルツクスから除去する。

ＤＢ−Ａ　３７１７２１１から、核酸のような生体ポリマーの分離及び精製の方 法が知られており、それにおいて核酸は特殊な装置中に配置されたマトリックス に吸着される。ここでは、バッファー条件は核酸が優先的に吸着され、蛋白、低 分子量物質又は細胞破片のような邪魔な物質は結合しないように調整される。

“核酸の単離、分画化及びハイブリダイゼーション：概論及び方法解説（ウルリ ッヒ・ホビス（Ｕｌｒｉｃｈ　Ｗｏｂｉｓ）編、フィルター層・ケミエ、１９８ ０年）に、核酸の単離方法が記載されている。それによると、高分子量のリポ核 酸はン１．５１Ｊ塩化ナトリウムの塩溶液には不溶性であり沈殿する。しかしな がら、そのような沈殿では有効と考えられないために、この研究論文では高い塩 濃度を用いた沈殿処理を複数回反復することが勧められている。

ＤＮＡ制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物の両方の効果的な分離が、 Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、　５１２巻、　４３３−４４４頁、　１９９０年 、に述へられている。クロマトグラフィ一部材として、２．５μｍサイズの非多 孔質粒子を有するイオン交換体ＤＥＡＤＮＰＲ部材が使用されている。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　４８４８頁、　１９７２年、により、酵母からの 核酸がポリ−し一リジンでコーティングされた珪藻土で分離されている。同様に 、ミトコンドリアＤＮＡがこのようなりロマトグラフィ一部材て分離されている 。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、　１９巻、　２３６−９頁、　１９８４年、 に、予備スケールでの合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの単離における多次 元クロマトグラフィーの使用が述へられている。ここては、最初の処理としてセ フ了デツクスＧ−１５によるサイズ排除（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロ マトグラフィーを行い、次いてＨＰＬＣイオン交換体カラム（パーティツルー１ ０３ＡＸ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行う。

この後、ＨＰＬＣ（ヌクレオシルＣｌ８）を用いた疎水性クロマトグラフィーを 行う。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９４巻、　１６３−１６９頁、　１９８３年、は核 酸の吸着クロマトグラフィー精製を行うための疎水性コーティングされたガラス 粒子の適合性について報告している。

従来のこの代用技術の欠点は、細胞溶解物からの細胞断片及び不溶性成分を除去 するために遠心分離処理か必要であるという事実にある。もう一つの問題は、高 イオン強度のバッファーで溶出するために高濃度に存在する塩類から核酸を回収 して同時に濃縮しなければならないことである。はとんとの場合、こうして得ら れた核酸のその後の処理操作は低イオン強度のバッファー条件でのみ可能である 。バッファー中に高濃度に溶解している塩類の除去は透析によって行うこともで きるが、この処理は対応する試料中の核酸の著しい分解を招く。透析に続いて、 脱塩した核酸を凍結乾燥によって濃縮しなければならない。濃縮の他の方法はエ タノール、イソプロパツール、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で核酸を 沈殿させることによる。核酸はこの系に不溶性であり沈殿する。しかしながら、 沈殿した核酸を遠心分離処理によってペレット化しなければならない。核酸ベレ ットは一旦乾燥させた後、非常に低塩濃度の低容量バッファーに溶解して無塩濃 縮核酸試料を得る。このような遠心分離及び沈殿方法では、核酸の簡単且つ迅速 な回収は不可能であり、自動化も達成困難である。一方、いずれの場合も大量の 試料を処理しなければならない臨床診断術及びヒトゲノム配列決定における分子 生物学の進歩によって、核酸を調製するための簡単且つ自動的な処理の必要性が 増大しつつある。

本発明が基本とする技術的課題は、細胞溶解物中の細胞断片又は不溶性成分を除 去するための遠心分離処理の必要性がなく、さらにその後に核酸を脱塩及び濃縮 処理しなければならないような高塩濃度のバッファー系中に核酸を得ることなく 、核酸を単離及び精製できる方法を提供することにある。実質的には、提供され る方法によりその後の処理に直接かけることができる条件にある核酸が供給され る。上記の技術的課題の他の重要な一面は、該方法を特に有利な様式で該方法を 実施することができる装置を製造することである。

本発明が基本とする技術的課題は請求項１．３４及び３６に記載の構成を特徴と する方法により驚くほど簡単な様式で解決される。方法に関する後続の請求項は 本発明の方法の好ましい態様に関するものである。

特に有利な様式で本発明の方法を実施することができる装置は、請求項１６．３ ５及び３７に記載の構成を特徴とする。それに関連した従属請求項は、本発明の 装置のさらに好ましい態様に関するものである。

最初に、それから核酸を単離する細胞を通常の様式で消化し、細胞の破片を除去 する。これは濾過又は遠心分離によって行ってもよい。好ましくは、回収は段階 的又はアシンメトリ−に作られたフィルター層で濾過することにより行う。核酸 を含む濾液を直ちに陰イオン交換体で処理してもよい。陰イオン交換体としては 、単離すべき核酸が各々の調製条件下で結合できるような市販の部材を選択して もよい。好ましくは、例えばＤＥＡＥセファロース■、Ｑセファロース■、ＤＥ Ａεセファデックス■、ＤＥＡＥトヨパール０、アンバーライト■、ヌクレオゲ ン［Ｆ］、キアゲン［Ｆ］のような、好ましくはアガロース、デキストラン、セ ルロース、アクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール）、ポリスチレン、ガラス 、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、又はシリカゲルから 成るマトリックスでできている表面改質された担体である。該陰イオン交換体は 、相互作用に適した高容量内部表面を持つ多孔質担体部材であるか、又は混合物 と相互作用して外部表面上でのみ分離する非多孔質担体部材でもよい。特に好ま しくは、該陰イオン交換体はシリカゲルを基材とし、粒子径が１〜２５０μｍ１ 好ましくは１０〜５０μｍ、特に好ましくは１５〜２５μｍであり、ボアの直径 が１〜２．５００　ｎｍ　、好ましくは１０〜５００　ｎｍ　、特に好ましくは １００〜４００ｎｍである部材である。特に、陰イオン交換体部材が高い表面電 荷及び核酸に対する高い結合能力を持つ部材であることが立証されている。好ま しくは、シリカゲル改質は、例えばＥＰ−Ａ　８３９０１０６５、ＤＥ−Ａ−３ ９３５０９８及びＵＳ−Ａ−５，０５７，４２６に開示されているように担体部 材をシラン化することにより行われる。ＥＰ−Ａ　８３９０１０６５では、例え ば、γ−グリシジルオキシブロピルトリメトキソシラン及びＮ、Ｎ−ジメチルア ミノエタノールが担体部材の改質に使用される。

核酸の吸着は、一般的に低塩濃度で存在するような条件下で行われる。好ましく は、これらは核酸をカラムから溶出させるものよりも低い塩濃度である。ここで は、イオン交換体部材及び使用するｐＨに応じて、該塩濃度は０．２５〜１．５ Ｍでよい。

陰イオン交換体部材への核酸の吸着に続いて、低イオン強度のバッファーを用い て最低−回の洗浄処理を行ってもよい。

ここでは、好ましくは、イオン交換体部材を主に円筒形の中空体のカラムに入れ る。その後、カラムを可能な限り高いイオン強度の塩溶液で洗浄するが、核酸は 溶出されない。それにより、低分子量及び電荷の弱い不純物及び蛋白が洗い出さ れる。

収量の不必要な損失を避けるために、吸着処理及び溶出処理の間に各々の吸着部 材の状態調節（ｃｏｎｄ　ｉ　ｔ　ｉｏｎ　ｉ　ｎｇ）を行うか、又は特に高塩 濃度条件下での核酸の吸着を後に行おうとする領域において、最終の洗浄処理と して可能な限り高いイオン強度を実現すると都合かよいであろう。特に、この目 的において、ｐＨが約５でイオン強度が約１．５Ｍの過塩素酸ナトリウムに対応 する平衡化及び状態調節用の溶液を使用してもよい。

対応して、高イオン強度の条件下で核酸を結合させる部材を、別の主に円筒形の 中空体に入れる。イオン交換部材から脱着されて高塩濃度分画中にある核酸分画 を、高塩濃度条件下で核酸を吸着する部材の入ったカートリッジ又はカラム中に 入れる。好ましい態様において、陰イオン交換体の入った容器が高塩濃度条件下 で核酸を吸着する部材の入った容器の上に配置されるように、各装置を対応する 吸着部材に合わせる。

特に、高イオン強度で核酸を吸着することかできる部材の状態調節は、そのよう な処理方法により容易に行うことができる。高イオン強度で核酸に結合すること ができる部材を、対応する高濃度の塩溶液で前処理することにより状態調節を前 もって行ってもよい。しかしながら、例えば、核酸を吸着する部材を高イオン強 度の塩溶液で初めに処理し、その結果、水溶液がそれに接触すると直ちに非常に 高い塩濃度か生して高イオン強度下で該部材を核酸を吸着させるように、適当に 前処理した部材を使用することも可能である。陰イオン交換体からの核酸の溶出 により該部材から分離する最初の容量が、十分な強度で次の部材に吸着させるに は低すぎる塩濃度となることが実際にあり得るために、状態調節は有利である。

そこで、比較的薄い溶出液滴が、上記のように状態調節した、高イオン強度の条 件下で核酸に結合することができる部材に接触するに至った場合、高い塩濃度が 即座に得られ核酸がこの部材に吸着されるであろう。

その後、核酸を高イオン強度の溶出バッファーで無機質担体に直ちに結合させる ために、高イオン強度のバッファーを用いて陰イオン交換体部材から該核酸を脱 着させてもよい。ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸ナトリウムのようなカオトロピ ック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）塩の存在下では、微細ガラス又はシリカゲルの懸 濁液を核酸に加え、核酸がシリカゲルに結合できるように長時間インキュベーシ ョンを行った場合、核酸が微細粉砕ガラス又はシリカゲルに結合することもある （Ｂ、）十−ゲルスティン及びり、ギレスピ−（Ｂ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　 ａｎｄ　Ｄ、　Ｇ１１ｌｅｓｐｉａ）　：アガロースからのＤＮＡ０分取及び分 析用精製：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、７ ６巻、　６１５−１９頁、　１９７９年：Ｒ，ギン１，１．リス及びＢ、つ（Ｒ ，Ｙａｎｇ、　Ｊ、　Ｌｉｓ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｗｕ）ニゲル電気泳動後のアガロ ースからのＤＮＡの溶出：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６５巻、　 ＋７６−１８２頁。

１９７９年、Ｍ、Ａ、マルコ、Ｒ，チッパ−フィールド及びＨ，Ｃ，ビルンボイ ム（Ｍ、Ａ、　Ｍａｒｋｏ、　Ｒ，Ｃｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ　ａｎｄ　Ｉ（、 Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　：アルカリ抽出及びガラスパウダーへの結合を用いた 高度精製プラスミドＤＮＡの大量単離法：Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２ １巻。

３８２−３８７頁、　１９８２年）。

驚くへきことに、核酸の無機質担体への吸着は試料に低級アルコールを加えるこ とによっても行うことができる。好ましくは、メタノール、エタノール、プロパ ツール、イソプロパツール、及びブタノールが可能である。試料に加えるアルコ ールの量の好ましい範囲は、１−５０％（Ｖ／Ｖ）の水に溶ける限りの範囲であ る。さらに、核酸の吸着はポリ（エチレングリコール）類を用いて行うこともて きる。

使用できるエチレングリコールは１．０００〜１００．０００、とりわけ６．０ ００〜８．０００の分子量を持つものである。ポリ（エチレングリコール）の添 加は試料の１−３０％の範囲でもよい。

驚くべきことに本発明の方法は、核酸かガラス又はシリカゲルの非常に薄い層を 通過する際に、滞留時間がわずかｌ−３Ｏ３（秒）であるにもかかわらず、効率 よく吸着されることを示している。同様に、結合が高濃度の塩化ナトリウム及び 塩化リチウム中で起きること、及びカオトロピック塩は必要でないことが見られ る。さらに、陰イオン交換体が核酸の精製に役立ち、０．２５〜１．５Ｍの塩濃 度で代謝物質、蛋白及びＲＮＡの一部、並びにポリサッカライド類のような不純 物が除去されて、これらは所定の条件下では下流のシリカゲル層に吸着すること ができず、次の段階どしてシリカゲル層への核酸の吸着を可能にする十分に高い 塩濃度で核酸か陰イオン交換体から溶出される際に、該シリカゲル層か脱塩及び 濃縮の目的を果たすような、陰イオン交換体及びシリカゲルの組み合わせはこむ までに述へられていない。

無機質担体への吸着処理においては、表中に示す濃度の７＜ソファ−塩を用いる ことができる。

ＮａＣ１３−５Ｍ ＮａＣＩ０４５−７　Ｍ Ｇｕ−ＨＣＩ　５−７　Ｍ Ｎａｌ　３−５Ｍ 塩溶液での処理は、フィルター上への滴下及び吸水によって簡単に行ってもよい 。好ましい態様においては、該シリカゲル層をｐＨ６，５〜８．５、とりわけｐ Ｈ７〜８の過塩素酸溶液で処理する。便宜的には、これをピペッティング及び吸 水によって行う。特にこの目的において好ましいのは、４〜８ＭのＮａＣｌＯ４ ，５〜２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐｌ　７−８、及び０．５〜２ｍ！ｉ ｌのＥＤＴＡを含む溶液の使用である。

カオトロピック溶液、とりわけ過塩素酸ナトリウム溶液の除去に続いて、再洗浄 を好ましくはエタノール、例えば５０−９０％エタノールを用いて行う。

フィルターが一旦乾燥すれば、溶出は、例えばＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 　１０１巻、　３３９−３４１頁、　１９８０年、に述へられているような塩の 希釈水溶液を用いて通常の様式で行われる。好ましい溶出液は、０．０５〜０． ２　ｍＭのＥＤＴＡを含む０．５−２　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７−８ ，てあり、以後ＴＥと呼ぶ。それ以外の適当な溶出液として、例えば、０．１％ ＳＤＳのような洗剤の希釈溶液かあるが、ＴＥはど好ましくはない。

シリカゲル以外に、他の無機質担体も核酸の吸着に適当であることが見出だされ た。しかしながら、好ましい態様においては、１〜２５０μｍ、好ましくは１〜 ５０μｍ、特に１〜５μｍの粒子径のノリ力ゲルが使用される。脱塩層を、二個 のＰＥフリットの間に挟まれた粗く充填された層として抽出カラム中に使用して もよい。別の態様には、εＰ−０３２３０５５（＋２１０７／＋９８８．３Ｍ、 コンポジション・クロマ１−グラフィック・アーティクル）による膜の形態の無 機質担体の適用が含まれる。

本発明の方法を用いて、非常に多様な由来の核酸を、該核酸がバクテリア、細胞 培養物、血液、組織、尿、ウィルスに由来するものであるかどうか、又はＰＣＲ （ポリメラーゼ連鎖反応）　、５ＳＳＲ（自立配列複製）、リガーゼ連鎖反応、 及び類似の反応のような増幅反応に由来するものであるかとうかにかかわらず、 或いはビオチンラベル、蛍光ラベル、放射性ラベル等のラベル化核酸が関係する かどうかにかかわらず、分離及び調製することができる。該核酸がｌＯヌクレオ チドから２００．０００ヌクレオチドの範囲のサイズであれば可能である。本発 明で意味する核酸とは、ｌＯ〜１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、５０ 〜２５．０００ヌクレオチドのＲＮＡ、２．５００〜２５．０００塩基対のプラ スミドＤＮＡ、５．０００〜６０．０００塩基対のコスミドＤＮＡ、又は１００ 〜２００．０００塩基対のゲノムＤＮＡと理解される。

本発明の方法のステップｄ）により得られた核酸分画は、低塩負荷の溶液として 得られる。従って続いて、その後の処理に必要なバッファー条件の調整が可能で ある。特に便利な様式を取れば、シリカガラスに結合した核酸はその後の処理用 に設定されたバッファー中にすでに溶出されている。

単離された核酸は非常に多様な用途に用いられる。特に度々用いられるあは、制 限分析、配列決定、放射性物質又はビオチン、ＦＩＴＣ、ジゴキシゲニンのよう な非放射性マーカーによるラベル化、並びにＰＣＲ，５ＳＳＲ，及びリガーゼ連 鎖反応を用いた増幅を行うための制限酵素、ポリメラーゼ、及びリガーゼを用い た酵素反応を行う場合においてである。

本発明の方法はプラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの単離及び調製において特に 適している。

添付の図面は、核酸用の多様な吸着部材が一装置に組み合わされた、本発明の装 置の好ましい態様を図解している。

図１は、本発明の方法を実施するための装置を示しており、入口開口部７及び出 口開口部８を持つ中空体１から成る。好ましくは、該中空体はポリプロピレン（ ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（メチルメタクリレ−））　（ＰＭＭＡ） 、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ（エチルテレフタレート）　 （ＰＵＴ）　、又はポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）から成る。中空体ｌの中に は、固定具５及び６の間に無機質担体部材である第一の粉末部材ＩＯか配置され ている。中空体１の中の、第一の部材ＩＯ及び出口開口部８の間に無機質担体部 材である第二の粉末部材ＩＩが置かれている。第−及び第二の部材１０及び１１ は核酸に対して異なる吸着特性を持つ。吸着特性の差は、それぞれ、高イオン強 度及び低イオン強度のバッファーにおける異なる吸着作用により決定されている 。例えば、低イオン強度の条件下で第一の部材１０に核酸が吸着される場合、第 二の部材ＩＩは低イオン強度のバッファー条件下では核酸を容易に通過させるこ とができなくてはならず、一方高イオン強度の条件下では、核酸は第一の部材１ ０から脱着されて、第二の部材１１に吸着されることになる。

好ましくは、第一の粉末部材１０はアガロース、デキストラン類、セルロース、 アクリルアミド、ポリ（ビニルアルコール）、ポリスチレン、ガラス、酸化アル ミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、又はシリカゲルを基材として表 面改質された担体の陰イオン交換体、特にシリカゲルを基材とする上記の型の陰 イオン交換体から成る。好ましい該塩基性イオン交換体は、１０〜４０μｍ１と りわけ１５〜２５μｍ、特に１５〜２５１ｔｍの粒子径を持ち、孔の直径が１〜 ２．５０ＯｎｌＩ＋、好ましくは１０〜５００ｎｍ、とりわけ２００〜４００ｎ ｍである。

第二の部材１１は無機質担体部材であり、とりわけシリカゲル、ガラス、ゼオラ イト、酸化アルミニウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、珪藻 土、好ましくはシリカガラスから成り、シリカゲル懸濁液の形態を取ってもよい 。第二の部材１１は、好ましくは１〜２５０μｍ１とりわけ１〜３０μｍの粒子 径を持ち、１〜５μｍが好ましい。

好ましくは、装置５及び６は焼結ガラス（フリット類）、ポリエチレン、ＰＴＦ Ｅ、ポリプロピレン、ガラス、セラミックス、ナイロンのようなプラスチック膜 ：又はポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロンでできた不織布から成る。好ま しくは、装置５及び６の気孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）は１０〜５００μｍである 。

本発明の装置の別の好ましい態様を、図２に図解する。ここでは、第一の部材Ｉ Ｏ及び第二の部材ｌ！は中空体Ｉの中に、部材１０及び１１が直接隣接し、即ち 固定具５及び６によって一緒に固定されている別々の層となるように配置されて いる。好ましくは、該部材は分離具１３により分離されており、当該分離具１３ は多孔性の枠であり、好ましくは焼結ガラス、又はプラスチック膜或いは好まし くはナイロン製のティッシュでてきている。

図３は本発明の装置の別の好ましい態様を図解するもので、第二の部材＋１がチ ャンネルを形成する出口開口部１８の中の固定具５及び１５の間に固定されてい る。チャンネルを形成する出口開口部１８は、中空体１よりも小さな横断面を持 ち、好ましくはチャンネル１８ａで終わり、チャンネル１８ａの直径はチャンネ ル１８の直径よりも小さい。第一の部材１０は中空体１の内部の直径の長い領域 に置かれ、装置６及び１６により固定される。ここでは、第−及び第二の部材Ｉ Ｏ及び１１を隣接させると、共通の手段１７だけによって分離できるので都合が よいと考えられる（図４参照）。

図５は本発明の装置の別の好ましい態様を示しており、第−及び第二の部材１０ 及びＩＩの層の他に、第一の部材１０の上に配置された別の層１２を中空体の中 に持つ。層１２は機械的フィルタ一手段として設計されている。好ましくは、第 三の層１２は、フィルターボア径か試料の流れる方向、即ち供給ロアから出口開 口部８又は１８の方向に小さくなるアシンメトリ−なフィルターである。それに より、装置を目詰まりさせる恐れもなく試料中の細胞破片を除去することができ る。

本発明の装置の全ての態様において、部材１０及び１１のいずれも粉末形態でも よく、又は成形体に設計されていてもよい。部材ｌＯ及び１１が粒子の形態で存 在する場合は、該層かＵＳ−ＰＳ　４．８１０．３８１及びＵＳ−ＰＳ　４．６ ９９．７１７による膜であってＤＥ　４１２７２７６に提示されているような形 態で存在するように、それらを不活性プラスチックのサポーテイングネット中に 埋封することが勧められるであろう。

該サポーテイングネットはテフロン製でもよい。

図６は本発明の装置の他の好ましい態様を示しており、それにおいては８個の独 立した別々の図２の装置か互いに隣接して、８個でｌユニットを形成している。

図１−５に述へた個々の態様のいずれて実現してもよいこの態様の利点は、マル チチャンネルピペットを補助器具とする８試料の同時調製を基本とする。同様に 、この設計は１２列形態に製造することもてき、それにより９６試料が処理可能 となる。国際標準化微量滴定フォーマットを用いる場合に非常に有利である。

図７は、入口開口部７及び出口開口部８、並びに二個の手段６及び５の間に固定 された陰イオン交換体部材１０を有する円筒形中空体１を含む装置を示している 。その上に、内部に種々のフィルター層が配置されている別の円筒形中空体が装 着されている。フィルター！　２０．２１．２２は、焼結されたポリエチレン、 ポリプロピレン、ＰＴＦＥ、ガラス、シリカゲル、酸化アルミニウム又は圧縮珪 藻土、例えばセライト又はシリカゲルからできていてもよい。もっとも、その他 にポリプロピレン、ポリエステル、ガラス繊維、及びシリカの織フリース又は不 織フリースも可能である。好ましくは、個々の層の気孔率は１５〜５００μｍで 、厚さは０．１〜１０ｍｍである。該フィルター層のボア径は、流れの方向に見 て、順に小さくなる。典型的な態様では、層２０におけるボア径はおよそ１００ 〜３００μｍで、層２Ｉては３０〜１００μｍ１第三のフィルター層では５〜３ ０μｍである。

図８は、図７の装置の別の好ましい態様を図解しており、流れの方向に見て一番 上のフィルター層２３として疎水性の層が挿入されている。該疎水性中間層２３ は、実際の濾過が開始される以前のフィルター層中への望ましくない粗細胞溶解 物の侵入を防ぐ。好ましくは、疎水性中間層２３は、気孔率が１０〜５００μｍ で、好ましくは厚さが０．１〜５ＩＴＩＩ１１の、紡績又は焼結されたポリプロ ピレン、ポリエチレン、ポリエステル又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦ Ｅ）繊維から成る。

図９は、図７及び８に述へたものと類似の設計の濾過装置を示しており、異なる 点は、ボア径が小さくなっていく種々のフィルター層が、連続的にボア径が小さ くなっていく単一のフィルター層１２に合わせられていることにある。好ましく は、該アシンメトリツクフィルター１１１２の流れの方向に見て上面に疎水性フ ィルター２３か備えられる。好ましくは、該アシンメトリツクフィルタ一層１２ は紡績ポリプロピレン又はポリエステル繊維から成る。市販のものには、例えば 、パル・フィルターテクニク社（ドライアイヒ、フランクフルト）の、気孔率の 段階的変化が５００から５０μｍのもの、１００から１０μｍのもの、５０から ５μｍのもの、及びｌＯから０．１μｍのものがある。好ましくは、該アシンメ トリツクフィルタ一層の厚さは１〜１０ｍｍがよい。

図１０は、本発明で意味するところの核酸の分離を行うための濾過装置を示して おり、ここでは図９のフィルター配置か再び使用され、アシンメトリツクフィル ターに疎水性フィルター層２３が備えられている。陰イオン交換体１０の代わり に、高濃度の塩溶液において核酸を吸着することかできる無機質担体１１を中空 体Ｉの中に置く。

図１１は、図９及び１０を組み合わせた配置を示す。ここでは、適当に設計され たカートリッジを挿入するなどにより、アシンメトリツクフィルター１２及び疎 水性フィルター層２３から成るフィルターヘッドが図２に示した装置に単に備え られただけである。

図１から５、及び図７から１１により詳しく述べられている個々の装置は全て、 ８列の単一の装置から成る微量滴定ストリップに配置してもよい。これは、図１ ２から１４に、もう一度例示しである。

図１２は、陰イオン交換体、微量滴定ストリップ、又は８及び／又は８×１２ウ エルの微量滴定プレートを含む濾過装置を図解している。図１２の装置において は、装置５及び６の間に固定された陰イオン交換体層を含む円筒形中空体ｌの上 の、装着式カートリッジの中にアシンメトリ−の濾過装置が置かれている。

図１３は、陰イオン交換体部材の代わりに、高塩濃度において核酸を吸着するこ とができる無機質担体部材を有する濾過装置に関する。好ましくはシリカゲル層 ｌｌが、５及び６の二装置の間に配置されている。

図１４は、図２の配置、及び試料が流れる方向に見て中空体Ｉの上に置かれた疎 水フィルター層を伴うアシンメトリツクフィルタ一層の組み合わせを図解してい る。

本発明の装置、特に図３又は４て詳細に検討した装置は、非常に少量の液体を用 いても第二の部材からの核酸の溶出が確実になされることにおいて特に有利であ る。

基本的には、試料の本発明の装置中の流動は重力によってなされるが、核酸の精 製及び分離を促進するために、開口部７を加圧するか、又は開口部８又は１８を 減圧してもよい。本発明の装置の他の好ましい態様では、アシンメトリツクフィ ルターとして、該中空体の中を試料が流れる方向にボア径が小さくなる焼結ガラ ス、又はボア径が小さくなるプラスチック膜の積層からできているものを使用す る。

細胞及び他の原料からの核酸を、遠心分離、フェノール／クロロホルム抽出、及 びアルコール沈殿をすることなく得ることができ、該処理の終了に際して核酸は 水又は低塩濃度のバッファー中に濃縮された形態で存在し、従って、直接その後 の酵素反応に使用できる。別の利点は、高価な実験装置の使用を避けられること にある。例えば、溶出は重力によって行うことができ、いわゆるＨＰＬＣ装置に より行う必要がない。

好ましくは、シリカゲル陰イオン交換体／シリカゲル抽出カラムの調製は、５０ μｍの底部ポリエチレンフリット（ポリエチレン製の多孔質フィルター層、厚さ １．５ｍｍ）を持つ市販の１．５ｍｌ遠心管の中にポリプロピレン管をぴったり と討入し、５０　ｍｇのシリカゲル（リクロスフ７−Ｓｉ　１００．１６−２４ 　μｍ　；メルク、ダームスタット、ドイツ）を積層させることにより行うこと ができる。このシリカゲル層を第二の多孔質ポリエチレンフリットでシールし、 第二のフリットにｌｏＯｍｇのシリカゲル陰イオン交換体（キアゲン、ヂアゲン 社、デュッセルドルフ、ドイツ）、粒子径１６〜２３μｍ、を積層させ、最後に 第三の多孔質ポリエチレンフリットでシールする。

好ましくは、アガロース陰イオン交換体／シリカゲル抽出カラムの調製は、５０ μｍのポリエチレンフリット（ＰＥ製の多孔質フィルター層、厚さ１．５ｍｍ） でポリプロピレン管の底部をシールし、５０ｍｇのシリカゲル（リクロスファ− Ｓｉ　１００　。

１６−２４μｍ　、メルク、ダームスタット、ドイツ）を積層させることにより 行うことができる。このシリカゲル層を第二の多孔質ポリエチレンフリットでシ ールし、第二のフリットに０．５ｍｌのＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシ ア社、フロイバーグ、ドイツ）、粒子径４５〜１６５μｍ、を積層させ、最後に 第三の多孔質ポリエチレンフリットでシールする。

好ましくは、図３の陰イオン交換体膜／シリカゲル膜抽出カラムの調製は、ポリ プロピレン管の中のポリエチレンフリットの上に、厚さがＩＩＩＩＩＩ＋のエム ボア■シリカゲル膜（３）　（３Ｍ社、セント・ボール、ＵＮ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、 ）　、厚さが０．２ｍｍのポリプロピレンフリース、及び１６−２３μｍのキア ゲン陰イオン交換体粒子（ヂアゲン社、デュッセルドルフ、ドイツ）から成る厚 さが１ｎｖｎの陰イオン交換体膜を置くことにより行うことができる。

陰イオン交換体／シリカゲル微量滴定ストリップ抽出カラムの調製は、以下のよ うに行うことができる二８又は９６の位置を持つ微量滴定ストリップにＤＥＡＥ シリカゲル膜及びシリカゲル膜を装填する。微量滴定ストリップのポーリングの 中に、シデント９シリカゲル粒子（デグサ社、フランクフルト、ドイツ）ででき ている厚さが０．７５ｍｍのシリカゲル膜、厚さが０．２ｍｍのポリプロピレン フリース層、及び１６−２３μｍのキアゲン（チアゲン社、デュッセルドルフ、 ｌ・イツ）でできている厚さが０．８ｍｍの陰イオン交換体膜を固定させる。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

プラスミドＤＮＡの調製 ｐｕｃ　＋８−形質転換ＨＢ　１０１大腸菌細胞を含むＬＢアンピシリン培地に よる培養物１００　ｍｌを５．０００ｇで１０分間遠心分離する。該細胞ベレッ トを１０　ｍｌの５０ｍ！ｉｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、 　ｐＨ８，０，及び１００μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａに再懸濁する。

細胞を溶解するために、１０　ｍｌの０．２　Ｍ　ＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを細 胞懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間室温に置く。これを、１０ｍ１の３Ｍ 酢酸カリウム及び２Ｍ酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で１５分間インキュ ベートする。該溶解物を１５．０００　ｇで３０分間遠心分離し、上清を注意深 （除去する。澄んだ細胞溶解物１ｍｌをピペットでＤＥＡＥ陰イオ陰イオン交換 体／シリカゲル遠心分離抽出カラ軌上、該試料を２．５００ｇで１分間遠心分離 してイオン交換体層を通過させる。該抽出カラムを、０８ｍ１のｌ　Ｍ　ＮａＣ １，１５％エタノール、５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，０、及び１５％エタ ノール、１０　ｍＭ酢酸ナトリウム、　ｐＨ７，０、及び０．８ｍｌのＩ　Ｍ　 ＮａＣ１０゜て洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮＡを７　Ｍ　ＮａＣｌ Ｏ４，１５％エタノール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，０で溶出し、それ によりシリカゲル層に直接結合させる。

該抽出カラムを、０．８ｍｌの７０％エタノール、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ ｍＭ酢酸ナトリウム。

ｐＨ７，０、及び０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する。場合により、 痕跡量のエタノールをさらに遠心分離して除去する。続いて、５０μｌのｌ０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０を用いてＤＮＡを遠心分離により溶出し、別 の１．５ｍｌ試験管に回収する。溶出されたＤＮＡはその後、例えば制限処理、 ラヘル化、配列決定、又は増幅のような酵素反応に直接使用することかできる。

実施例２ ブラスミ１−ＤＮＡの同時調製 ８　ＤＥＡＥンリ力ゲル膜／シリカゲル抽出カラムを減圧チャンバー上に装着す る。

プラスミドＤＮＡを含む各々１ｍ１Ｘ８の細胞溶解物を、減圧（２０〜７５０　 ｍｂ）吸引により該抽出カラムを通過させる。該抽出カラムを０．８ｍｌのｌ　 Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，０、及び １５％エタノール、１０＋ｎＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７０、及び０．８ｍｌのＩ 　Ｍ　ＮａＣｌＯ４で洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮＡを７　Ｍ　Ｎ ａＣｌＯ４，１５％エタノール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，０で該陰イ オン交換体層から溶出し、それによりシリカゲル層に直接結合させる。該抽出カ ラムを、０．８ｍｌの７０％エタノール、＋００　ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ酢 酸ナトリウム、ｐｔｉ７．ｏ及び０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する 。高濃度の塩溶液を除去するために、該サンプル管を、０．８ｍ！の７０％エタ ノール、１００ｍ１Ｊ　ＮａＣ１，１０ｍＭ酢酸ナトリウム、　ｐＨ７，０、及 び０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する。該抽出層中に残存するエタノ ール／Ｈ２０を、減圧吸引して空気を１−２分間通すことにより蒸発させる。続 いて、該８試料を５０μｍの１ｍ！ｉｔ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　０．１　ｍＭ　 ＥＤＴＡ、　ｐｌ　ｓ、ｏで溶出する。

実施例３ Ｍ１３一本鎖ＤＮＡの調製 １ｍｌのＭ１３ファージ懸濁液に０．５ｍｌの３０％ＰＥＧ　６０００．１．５ 　Ｍ　ＮａＣｌを加え、氷上で１０分間インキュへ−１−シ、これを１５．００ ０ｇで１５分間遠心分離する。

ファージペレットを０．５ｍｌの０．５ＭグアニジノーＨＣＩ、　１％トライト ンＸ−１００に再懸濁し、７０°Ｃて１０分間溶解させる。実施例３に従って、 減圧チャンバー上の抽出カラム中に該ファージ溶解物を吸引して通過させ、吸着 させる。該抽出カラムを１ｍｌの０．７５　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、 ５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，０、及び１ｍｌの０．７５　Ｍ　ＮａＣ１０ ，、５０ｍｌＪ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０で洗浄する。ＤＮＡを該陰イ オン交換体層から７Ｍグアニジン、１５％エタノール、５０ｍＭ酢酸ナトリウム 、ｐＨ７，０で溶出し、３１０２層に吸着させる。

実施例４ 血液からのゲノムＤＮＡの調製 １ｍｌのクエン酸安定化ヒト全血に、赤血球を溶解させるためにサポニン１ｍｌ を加え、混合後直ちに２．５００ｇで５分間遠心分離する。白血球をＰＢＳバッ ファー１ｍｌに再懸濁し、再ペレット化する。洗浄した該白血球を１ｍｌの５０ ０ｍＭグアニジン−）ＩＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０　ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、　ｐＨ８，０に再懸濁し、Ｏ，１ｍｌのプロテイナーゼＫ　（１０ｍｇ ／ｍｌ）を加えて、５０°Ｃに２時間置き、細胞を溶解させる。該白血球溶解物 を直ちにピペツＩ・で、アガロース／陰イオン交換体／シリカゲル／抽出カラム に載せ、１ｍｌの０．２５　Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍｌＪ酢酸ナトリウム、ｐ）１ ７．０及び１ｍｌの０．２５　Ｍ　ＮａＣｌ０ａ、　１０　ｍＭ酢酸ナトリウム 、ｐＨ７，０で洗浄する。１ｍｌのクエン酸安定化ヒト全血を、陰イオン交換体 ／シリカゲルカラム中を減圧吸引して通過させる。それにより、白血球はマトリ ックス中に取り込まれ、一方案質的により小さな赤血球はマトリックス中を移動 する。該抽出カラムを１ｍｌのＰＢＳバッファーを用いて２回再洗浄する。取り 込まれた白血球を１０％トウイーン１０を用いて室温で１５分間溶解する。細胞 断片及び蛋白を１ｍｌの１Ｍグアニジン−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０を用いて洗い出 し、ＤＮＡを７！Ｊ　ＮａＣｌ０ａ、　５０　ｍｌＪ酢酸ナトリウム、ｐＨ７， ０で該カラムから溶出する。

実施例５ 微量滴定フォーマットにおけるＤＮＡの調製、脱塩及び濃縮ＸＬ　Ｉ　Ｂｌｕｅ 大腸菌細胞中のプラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲ［ＰＴの９６　ＸＩ　ｍｌの培養物 を、１．５ｍｌウェルを持つ微量滴定プレート（ベックマン社、ミュンヘン）中 の２ＸＹＴ培地中で、１８時間、３７°Ｃて培養する。細胞を、微量滴定遠心分 離機で２．５００ｇで１０分間遠心分離してペレット化する。８チャンネルピペ ット（マトリックス・テクノロジー社、ローウェル、ＭＡ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、 　）を用いて、０．２５ｍ１の５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０　ｍＭ　 ＥＤＴＡ、　１００　μｇ／ｍｌ　ＲＮＡｇｌＡを微量滴定プレートウェル中に 注入し、細胞を振動シェイカーで５分間再懸濁させる。

０．２５ｍ１の０．２　Ｍ　ＮａＯＨ，１％ＳＤＳを各々に加え、緩く振動させ ながら室温に５分間置き、細胞を溶解させる。続いて、０．２５ｍ１の３Ｍ酢酸 カリウム、２Ｍ酢酸。

ｐＨ５，５−６，０中和用バツフアーを各々に加え、各ウェルに蓋をして密封し 混合する。氷上で１０分間インキュベートした後、試料を３．０００ｇで３０分 間遠心分離して、細胞断片及びＳＯ３沈殿をペレット化する。８チヤンネルピペ ツトを用いて上清を注意深く取り、ＤＥＡＥシリカゲル膜及びシリカゲル膜を存 する９６穴微量滴定プレート中に入れる。９６試料全てを移した後、該濾過装置 に減圧を加えることにより試料を微量滴定プレート中に通過さぜる。それにより 、ＤＮＡは該陰イオン交換体層に吸着されるが、一方蛋白、ＲＮＡ及び代謝物質 はこの条件下では吸着されない。

該抽出カラムを、０．８　ｍｌ（Ｄ、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、 ５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐｔ＋　７．０゜及ヒ１５％エタ）−ル、１０ｍＭ酢 酸ナトＩＪ　ラム、　ｐＨ７，０，及Ｄ　Ｏ，８ｍ１（７）　ＬＭ　ＮａＣｌ０ ａて洗浄しテＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮＡを７　Ｍ　ＮａＣｌＯ４，１５ ％エタノール、１０ｍ１Ｊ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，０で溶出し、それによりシ リカゲル層に直接結合させる。

該抽出カラムを、０．８ｍｌの７０％エタノール、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ ｍＲＪ酢酸ナトリウム。

ｐＨ７，０、及び０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する。続いて、塩を 含まなり４μｇすｔ”ｔｆ、＝形態（７）　ＤＮＡヲ、５０μｌ　（７）　１ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０■p いて該シリカゲル層から別の微量滴定プレート中に溶出する。

遠心分離の補助が必要な細胞溶解物の調製は時間と費用のかさむ処理である。

主として、日常的に多くの試料を調製しなければならない場合に制約が生まれる 。

遠心分離には自動化できないという欠点がある。

本発明の他の対象物（及び方法）は、該方法を遠心分離を行わずに自動的に稼働 させるための、核酸か実際に精製されるところよりも上流にある濾過ユニットの 形態を取る装置及び方法である。

ここでは、試料をブロティナーゼ、洗剤及び／又は温度又はアルカリを用いて周 知の方法により溶解する。この粗溶解物を、濾過ヘッド上に直接注ぐが、移すか 、又はピペットで載せる。該濾過ヘッドのフィルター層は、細胞破片、沈殿蛋白 又は洗剤によるフィルターの目詰まりを避けるように設計されている。該細胞溶 解物は、ピストン或いは高圧によりフィルター層を加圧通過されるが、又は減圧 により吸引されて通過する。それにより、不溶性成分は全て残り、澄んだ溶解物 が直接吸着層に滴下する。適当な吸着条件を選択することにより、核酸が該吸着 層に吸着される。フィルターケーキを含む濾過ユニットは吸着ユニットから取り 外して廃棄するか、又はフィルターケーキを分析するために取っておく。該吸着 ユニットは適当な溶媒又はバッファーで再洗浄して望ましくない成分を除去し、 最後に請求める試料が適当な溶出剤を使用して溶出される。

本発明の方法により、例えばプラスミドＤＮＡを、浄化目的の遠心分離を冷蔵遠 心分離機で行うことなく調製することがてきる。ＸＬＩ　Ｂｌｕｅ大腸菌細胞中 のプラスミドｐＢＬＵＥｓｃＲ［ＰＴの培養物９６　Ｘ　Ｉ　ｍｌを、１．５ｍ ｌウェルを持つ微量滴定プレート（ベックマン社、ミュンｌ＼ン）中の２ＸＹＴ 培地中で、１８時間、３７℃で培養する。細胞を、微量滴定遠心分離機で２．５ ００ｇで１０分間遠心分離してペレット化する。

８チヤンネルピペツト（マトリックス・テクノロジー社、ローウェル、ＭＡ、　 Ｕ。

Ｓ、　Ａ、　）を用いて、０．２５ｍ１の５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１ ０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１００μｇ／ｍｌ　ＲＮＡｇｌＡを微量滴定プレートウ ェル中に注入し、振動シェイカーで５分間再懸濁させる。

再懸濁した細胞を濾過ヘットのサンプルリザーバーに移し、それに０．２５ｍ１ 　の０．２　ｍ　ＮａＯＨ／　Ｉ％ＳＤＳを加える。該試料を振動シェイカー上 で５分間振盪するか、又は栓或いは接着フィルムでシールして混合するか、又は 上下ピペッティングを繰り返して混合する。

室温で５分間インキュベートして溶解させた後、ＮａＯＨを中和しＳＤＳを沈殿 させるために、上記の方法のうちのひとつに従って、０．２５ｍ１の３Ｍ酢酸カ リウム及び２Ｍ酢酸を加えて混合する。次に、減圧チャンバー上で遠心分離する 代わりに、この粗細胞溶解物を１０−８００　ｍｂの減圧条件で吸引して濾過層 を通過させる。厚さか２−１０　ｍｍで、２００から５μｍの範囲のアシンメト リツク又はステップワイズな多孔性を持つフィルター層か、目詰まりすることな く細胞断片及び他の不溶性又は沈殿性成分を保持する。プラスミドＤＮＡを含有 する澄んだ細胞溶解物か該フィルター層を通して吸着層（陰イオン交換体又はシ リカゲル）上に滴下し、ＤＮＡが吸着されるが、一方蛋白、ＲＮＡ及び他の細胞 代謝物は所定の塩条件下では結合しない。濾過は約１０−６０秒後に完了する。

該フィルターヘットを取り外し、フィルターケーキと共に廃棄する。

結合したＤＮＡは１ｍｌのｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、５０　ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ｔ（Ｃ１，ｐｔ（７，０で１回、さらに１．５　Ｍ　ＮａＣｌＯ４， １０ｍＭ　酢酸ナトリウム、ｐＨ６，５で２回洗浄し、該陰イオン交換体から７ 　Ｍ　ＮａＣｌＯ４，１５％エタノール、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐ Ｈ７，０で溶出し、分離層を通過した後、高塩濃度下で直ちにナイロンネット又 はＰＰフリースからシリカゲル層に結合される。ここにおける１−２Ｍ　ＮａＣ ｌＯ４では、蛋白及びＲＮＡは該シルカゲル層には結合しないで洗い出される。

残留する痕跡量の蛋白を除去するために、該シリカゲル層を１ｍｌの７Ｍグアニ ジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐｉ（７，ｏて洗浄する。７　Ｍ　Ｎ ａＣｌ０．の高塩溶液は、１ｍｌの７０％ＥｔＯＨ。

１００　ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍｌＪ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，０及び１ｍｌの ９０％エタノール／水又は１ｍｌの９０％アセトン／水で洗浄すると都合がよい 。乾燥させた後に、プラスミドＤＮＡが、５０μｍのＩｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、　０．１　ｍｌＪ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，５により、無塩、且つ濃縮された形 態で溶出される。

この方式により、遠心分離、フェノール／クロロホルム抽出及びアルコール沈殿 を行うことなく、濃縮された形態のプラスミドＤＮＡを非常にわずかな時間で単 離することができ、収率は５０−８０％の範囲である。上記のような微量滴定プ レート型を用いると、Ｉ−２ｍｌの大腸菌培養物によるプラスミド少量調製品（ ｍｉ　ｎ　ｉ　ｐｒｅｐ）９６個が一人の操作で６０分以内に調製することがで き、１〜１０μｇのＤＮＡが得られる。これまでの周知の方法では、６〜１２時 間が必要である。

実施例６ 図７の装置を用いたプラスミド少量調製ＬＢ培地中のｐｕｃ　＋８プラスミドＤ ＮＡを存するＸＬ　Ｂｌｕｅ大腸菌培養物１．５ｍｌを１０．０００　ｇで５分 間遠心分離して、細胞をペレット化化する。該細胞ペレットを０．２５ｍ１の５ ０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０　ｍ！ｉｆ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０，１ ００μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａに再懸濁する。細胞を溶解するために、０．２ ５ｍ１の０．２　Ｍ　ＮａＯＨ及び１％ＳＯ３を該細胞懸濁液に加え、注意深く 攪拌し、５分間室温に静置する。次いで、０．２５ｍ１の３Ｍ酢酸カリウム及び ２Ｍ酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で１５分間インキュベートする。該溶 解物を図７の濾過装置に移す。該装置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶 解物を２０−８００　ｍｂで吸引して装置中を通過させる。或いは、該試料をピ ストン又は高圧を用いて濾過層中を加圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置を 取り外し、フィルターケーキを細胞断片、変性蛋白及び沈殿ＳＤＳと共に破棄す る。

該抽出カラムを、０．８ｍｌのｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、　５０　 ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，０で２回洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮ Ａを１ｍｌの１．２５　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、　５０　ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，５で溶出する。脱塩及び濃縮するために、溶出された ＤＮＡをアルコールで沈殿さ氷核アルコール沈殿物を遠心分離によりペレツト化 させる。

実施例７ 図８の装置を用いたプラスミドＤＮＡの調製ＬＢ培地中のｐｕｃ　１８プラスミ ド開八を有するＸＬ　Ｂｌｕｅ大腸菌培養物１．５ｍｌを１０．０００　ｇで５ 分間遠心分離して、細胞をペレット化する。該細胞ペレツトを０．２５ｍ１の５ ０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０，１００ μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａに再懸濁し、濾過装置に移す。細胞を溶解するため に、０．２５ｍ１の０．２　Ｍ　ＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを図８の濾過装置中の 該細胞懸濁液に加え、該装置を栓又は接着フィルム（こよりシールし、注意深く 攪拌して、５分間室温に静置する。次いで、０．２５ｍ１の３Ｍ酢酸力ＩＪ’＋ ム及び２Ｍ酢酸を用いて中和し、混合して、氷上で１５分間インキュベートする 。該装置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を２０２０−８Ｏ０で吸 引して装置中を通過させる。或いは、該試料をピストン又は高圧を用いて濾過層 中を加圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置を取り外し、ブイｌレターケーキ を細胞断片、変性蛋白及び沈殿ＳＤＳと共に破棄する。該抽出カラムを、０゜８ ｍｌのｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７ ，ｏて２回洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮＡを１．ｍｌの１．２５　 Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ８，５て溶出する。脱塩及び濃縮するために、溶出されたＤＮＡをアルコー ル沈殿させ、該アルコール沈殿物を遠心分離によりペレット化させる。

実施例８ 図１Ｏの装置を用いたシリカゲル層におけるプラスミドＤＮＡの調製ＬＢ培地中 のｐｕｃ　！８プラスミドＤＮＡを有するＸＬ　ＢＩＵｅ大腸菌培養物１．５ｍ ｌを１０．０００　ｇて５分間遠心分離して、細胞をペレツト化する。該細胞ベ レ・ノドを０、２５ｍｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．　１０　ｍＭ　ＥＤ ＴＡ．　ｐＨ　８．０．　１００μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａに再懸濁し、濾過 装置に移す。細胞を溶解するために、０．２５ｍｌの０．　２　Ｍ　ＮａＯＨ及 び１％ＳＤＳを濾過装置中の該細胞懸濁液に加え、該装置を栓又は接着フィルム によりシールし、注意深く攪拌して、５分間室温に静置する。次いで、０．５ｍ ｌの５．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ．　０．２５　Ｍ　酢酸カリウム、ｐＨ５．５ を用いて中和し、混合して、氷上で１５分間インキュベートする。図１Ｏの装置 全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を２０−８００　ｍｂで吸引して 装置中を通過させる。或いは、該試料をピストン又は高圧を用いて濾過層中を加 圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置を取り外し、フィルターケーキを細胞断 片、変性蛋白及び沈殿ＳＯＳと共に破棄する。該抽出カラムを、１ｍｌの７　Ｍ 　ＮａＣＩＯａ．　１０　ｎＪＪ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０で２回洗浄し、さ らに０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄し、痕跡量のエタノールを吸引除 去する。最後に、ＤＮＡを５０７ｚｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，　１　 ｍＭ　ＥＤＴＡ．　ｐＨ　８．０で溶出し、別の１．５ｍｌ試験管に回収する。

溶出されたＤＮＡは、例えば制限処理、ラベル化、配列決定、又は増幅のような 酵素反応に直接使用することができる。

実施例９ 微量滴定ストリップによる８×プラスミドＤＮＡの調製ＬＢ培地中のｐｕｃ　＋ ８ブラスミＩ”　ＤＮＡを有するＸＬ　Ｂｌｕｅ大腸菌培養物８刈．５ｍｌを１ ０．０００　ｇで５分間遠心分離して、細胞をペレット化する。該細胞ベレツト を０．２５ｍｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　 ｐＨ　８．０．　１００μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａに再懸濁し、図１４の装置 に移す。細胞を溶解するために、０．２５ｍｌの０．　２　Ｍ　ＮａＯＨ及び１ ％　ＳＤＳを濾過装置中の該細胞懸濁液に加え、該装置を栓又は接着フィルムに よりシールし、注意深く攪拌して、５分間室温に静置する。次いて、０．２５ｍ ｌの３Ｍ酢酸カリウム及び２Ｍ酢酸を加えて中和し、混合して、氷上で１５分間 インキュベートする。該装置全体を減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を２ ０−８００ｍｂで吸引して装置中を通過させる。或いは、該試料を高圧により濾 過層中を加圧通過させてもよい。濾過後、濾過装置を取り外し、フィルターケー キを細胞断片、変性蛋白及び沈殿ＳＤＳと共に破棄する。該抽出カラムを、０． ８ｍｌのＩＭ　ＮａＣＩ。

１５％エタノール、　５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ．　ｐＨ　７．０、及び０．８ｍｌ のＩＭ　ＮａＣｌＯａ．　１５％エタノール、ＩＯｎ＋Ｍｉｔ酸ナトリウム、ｐ Ｈ７．０で洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮＡを７　Ｍ　ＮａＣ１０４ ．　１５％エタノール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を用いて陰イオン 交換体層１０から溶出し、それにより直接シリカゲル層１１に結合させる。該抽 出カラムを、０．８ｍｌの７０％エタノール、　１００　ｍＭ　ＮａＣｌ，　ｔ ｏ　ｍＭ酢酸ナトリウム、　ｐＨ７、０及び０．８ｍｌの９０％エタノール／水 で洗浄する。抽出カラム中に残存するエタノール／Ｈ２０は減圧吸引して空気を １−２分間通すことにより蒸発させる。続いて、該８試料を５０μｍの１ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．　０．　１　ｍｌｉｆ　ＥＤＴＡ．　ｐＨ　８．０で溶出す る。

実施例１０ 図１３の装置を用いた８％１ｍｌのＭ１３　ＤＮＡの調製８刈ｍｌのＭ１３ファ ージ懸濁液に、０．５ｍｌの３０％ＰＥＧ　６０００．　１．５　Ｍ　ＮａＣ１ を加え、これを氷上で１０分間インキュベートする。該試料を図１３の装置に移 し、ファージ溶解物を減圧チャンバー上の図１３の装置に直接吸引して通過させ て濾過する。該ファージペレットを７Ｍグアニジン−ＨＣＩ，　ｐＨ　７．０中 を吸引により通過させて溶解し、同時にＤＮＡをシリカゲル層１１に吸着させる 。該抽出カラムを、０、８ｍｌの７０％エタノール、　１００　ｍｌ１！ＮａＣ １．　１０　ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐｉ（７．０及び０．８ｍｌの７０％エタノ ール川００　ｍＭ　ＮａＣ１．　１００　ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０及び ０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄し、吸引により空気を１−２分間通す 。最後に、ＤＮＡを５０μｍのｔｏ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．　ｌ　ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ．　ｐＨ　８．０で溶出し、別の１．５ｍｌ試験管に回収する。

溶出されたＤＮＡはその後、例えば制限処理、ラベル化、配列決定、又は増幅の ような酵素反応に直接使用することができる。

尤棟興旦 図１４の装置を用いた８×１２プラスミドＤＮＡの調製ＬＢ培地中のｐｕｃ　１ ８プラスミドＤＮＡを有するＸＬ　Ｂｌｕｅ大腸菌培養物９６Ｘ１．５ｍｌを２ ．５００ｇで５分間遠心分離して、細胞をペレット化する。該細胞ペレ・ノドを ０、２５ｍｌの５０　ｍｌｉｔ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ．　ＩＱ　ｍＭ　ＥＤＴＡ． 　ｐｉ（　８．０．　ｌｏｏμｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａに■恆■ し、該装置に移して、栓又は接着フィルムによりシールし、注意深く攪拌して、 ５分間室温に静置する。次いで、０．２５ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム及び２Ｍ酢酸 を用いて中和し、混合して、氷上で１５分間インキュベートする。該装置全体を 減圧チャンバー上に装着し、細胞溶解物を２０−８００　ｍｂで吸引して装置中 を通過させる。

或いは、該試料を高圧により濾過層中を加圧通過させてもよい。濾過後、濾過装 置を取り外し、フィルターケーキを細胞断片、変性蛋白及び沈殿ＳＤＳと共に破 棄する。該抽出カラムを、０．８ｍｌのＩＭ　ＮａＣ１．　１５％エタノール、 　５０ｍＭ　ＭＯＰＳ，　ｐＨ７．０、及び０．８ｍｌのＬＭ　ＮａＣｌＯ２． 　１５％エタノール、　１０−酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０で洗浄してＲＮＡ及 び蛋白を除去する。ＤＮＡを７　Ｍ　ＮａＣｌＯａ，　１５％エタノール、１０ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐ）１７．０を用いて陰イオン交換体層１０から溶出し、 それにより直接シリカゲル層１１に結合させる。該抽出カラムを、０．８ｍｌの ７０％エタノール。

１００　ｍｌｉｌ　ＮａＣ１．　１０　ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐ）１７．０及び ０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する。

抽出層中に残存するエタノール／Ｈ２０は減圧吸引して空気を１−２分間通すこ とにより蒸発させる。続いて、該９６試料を各々５０μｌの１ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ．　０．　１　ｍｌｉｌＥＤＴＡ．　ｐＨ　８．０で溶出し、別の１．５ ｍｌ試験管に回収する。溶出されたＤＮＡは例えば制限処理、ラベル化、配列決 定、又は増幅のような酵素反応に直接使用することができる。

実施例１２ 状態調節を行わないプラスミドＤＮＡの調製ｐｕｃ　１８−形質転換ＨＢ　１０ １大腸菌細胞を含むＬＢチアンシリン培地による培養物３ｍｌを５．０００ｇで １０分間遠心分離する。該細胞ペレットを０．２５ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ．　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ．　ｐＨ　８．０．及び１００μｇ／ｍｌ　Ｒ Ｎａｓｅ　Ａに再懸濁する。細胞を溶解するために、０．２５ｍｌの０．　２　 Ｍ　ＮａＯＨ及び１％ＳＤＳを細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間室温 に置く。これを、０．２５ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム及び２Ｍ酢酸を用いて中和し 、混合して、氷上で１５分間インキュベートする。該溶解物を１０．０００　ｇ で１５分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。澄んだ該細胞溶解物をピペッ トてＤＥＡＥ陰イオン交換体／抽出カラム上に載せ、該試料を吸引してイオン交 換体層を通過させる。該抽出カラムを、０．８ｍｌのｌ　Ｍ　ＮａＣ１．　１５ ％エタノール、５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ．　ｐＨ　７．０及び１５％エタノール、 １０ｍＭ酢酸ナトリウム。

ｐＨ７，０で洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去する。ＤＮＡを７　Ｍ　ＮａＣ１， Ｏａ、　１５％エタノール。

１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７，０を用いて、ガラス繊維膜を存する抽出カラ ム上に吸引して載せる。７　Ｍ　ＮａＣｌ０．中の溶出ＤＮＡ溶液を吸引してガ ラス繊維膜を通過させ、それにより直接シリカゲル層に吸着させる。該抽出カラ ムを、０．８ｍｌの７０％エタノール、１００ｍ１Ｊ　ＮａＣ１，１０ｍＭ酢酸 ナトリウム、ｐＨ７，０、及び０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する。

場合により、吸引して空気を通すことにより痕跡量のエタノールを除去する。最 後に、ＩＯμｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ ｓ、。

を用いてＤＮＡを溶出し、別の１．５ｍｌ試験管に回収する。

実施例１３ 状態調節を行うプラスミドＤＮＡの調製ｐｕｃ　１８−形質転換ＨＢ　１０１大 腸菌細胞を含むＬＢアンピシリン培地による培養物３ｍｌを５．０００ｇで１０ 分間遠心分離する。該細胞ペレットを０．２５ｍ１の５０ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０，及び１００μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ 　Ａに再懸濁する。細胞を溶解するために、０．２５ｍ１の１．２　Ｍ　ＮａＯ Ｈ及び１％ＳＤＳを細胞懸濁液に加え、注意深く攪拌し、５分間室温に置く。こ れを、０．２５ｍ１の３Ｍ酢酸カリウム及び２Ｍ酢酸を用いて中和し、混合して 、氷上で１５分間インキュベートする。該溶解物を１０．０００ｇで１５分間遠 心分離し、上演を注意深く除去する。澄んだ該細胞溶解物をピペットでＤＥＡＥ 陰イオン交換体／抽出カラム上に載せ、該試料を吸引してイオン交換体層を通過 させる。該抽出カラムを、０．８ｍｌのＩ　Ｍ　ＮａＣ１，１５％エタノール、 　５０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐｌ　７．０で洗浄してＲＮＡ及び蛋白を除去し、 ０．８ｍｌの１Ｍ　ＮａＣｌＯ４，１５％エタノール、ｌ０ｍＭ酢酸ナトリウム 、ｐＨ５，０を用いて状態調節を行う。ＤＮＡを０．７ｍｌの７　ＭＮａＣｌｏ ａ、　１５％エタノール、ｌＯｍ！ｉｌ酢酸ナトリウム。

ｐＨ７，０を用いて、ガラス繊維膜を存する抽出カラム上に吸引して載せる。こ のガラス繊維膜は、より良好なりＮＡ吸着をもたらし最初の滴下中の損失を避け るために、０．２ｍｌの７　Ｍ　ＮａＣｌＯ４，１５％エタノール、１０ｍＭ酢 酸ナトリウム、ｐＨ７，０を用いて予め状態調節されている。次いで、７　Ｍ　 ＮａＣｌＯ４中の溶出ＤＮＡ溶液を減圧装置上で吸引してガラス繊維膜を通過さ せ、それにより直接シリカゲル層に吸着させる。該抽出カラムを、０．８ｍｌの ７０％エタノール、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７ ，０、及び０．８ｍｌの９０％エタノール／水で洗浄する。場合により、吸引し て空気を通すことにより痕跡量のエタノールを除去する。最後に、１００μ■の ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐｔ（８，０を用いて ＤＮＡを溶出し、別の１．５ｍｌ試験管に回収する。

前状態調節は、７　Ｍ　ＮａＣＩＣＬ、　１５％エタノール、１０ｍＭ酢酸ナト リウム、ｐｏ７．。

に浸い゛こ後乾燥させた膜を使用することによって行うこともできる。この前状 態調節により、吸着損失が３０％から５％以下に減少し、ＤＮＡの総数率が５０ −６０％がら８０−９０％に増加する。

ＦＩＧ、３ ＦＩｏ７　ＦＩＧ　Ｒ ＦＩｏ、９　ＦＩｏ　１０ １　１％ｊ、／　ｌ　＋−ノ、％Ｊ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＩＪＲＲＥＣ）ＩＥＲｃ）ＩＥＮＩＩＥＲＩｃＨＴ１ □。、ゎ　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２７７５、　＝、−＋＋　ＰＣＴ／ＥＰ　９ ２１０２７７５

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸、特にプラスミド又はゲノムＤＮＡを細胞又は他の材料から単離及び精 製する方法であって、 ａ）核酸を含む細胞を消化して細胞破片を除去するか、又は核酸を含む他の試料 を陰イオン交換体で、即ち、低イオン強度のバッファー溶液中で処理し、ｂ）そ の後、該核酸を高イオン強度のバッファーを用いて該陰イオン交換体から脱着し 、続いてそれにより Ｃ）該核酸を高イオン強度の当該バッファー中において、又は低級アルコール類 及び／又はポリ（エチレングリコール）の存在下で、無機質担体部材で処理して 、該無機質担体部材の表面に核酸を吸着させ、さらにｄ）水又は低イオン強度の バッファー溶液を用いて、該核酸の脱着を行う方法。
2. ２．処理ｂ）及びｃ）が連続して行われることを特徴とする、請求項１記載の方 法。
3. ３．不溶性成分を機械的に除去するために遠心分離又は濾過処理を処理ａ）より 前に行う、請求項１及び／又は２に記載の方法。
4. ４．処理ａ）及びｂ）の間に一回以上の洗浄処理を低イオン強度のバッファー溶 液を用いて、又は洗浄回数毎にイオン強度を上げたバッファーを用いて行う、請 求項１〜３の少なくとも一項に記載の方法。
5. ５．処理ｃ）及びｄ）の間に一回以上の洗浄処理を高イオン強度のバッファー溶 液を用いて行う、請求項１〜４の少なくとも一項に記載の方法。
6. ６．処理ｃ）及びｄ）の間に最低一回の洗浄処理をアルコール水溶液を用いて行 う、請求項１〜５の少なくとも一項に記載の方法。
7. ７．請求項１の処理ｃ）及びｄ）の間に、１．５モル過塩素酸ナトリウム溶液に 対応する幾分高いイオン強度及び相対的に低い５程度のｐＨ値を用いて洗浄処理 を行う、請求項１〜６の少なくとも一項に記載の方法。
8. ８．好ましくは高表面電荷を持つ陰イオン交換体を使用する、請求項１〜７の少 なくとも一項に記載の方法。
9. ９．該核酸がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＳＳＳＲ（自立配列複製）、及 びリガーゼ連鎖反応に由来する、請求項１〜８の少なくとも一項に記載の方法。
10. １０．該核酸が１０ヌクレオチド〜２００，０００ヌクレオチドを含む、請求項 １〜９の少なくとも一項に記載の方法。
11. １１．該核酸がバクテリア、細胞培養物、血液、組織、尿、ウィルス、又は他の 生物原料に由来する、請求項１〜１０の少なくとも一項に記載の方法。
12. １２．ラベルされた核酸、より詳しく言えば、ビオチンラベル化核酸；フルオレ セインイソチオシアネートラベル化のような蛍光ラベル化核酸；又は放射性ラベ ル化核酸を使用する、請求項１〜１１の少なくとも一項に記載の方法。
13. １３．該無機質担体として、シリカゲル、ガラス、ゼオライト類、酸化アルミニ ウム、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、カオリン、及び／又は珪藻土を使用 する、請求項１〜１２の少なくとも一項に記載の方法。
14. １４．１〜２５０μｍ、好ましくは１０〜３０μｍの粒子径を持つ多孔質又は非 多孔質のマトリックスを使用する、請求項１〜１３の少なくとも一項に記載の方 法。
15. １５．１〜２５０μｍ、好ましくは１〜５μｍの粒子径を持つシリカゲル態濁液 を使用する、請求項１〜１４の少なくとも一項に記載の方法。
16. １６．該陰イオン交換体の粒子径が１〜２５０μｍ、好ましくは１０〜１００μ ｍであり、孔の直径が１〜２，５００ｍｍ、好ましくは１００〜４００ｍｍであ る、請求項１〜１５の少なくとも一項に記載の方法。
17. １７．入口開口部（７）及び出口開口部（８）を有する中空体（１）を設え、該 中空体（１）中において固定具（５，６）の間にシリカゲルを基材とする第一の 粉末部材（１０）が配置されている核酸を単離及び精製する装置であって、第二 の部材（１１）が第一の部材（１０）及び出口開口部（８）の間に置かれ、第一 及び第二の部材（１０，１１）が核酸に対して異なる吸着特性を有することを特 徴とする装置。
18. １８．該固定具（５，６）が焼結ガラス或いはセラミックス（フリット類）の多 孔性枠又は、ポリエチレン、ポロプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、或 いはナイロンのようなプラスチック類の膜であることを特徴とする、請求項１７ 記載の装置。
19. １９．該部材（１０，１１）が互いに直接隣接しており、即ち、別々の層であっ て固定具（５，６）により一つに合わされていることを特徴とする、請求項１７ 及び／又は１８に記載の装置。
20. ２０．該部材（１０，１１）が分離具（１３）によって分離されていること特徴 とする、請求項１７〜１９の少なくとも一項に記載の装置。
21. ２１．該分離具（１３）が焼結ガラス（フリット類）の多孔性枠又は、好ましく はナイロン製の、プラスチック膜であることを特徴とする、請求項２０記載の装 置。
22. ２２．該第二の部材（１１）が、チャンネルを形成し中空体（１）よりも小さな 横断面を持つ導出管（１８）中の固定具（５，１５）の間に固定されていること を特徴とする、請求項１７〜２１の少なくとも一項に記載の装置。
23. ２３．該第二の部材（１１）が共通の手段（１７）だけによって第一の部材（１ ０）から分離されていることを特徴とする、請求項２２記載の装置。
24. ２４．該第一の部材（１０）がシリカゲルを基材とする陰イオン交換体から成り 、他方第二の部材（１１）がシリカガラスから成ることを特徴とする、請求項１ ７〜２３の少なくとも一項に記載の装置。
25. ２５．該部材類（１０，１１）が粉末形態及び／又は成形体であることを特徴と する、請求項１７〜２４の少なくとも一項に記載の装置。
26. ２６．該部材類（１０，１１）の粒子が不活性プラスチックのサポートネット中 に埋封されている、請求項１７〜２４の少なくとも一項に記載の装置。
27. ２７．該サポートネットがテフロンから成ることを特徴とする、請求項２６記載 の装置。
28. ２８．該中空体（１）の中の、入口開口部（７）及び第一の部材（１０）の間に 機械的フィルター装置として機能する別の層（１２）が配置されていることを特 徴とする、請求項２４〜２７の少なくとも一項に記載の装置。
29. ２９．該第三の層（１２）が、流れの方向にフィルターポア径が小さくなるアシ ンメトリックフィルターであることを特徴とする、請求項２８記載の装置。
30. ３０．該アシンメトリックフィルターがポア径が小さくなる焼結ガラス又はポア 径が小さくなるプラスチック膜の積層から成る、請求項２８及び／又は２９のう ちの一つに記載の装置。
31. ３１．核酸を含む試料から、フェノール、フェノール／クロロホルム又はクロロ ホルム抽出を行わずに蛋白を除去するための、請求項１〜１５の少なくとも一項 に記載の方法における、請求項１７〜３０の少なくとも一項に記載の装置の使用 。
32. ３２．請求項１〜１６の少なくとも一項に記載の方法を実施するための洗浄バッ ファー及び吸着バッファーの使用であって、該溶液が１〜７Ｍの過塩素酸ナトリ ウム、１〜７Ｍのグアニジン−ＨＣ１、１〜５Ｍの塩化ナトリウム、１〜６Ｍの ヨウ化ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム／２０％エタノール、又はメタノール、 エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールのような低級アルコ ール類及び／又はポリ（エチレングリコール）を含むことを特徴とする使用。
33. ３３．請求項１〜１６の少なくとも一項に記載の方法において吸着された核酸を 溶出するためのバッファー系の使用であって、該バッファーが水及びｐＨ値が５ 〜９のトリス（Ｔｒｉｓ）を含む使用。
34. ３４．請求項１〜１６の少なくとも一項に記載の方法において回収された核酸の 、制限処理、配列決定、増幅、又はラベル化のような酵素反応のうちの一つにお ける使用。
35. ３５．細胞又は他の原料からの核酸を単離及び精製する方法であって、ａ）細胞 破片及び他の位子を流れの方向にポア径が小さくなるフィルター層によって除去 し、 ｂ）該溶出液をその後、低イオン強度のバッファー溶液中で陰イオン交換体によ り処理する方法。
36. ３６．請求項３５記載の方法を実施するための装置であって、少なくとも一個の フィルター層（１２，２０，２１，又は２２）が実質的に円筒形の中空体（１） の内部に、二個の手段（５，６）の間に固定された陰イオン交換特性を持つ層（ １０）よりも入口開口部（７）の方向から見て上流に配置されている装置。
37. ３７．細胞又は他の原料からの核酸を単離及び精製する方法であって、ａ）細胞 破片及び他の粒子を試料が流れる方向に見てフィルターポア径が小さくなるフィ ルター層によって除去し、 ｂ）その後、該溶出液を高イオン強度のバッファー溶液中で無機質担体により処 理する方法。
38. ３８．請求項３７記載の方法を実施するための装置であって、少なくとも一個の フィルター層（１２，２０，２１，又は２２）が実質的に円筒形の中空体（１） の内部に、二個の手段（５，６）の間に固定された、高イオン強度の各溶液にお いて核酸を結合することができる層（１１）よりも入口開口部（７）の方向から 見て上流に配置されている装置。