ES2837096T3 - Dispositivo para aislar fracciones celulares de tejidos humanos y animales y procedimiento para su uso - Google Patents

Abstract

Un dispositivo para separar una fracción estromal vascular de tejidos humanos o animales, que contiene un recipiente hermético a los fluidos para el tratamiento de tejidos y un sistema de canales dentro de las paredes laterales del recipiente, en el que la entrada de cada canal tiene huecos y ranuras sectoriales para la conexión de bayoneta a los accesorios adaptadores, siendo dicho recipiente para el tratamiento de tejidos de forma cónica y está dividido en dos cámaras por un sistema de microfiltros, conteniendo el sistema de microfiltros al menos dos microfiltros de nailon, con diámetros de poro desde 10 μm para el filtro inferior hasta 500 μm para el filtro superior, y los filtros están separados por almohadillas poliméricas, sujetándose las cámaras herméticamente con una conexión de bayoneta a través de un sello de silicona, en el que una cámara, a saber, una cámara de tratamiento de tejidos, se utiliza para el tratamiento de tejidos y la otra cámara, a saber, una cámara de concentración de células, se utiliza para concentrar células, en el que la superficie interior del recipiente tiene un revestimiento antiadhesivo hidrófobo; un canal del sistema de canales se abre hacia la cámara de tratamiento de tejidos, otro canal del sistema de canales se abre hacia la cámara de concentración de células y el recipiente también contiene un filtro bacteriológico configurado para igualar la presión dentro del dispositivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo para aislar fracciones celulares de tejidos humanos y animales y procedimiento para su uso CAMPO TÉCNICO

El presente grupo de invenciones se refiere a la biotecnología médica y la tecnología celular y está destinado a aislar fracciones celulares de tejidos humanos y animales, concretamente aislar la fracción vascular estromal del tejido adiposo.

TÉCNICA ANTERIOR

El tejido adiposo subcutáneo es una fuente de células madre y progenitoras para la medicina regenerativa como alternativa a la médula ósea. La principal ventaja del tejido adiposo es la pequeña invasividad de los procedimientos de recuperación, el dolor mínimo, así como la incomodidad y el riesgo mínimos en los pacientes. El tejido adiposo proporciona más células madre en comparación con la médula ósea. Trasplante intramedular contiene 0,006-0,06x106 células madre por 100 ml; y las células madre y progenitoras viables cuentan en adiposo fracción tejido es de aproximadamente 0,5x106 a 20x106 células por 100 ml de tejido.

La fracción heterogénea de tejido adiposo, separada del estroma y los adipocitos con colagenasa, se denomina fracción vascular estromal. La fracción vascular del estroma se caracteriza por una significativa heterogeneidad y variabilidad de la composición celular dependiendo del estado del donante, así como de la edad y el lugar de recolección del material biológico. Después de la clasificación, las siguientes poblaciones de células se pueden aislar de la fracción vascular estromal: células endoteliales y de músculo liso, pericitos, fibroblastos, células grasas y preadipocitos. Las células de la fracción regenerativa, a saber, el complejo de células madre y progenitoras del tejido adiposo (células madre derivadas de tejido adiposo, ADSC), son de interés. Las ADSC tienen un potencial significativo para diferenciarse en adipocitos, condrocitos y osteoblastos, miocitos, células neuronales, cardiomiocitos y hepatocitos.

El uso clínico de la fracción vascular estromal incluye regeneración ósea y de tejidos blandos, defectos cosméticos, úlceras tróficas crónicas y por radiación, quemaduras, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, reacción de injerto contra huésped, infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares de diversa génesis. Las principales ventajas de usar este tipo de células son el fácil acceso a la fuente celular, un gran número y alto rendimiento por unidad de volumen de tejido, alta multipotencia, eficacia y seguridad comparables con respecto a las células mesenquimales de la médula ósea. Además, el procedimiento de lipoaspiración se usa ampliamente; es estandarizado, simple de ejecutar en una sala de tratamiento y solo toma alrededor de 90 minutos. Por tanto, las fracciones de células aisladas del tejido adiposo pueden ser beneficiosas para la práctica clínica al excluir también la etapa de cultivo. Se divulga un procedimiento para el aislamiento de células madre del tejido adiposo mediante el uso de un procedimiento manual (Zuk R. A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7(2): 211-28). El procedimiento se basa en el tratamiento del lipoaspirado con una solución de colagenasa tipo I al 0,075 % a 37 °C durante 30 minutos y la posterior centrifugación de la suspensión resultante a 800 g. Después de la centrifugación, la suspensión celular se divide en dos fracciones: adipocitos en la capa sobrenadante superior y en el sedimento una fracción vascular estromal con contaminación de glóbulos rojos, que se eliminaron durante la incubación en solución de lisis de cloruro de amonio. Las desventajas e inconvenientes del procedimiento son el tiempo adicional y los gastos de organización, la presencia de "factor humano", un alto riesgo de falla del proceso de esterilidad y la contaminación del material biológico/producto final.

Las tecnologías de aislamiento se están desarrollando hacia la automatización de procesos. Se han creado sistemas automáticos y semiautomáticos de aislamiento celular.

Del estado de la técnica se conoce un dispositivo (Sistema para procesar células lipoaspiradas EP 1921133 A2, CYTORI THERAPEUTICS, INC (US), CIP A61K31/436, publicado el 14 de mayo de 2008), que es un sistema cerrado para el tratamiento de lipoaspirado obtenido durante liposucción. El sistema está conectado directamente a la cánula de lipoaspiración. Incluye una bomba de vacío, un contenedor para la recogida del lipoaspirado, un mezclador para mezclar el biomaterial procesado con aditivos y activadores, y un sistema de dos filtros con poros de diferente diámetro. El primer filtro separa el lipoaspirado en 2 fracciones, donde una fracción contiene una población celular que incluye células madre del tejido adiposo y la otra fracción contiene lípidos, sangre, adipocitos y solución salina. De ese modo, el primer filtro gira y divide constructivamente el contenedor en dos cámaras para las fracciones respectivas, y el segundo filtro concentra la fracción celular antes de alimentarla en el mezclador. La línea principal permite recuperar la fracción final sin romper la estanqueidad del sistema y dirigirla a la centrífuga, luego recuperar asépticamente la fracción resultante. El dispositivo permite la introducción de activadores y aditivos. El sistema también tiene un controlador de temperatura incorporado. Las principales desventajas e inconvenientes de dicho dispositivo son las siguientes: durante la primera etapa de tratamiento, el lipoaspirado se filtra sin proporcionar destrucción del estroma tisular que fija las células de la fracción vascular estromal, y no permite que pasen por el filtro, por lo que reduciendo la concentración celular en el permeado. Las desventajas e inconvenientes del sistema incluyen también líneas alargadas y un número significativo de uniones que son el medio para la adhesión y pérdida de células diana.

Del estado de la técnica se conoce un dispositivo (Method and Apparatus for Separating a Material, US 20110251041 A1, BIOMET BIOLOGICS, LLC (US), IPC B04B1/08, publicado el 13 de octubre de 2011), que es un sistema para material multicomponente separación, al menos en parte, en dos fracciones. Dicho dispositivo es un contenedor, en forma de cilindro hueco dividido por una válvula en dos partes con volúmenes desiguales. La función de la válvula es distinguir fracciones de diferentes densidades. En la base de la estructura con paredes inclinadas, el sistema contiene un sumidero separado del volumen de la cámara principal por una válvula. La válvula tiene una superficie cónica; incluye un revestimiento también con superficie cónica entre la pared lateral y el eje longitudinal del cilindro; la superficie cónica se gira con la esquina hacia abajo. La válvula contiene un disco con orificios de forma circular y sectorial. La válvula tiene una membrana flexible que la activa al aumentar la presión hidráulica durante la centrifugación; cuando el disco gira, los orificios se yuxtaponen, lo que garantiza la permeabilidad de la válvula. El sistema también está equipado con un picador y una bomba de vacío conectados a la cámara de separación. En este caso, el tejido adiposo se divide en tres fracciones. La primera fracción está aislada entre la válvula y el fondo de la cámara y contiene material celular. La segunda fracción está aislada entre la válvula y la parte superior de la cámara y contiene grasa. La tercera fracción está aislada entre los componentes de la válvula y contiene fluido tumescente. El principal inconveniente y desventaja de dicho sistema es el peligro de que los elementos mecánicos del dispositivo se llenen de fragmentos de tejido, lo que conlleva el riesgo de fallo del dispositivo y contaminación de la fracción final con los componentes originales del biomaterial. Tratamiento sin asegurar la destrucción del estroma tisular, que fija las células de la fracción vascular estromal y no permite que pasen por el filtro, reduciendo así la concentración celular en el permeado.

Del estado de la técnica se conoce un dispositivo (Regenerative gel extraction device WO 2013183797 A1, HURIMBIOCELL CO., LTD (KR), IPC C12M1/10, publicado el 12 de diciembre de 2013), que es un contenedor con fondo en forma de cono y un eje longitudinal giratorio accionado por un motor externo. El producto compuesto por una serie de pétalos, que tienen un efecto directo sobre el lipoaspirado, se fija sobre el eje. El depósito tiene una boquilla para la inyección de biomaterial y el aislamiento de la fracción de tejido que contiene las células madre. La desventaja y el inconveniente de dicho sistema es un efecto mecánico significativo sobre las células que conduce a su destrucción y daño por las enzimas liberadas de otras células, contaminación del producto final con componentes del lipoaspirado original, un alto riesgo de contaminación microbiológica del biomaterial debido a la ausencia de barrera aséptica.

Del estado de la técnica se conoce un dispositivo (Device for separating adult stem cell US 20130344589 A1, HUMAN MED AG (DE), IPC C12M1/00, publicado el 26 de diciembre de 2013), que es un sistema que incluye un contenedor para tejido adiposo con un dispositivo de alimentación líquida para el lavado del biomaterial, mezclas de los reactivos necesarios, alternativamente con la extracción de la fracción de células madre, una válvula de equilibrio de presión, un pistón, un vibrador, una membrana semipermeable con carga electrostática y una válvula divisoria el contenedor en 2 partes, así como un controlador de temperatura. Una de las cámaras está equipada con un dispositivo para mezclar el biomaterial original con aditivos, realizando movimientos rotacionales y/o pendulares. La principal desventaja e inconveniente de dicho dispositivo es el procedimiento de presurización realizado por un pistón, que conduce a una alta tensión mecánica en las celdas objetivo debido a la presión a través del filtro y a la destrucción de la celda marginal en la unión del pistón a la pared del cilindro.

Como prototipo se ha elegido un dispositivo para el aislamiento de células madre de tejido adiposo (Sistema para procedimientos para la preparación de células madre derivadas adiposas, US 20130012921 A1, PUSTILNIK FELIX, IPC A61M37/00, publicado el 10 de enero de 2013), que es un contenedor en forma de cono, herméticamente cerrado con una tapa provista de conectores para la inyección y extracción de biomaterial y fluidos para su tratamiento, así como un tubo auxiliar para la concentración de la fracción vascular estromal resultante. Las desventajas de dicho sistema son la presencia de dos tubos-contenedores, lo que aumenta el riesgo de contaminación del material, su pérdida cuando se transfiere entre los contenedores, y conlleva requisitos adicionales a los equipos periféricos. Además, no hay separación del lipoaspirado primario en fracciones que contienen células diana y subproductos de procesamiento que contaminan el producto final. Se conocen otros dispositivos por el documento WO2013/106655 A1.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Una tarea técnica común de dicho grupo de invenciones es aumentar la eficacia y seguridad del procedimiento de aislamiento celular, ampliar su funcionalidad y optimizar el procedimiento de aislamiento.

El resultado técnico general del grupo de invenciones propuesto es el aislamiento controlado de la fracción vascular estromal del tejido adiposo caracterizada por una alta supervivencia celular, ausencia de detritos, residuos de tejido estromal y adiposo y células sanguíneas circulantes, baja concentración y actividad de las enzimas residuales.

La tarea técnica asignada se logra mediante la presencia en el dispositivo de dos cámaras separadas por un sistema de microfiltros con diferentes diámetros de poro; la presencia de canales aislados en la pared del sistema; la presencia de válvulas en los accesorios adaptadores para inyección de material biológico, adición de reactivos y tampón de lavado, extracción de detritos y residuos de tejido adiposo estromal, extracción del producto final, uso de tratamiento antiadherente de la superficie interna del dispositivo, y use una jeringa Luer-Lock con una nariz alargada y un mango de pistón agrandado para incrustar y extraer material biológico.

El dispositivo propuesto es un sistema cerrado y sellado en forma de contenedor transparente en forma de cono de 150-300 ml con calibración externa por volumen, sistemas de canales y accesorios adaptadores con conectores tipo Luer-Lock, en el que el contenedor está dividido por un filtro multicapa en dos cámaras: una cámara de trabajo para el tratamiento de tejidos y una cámara para la concentración de células, en la que la cámara de trabajo tiene un volumen de 145 a 299 ml y la cámara de concentración tiene un volumen de 1-5 ml.

El sistema de filtrado es un complejo de al menos 2 filtros de nailon con un diámetro de 10 pm del filtro inferior y de hasta 500 pm para el filtro superior, separados por almohadillas poliméricas y colocados en un cuerpo polimérico que tiene en su circunferencia palancas y un elemento de cierre para una conexión de bayoneta con el contenedor. El sistema de filtrado se instala en un contenedor en una almohadilla de silicona mediante conexión de bayoneta; para ello, el punto de conexión filtro-contenedor tiene ranuras sectoriales.

La forma cónica del contenedor para el tratamiento de tejidos y dividirlo en dos cámaras mediante un sistema de microfiltros con un diámetro de poro de 10 a 500 pm aumenta la eficiencia, seguridad y rentabilidad del procedimiento de aislamiento celular.

El dispositivo tiene canales aislados en las paredes laterales del contenedor, en el que la entrada de cada canal tiene rebajes y ranuras sectoriales para la conexión de bayoneta a los accesorios adaptadores.

El dispositivo tiene un canal para la inyección de material biológico, que termina en una ranura de rebaje en la cámara para el tratamiento de tejidos.

El dispositivo tiene un canal para la inyección de tampón de lavado y reactivo, que termina en una ranura de rebaje en la cámara para el tratamiento de tejidos.

El dispositivo tiene un canal para la extracción de sobrenadante que contiene detritos celulares, residuos de tejido adiposo y estromal sin tratar, que termina en el punto de fijación del filtro en la cámara de tratamiento de tejidos. El dispositivo tiene un canal para la extracción del producto final como fracción vascular estromal del tejido adiposo, que termina en la base del contenedor en una cámara de concentración de células.

El dispositivo puede tener canales adicionales para la inyección o extracción de componentes que terminan en una cámara de tratamiento de tejidos y/o en una cámara de concentración de células.

El dispositivo tiene un filtro bacteriológico para igualar la presión en el sistema.

El dispositivo tiene una tapa, por lo que la tapa tiene elementos de bloqueo en su circunferencia y se conecta al contenedor a través de una almohadilla de silicona mediante conexión de bayoneta o rosca.

La tapa del dispositivo puede tener orificios para cada uno de los canales y un filtro bacteriológico.

La tapa se puede conectar al contenedor a través de una almohadilla de silicona mediante pernos de acero; para ello, el contenedor tiene los correspondientes orificios roscados.

El dispositivo tiene accesorios adaptadores para cada canal. Cada accesorio adaptador tiene una válvula de reflujo. Cada accesorio adaptador tiene una rosca tipo Luer-Lock para la conexión a una jeringa. Cada accesorio adaptador tiene un tapón de rosca. Cada accesorio adaptador tiene almohadillas de silicona para ajuste cuando se conecta a un contenedor. Cada accesorio adaptador tiene un elemento de bloqueo para la conexión a un contenedor. Cada accesorio adaptador está conectado a un contenedor a través de la tapa y una almohadilla de silicona mediante conexión de bayoneta.

El dispositivo puede tener una carcasa-cubierta, en la que la carcasa-cubierta está conectada al contenedor mediante conexión de bayoneta o rosca.

El dispositivo puede tener patas en forma de hoja como asiento de contenedor.

El dispositivo puede tener ranuras para la fijación en el rotor del cubo oscilante. En este caso, el dispositivo se suministra con armadura interna de acero a lo largo de las ranuras.

La superficie interna del dispositivo está recubierta con una película de organosilicona y/o agarosa para propiedades hidrófobas y antiadhesivas de la superficie. Para hacer esto, el sistema estéril y libre de grasa se seca y las superficies internas del sistema y los canales se tratan con una solución de polidimetilsiloxano al 0,1-10 % en cloroformo y/o una solución de agarosa al 0,1-5 %. El sistema tratado se coloca durante 1-5 horas en un horno de pérdida por secado a una temperatura de 100 °C a 300 °C.

El dispositivo puede tener una jeringa Luer-Lock de 50-200 ml (no mostrada en los dibujos) con una nariz alargada, un tapón de rosca y un mango de pistón agrandado para la inyección de material biológico y extracción del sobrenadante y el producto final.

Todos los componentes del dispositivo, incluidos el contenedor, la tapa, los accesorios adaptadores, las tapas de los accesorios adaptadores, la carcasa del filtro y las almohadillas del sistema, están hechos de policarbonato y/o polipropileno y/o polietileno y/o fluoroplástico. Las pastillas y válvulas están hechas de silicona y/o caucho.

El procedimiento para extraer la fracción vascular estromal del tejido adiposo del lipoaspirado para dicha invención comprende las siguientes etapas:

- decantación del lipoaspirado y lavado de los residuos de sangre, en el que la decantación se lleva a cabo en 10-30 minutos y el lavado del lipoaspirado se realiza con solución salina y/o solución salina equilibrada de Hank y/o medio Eagle modificado con Dulbecco a 37 °C, en el que el lipoaspirado el lavado se realiza de 1 a 5 veces;

- tratamiento fermentativo con lipoaspirado con una mezcla enzimática de colagenasa I y/o colagenasa II y/o termolisina y/o dispasa y/o tripsina, en el que el tratamiento se realiza a 37 °C bajo termostato, con tratamiento por agitación a 10-200 rpm, donde el tiempo de tratamiento es de 30 a 60 minutos;

- separación de la fracción vascular estromal de los restos celulares y los residuos estromales del tejido adiposo, en el que la separación se realiza con centrifugación a 500-2000 g durante 15 a 45 minutos;

- eliminación de residuos celulares y residuos estromales de tejido adiposo;

- lavado del producto final de los residuos enzimáticos, en el que el lavado se lleva a cabo con solución salina y/o solución salina equilibrada de Hank y/o medio Eagle modificado con Dulbecco a 37 °C, con el lavado del producto final realizado de 1 a 5 veces;

- concentración de la fracción vascular estromal, donde la concentración se lleva a cabo con centrifugación a 500-2000 g durante 15-45 minutos;

- en el que todas las etapas del proceso se llevan a cabo en el aparato de la presente invención;

- en el que la aplicación del material biológico y su extracción del dispositivo se realizan mediante el uso de una jeringa para inyección y extracción de material biológico.

La fracción vascular del estroma aislada del tejido adiposo puede utilizarse en biología y medicina como elemento celular para la creación de estructuras de ingeniería de tejidos basadas en materiales sintéticos y naturales.

La fracción vascular estromal aislada del tejido adiposo se puede utilizar en biología y medicina como un injerto autólogo celular para el reemplazo y regeneración de defectos de tejidos duros y blandos, inyectando la fracción vascular estromal del tejido adiposo en tejidos duros y/o blandos.

Por lo tanto, el tejido biológico introducido en el sistema se elimina de los residuos sanguíneos circulantes; se somete a un tratamiento enzimático con una mezcla de colagenasas I y II, termolisina, dispasa y tripsina, lo que provoca la lisis del tejido estromal y la salida de la fracción vascular estromal al medio. En la siguiente etapa, el componente celular y los residuos del tejido adiposo y estromal se separan por centrifugación a través de un sistema de filtros con diferentes tamaños de poro, seguido de lavado de la fracción celular de las enzimas residuales y su concentración. Como resultado del tratamiento de la superficie interna con medios antiadhesivos, no quedan restos de sangre circulante ni fracción celular que se adhiera a las paredes del sistema, y se eliminan por completo durante el procedimiento. Al usar una mezcla de enzimas, hay una lisis completa del tejido estromal y el flujo de salida de la fracción vascular estromal en el medio. Debido a la presencia de un sistema de filtros con diferentes diámetros de poro, se produce un aislamiento óptimo de la fracción celular sin mezclas de tejido estromal y adiposo. La presencia de canales de introducción y extracción que terminan en diferentes niveles dentro de la pared del sistema permite minimizar el área total de la superficie interior del sistema, lo que reduce el riesgo de adhesión celular en la superficie del tubo; permite que el material biológico y los reactivos se introduzcan de forma controlada cerca de la pared, lo que reduce los efectos físicos sobre el material biológico y aumenta la tasa de supervivencia de las células; permite extraer completamente el sobrenadante con estroma de tejido adiposo residual sin afectar el sedimento; permite extraer completamente el sedimento en forma de una fracción vascular estromal de tejido adiposo. Las válvulas de entrada en los canales aseguran la esterilidad del proceso dentro del sistema. El plástico transparente se utiliza como material principal, lo que permite el control visual del proceso de aislamiento celular, la introducción de material biológico y reactivos, la extracción del sobrenadante con tejidos residuales estromales y adiposos y la extracción de la fracción vascular del estroma terminal. La presencia de marcas de graduación en la superficie del sistema permite el control visual del volumen de material biológico y reactivos introducidos. El uso de una jeringa de punta larga permite la introducción y extracción de material biológico y reactivos sin riesgo de contaminación del material y derrame de líquidos fuera del sistema.

La fracción vascular del estroma del tejido adiposo aislado mediante el uso de la invención reivindicada se puede utilizar para la creación de construcciones de ingeniería tisular basadas en materiales sintéticos y naturales; para uso como injerto autólogo celular; como procedimiento de tratamiento, reparación o sustitución del tejido, incluida la inyección de la fracción vascular estromal del tejido adiposo en tejidos duros y/o blandos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra el dispositivo para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales, en una vista del dispositivo en despiece.

La figura 2 muestra el dispositivo para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales, en una vista en sección despiezada.

La figura 3 muestra el dispositivo para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales, en una vista ensamblada.

La figura 4 muestra el dispositivo para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales, en una vista en sección ensamblada.

La figura 5 muestra el dispositivo para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales, en vista superior.

La figura 6 muestra una monocapa de células en cultivo p0 (pasaje n.° 1), el quinto día. Contraste de fase (aumento de x10).

La figura 7 muestra una monocapa de células en cultivo p1 (pasaje n.° 1), el quinto día. Contraste de fase (aumento de x10).

REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La esencia de la divulgación se puede explicar mediante los dibujos. La figura 1 muestra el dispositivo para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales, en una vista del dispositivo en despiece. La figura 2 muestra el dispositivo, en una vista en sección despiezada. La figura 3 muestra el dispositivo, en vista ensamblada. La figura 4 muestra el dispositivo, en una vista en sección ensamblada. La figura 5 muestra el dispositivo, en vista superior. La figura 6 es una microfotografía de la monocapa celular en el cultivo p0 (pasaje n.° 1), el quinto día. Contraste de fase. Ampliación de x10. La figura 7 es una microfotografía de la monocapa celular en el cultivo p1 (pasaje n.° 1), el quinto día. Contraste de fase. Ampliación de x10.

El dispositivo para el aislamiento de fracciones celulares de tejidos humanos y animales es un sistema cerrado hermético a los fluidos en forma de recipiente cónico transparente (A) con graduación externa del volumen (3), conjunto de canales (2.1, 2.2, 2.3, 2.4) y accesorios adaptadores (1) con conectores Luer-Lock, fijados dentro de la carcasa transparente (C) mediante unión de bayoneta (4); el recipiente se separa con un sistema de microfiltros (D) en dos cámaras: una cámara para el tratamiento de tejidos (B) y una cámara de concentración de células (E).

El sistema de microfiltros consta de al menos dos microfiltros de nailon (9) separados con inserciones de polímero (10) y colocados en una carcasa de polímero que consta de un sello de silicona superior (8) y una base (11) con palancas de circunferencia y un elemento de bloqueo (12) para conexiones con la cámara de tratamiento de tejidos (B) y la cámara de concentración de células (E). El sistema de microfiltro se coloca en el sello de silicona dentro del recipiente (8). El dispositivo tiene canales aislados (2.1, 2.2, 2.3, 2.4) en las paredes laterales del recipiente; la entrada de cada canal tiene rebajes y ranuras sectoriales (no indicadas en el dibujo) para unión de bayoneta a los racores accesorios adaptadores. El dispositivo tiene un filtro bacteriológico (5) para igualar la presión en el sistema. El dispositivo tiene una tapa (F) con al menos un orificio y con elementos de bloqueo de circunferencia; la tapa se fija al recipiente a través de un sello de silicona (7) mediante conexión de bayoneta o rosca (13). El dispositivo tiene accesorios adaptadores (1) para cada canal. El dispositivo tiene una base/carcasa (C) con patas en forma de paleta (6).

EJEMPLO DE REALIZACIÓN

El ejemplo dado no pretende limitar la invención, sino que se ofrece únicamente como ilustración.

En términos generales, el funcionamiento del dispositivo representa un lavado y un tratamiento enzimático escalonados del tejido adiposo para aislar la fracción vascular estromal. El lipoaspirado de tejido adiposo se coloca en un recipiente hermético a los fluidos (A), es decir, en una cámara de tratamiento de tejidos (B), a través del canal (2.1) mediante una conexión de la jeringa con material biológico al accesorio adaptador (1). El tejido biológico se lava de la sangre residual en una solución tampón inyectada a través del canal (2.2). El exceso de líquido se extrae a través del canal (2.4). El tejido biológico se trata con una mezcla de enzimas proteolíticas inyectadas a través del canal (2.2). El dispositivo se centrifuga y la fracción vascular estromal pasa a través del sistema de microfiltros (D) a la cámara de concentración de células (E). El exceso de líquido se extrae a través del canal (2.3) y el sedimento se lava de las enzimas residuales con una solución tampón. La fracción vascular del estroma final se extrae a través del canal (2.4). El dispositivo funcionó con 3 muestras de lipoaspirado derivado de la liposucción quirúrgica. El lipoaspirado se extrajo usando jeringas tipo Luer-Lock de 50 mL. Se inyectaron 100 ml del lipoaspirado en la cámara de tratamiento de tejidos (B) lavando los lados del sistema cuidadosamente a través del canal (2.1) a través de la conexión de la jeringa (no se indica en el dibujo) al accesorio adaptador (tipo 1), luego se cerró herméticamente la tapa del accesorio adaptador. Se inyectaron 100 ml de solución salina equilibrada de Hank a través del canal (2.2) a través de la conexión de la jeringa (no indicada en el dibujo) al accesorio adaptador (tipo 1) y luego se cerró herméticamente la tapa del accesorio adaptador. El sistema se colocó en una cámara de temperatura controlada (37 °C) con un agitador de 100-150 RPM durante 15-20 minutos para lavar el material biológico. El sistema se centrifugó a 500 g durante 10 minutos. Se extrajeron completamente 100 mL del sedimento a través del canal (2.4) utilizando la jeringa sin volcar el sistema y luego se cerró la tapa herméticamente. El ciclo de lavado se repitió tres veces. Se inyectaron 10 mL de una mezcla de colagenasa I, colagenasa II, termolisina, dispasa y tripsina a través del canal (2.2) mediante la conexión de la jeringa (no indicada en el dibujo) al accesorio adaptador (tipo 1), luego la tapa del accesorio adaptador se cerró bien. Se inyectaron 90 ml de solución salina balanceada de Hank a través del canal (2.2) a través de la conexión de la jeringa (no indicada en el dibujo) al accesorio adaptador (tipo 1) y luego se cerró herméticamente la tapa del accesorio adaptador. El sistema se colocó en una cámara de temperatura controlada (37 °C) con un agitador de 100-150 RPM durante 45 minutos para lavar el material biológico. El sistema se centrifugó a 1000 g durante 30 minutos. Se extrajeron completamente 190 ml de grasa, estroma, detritos y eritrocitos residuales a través del canal (2.3) mediante la conexión de la jeringa (no indicada en el dibujo) al accesorio adaptador (tipo 1) y luego la tapa del accesorio adaptador se cerró herméticamente. Se introdujeron 90 ml de solución salina equilibrada de Hank a través del canal (2.2) mediante la conexión de la jeringa (no indicada en el dibujo) al accesorio adaptador (tipo 1) y luego se cerró herméticamente la tapa del accesorio adaptador. El sistema se centrifugó a 1000 g durante 5 minutos. El procedimiento de lavado se repitió tres veces. Se extrajeron completamente 190 ml de grasa, estroma e impurezas de detritos a través del canal (2.3) utilizando la jeringa sin volcar el sistema, luego se cerró la tapa herméticamente. Se inyectaron 10 ml de suero de paciente autólogo a través del canal (2.2). El sistema se colocó en una cámara de temperatura controlada (37 °C) con un agitador de 100-150 RPM durante 5 minutos para inactivar las enzimas. El sistema se centrifugó a 1000 g durante 5 minutos. Se extrajeron 2 mL de fracción vascular estromal a través del canal (2.4).

El cultivo primario obtenido de la fracción vascular estromal se caracterizó en términos de viabilidad celular y expresión de marcadores de superficie - CD90, CD105, CD73, CD34, CD11b, CD19, CD45, CD44 - inmediatamente después de la extracción, en el primer y segundo pases.

Se analizaron no menos de 100.000 eventos para cada muestra. Después del tratamiento y centrifugación de la suspensión celular según el protocolo, FSC y SSC, se realizaron análisis para determinar el tamaño de los objetos de estudio y la presencia de inclusiones intracelulares.

La fracción aislada se caracteriza por una "pureza de eventos" y un bajo contenido de duplicados y detritos. Las características ópticas se utilizaron para determinar la puerta linfocítica y monocítica y la fracción de células diana. Se demostró que las células individuales componían el 92 % de 47.264 eventos (43.487 eventos en términos absolutos), duplicados (células agregadas) - 1,4 %, detritos (restos celulares de la muestra) y eritrocitos - solo 6,2 %. La puerta linfocítica y monocítica compuso el 91,8 % de los eventos únicos agrupados, la fracción objetivo - 7,5 %. Mientras tanto, la concentración total de células de la fracción vascular estromal por unidad de volumen fue de 66.000 células por 100 pl.

Para identificar y analizar la fracción regenerativa en una muestra aislada, se utilizaron marcadores comunes de células madre maduras (CD90, CD73, CD105, CD44).

Los resultados experimentales han demostrado que la fracción aislada contiene hasta el 20 % de células positivas para CD90, el 0,24 % de células positivas para CD105 y no menos del 0,01 % de células positivas para CD44.

La expresión de endoglina (CD105) es típica de MSC después del pasaje; sin embargo, este marcador también se puede expresar en células progenitoras: angioblastos mesenquimales. Por tanto, el porcentaje de células regenerativas en la fracción vascular del estroma aislada es del 0,5 %.

Se realizó un análisis de viabilidad de la fracción celular, incluido el cálculo de células muertas y apoptóticas. La prueba se realizó usando anexina V marcada con FITC que es afín a la fosfatidilserina. La fosfatidilserina se localiza en la superficie de las células apoptóticas y forma una de las señales características específicas de las células apoptóticas. Los resultados de la prueba de anexina mostraron que el 1,02 % de las células de la fracción de estudio son células apoptóticas, el 0,04 % son células destruidas y el 98,94 % son células vivas.

Después del pasaje, se observó un aumento persistente en la expresión de CD90 y CD105, que es típico del cultivo de células estromales mesenquimales. En el quinto día de cada pase, las células alcanzaron un 100 % de confluencia (monocapa), como se demuestra en la figura 3 y la figura 4.

Tabla 1. Resultados de la tinción de los marcadores mediante el uso del kit de análisis de MSC humana (BD, cat # 562245) (CD90, CD105, CD73, CD34, CD11b, CD19, CD45, CD44)

Anteriormente, se describió el dispositivo para aislar fracciones celulares de tejidos humanos y animales. Este dispositivo contiene un recipiente hermético a los fluidos para el tratamiento de tejidos con accesorios adaptadores y un sistema de canales. Según la invención, el recipiente para el tratamiento de tejidos es de forma cónica y está separado en dos cámaras por un sistema de microfiltros con tamaños de poro de 10-500 micrómetros, herméticamente cerrado con unión de bayoneta mediante junta de silicona, donde una cámara se utiliza para el tratamiento de tejidos y una segunda cámara se utiliza para la concentración de células. La superficie interna del recipiente tiene un revestimiento antiadhesivo hidrofóbico, y el área de la superficie interna se minimiza mediante el uso de canales dentro de la pared del sistema, en el que un canal se abre en la cámara de tratamiento de tejidos, un segundo canal se abre en la cámara de concentración de células y la presión se iguala utilizando un filtro bacteriológico.

También se describió anteriormente un procedimiento para aislar fracciones de células de tejidos humanos y animales utilizando el dispositivo propuesto. Incluye decantación de un lipoaspirado; lavado delicado del lipoaspirado en soluciones tampón; tratamiento enzimático mediante el uso de una mezcla de colagenasas, termolisina, dispasa y tripsina a una temperatura de 37 °C; centrifugación a 500-2000 g y filtración a través de microfiltros con un tamaño de poro de 10-300 micrómetros con la posterior eliminación de la materia grasa y del tejido estromal; lavado repetido y concentración de la fracción celular.

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con respecto a los modos de realización ejemplares que parecen ser preferentes, debe entenderse que estas realizaciones de la invención tienen únicamente fines ilustrativos. Esta descripción no debe considerarse como limitante del alcance de la invención, ya que los especialistas en el campo de la biotecnología médica y tecnología celular, etc. pueden modificar las etapas de los métodos y dispositivos descritos para adaptarlos a dispositivos o situaciones específicas, pero no más allá del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los especialistas en este campo entienden que son posibles diferentes variaciones y modificaciones, incluidas soluciones equivalentes, dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones.

REFERENCIAS

1. Sistema pare procesar células lipoaspiradas EP 1921133 A2

2. Procedimiento y aparato para separar un material US 20110251041 A1

3. Dispositivo de extracción de células regenerativas WO 2013183797 A1

4. Dispositivo para separar células madre adultas US 20130344589 A1

5. Sistema y procedimientos para la preparación de células madre derivadas adiposas US 20130012921 A1, WO 2014011213 A1

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo para separar una fracción estromal vascular de tejidos humanos o animales, que contiene un recipiente hermético a los fluidos para el tratamiento de tejidos y un sistema de canales dentro de las paredes laterales del recipiente, en el que la entrada de cada canal tiene huecos y ranuras sectoriales para la conexión de bayoneta a los accesorios adaptadores, siendo dicho recipiente para el tratamiento de tejidos de forma cónica y está dividido en dos cámaras por un sistema de microfiltros, conteniendo el sistema de microfiltros al menos dos microfiltros de nailon, con diámetros de poro desde 10 pm para el filtro inferior hasta 500 pm para el filtro superior, y los filtros están separados por almohadillas poliméricas, sujetándose las cámaras herméticamente con una conexión de bayoneta a través de un sello de silicona, en el que una cámara, a saber, una cámara de tratamiento de tejidos, se utiliza para el tratamiento de tejidos y la otra cámara, a saber, una cámara de concentración de células, se utiliza para concentrar células, en el que la superficie interior del recipiente tiene un revestimiento antiadhesivo hidrófobo; un canal del sistema de canales se abre hacia la cámara de tratamiento de tejidos, otro canal del sistema de canales se abre hacia la cámara de concentración de células y el recipiente también contiene un filtro bacteriológico configurado para igualar la presión dentro del dispositivo.

2. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene patas en forma de paleta en la parte inferior del cono.

3. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que hay ranuras en el exterior del recipiente para sujetar el recipiente en un rotor de cubeta oscilante de una centrífuga, en el que el dispositivo debe estar equipado con una armadura de acero interna a lo largo de las ranuras.

4. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene bombas para alimentación de líquido y extracción de células.

5. Un procedimiento para separar una fracción estromal vascular de tejidos humanos o animales usando el dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el procedimiento: decantar un lipoaspirado; lavar delicadamente el lipoaspirado en soluciones tampón; proporcionar un tratamiento enzimático del lipoaspirado usando una mezcla de colagenasas, termolisina, dispasa y tripsina a una temperatura de 37 °C; realizar la centrifugación a 500-2000 g y filtrar a través de microfiltros con un tamaño de poro de 10-500 pm con la posterior eliminación de grasa y tejido estromal; repitiendo el lavado y concentración de la fracción celular.

6. Una fracción vascular estromal de tejido adiposo, obtenida mediante el uso del dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 para la creación de construcciones de tejido de ingeniería basadas en materiales sintéticos y naturales.

7. La fracción vascular estromal de tejido adiposo de acuerdo con la reivindicación 6 para uso como injerto autólogo celular.