WO2017078563A1 - Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения - Google Patents

Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения Download PDF

Info

Publication number
WO2017078563A1
WO2017078563A1 PCT/RU2015/000738 RU2015000738W WO2017078563A1 WO 2017078563 A1 WO2017078563 A1 WO 2017078563A1 RU 2015000738 W RU2015000738 W RU 2015000738W WO 2017078563 A1 WO2017078563 A1 WO 2017078563A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
stromal
cell
fraction
cells
Prior art date
Application number
PCT/RU2015/000738
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2017078563A8 (ru
Inventor
Алексей Владимирович ВЕРЕМЕЕВ
Натан Георгиевич КАЦ
Владимир Георгиевич НЕСТЕРЕНКО
Роман Николаевич БОЛГАРИН
Мария Александровна ПЕТКОВА
Original Assignee
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДЖОИН ТЕКСЭЛЛ" (ООО "Джоин ТекСэлл")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДЖОИН ТЕКСЭЛЛ" (ООО "Джоин ТекСэлл") filed Critical ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДЖОИН ТЕКСЭЛЛ" (ООО "Джоин ТекСэлл")
Priority to ES15907892T priority Critical patent/ES2837096T3/es
Priority to IL259095A priority patent/IL259095B/en
Priority to PL15907892T priority patent/PL3372669T3/pl
Priority to PCT/RU2015/000738 priority patent/WO2017078563A1/ru
Priority to KR1020187015690A priority patent/KR102143286B1/ko
Priority to EP15907892.2A priority patent/EP3372669B1/en
Priority to EA201891056A priority patent/EA037537B1/ru
Publication of WO2017078563A1 publication Critical patent/WO2017078563A1/ru
Publication of WO2017078563A8 publication Critical patent/WO2017078563A8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/02—Means for pre-treatment of biological substances by mechanical forces; Stirring; Trituration; Comminuting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/05—Means for pre-treatment of biological substances by centrifugation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the present group of inventions relates to medical biotechnology and cell technology and is intended for the isolation of cell fractions from human and animal tissues, namely the isolation of the stromal-vascular fraction of adipose tissue.
  • Subcutaneous fat is an alternative bone marrow source of stem and progenitor cells for regenerative medicine.
  • the main advantage of adipose tissue is the low invasiveness of the sampling procedure, minimal pain, discomfort and risk to the patient.
  • Adipose tissue provides a significantly larger number of stem cells compared to bone marrow.
  • the bone marrow transplant contains 0.006 - 0.06 x 10 6 stem cells per 100 ml, and the number of viable stem and progenitor cells in the adipose tissue fraction is approximately 0.5 x 106 to 20 x 10 6 cells per 100 ml of tissue.
  • the stromal-vascular fraction is characterized by significant heterogeneity and variability of the cellular composition depending on the condition of the donor, its age and the place of collection of biological material. After sorting, cell populations can be isolated from the stromal-vascular fraction: endothelial and smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, mast cells and preadipocytes.
  • cells of the regenerative fraction namely, a complex of stem and progenitor cells of adipose tissue (adipose derived stem cells, ADSCs).
  • ADSCs have significant potential for differentiation into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts, myocytes, neuronal cells, cardiomyocytes and hepatocytes.
  • the clinical use of the stromal-vascular fraction includes the regeneration of soft tissues and bones, cosmetic defects, chronic trophic and radiation ulcers, burns, Crohn's disease, multiple sclerosis, in the graft versus host reaction, in myocardial infarction and strokes of various origins.
  • the main advantages of using this type of cell are easy access to the source of cells, a large number and high yield per unit volume of tissue, high multipotency, comparable efficiency and safety regarding bone marrow mesenchymal cells.
  • the lipoaspiration procedure is widely used, standardized, easy to perform in the conditions of the treatment room and can be carried out in a short time - about 90 minutes.
  • cell fractions isolated from adipose tissue can be advantageously used for clinical practice, including, excluding the stage of cultivation.
  • a known method of isolating stem cells from adipose tissue using the manual method (Zuk P.A., Zhu M., Mizuno N. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7 ( 2): 211-28.).
  • This method is based on the treatment of lipoaspirate with a 0.075% type I collagenase solution at 37 ° C for 30 minutes and subsequent centrifugation of the resulting suspension at 800 d.
  • the cell suspension After centrifugation, the cell suspension is divided into two fractions: adipocytes are in the upper layer and the sediment is in the sediment - stromal-vascular fraction with an admixture of red blood cells, which were removed during incubation in a lysis solution of ammonium chloride.
  • the disadvantages of this method are the high time and organizational costs, the presence of the "human factor”, a high risk of impaired sterility of the process and contamination of biological material and the final product.
  • a device is known from the prior art (System for processing lipoaspirate cells EP 1921133 A2, CYTORI THERAPEUTICS, INC (US), IPC A61K31 / 436, published May 14, 2008), which is a closed system for processing lipoaspirate obtained during liposuction.
  • the system connects directly to the lipoaspiration cannula. It includes a vacuum pump, a container for collecting lipoaspirate, a mixer for mixing the processed biomaterial with additives and activators, a system of two filters with pores of different diameters.
  • the first filter divides the lipoaspirate into 2 fractions, where one fraction contains a population of cells, including stem cells of adipose tissue, and the other fraction contains lipids, blood, adipocytes and saline.
  • the first filter rotates and structurally divides the container into two chambers, for the corresponding fractions, and the second filter concentrates the cell fraction before being fed to the mixer.
  • the conductive line allows you to extract the final fraction without violating the tightness of the system and direct it to a centrifuge, then extract the obtained fraction aseptically.
  • the device allows you to enter activators and additives.
  • the system also has a built-in temperature controller.
  • the main disadvantage of this device is that at the first stage of processing, the lipoaspirate is filtered without providing destruction of the stroma of the tissue, which fixes the cells of the stromal-vascular fraction and does not allow them to pass through the filter, thereby reducing the concentration of cells in the permeate. Also, the shortcomings of the system are long trunk lines and a significant number of junctions, which are an environment for adhesion and loss of target cells.
  • a device is known from the prior art (Method and Apparatus for Separating a Material, US20110251041 A1, BIOMET BIOLOGICS, LLC (US), IPC B04B1 / 08, published October 13, 2011), which is a system for separating multicomponent material, at least into two fractions.
  • This device is a container in the form of a hollow cylinder divided by a valve into two parts unequal in volume. The function of the valve is to differentiate fractions of different densities.
  • the system contains a settling tank at the base of the design with inclined walls, separated by a valve from the main chamber volume.
  • the valve has a conical surface, includes an insert, also having a conical surface, between the side wall and the longitudinal axis of the cylinder, the conical surface is turned downward.
  • the valve contains a disk with round holes and sector shapes.
  • the valve includes a flexible membrane that activates it with increasing hydraulic pressure during centrifugation; when the disk is rotated, the holes are matched, ensuring valve permeability.
  • the system is additionally equipped with a grinder and a vacuum pump in communication with the separation chamber. In this case, adipose tissue is divided into three fractions. The first fraction is isolated between the valve and the bottom of the chamber and contains cellular material. The second fraction is isolated between the valve and the upper end of the chamber and contains fat.
  • the third fraction is isolated between the components of the valve and includes a tumescence fluid.
  • the main disadvantage of this system is the possibility of filling elements of a mechanical device with tissue fragments, which entails the risk of device failure, contamination of the final fraction with components of the original biomaterial. Processing without ensuring the destruction of the stroma of the tissue, which fixes the cells of the stromal-vascular fraction and does not allow them to pass through the filter, thereby reducing the concentration of cells in the permeate.
  • a device is known from the prior art (Regenerative cell extraction device WO 2013183797 A1, HURIMBIOCELL CO., LTD (KR), IPC C12M1 / 10, published 12.12.2013), which is a container with a cone-shaped bottom and a rotating longitudinal axis driven by an external motor. A product consisting of many petals is fixed on the axis, which has a direct effect on the lipoaspirate.
  • the tank is equipped with a pipe for introducing biomaterial and isolating the tissue fraction containing stem cells.
  • a prior art device is known (Device for separating adult stem cell US 20130344589 A1, HUMAN MED AG (DE), IPC C12M1 / 00, published December 26, 2013), which is a system including an adipose tissue container equipped with a device for feeding liquids for washing biomaterial, a mixture of necessary reagents, alternately with extracting the fraction containing stem cells, a valve for equalizing pressure, a piston, a vibrator, a semi-permeable membrane having an electrostatic charge and a valve that divide the container into 2 parts, with a temperature controller atura.
  • One of the chambers is equipped with a device for mixing the initial biomaterial with additives, performing rotational and / or pendulum movements.
  • the main disadvantage of this device is the method of creating pressure due to the piston, which leads to a high mechanical load on the target cells due to punching through the filter and edge destruction of the cells at the junction of the piston to the cylinder wall.
  • a device for the isolation of adipose stem cells (System and methods for preparation of adipose-derived stem cells, US 20130012921 A1, PUSTILNIK FELIX, IPC A61M37 / 00, publ. 10.01.2013), which is a cone-shaped container, hermetically closed, is selected as a prototype a lid equipped with connectors for the introduction and removal of biomaterial and liquids for its processing, as well as an auxiliary tube for the concentration obtained from the stromal-vascular fraction.
  • the disadvantages of this system are the presence of two test tubes, which increases the risk of contamination of the material, its loss when transferred between containers, entails additional requirements for auxiliary equipment.
  • the general technical task of this group of inventions is to increase the efficiency and safety of the method for isolating cells, expanding its functionality and optimizing the isolation procedure.
  • the overall technical result of the proposed group of inventions is the controlled release of the stromal-vascular fraction of adipose tissue, characterized by high cell survival, lack of debris, residues of stromal and adipose tissue and circulating blood cells, low concentration and activity of residual enzymes.
  • the stated technical problem is achieved due to the presence in the device of two chambers separated by a system of microfilters with different pore diameters; the presence of isolated channels in the wall of the system; the presence of valves on the adapter fittings for introducing biological material, introducing reagents and washing buffer, selecting debris and adipose tissue stroma residues, and selecting the final product; the use of release treatment of the inner surface of the device and use for filling and selection of the biological material of the syringe Luer-lock with an elongated nose and an enlarged piston handle.
  • the proposed device is a closed airtight system in the form of a transparent cone-shaped container with a volume of 150 - 300 ml, with external graduation by volume, a system of channels and fittings-adapters having Luer-Lock connectors, the container is divided by a multilayer filter into two chambers - a working chamber for treating tissue and a chamber for concentrating cells, the working chamber having a volume of 145-299 ml, and the chamber for concentrating having a volume of 1-5 ml.
  • the filter system is a complex of at least 2 nylon filters with a diameter of 10 microns for the lower filter to 500 microns for the upper filter, separated by polymer gaskets and placed in a polymer housing having levers on its circumference and a locking element for bayonet connection with capacity.
  • the filter system is installed in a container in a silicone gasket by means of a bayonet connection, for this the connection point between the filter and the container has sector grooves.
  • the cone-shaped shape of the tissue processing container and its separation into two chambers by a microfilter system with a pore diameter of 10-500 microns provides an increase in the efficiency, safety and economy of the cell isolation method.
  • the device has insulated channels located in the side walls of the tank, and the input of each channel has recesses and sectoral grooves for bayonet connection with adapter fittings.
  • the device has a channel for introducing biological material, ending with a groove-recess in the working chamber for processing tissue.
  • the device has a channel for introducing reagents and wash buffers, ending with a groove-recess in the working chamber for processing tissue.
  • the device has a channel for sampling the supernatant containing cell debris, the remains of untreated stromal and adipose tissue, ending at the place of attachment of the filter in the working chamber for processing tissue.
  • the device has a channel for the selection of the final product - the stromal-vascular fraction of adipose tissue, ending at the base of the container in the cell concentration chamber.
  • the device may have additional channels for introducing or selecting components ending in a working chamber for processing tissue and / or in a chamber for concentrating cells.
  • the device has a bacteriological filter to equalize the pressure inside the system.
  • the device has a cover, and the cover around its circumference has locking elements and is connected to the container through a silicone gasket using a bayonet mount or thread.
  • the device cover may have openings for each of the channels and the bacteriological filter.
  • the lid can be connected to the container through a silicone gasket using steel bolts; for this, the container has corresponding threaded holes.
  • the device has adapter fittings for each channel.
  • Each adapter fitting has a check valve.
  • Each adapter fitting has a Luer-Lock type thread for connection to a syringe.
  • Each adapter fitting has a screw cap.
  • Each adapter nipple has silicone gaskets to ensure tightness when connected to a container.
  • Each adapter nipple has a locking element for connection to the container.
  • Each adapter nipple is connected to the tank through the cap and silicone gasket via a bayonet fitting.
  • the device may have a casing-cover, and the casing-cover is connected to the tank through the bayonet connection or thread.
  • the device may have legs in the form of blades, which are a stand for the container.
  • the device may have grooves for fastening to the bucket-rotor of the centrifuge.
  • the device is equipped with internal steel reinforcement along the grooves.
  • the inner surface of the device is covered with an organosilicon and / or agarose film in order to impart hydrophobic and anti-adhesive properties to the surface.
  • an organosilicon and / or agarose film in order to impart hydrophobic and anti-adhesive properties to the surface.
  • the sterile and fat-free system is dried and the internal surfaces of the system and channels are treated with a 0.1-10% solution of polydimethylsiloxane in chloroform and / or a 0.1-5% agarose solution.
  • the treated system is placed for 1-5 hours in an oven at a temperature of 100 ° C to 300 ° C.
  • the device may have a Luer-Lock syringe (not shown in the drawings) with a volume of 50-200 ml with an elongated nose, a screw cap and an enlarged piston handle for introducing biological material and selecting the supernatant and the final product.
  • a Luer-Lock syringe (not shown in the drawings) with a volume of 50-200 ml with an elongated nose, a screw cap and an enlarged piston handle for introducing biological material and selecting the supernatant and the final product.
  • All components of the device including the container, cover, adapter fittings, adapter nozzle covers, filter system housing and filter system gaskets are made of polycarbonate and / or polypropylene and / or polyethylene and / or fluoroplastic. Gaskets and valves are made of silicone and / or rubber.
  • the method for isolating the stromal-vascular fraction of adipose tissue from the lipoaspirate of the present invention includes the following steps:
  • the decantation being carried out within 10 to 30 minutes, moreover, the lipoaspirate is washed with physiological saline and / or Hanks balanced salt solution and / or Eagle’s medium in the Dulbecco modification at a temperature of 37 ° C, and the lipoaspirate is washed 1 - 5 times;
  • washing the final product from residues of enzymes moreover, washing is carried out with physiological saline and / or Hanks balanced salt solution and / or Eagle’s medium in the Dulbecco modification at a temperature of 37 ° C, moreover, washing of the final product is carried out 1-5 times;
  • the introduction of biological material and the selection of biological material from the device is carried out using a syringe for the introduction and selection of biological material.
  • the isolated stromal-vascular fraction of adipose tissue can be used in biology and medicine as a cell element for creating tissue-engineering structures based on synthetic and natural materials.
  • the isolated stromal-vascular fraction of adipose tissue can be used in biology and medicine for use as a cell autograft to replace and regenerate defects in hard and soft tissues by introducing the stromal-vascular fraction of adipose tissue into hard and / or soft tissues
  • the biological tissue placed in the system is washed from the remnants of the circulating blood; subjected to enzymatic treatment with a mixture of collagenases I and II, thermolysin, dispase and trypsin, due to which the stromal tissue is lysed and the stromal-vascular fraction enters the medium.
  • the next step is the separation of the cellular component and the remains of stromal and adipose tissue by centrifugation through a filter system with different pore sizes, followed by washing the cell fraction from residual enzymes and concentrating it. Due to the treatment of the inner surface with anti-adhesive media, the remains of the circulating blood and the cell fraction do not stick to the walls of the system and are completely washed during the procedure.
  • stromal tissue lysis occurs and the stromal-vascular fraction enters the medium. Due to the presence of a filter system with different pore diameters, the optimal selection of the cell fraction occurs without impurities of stromal and adipose tissue.
  • the presence of input / output channels with outputs at different levels inside the system wall allows minimizing the total area of the internal surface of the system, which reduces the risk of cell adhesion on the tube surface; It allows the controlled wall-wise introduction of biological material and reagents, which reduces the physical effect on the biological material and increases the degree of cell survival; allows you to fully select the supernatant with the remains of the stroma of adipose tissue, without affecting the sediment; allows you to fully select the sediment in the form of a stromal-vascular fraction of adipose tissue.
  • the presence of inlet valves on the channels ensures the sterility of the processes occurring inside the system.
  • the use of transparent plastic as the main material allows you to visually control the process of cell isolation, the introduction of biological material and reagents, the selection of the supernatant with the remains of stromal and adipose tissue, and the selection of the final stromal-vascular fraction.
  • the presence of graduation on the surface of the system allows you to visually control the amount of introduced biological material and reagents.
  • the use of a syringe with an elongated nose makes it possible to conveniently introduce and select biological material and reagents without the risk of contamination of the material and spillage of liquids outside the system.
  • the stromal-vascular fraction of adipose tissue isolated using the claimed invention can be used to create tissue-engineering structures based on synthetic and natural materials; for use as a cell autograft; as a method of treating, repairing or replacing tissue, comprising introducing the stromal-vascular fraction of adipose tissue into hard and / or soft tissues.
  • FIG. 1 - shows a device for the isolation of cell fractions from human and animal tissues in an expanded form.
  • FIG. 2 - shows a device for isolating cell fractions from human and animal tissues in a detailed sectional view.
  • FIG. 3 - shows a device for isolating cell fractions from human and animal tissues in assembled form.
  • FIG. 4 - shows a device for the isolation of cell fractions from human and animal tissues in assembled form in a section.
  • FIG. 5 - shows a device for isolating cell fractions from human and animal tissues (top view).
  • FIG. 6 - depicts a monolayer of cells in the culture of pO (passage Ns1), 5th day. Phase contrast (magnification x10).
  • FIG. 7 - depicts a monolayer of cells in culture p1 (passage N ° 1), 5th day.
  • Fig 1. shows a device for isolating cell fractions from human and animal tissues in expanded form
  • Fig 2 shows a device in expanded form in section
  • Fig 3 shows the device in assembled form
  • Fig 4 shows a device in assembled form in section
  • Fig. 5 shows a device (top view).
  • Fig.6 a micrograph of a monolayer of cells in a pO culture (passage N ° 1), day 5, is shown.
  • Phase contrast X10 magnification in Fig.7. micrograph of a monolayer of cells in culture p1 (passage N ° 1), day 5 is shown.
  • a device for isolating cell fractions from human and animal tissues is a closed airtight system in the form of a transparent cone-shaped container (A) with external calibration in volume (3), a combination of channels (2.1, 2.2, 2.3, 2.4) and adapter fittings (1 ) having connectors of the Luer-Lock type fixed in a transparent cover-case (C) by means of a bayonet connection (4); moreover, the container is divided by a system of microfilters (D) into two chambers - a working chamber for tissue processing (B) and a chamber for concentrating cells (E).
  • D system of microfilters
  • the microfilter system is a combination of at least two nylon microfilters (9) separated by polymer gaskets (10) and placed in a polymer housing containing the upper part - a silicone gasket (8) and a base (11), which has levers on its circumference and locks an element (12) for connecting to the tissue processing chamber (B) and the cell concentration chamber (E).
  • the microfilter system is installed in a container in a silicone gasket (8).
  • the device has isolated channels (2.1, 2.2, 2.3, 2.4) located in the side walls of the tank, and the input of each channel has recesses and sectoral grooves (not shown in the device drawings) for bayonet connection with adapter fittings.
  • the device has a bacteriological filter (5) for balancing the pressure inside the system.
  • the device has a cover (F) with at least one hole, and the cover around its circumference has locking elements and is connected to the container through a silicone gasket (7) by means of a bayonet connection or thread (13).
  • the device has adapter fittings (1) for each of the channels.
  • the device has a stand-casing (C) with legs in the form of blades (6).
  • the operation of the device is a process of stepwise washing and treating adipose tissue with proteolytic enzymes in order to isolate the stromal-vascular fraction, where adipose tissue - lipoaspirate is introduced into the device - a sealed container (A), namely, into the tissue processing chamber (B) through channel (2.1), by connecting a syringe with biological material to the adapter fitting (1).
  • adipose tissue - lipoaspirate is introduced into the device - a sealed container (A), namely, into the tissue processing chamber (B) through channel (2.1), by connecting a syringe with biological material to the adapter fitting (1).
  • Biological tissue is washed off from the remnants of blood in a buffer solution introduced through a channel (2.2). Excess fluid is removed from the system through the channel (2.4).
  • Biological tissue is subjected to enzymatic treatment with a mixture of proteolytic enzymes introduced through the channel (2.2).
  • the device is centrifuged in which the stromal-vascular fraction passes through a microfilter system (D) into the cell concentration chamber (E). Excess liquid is removed through channel (2.3), the precipitate is washed off from the residual enzymes with a buffer solution. The final stromal-vascular fraction is taken through the channel (2.4).
  • the lipoaspirate was collected in syringes of the type with a Luer-Lock lock with a volume of 50 ml.
  • a lipoaspirate in a volume of 100 ml was carefully introduced along the wall into the system into the tissue processing chamber (B) through the channel (2.1), by connecting a syringe (not shown) to the adapter fitting (type 1) and tightly closed the adapter nozzle cover.
  • Hanks balanced salt solution was introduced in a volume of 100 ml through the channel (2.2) by connecting the syringe with a buffer (not shown in the figure) to the adapter nozzle (type 1) and tightly closed the adapter nozzle cover.
  • the system was placed in a temperature-controlled chamber at 37 ° C with a shaker with a rotation speed of 100-150 rpm for 15-20 minutes for washing the biological material.
  • the system was centrifuged at 500 g for 10 minutes. Without turning the system over, using a syringe, a sediment was carefully taken through a channel (2.4) in a volume of 100 ml and the lid was tightly closed. The washing cycle was repeated three times.
  • a mixture of collagenase I, collagenase II, thermolysin, dispase and trypsin in a total volume of 10 ml was introduced through the channel (2.2) by connecting a syringe (not shown) to the adapter fitting (type 1) and tightly closed the adapter nozzle cover.
  • Hanks balanced salt solution was introduced in a volume of 90 ml through the channel (2.2) by connecting a syringe (not shown) to the adapter fitting (type 1) and tightly closing the adapter nozzle cover.
  • the system was placed in a temperature-controlled chamber at 37 ° C with a shaker with a rotation speed of 100-150 rpm for 45 minutes for the enzymatic treatment of biological material.
  • the system was centrifuged at 1000 g for 30 minutes. Not turning the system over, using a syringe, carefully selected impurities of fat, stroma, debris and red blood cell residues through a channel (2.3) in a volume of 190 ml, by connecting a syringe (not shown in the figure) with an adapter fitting (type 1) and tightly closed the adapter nozzle cover. Hanks balanced salt solution was introduced in a volume of 190 ml through the channel (2.2) by connecting a syringe (not shown in the figure) to the adapter nozzle (type 1) and tightly closed the adapter nozzle cover. The system was centrifuged at 1000 g for 5 minutes. The washing procedure was repeated three times.
  • the obtained primary stromal-vascular fraction cell culture was characterized by cell viability and expression of surface markers - CD90, CD105, CD73, CD34, CD11b, CD19, CD45, CD44 immediately after isolation, in the first and second passages.
  • At least 100,000 events for each sample were analyzed. After processing and centrifuging the cell suspension according to the protocol, an analysis of direct (FSC) and lateral (SSC) light scattering was performed in order to determine the size of the studied objects and the presence of intracellular inclusions.
  • FSC direct
  • SSC lateral
  • the isolated fraction is characterized by “purity” of events and a low content of takes and debris.
  • the lymphocyte-monocytic gate and the target cell fraction were determined. So, it was shown that for 47,264 events, individual cells accounted for 92%, which in absolute terms amounts to 43,487 events; duplicates (adherent cells) - 1, 4%, and debris (cell debris in the sample) and red blood cells only 6.2%.
  • the lymphocytic-monocytic gate was 91.8%, and the target fraction was 7.5%.
  • the total concentration of stromal-vascular fraction cells in the sample in terms of unit volume was 66,000 cells per 100 ⁇ l.
  • CD 90 positive cells 0.24% CD105 positive cells, at least 0.01% CD44 positive cells.
  • Endoglin expression (CD 105) is characteristic of MSCs after passaging, however, this marker can also be expressed on progenitor cells - “mesenchymoangioblasts”. Thus, the percentage of regenerative cells in the selected stromal-vascular fraction is 0.5%.
  • a device for isolating cell fractions from human and animal tissues comprising a sealed container for processing tissue with a system of channels and adapter fittings, in which, according to the invention, the container for processing tissue has a cone shape and is divided into two chambers by a microfilter system with a diameter pores of 10 - 500 ⁇ m, hermetically secured with a bayonet connection through a silicone pad, with one chamber serving to treat tissue and the other to concentrate cells, the container being covered with the inner surface is hydrophobic release coating, and to minimize the inner surface area has channels located in the thickness of the vessel wall, one of the channels goes into the tissue processing chamber and the other into the cell concentration chamber, and has a bacteriological filter to equalize the pressure.
  • Also described above is a method for isolating cell fractions from human and animal tissues using the proposed device, which includes decantation of lipoaspirate; delicate washing of lipoaspirate in buffer solutions; enzymatic treatment using a mixture of collagenases, thermolysin, dispase and trypsin at 37 ° C; centrifugation at 500 - 2000 g and filtration through microfilters with a pore size of 10 - 300 microns, followed by removal of admixtures of fat and stromal tissue; secondary washing and concentration of cell fraction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии и клеточной технологии. Предложен способ выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани, включающий: декантацию липоаспирата; деликатную отмывку липоаспирата в буферных растворах; ферментативную обработку с использованием смеси коллагеназ, термолизина, диспазы и трипсина при 37ºC; центрифугирование при 500-2000 g и фильтрацию через микрофильтры с размером пор 10-300 мкм с последующим удалением примесей жира и стромальной ткани; вторичную отмывку и концентрацию клеточной фракции, причем все стадии процесса выполняются в условиях замкнутой системы - устройства. Устройство представляет собой герметичный контейнер, состоящий из двух камер, разделенных между собой нейлоновыми микро-фильтрами с размерами пор 10-500 мкм. Устройство содержит штуцеры-переходники с клапанами и каналы для внесения и забора биологической ткани и конечного клеточного продукта для последующего введения. Благодаря наличию в стомально-васкулярной фракции коктейля зрелых и прогениторных клеток, их паракринного эффекта, обеспечению стерильности всех стадий процесса и безопасности применения способ может быть использован в медицине для клеточной терапии и регенерации органов и тканей, включая: регенерацию мягких тканей и костей, косметические дефекты, хронические трофические и лучевые язвы, ожоги, болезнь Крона, рассеянный склероз, при реакции трансплантат против хозяина, при инфаркте миокарда и инсультах различного генеза.

Description

УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ ИЗ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая группа изобретений относится к медицинской биотехнологии и клеточной технологии и предназначено для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных, а именно выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Подкожная жировая клетчатка является альтернативным костному мозгу источником стволовых и прогениторных клеток для регенеративной медицины. Основным преимуществом жировой ткани является малая инвазивность процедуры забора, минимальная болезненность, дискомфорт и риск для пациента. Жировая ткань обеспечивает значительно большее количество стволовых клеток по сравнению с костным мозгом. Костномозговой трансплантат содержит 0,006 - 0,06x 106 стволовых клеток на 100 мл, а число жизнеспособных стволовых и прогениторных клеток во фракции жировой ткани составляет примерно 0,5x 106 до 20x 106 клеток на 100 мл ткани.
Гетерогенную фракцию жировой ткани, отделенную от стромы и адипоцитов с использованием коллагеназ, принято называть стромально-васкулярной фракцией. Стромально-васкулярная фракция характеризуется значительной неоднородностью и вариабельностью клеточного состава в зависимости от состояния донора, его возраста и места забора биологического материала. После сортировки из стромально- васкулярной фракции могут быть выделены популяции клеток: эндотелиальные и гладкомышечные клетки, перициты, фибробласты, тучные клетки и преадипоциты. Интерес представляют клетки регенераторной фракции, а именно комплекса стволовых и прогениторных клеток жировой ткани (adipose derived stem cells, ADSCs). ADSCs имеют значительный потенциал к дифференцировке в адипоциты, хондроциты и остеобласты, миоциты, нейрональные клетки, кардиомиоциты и гепатоциты.
Клиническое применение стромально-васкулярной фракции включает регенерацию мягких тканей и костей, косметические дефекты, хронические трофические и лучевые язвы, ожоги, болезнь Крона, рассеянный склероз, при реакции трансплантат против хозяина, при инфаркте миокарда и инсультах различного генеза. Основными преимуществами использования данного типа клеток является легкий доступ к источнику клеток, большое количество и высокий выход на единицу объема ткани, высокую мультипотентность, сравнимую эффективность и безопасность относительно мезенхимальных клеток костного мозга. Кроме того, процедура липоаспирации широко используется, стандартизована, проста в исполнении в условиях процедурного кабинета и может быть проведена в течение короткого времени - порядка 90 минут. Таким образом, клеточные фракции, выделенные из жировой ткани могут быть выгодно использованы для клинической практики, и в том числе, исключая стадию культивирования.
Известен способ выделения стволовых клеток из жировой ткани с использованием ручного метода (Zuk Р.А., Zhu М., Mizuno Н. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001 ; 7(2): 211- 28.). Данный метод основан на обработке липоаспирата 0,075% раствором коллагеназы I типа при температуре 37°С в течение 30 минут и последующим центрифугированием получившейся суспензии при 800 д. После центрифугирования суспензия клеток разделяется на две фракции: в верхнем слое - супернатанте находятся адипоциты, а в осадке - стромально-васкулярная фракция с примесью эритроцитов, которые удаляли во время инкубации в лизирующем растворе хлорида аммония. Недостатками данного метода являются высокие временные и организационные затраты, наличие «человеческого фактора», высокий риск нарушения стерильности процесса и контаминации биологического материала и конечного продукта.
Технологии выделения развиваются в сторону автоматизации процесса.
Созданы автоматические и полуавтоматические системы выделения клеток.
Из предшествующего уровня техники известно устройство (System for processing lipoaspirate cells ЕР 1921133 A2, CYTORI THERAPEUTICS, INC (US), МПК A61K31/436, опубл. 14.05.2008), представляющее собой замкнутую систему для обработки липоаспирата, полученного в ходе липосакции. Система подсоединяется непосредственно к липоаспирационной канюле. Включает вакуумный насос, контейнер для сбора липоаспирата, миксер для смешивания обработанного биоматериала с добавками и активаторами, систему из двух фильтров с порами разного диаметра. Первый фильтр разделяет липоаспират на 2 фракции, где одна фракция содержит популяцию клеток, включающую в себя стволовые клетки жировой ткани, а другая фракция содержит липиды, кровь, адипоциты и солевой раствор. При этом первый фильтр вращается и конструктивно делит ёмкость на две камеры, для соответствующих фракций, а второй фильтр концентрирует клеточную фракцию перед подачей в миксер. Проводящая магистраль позволяет извлечь конечную фракцию, не нарушая герметичности системы и направить её в центрифугу, затем асептично извлечь полученную фракцию. Устройство позволяет вводить активаторы и добавки. Также система имеет встроенный контроллер температуры. Основным недостатком данного устройства является то, что на первом этапе обработки липоаспират фильтруется без обеспечения разрушения стромы ткани, которая фиксирует клетки стромально-васкулярной фракции и не позволяет им пройти через фильтр, снижая тем, самым концентрацию клеток в пермеате. Также недостатками системы являются магистрали большой протяженности и значительное количество примыканий, являющиеся средой для адгезии и потери целевых клеток.
Из предшествующего уровня техники известно устройство (Method and Apparatus for Separating a Material, US 20110251041 A1 , BIOMET BIOLOGICS, LLC (US), МПК B04B1/08, опубл. 13.10.2011), представляющее собой систему для сепарации многокомпонентного материала, по меньшей мере, на две фракции. Данное устройство представляет собой емкость, в виде полого цилиндра, разделенного клапаном на две неравные по объёму части. Функцией клапана является разграничение фракций разной плотности. Система содержит отстойник в основании конструкции с наклонными стенками, отделенный клапаном от основного объёма камеры. Клапан имеет коническую поверхность, включает в себя вставку, также имеющую коническую поверхность, между боковой стенкой и продольной осью цилиндра, коническая поверхность обращена углом вниз. Клапан содержит диск с отверстиями круглой формы и формы сектора. Клапан включает гибкую мембрану, активирующую его при возрастании гидравлического давления при центрифугировании, при повороте диска происходит сопоставление отверстий, обеспечивая, проницаемость клапана. Система укомплектована дополнительно измельчителем и вакуумным насосом, сообщающимся с разделительной камерой. При этом жировая ткань разделяется на три фракции. Первая фракция изолируется между клапаном и дном камеры и содержит клеточный материал. Вторая фракция изолируется между клапаном и верхним концом камеры и содержит жир. Третья фракция изолируется между компонентами клапана и включает туменесцентную жидкость. Основным недостатком данной системы является возможность заполнения фрагментами ткани элементов механического устройства, что влечет риск несрабатывания устройства, загрязнение конечной фракции компонентами исходного биоматериала. Обработка без обеспечения разрушения стромы ткани, которая фиксирует клетки стромально-васкулярной фракции и не позволяет им пройти через фильтр, снижая тем, самым концентрацию клеток в пермеате.
Из предшествующего уровня техники известно устройство (Regenerative cell extraction device WO 2013183797 A1 , HURIMBIOCELL CO., LTD (KR), МПК C12M1/10, опубл. 12.12.2013), представляющее собой емкость с дном конусовидной формы и вращающейся продольной осью, приводимой в движение от внешнего двигателя. На оси закрепляется изделие, состоящее из множества лепестков, которое оказывает непосредственное воздействие на липоаспират. Емкость снабжена патрубком для введения биоматериала и выделения тканевой фракции содержащей стволовые клетки. Недостатками данной системы является значительное механическое воздействие на клетки, что приводит к их разрушению и повреждению высвобожденными ферментами прочих клеток, загрязнение конечного продукта компонентами исходного липоаспирата, высокий риск микробиологической контаминации биоматериала за счет отсутствия асептических барьеров.
Из предшествующего уровня техники известно устройство (Device for separating adult stem cell US 20130344589 A1 , HUMAN MED AG (DE), МПК C12M1/00, опубл. 26.12.2013), представляющее собой систему, включающую контейнер для жировой ткани, снабженный устройством для подачи жидкости с целью отмывки биоматериала, смеси необходимых реагентов, попеременно с извлечением фракции содержащей стволовые клетки, клапаном для выравнивания давления, поршнем, вибратором, полупроницаемой мембраной имеющей электростатический заряд и клапаном, которые делят контейнер на 2 части, контроллером температуры. Одна из камер снабжена устройством для перемешивания исходного биоматериала с добавками, совершающего вращательные и/или маятниковые движения. Основным недостатком данного устройства является метод создания давления за счет поршня, что приводит высокой механической нагрузке на целевые клетки из-за продавливания через фильтр и краевого разрушения клеток в месте примыкания поршня к стенке цилиндра.
В качестве прототипа выбрано устройство для выделения стволовых клеток жировой ткани (System and methods for preparation of adipose-derived stem cells, US 20130012921 A1 , PUSTILNIK FELIX, МПК A61M37/00, опубл. 10.01.2013), представляющее собой конусовидную емкость, герметично закрытую крышкой, снабженную разъемами для введения и выведения биоматериала и жидкостей для его обработки, а также вспомогательную пробирку для концентрации, полученной стромально-васкулярной фракции. Недостатками данной системы являются наличие двух пробирок-емкостей, что увеличивает риск контаминации материала, его потери при перенесении между емкостями, влечет дополнительные требования к вспомогательному оборудованию. Кроме этого, в системе отсутствует разделение первичного липоаспирата на фракции, содержащие целевые клетки и побочные продукты обработки, загрязняющие конечный продукт. РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общей технической задачей настоящей группы изобретений является повышение эффективности и безопасности способа выделения клеток, расширение его функциональных возможностей и оптимизация процедуры выделения.
Общим техническим результатом предлагаемой группы изобретений является контролируемое выделение стромально-васкулярной фракции жировой ткани, характеризующейся высокой выживаемостью клеток, отсутствием дебриса, остатков стромальнои и жировой ткани и клеток циркулирующей крови, низкой концентрацией и активностью остаточных ферментов.
Поставленная техническая задача достигается за счет наличия в устройстве двух камер, разделенных между собой системой микрофильтров с различным диаметром пор; наличия изолированных каналов в стенке системы; наличия клапанов на штуцерах-переходниках для ввода биологического материала, внесения реагентов и промывочного буфера, отбора дебриса и остатков стромы жировой ткани, отбора конечного продукта; использования антиадгезионной обработки внутренней поверхности устройства и использования для заливки и отбора биологического материала шприца луер-лок с удлиненным носиком и увеличенной ручкой поршня.
Предложенное устройство представляет собой замкнутую герметичную систему в виде прозрачной конусовидной емкости объемом 150 - 300 мл, с нанесенной внешней градуировкой по объему, системой каналов и штуцеров-переходников, имеющих разъемы типа «луер-лок», причем емкость разделена многослойным фильтром на две камеры - рабочая камера для обработки ткани и камера для концентрирования клеток, причем рабочая камера имеет объем 145 - 299 мл, а камера для концентрирования имеет объем 1 - 5 мл.
Система фильтров представляет собой комплекс, по крайней мере, из 2-х нейлоновых фильтров диаметром от 10 мкм для нижнего фильтра до 500 мкм для верхнего фильтра, разделенных полимерными прокладками и помещенными в полимерный корпус, имеющий на своей окружности рычаги и запирающий элемент для байонетного соединения с емкостью. Система фильтров устанавливается в емкость в силиконовую прокладку посредством байонетного соединения, для этого место соединения фильтра с емкостью имеет секторные пазы.
Конусообразная форма емкости для обработки ткани и разделение её на две камеры системой микрофильтров с диаметром пор 10 - 500 мкм обеспечивает повышение эффективности, безопасности и экономичности способа выделения клеток. Устройство имеет изолированные каналы, расположенные в боковых стенках емкости, причем вход каждого канала имеет углубления и секторальные пазы для байонетного соединения со штуцерами-переходниками.
Устройство имеет канал для введения биологического материала, заканчивающийся пазом-углублением в рабочей камере для обработки ткани.
Устройство имеет канал для введения реагентов и промывочных буферов, заканчивающийся пазом-углублением в рабочей камере для обработки ткани.
Устройство имеет канал для отбора супернатанта, содержащего клеточный дебрис, остатки необработанной стромальной и жировой ткани, заканчивающийся у места крепления фильтра в рабочей камере для обработки ткани.
Устройство имеет канал для отбора конечного продукта - стромально- васкулярной фракции жировой ткани, заканчивающийся у основания емкости в камере для концентрирования клеток.
Устройство может иметь дополнительные каналы для внесения или отбора компонентов, заканчивающихся в рабочей камере для обработки ткани и/или в камере для концентрирования клеток.
Устройство имеет бактериологический фильтр для выравнивания давления внутри системы.
Устройство имеет крышку, причем крышка по своей окружности имеет запирающие элементы и соединяется с емкостью через силиконовую прокладку посредством байонет соединения или резьбы.
Крышка устройства может иметь отверстия для каждого из каналов и бактериологического фильтра.
Крышка может соединяться с емкостью через силиконовую прокладку посредством стальных болтов, для этого емкость имеет соответствующие отверстия с резьбой.
Устройство имеет штуцеры-переходники для каждого из каналов. Каждый штуцер-переходник имеет обратный клапан. Каждый штуцер-переходник имеет резьбу типа «луер-лок» для соединения со шприцем. Каждый штуцер-переходник имеет навинчивающуюся крышку. Каждый штуцер-переходник имеет силиконовые прокладки для обеспечения герметичности при соединении с емкостью. Каждый штуцер- переходник имеет запирающий элемент для соединения с емкостью. Каждый штуцер- переходник соединяется с емкостью через крышку и силиконовую прокладку посредством байонетного соединения.
Устройство может иметь кожух-чехол, причем кожух-чехол соединяется с емкостью посредством байонет соединения или резьбы. Устройство может иметь ножки в виде лопастей, являющиеся подставкой для емкости.
Устройство может иметь пазы для закрепления на бакет-роторе центрифуги. В этом случае устройство снабжают внутренней стальной арматурой по ходу пазов.
Внутреннюю поверхность устройства покрывают органосиликоновой и/или агарозной пленкой с целью придания поверхности гидрофобных и антиадгезивных свойств. Для этого стерильную и обезжиренную систему высушивают и обрабатывают внутренние поверхности системы и каналы 0,1-10% раствором полидиметилсилоксана в хлороформе и/или 0,1-5% раствором агарозы. Обработанную систему помещают на 1-5 часов в сушильный шкаф при температуре 100°С— 300°С.
Устройство может имеет шприц типа «луер-лок» (на чертежах не показано) объемом 50 - 200 мл с удлиненным носиком, завинчивающейся крышкой и увеличенной ручкой поршня для внесения биологического материала и отбора супернатанта и конечного продукта.
Все компоненты устройства, включая емкость, крышку, штуцеры-переходники, крышки штуцеров-переходников, корпус системы фильтров и прокладки системы фильтров изготавливаются из поликарбоната и/или полипропилена и/или полиэтилена и/или фторопласта. Прокладки и клапаны изготавливаются из силикона и/или резины.
Способ выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани из липоаспирата по настоящему изобретению включает следующие стадии:
-декантацию и отмывку липоаспирата от остатков крови, причем декантацию осуществляют в течение 10 - 30 минут, причем отмывку липоаспирата проводят физиологическим раствором и/или сбалансированным солевым раствором Хенкса и/или средой Игла в модификации Дульбеко при температуре 37°С, причем отмывку липоаспирата проводят 1 - 5 раз;
-ферментативную обработку липоаспирата смесью ферментов состоящую из коллагеназы I и/или коллагеназы II и/или термолизина и/или диспазы и/или трипсина, причем обработку проводят при 37°С в условиях термостата, причем обработку проводят при перемешивании на шейкере при 10 - 200 об./мин, причем обработку проводят в течение 30 - 60 минут;
-сепарирование стромально-васкулярной фракции от клеточного дебриса и остатков стромы жировой ткани, причем сепарирование осуществляют в условиях центрифугирования при 500 - 2000 д, причем центрифугирование проводят в течение 15 - 45 минут;
-удаление клеточного дебриса и остатков стромы жировой ткани; -отмывку конечного продукта от остатков ферментов, причем отмывку проводят физиологическим раствором и/или сбалансированным солевым раствором Хенкса и/или средой Игла в модификации Дульбеко при температуре 37°С, причем отмывку конечного продукта проводят 1 - 5 раз;
-концентрирование стромально-васкулярной фракции, причем концентрирование осуществляют в условиях центрифугирования при 500 - 2000 д, причем центрифугирование проводят в течение 15 - 45 минут;
-причем все стадии способа осуществляют в устройстве по настоящему изобретению;
-причем внесение биологического материала и отбор биологического материала из устройства осуществляют с использованием шприца для внесения и отбора биологического материала.
Выделенная стромально-васкулярная фракция жировой ткани может применяться в биологии и медицине в качестве клеточного элемента для создания тканеинженерных конструкций на основе синтетических и природных материалов.
Выделенная стромально-васкулярная фракция жировой ткани может применяться в биологии и медицине для использования в качестве клеточного аутотрансплантата для замещения и регенерации дефектов твердых и мягких тканей, путем введения стромально-васкулярной фракции жировой ткани в твердые и/или мягкие ткани
Таким образом, биологическая ткань, помещенная в систему, отмывается от остатков циркулирующей крови; подвергается ферментативной обработке смесью коллагеназ I и II, термолизина, диспазы и трипсина, за счет чего происходит лизис стромальной ткани и выход стромально-васкулярной фракции в среду. На следующем этапе происходит разделение клеточного компонента и остатков стромальной и жировой ткани центрифугированием через систему фильтров с различным размером пор с последующей отмывкой клеточной фракции от остаточных ферментов и ее концентрирование. За счет обработки внутренней поверхности антиадгезивными средами остатки циркулирующей крови и клеточная фракция не прилипают к стенкам системы и полностью отмываются во время процедуры. За счет использования смеси ферментов происходит полный лизис стромальной ткани и выход стромально- васкулярной фракции в среду. За счет наличия системы фильтров с различным диаметром пор происходит оптимальное выделение клеточной фракции без примесей стромальной и жировой ткани. Наличие каналов ввода - вывода с выходами на разном уровне внутри стенки системы позволяет минимизировать общую площадь внутренней поверхности системы, что снижает риск адгезии клеток на поверхности трубок; позволяет контролируемо пристеночно вносить биологический материал и реактивы, что снижает физическое воздействие на биологический материал и повышает степень выживаемости клеток; позволяет полностью отбирать супернатант с остатками стромы жировой ткани, не затрагивая осадок; позволяет полностью отбирать осадок в виде стромально-васкулярной фракции жировой ткани. Наличие входных клапанов на каналах обеспечивает стерильность процессов происходящих внутри системы. Использование в качестве основного материала прозрачного пластика позволяет визуально контролировать процесс выделения клеток, внесение биологического материала и реактивов, отбор супернатанта с остатками стромальной и жировой ткани и отбор конечной стромально-васкулярной фракции. Наличие градуировки на поверхности системы позволяет визуально контролировать объем вносимого биологического материала и реактивов. Использование шприца с удлиненным носиком позволяет удобно вносить и отбирать биологический материал и реагенты без риска контаминации материала и пролива жидкостей вне системы.
Стромально-васкулярная фракция жировой ткани, выделенная с использованием заявленного изобретения может применяться для создания тканеинженерных конструкций на основе синтетических и природных материалов; для использования в качестве клеточного аутотрансплантата; в качестве способа лечения, репарации или замещения ткани, включающий введение стромально-васкулярной фракции жировой ткани в твердые и/или мягкие ткани.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 - изображено устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных в развернутом виде устройство.
На Фиг. 2 - изображено устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных в развернутом виде в разрезе.
На Фиг. 3 - изображено устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных в собранном виде.
На Фиг. 4 - изображено устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных в собранном виде в разрезе.
На Фиг. 5 - изображено устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных (вид сверху).
На Фиг. 6 - изображен монослой клеток в культуре рО (пассаж Ns1), 5-е сутки. Фазовый контраст (увеличение х10).
На Фиг. 7 - изображен монослой клеток в культуре р1 (пассаж N°1), 5-е сутки.
Фазовый контраст (увеличение х10). ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг 1. изображено устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных в развернутом виде; на фиг 2 изображено устройство в развернутом виде в разрезе; на фиг 3 изображено устройство в собранном виде; на фиг 4 изображено устройство в собранном виде в разрезе; на фиг 5 изображено устройство (вид сверху). На фиг.6. приведена микрофотография монослоя клеток в культуре рО (пассаж N°1), 5-е сутки. Фазовый контраст. Увеличение х10; на фиг.7. приведена микрофотография монослоя клеток в культуре р1 (пассаж N°1), 5-е сутки. Фазовый контраст. Увеличение х10.
Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных представляет собой замкнутую герметичную систему в виде прозрачной конусовидной емкости (А) с нанесенной внешней градуировкой по объему (3), совокупностью каналов (2.1 , 2.2, 2.3, 2.4) и штуцеров-переходников (1), имеющих разъемы типа «луер-лок», закрепленную в прозрачный кожух-чехол (С) посредством байонетного соединения (4); причем емкость разделена системой микрофильтров (D) на две камеры - рабочая камера для обработки ткани (В) и камера для концентрирования клеток (Е).
Система микрофильтров представляет собой совокупность по крайней мере из двух нейлоновых микрофильтров (9), разделенных полимерными прокладками (10) и помещенными в полимерный корпус, содержащий верхнюю часть - силиконовую прокладку (8) и основание (11), имеющий на своей окружности рычаги и запирающий элемент (12) для соединения с камерой обработки ткани (В) и камерой для концентрирования клеток (Е). Система микрофильтров устанавливается в емкость в силиконовую прокладку (8). Устройство имеет изолированные каналы (2.1 , 2.2, 2.3, 2.4), расположенные в боковых стенках емкости, причем вход каждого канала имеет углубления и секторальные пазы (на чертежах устройства отсутствует) для байонетного соединения со штуцерами-переходниками. Устройство имеет бактериологический фильтр (5) для выравнивания давления внутри системы. Устройство имеет крышку (F) по крайней мере с одним отверстием, причем крышка по своей окружности имеет запирающие элементы и соединяется с емкостью через силиконовую прокладку (7) посредством байонетного соединения или резьбы (13). Устройство имеет штуцеры-переходники (1) для каждого из каналов. Устройство имеет подставку-кожух (С) с ножками в виде лопастей (6).
ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА
Приведенный пример не предназначен для ограничения изобретения, предложен исключительно в качестве иллюстрации. В общем виде работа устройства представляет собой процесс постадийной отмывки и обработки жировой ткани протеолитическими ферментами с целью выделения стромально-васкулярной фракции, где жировую ткань - липоаспират вносят в устройство - герметичную емкость (А), а именно в камеру для обработки ткани (В) через канал (2.1), посредством соединения шприца с биологическим материалом со штуцером-переходником (1). Биологическая ткань отмывается от остатков крови в буферном растворе, внесенном через канал (2.2). Излишки жидкости удаляются из системы через канал (2.4). Биологическая ткань подвергается ферментативной обработке смесью протеолитических ферментов, внесенных через канал (2.2). Устройство подвергается центрифугированию при котором стромально- васкулярная фракция проходит через систему микрофильтров (D) в камеру для концентрирования клеток (Е). Излишки жидкости удаляются через канал (2.3), осадок отмывается от остатков ферментов буферным раствором. Конечная стромально- васкулярная фракция отбирается через канал (2.4).
Работу выполняли на 3 образцах липоаспирата, полученного в результате операции по липосакции. Липоаспират собирали в шприцы типа с замком «луер-лок» объемом 50 мл. Липоаспират в объеме 100 мл аккуратно по стенке вносили в систему в камеру для обработки ткани (В) через канал (2.1), посредством соединения шприца (на рисунке не показан) со штуцером переходником (тип 1 ) и плотно закрывали крышку штуцера переходника. Вносили сбалансированный солевой раствор Хэнкса в объеме 100 мл через канал (2.2) посредством соединения шприца с буфером (на рисунке не показан) со штуцером переходником (тип 1) и плотно закрывали крышку штуцера переходника. Систему помещали в термостатируемую при 37°С камеру с шейкером со скоростью вращения 100-150 об./мин на 15-20 минут для промывки биологического материала. Систему центрифугировали при 500 g в течение 10 мин. Не переворачивая систему, с помощью шприца аккуратно отбирали осадок через канал (2.4) в объеме 100 мл и плотно закрывали крышку. Повторяли цикл промывки три раза. Вносили смесь коллагеназы I, коллагеназы II, термолизина, диспазы и трипсина в общем объеме 10 мл через канал (2.2) посредством соединения шприца (на рисунке не показан) со штуцером переходником (тип 1) и плотно закрывали крышку штуцера переходника. Вносили сбалансированный солевой раствор Хэнкса в объеме 90 мл через канал (2.2) посредством соединения шприца (на рисунке не показан) со штуцером переходником (тип 1) и плотно закрывали крышку штуцера переходника. Систему помещали в термостатируемую при 37°С камеру с шейкером со скоростью вращения 100-150 об./мин на 45 минут для ферментативной обработки биологического материала. Систему центрифугировали при 1000 g в течение 30 мин. Не переворачивая систему, с помощью шприца аккуратно отбирали примеси жира, стромы, дебриса и остатков эритроцитов через канал (2.3) в объеме 190 мл, посредством соединения шприца (на рисунке не показан) со штуцером переходником (тип 1) и плотно закрывали крышку штуцера переходника. Вносили сбалансированный солевой раствор Хэнкса в объеме 190 мл через канал (2.2) посредством соединения шприца (на рисунке не показан) со штуцером переходником (тип 1) и плотно закрывали крышку штуцера переходника. Систему центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Процедуру промывки повторяли три раза. Не переворачивая систему, с помощью шприца аккуратно отбирали примеси жира, стромы и дебриса через канал (2.3) в объеме 190 мл и плотно закрывали крышку. С помощью шприца вносили 10 мл аутосыворотки пациента через канал (2.2). Систему помещали в термостатируемую при 37°С камеру с шейкером со скоростью вращения 100-150 об./мин на 5 минут для инактивации ферментов. Систему центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Отбирали стромально-васкулярную фракцию через канал (2.4) в объеме 2 мл.
Полученную первичную культуру клеток стромально-васкулярной фракции характеризовали по жизнеспособности клеточных элементов и экспрессии поверхностных маркеров - CD90, CD105, CD73, CD34, CD11b, CD19, CD45, CD44 сразу после выделения, на первом и втором пассажах.
Были проанализированы не менее 100 000 событий для каждого образца. После обработки и центрифугирования клеточной суспензии согласно протоколу проводили анализ прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния в целях определения размеров изучаемых объектов и наличия внутриклеточных включений.
Выделенная фракция характеризуется «чистотой» событий и низким содержанием дублей и дебриса. По оптическим характеристикам были определены лимфоцитарно-моноцитарный гейт и целевая фракция клеток. Так, было показано, что на 47 264 события отдельные клетки составляли 92%, что в абсолютных величинах составляет 43 487 события; дубли (слипшиеся клетки) - 1 ,4%, а дебрис (остатки клеток в образце) и эритроциты лишь 6,2%. Из общего пула единичных событий лимфоцитарно-моноцитарный гейт составил 91 ,8%, а целевая фракция - 7,5%. В то же время, общая концентрация клеток стромально-васкулярной фракции в образце в пересчете на единицу объема составила 66 000 клеток на 100 мкл.
Для выявления и анализа регенераторной фракции в выделенном образце использовали общепринятые маркеры зрелых стволовых клеток - CD90, CD73, CD105, CD44.
Результаты эксперимента показали, что выделенная фракция содержит до 20%
CD 90 позитивных клеток, 0,24% CD105 позитивных клеток, не менее 0,01% CD44 позитивных клеток. Экспрессия эндоглина (CD 105) характерна для МСК после пассирования, однако данный маркер может экспрессироваться и на прогениторных клетках - «мезенхимоангиобластах». Таким образом, процентное содержание регенераторных клеток в выделенной стромально-васкулярной фракции составляет 0,5%.
Был проведен анализ жизнеспособности клеточной фракции, включающей подсчет клеток, находящихся в состоянии апоптоза и подсчет мертвых клеток. Исследование выполнено с использованием теста, основанного на использовании аннексина V (Annexin V меченый FITC), аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания апоптотических клеток. Результаты аннексинового теста показали, что в исследуемой фракции клеток 1 ,02% находится в состоянии апоптоза, 0,04% разрушенных и 98,94% живых клеток.
После пассирования клеток наблюдали стойкое увеличение экспрессии CD 90 и CD 105, что характерно для мезенхимальных стромаьных клеток в культуре. На пятые сутки каждого пассажа клетки достигали 100% конфлюэнтности (монослоя), что продемонстрировано на фиг.З и фиг.4
Таблица 1. Результаты окраски на маркёры Human MSC AnalysisKit (BD, cat#562245) (CD90, CD105, CD73, CD34, CD1 1b, CD19, CD45, CD44)
Figure imgf000015_0001
P0 - пассаж 0 (фиг.6).
P1 - пассаж 1 (фиг.7).
P2 - пассаж 2 (на фигурах не показано).
Выше, было описано устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных содержащее герметичную емкость для обработки ткани с системой каналов и штуцеров-переходников, в котором, согласно изобретению, емкость для обработки ткани имеет конусообразную форму и разделена на две камеры системой микрофильтров с диаметром пор 10 - 500 мкм, герметично закрепленной байонетным соединением через силиконовую прокладку, причем одна камера служит для обработки ткани, а другая для концентрирования клеток, причем емкость покрыта с внутренней поверхности гидрофобным антиадгезивным покрытием, а для минимизации площади внутренней поверхности имеет каналы, расположенные в толще стенки емкости, причем один из каналов выходит в камеру обработки ткани, а другой в камеру концентрирования клеток, а с целью выравнивания давления имеет бактериологический фильтр.
Выше был также описан способ выделения клеточных фракций из тканей человека и животных с использованием предлагаемого устройства, который включает декантацию липоаспирата; деликатную отмывку липоаспирата в буферных растворах; ферментативную обработку с использованием смеси коллагеназ, термолизина, диспазы и трипсина при 37°С; центрифугирование при 500 - 2000 g и фильтрацию через микрофильтры с размером пор 10 - 300 мкм с последующим удалением примесей жира и стромальной ткани; вторичную отмывку и концентрацию клеточной фракции
Хотя настоящее изобретение было подробно описано на примерах вариантов, которые представляются предпочтительными, необходимо помнить, что эти примеры осуществления изобретения приведены только в целях иллюстрации изобретения. Данное описание не должно рассматриваться как ограничивающее объем изобретения, поскольку в этапы описанных способов и устройств специалистами в области медицинской биотехнологии и клеточной технологии и др. могут быть внесены изменения, направленные на то, чтобы адаптировать их к конкретным устройствам или ситуациям, и не выходящие за рамки прилагаемой формулы изобретения. Специалисту в данной области понятно, что в пределах сферы действия изобретения, которая определяется пунктами формулы изобретения, возможны различные варианты и модификации, включая эквивалентные решения.
ССЫЛКИ
1. System for processing lipoaspirate cells ЕР 1921133 A2
2. Method and Apparatus for Separating a Material US 20110251041 A1
3. Regenerative cell extraction device WO 2013183797 A1
4. Device for separating adult stem cell US 20130344589 A1
5. System and methods for preparation of adipose-derived stem cells, US 20130012921 A1 , WO 2014011213 A1

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных содержащее герметичную емкость для обработки ткани с системой каналов и штуцеров-переходников, отличающееся тем, что емкость для обработки ткани имеет конусообразную форму и разделена на две камеры системой микрофильтров с диаметром пор 10 - 500 мкм, герметично закрепленной байонетным соединением через силиконовую прокладку, причем одна камера служит для обработки ткани, а другая для концентрирования клеток, причем емкость покрыта с внутренней поверхности гидрофобным антиадгезивным покрытием, и имеет каналы, расположенные в толще стенки емкости, причем один из каналов выходит в камеру обработки ткани, а другой в камеру концентрирования клеток, при этом емкость также имеет бактериологический фильтр.
2. Устройство по п.1 отличающееся тем, что имеет ножки в виде лопастей в нижней части конуса.
3. Устройство по п.1 отличающееся тем, что имеет пазы для закрепления на бакет-роторе центрифуги, причем устройство снабжено внутренней стальной арматурой по ходу пазов.
4. Устройство по п.1 отличающееся тем, что имеет насосы для подачи жидкостей и отбора клеток.
5. Способ выделения клеточных фракций из тканей человека и животных с использованием устройства по любому из пп.1-4 включающий декантацию липоаспирата; деликатную отмывку липоаспирата в буферных растворах; ферментативную обработку с использованием смеси коллагеназ, термолизина, диспазы и трипсина при 37°С; центрифугирование при 500 - 2000 g и фильтрацию через микрофильтры с размером пор 10 - 300 мкм с последующим удалением примесей жира и стромальной ткани; вторичную отмывку и концентрацию клеточной фракции.
6. Стромально-васкулярная фракция жировой ткани, полученная с использованием устройства, по п.1.
7. Стромально-васкулярная фракция жировой ткани по п.6 для создания тканеинженерных конструкций на основе синтетических и природных материалов.
8. Стромально-васкулярная фракция жировой ткани по п.6 для использования в качестве клеточного аутотрансплантата.
9. Способ лечения, репарации или замещения ткани, включающий введение стромально-васкулярнои фракции жировой ткани по п.6 в твердые и/или мягкие ткани.
PCT/RU2015/000738 2015-11-03 2015-11-03 Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения WO2017078563A1 (ru)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES15907892T ES2837096T3 (es) 2015-11-03 2015-11-03 Dispositivo para aislar fracciones celulares de tejidos humanos y animales y procedimiento para su uso
IL259095A IL259095B (en) 2015-11-03 2015-11-03 A device for isolating cell segments from human and animal tissues and a method for using it
PL15907892T PL3372669T3 (pl) 2015-11-03 2015-11-03 Urządzenie do izolowania frakcji komórkowych z tkanek ludzkich i zwierzęcych i sposób jego stosowania
PCT/RU2015/000738 WO2017078563A1 (ru) 2015-11-03 2015-11-03 Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения
KR1020187015690A KR102143286B1 (ko) 2015-11-03 2015-11-03 인간 및 동물 조직으로부터 세포 분획을 단리하기 위한 장치 및 그 사용 방법
EP15907892.2A EP3372669B1 (en) 2015-11-03 2015-11-03 Device for isolating cell fractions from human and animal tissues and method for the use thereof
EA201891056A EA037537B1 (ru) 2015-11-03 2015-11-03 Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2015/000738 WO2017078563A1 (ru) 2015-11-03 2015-11-03 Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2017078563A1 true WO2017078563A1 (ru) 2017-05-11
WO2017078563A8 WO2017078563A8 (ru) 2018-05-17

Family

ID=58662531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2015/000738 WO2017078563A1 (ru) 2015-11-03 2015-11-03 Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP3372669B1 (ru)
KR (1) KR102143286B1 (ru)
EA (1) EA037537B1 (ru)
ES (1) ES2837096T3 (ru)
IL (1) IL259095B (ru)
PL (1) PL3372669T3 (ru)
WO (1) WO2017078563A1 (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019068271A1 (en) * 2017-10-03 2019-04-11 Bellemed Innovations S.R.O. DEVICE FOR SEPARATING FLUID BIOLOGICAL MATERIAL, SEPARATION FLOAT AND KIT
WO2021214159A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Cellunite Gmbh System and method for automated cell processing
WO2021214162A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Cellunite Gmbh Modular cell processing
WO2023001910A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Cellunite Gmbh System and method for cell processing
CN117305077A (zh) * 2023-09-25 2023-12-29 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 一种全封闭式组织解离方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202000002599A1 (it) * 2020-02-10 2021-08-10 Promoitalia Group Spa “siringa dotata di mezzi per la separazione selettiva dei componenti di una miscela eterogenea multifase, in particolare delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo, kit relativo, e metodo per il suo impiego”
KR102566931B1 (ko) * 2020-07-23 2023-08-16 주식회사 퍼비스코리아 줄기세포 분리용 다단 세척제 용기, 이를 포함하는 다단 줄기세포 분리장치 및 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5372945A (en) * 1985-06-06 1994-12-13 Alchas; Paul G. Device and method for collecting and processing fat tissue and procuring microvessel endothelial cells to produce endothelial cell product
US20010047966A1 (en) * 1991-12-02 2001-12-06 Qiagen Gmbh Process and a device for the isolation of cell components such as nucleic acids from natural sources
RU2252252C1 (ru) * 2004-04-09 2005-05-20 Тепляшин Александр Сергеевич Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток
WO2012148350A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 General Electric Company Automated systems and methods for isolating regenerative cells from adipose tissue

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008027146B4 (de) * 2008-06-02 2012-01-19 Ing. Erich Pfeiffer Gmbh Austragvorrichtung
WO2013106655A1 (en) * 2012-01-11 2013-07-18 The Gid Group, Inc. Method for processing adipose tissue and processing apparatus
EP2834344B1 (en) * 2012-09-06 2016-07-20 The GID Group, Inc. Tissue processing apparatus and method for processing adipose tissue
US10336980B2 (en) * 2013-09-05 2019-07-02 The Gid Group, Inc. Tissue processing apparatus and method for processing adipose tissue

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5372945A (en) * 1985-06-06 1994-12-13 Alchas; Paul G. Device and method for collecting and processing fat tissue and procuring microvessel endothelial cells to produce endothelial cell product
US20010047966A1 (en) * 1991-12-02 2001-12-06 Qiagen Gmbh Process and a device for the isolation of cell components such as nucleic acids from natural sources
RU2252252C1 (ru) * 2004-04-09 2005-05-20 Тепляшин Александр Сергеевич Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток
WO2012148350A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 General Electric Company Automated systems and methods for isolating regenerative cells from adipose tissue

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIMBLE J.M. ET AL.: "Concise Review: Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells and Stem Cells: Let's Not Get Lost in Translation", STEM CELLS, vol. 29, no. 5, 19 April 2011 (2011-04-19), pages c749 - 754, XP055382306 *
KOPTEVA V. B.: "Opory vertikalnykh i gorizontalnykh apparatov", METODICHESKIE UKAZANIA, 2005, pages 1, 2, XP009506403 *
See also references of EP3372669A4 *
YUAN S. ET AL.: "Evaluation of embryonic age and the effects of different proteases on the isolation and primary culture of chicken intestinal epithelial cells in vitro", ANIMAL SCIENCE JOURNAL, vol. c. 1-7, 2014, pages 1,4, XP055487364 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019068271A1 (en) * 2017-10-03 2019-04-11 Bellemed Innovations S.R.O. DEVICE FOR SEPARATING FLUID BIOLOGICAL MATERIAL, SEPARATION FLOAT AND KIT
US20200289720A1 (en) * 2017-10-03 2020-09-17 Bellemed Innovations S.R.O. Device for separation of fluid biological material, a separating float and a kit
US11666694B2 (en) 2017-10-03 2023-06-06 Bellemed Innovations S.R.O. Device for separation of fluid biological material, a separating float and a kit
WO2021214159A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Cellunite Gmbh System and method for automated cell processing
WO2021214162A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Cellunite Gmbh Modular cell processing
WO2023001910A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Cellunite Gmbh System and method for cell processing
CN117305077A (zh) * 2023-09-25 2023-12-29 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 一种全封闭式组织解离方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102143286B1 (ko) 2020-08-10
EP3372669A4 (en) 2019-07-24
IL259095A (en) 2018-06-28
PL3372669T3 (pl) 2021-01-25
EP3372669A1 (en) 2018-09-12
ES2837096T3 (es) 2021-06-29
EA201891056A1 (ru) 2018-10-31
IL259095B (en) 2022-08-01
KR20180073688A (ko) 2018-07-02
WO2017078563A8 (ru) 2018-05-17
EA037537B1 (ru) 2021-04-09
EP3372669B1 (en) 2020-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3372669B1 (en) Device for isolating cell fractions from human and animal tissues and method for the use thereof
US9463203B2 (en) Methods of using regenerative cells in the treatment of cartilage defects
US10967110B2 (en) System and methods for preparation of adipose-derived stem cells
EP2702144B1 (en) Automated systems and methods for isolating regenerative cells from adipose tissue
AU2004260937B2 (en) Systems and methods for separating and concentrating regenerative cells from tissue
US20150152375A1 (en) Systems and methods for isolating and using clinically safe adipose derived regenerative cells
JP6452695B2 (ja) 骨髄脂肪部分単離のデバイスおよび方法
EP1765980A1 (en) Systems and methods for isolating and using clinically safe adipose derived regenerative cells
EP2980206A1 (en) Methods of using regenerative cells in the treatment of musculoskeletal disorders
CN111542350B (zh) 用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法
US20190224245A1 (en) System and Methods for Preparation of Adipose-Derived Stem Cells
RU2620304C2 (ru) Устройство для выделения клеточных фракций из тканей человека и животных и способ его применения
Ferroni et al. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells
RU173796U1 (ru) Устройство для фракционирования жировой ткани и выделения из нее стромально-васкулярной фракции для применения в регенеративной медицине
WO2018160096A1 (ru) Устройство для фракционирования жировой ткани и выделения из нее стромально-васкулярной фракции для применения в регенеративной медицине
KR101440754B1 (ko) 세포 농축형 분리기 및 분리 방법
US20240016851A1 (en) System and Methods for Preparation of Adipose-Derived Stem Cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15907892

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 259095

Country of ref document: IL

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201891056

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: CR2018-000300

Country of ref document: CR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20187015690

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015907892

Country of ref document: EP