JP2003144149A - 分離装置及びその使用方法 - Google Patents
分離装置及びその使用方法Info
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
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- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
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- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
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- C07K—PEPTIDES
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来のトラップ装置を改良し、その新たな分
離装置を利用する核酸の分離精製方法、該方法に使用す
るキットを提供する。 【解決手段】 トラップ装置と強制分散設備からなるこ
とを特徴とする分離装置。トラップ装置を使用する核酸
の分離精製方法において、該トラップ装置を用いる処理
の少なくとも一つの処理に前記分離装置を用いる核酸の
分離精製方法。核酸吸着能を有する物質を構成の必須要
件とする核酸の分離精製方法、又は該方法に使用するキ
ット。
離装置を利用する核酸の分離精製方法、該方法に使用す
るキットを提供する。 【解決手段】 トラップ装置と強制分散設備からなるこ
とを特徴とする分離装置。トラップ装置を使用する核酸
の分離精製方法において、該トラップ装置を用いる処理
の少なくとも一つの処理に前記分離装置を用いる核酸の
分離精製方法。核酸吸着能を有する物質を構成の必須要
件とする核酸の分離精製方法、又は該方法に使用するキ
ット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は分離装置、及びその
核酸の分離、精製へ利用等に関する。
核酸の分離、精製へ利用等に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学技術の進歩により、遺伝情報
の担い手である核酸を対象とした研究が進んでいる。核
酸はＲＮＡとＤＮＡとに大別でき、更にその機能によっ
て数種に分類することができる。例えば、プラスミドは
宿主の染色体とは別に細胞内で自己増殖を行う寄生性レ
プリコンであり、組換えDNA 実験において広くベクター
（遺伝子の運び屋）として使用されている。その精製法
として一般的なものは、バームボイムＨ．Ｃ．及びドリ
ーＪ．のアルカリ溶菌法〔Birmboim,H.C. 、Doly,J. 、
ヌクレイック アシッズ リサーチ（ Nucleic Acids R
esearch)、第７巻、第1513〜1523頁(1979)〕やホルムス
Ｄ．Ｓ．ほかによる煮沸法〔Holmes,D.S.et al.、アナ
リチカル バイオケミストリー（ Analytical Biochemi
stry）、第１１４巻、第１９３頁(1981)〕等である。一
方、生物本来の機能を調べるために、各生物の本来の遺
伝情報をコードしたいわゆるゲノムＤＮＡを対象とした
研究も盛んである。現在ゲノムＤＮＡの精製方法として
様々な手法が開発されており、例えば、動物などの有核
細胞からのDNA の抽出、精製は、マーマーＮ．及びスタ
フォードＤ．Ｗ．の方法〔Marmur,N.,Stafford,D.W. 、
ヌクレイック アシッズ リサーチ、第３巻、第２３０
３頁（１９７５）〕や、その変法〔１９８２年、コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マ
ニアスティス（T.Maniastis ）ほか著、モレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning ，A Laboratory Manual)第８６〜９６頁〕
等が利用されている。上記の方法は、細胞内に混在して
いる他の成分、例えば、タンパクなどを除去するために
フェノール、クロロホルム等の危険な溶剤を使用しなけ
ればならず、現在この問題を解決するために様々な方法
が開発されている。例えば、塩酸グアニジンを溶解した
緩衝液と該緩衝液中で核酸を選択的に吸着する溶媒不溶
性担体を用いることにより、タンパクを変成させ核酸を
担体に吸着させることにより核酸の精製を行う方法が挙
げられる。
の担い手である核酸を対象とした研究が進んでいる。核
酸はＲＮＡとＤＮＡとに大別でき、更にその機能によっ
て数種に分類することができる。例えば、プラスミドは
宿主の染色体とは別に細胞内で自己増殖を行う寄生性レ
プリコンであり、組換えDNA 実験において広くベクター
（遺伝子の運び屋）として使用されている。その精製法
として一般的なものは、バームボイムＨ．Ｃ．及びドリ
ーＪ．のアルカリ溶菌法〔Birmboim,H.C. 、Doly,J. 、
ヌクレイック アシッズ リサーチ（ Nucleic Acids R
esearch)、第７巻、第1513〜1523頁(1979)〕やホルムス
Ｄ．Ｓ．ほかによる煮沸法〔Holmes,D.S.et al.、アナ
リチカル バイオケミストリー（ Analytical Biochemi
stry）、第１１４巻、第１９３頁(1981)〕等である。一
方、生物本来の機能を調べるために、各生物の本来の遺
伝情報をコードしたいわゆるゲノムＤＮＡを対象とした
研究も盛んである。現在ゲノムＤＮＡの精製方法として
様々な手法が開発されており、例えば、動物などの有核
細胞からのDNA の抽出、精製は、マーマーＮ．及びスタ
フォードＤ．Ｗ．の方法〔Marmur,N.,Stafford,D.W. 、
ヌクレイック アシッズ リサーチ、第３巻、第２３０
３頁（１９７５）〕や、その変法〔１９８２年、コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マ
ニアスティス（T.Maniastis ）ほか著、モレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning ，A Laboratory Manual)第８６〜９６頁〕
等が利用されている。上記の方法は、細胞内に混在して
いる他の成分、例えば、タンパクなどを除去するために
フェノール、クロロホルム等の危険な溶剤を使用しなけ
ればならず、現在この問題を解決するために様々な方法
が開発されている。例えば、塩酸グアニジンを溶解した
緩衝液と該緩衝液中で核酸を選択的に吸着する溶媒不溶
性担体を用いることにより、タンパクを変成させ核酸を
担体に吸着させることにより核酸の精製を行う方法が挙
げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】核酸の精製は現在の遺
伝子操作の基本であるが、時間の浪費を伴うものであ
り、加えてこれらの手法により多種の試料の核酸の精製
を手動で行う際には微量であっても熟練が必要とされ、
実験者による回収量や純度の差が見られる。これらの問
題を解決するために公知の方法を自動化した機器も発売
されているが、プラスミドＤＮＡ等対象試料が限定され
る、処理試料数が少ない、回収量が安定しない、設置場
所を取る、精製に時間を要する、高価である等の各装置
が採用した核酸精製法及び該装置機構に起因する問題を
有していた。本発明の目的は、従来のトラップ装置を改
良し、その新たな分離装置を利用する核酸の分離精製方
法、該方法に使用するキットを提供することにある。
伝子操作の基本であるが、時間の浪費を伴うものであ
り、加えてこれらの手法により多種の試料の核酸の精製
を手動で行う際には微量であっても熟練が必要とされ、
実験者による回収量や純度の差が見られる。これらの問
題を解決するために公知の方法を自動化した機器も発売
されているが、プラスミドＤＮＡ等対象試料が限定され
る、処理試料数が少ない、回収量が安定しない、設置場
所を取る、精製に時間を要する、高価である等の各装置
が採用した核酸精製法及び該装置機構に起因する問題を
有していた。本発明の目的は、従来のトラップ装置を改
良し、その新たな分離装置を利用する核酸の分離精製方
法、該方法に使用するキットを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はトラップ装置と強制分散設備からな
ることを特徴とする分離装置に関する。本発明の第２の
発明は、トラップ装置を使用する核酸の分離精製方法に
おいて、該トラップ装置を用いる処理の少なくとも一つ
の処理に、上記第１の発明の分離装置を用いることを特
徴とする核酸の分離精製方法に関する。また、本発明の
第３の発明は、細胞膜を有する核酸源自体に核酸吸着能
を有する物質を作用させることを特徴とする核酸の分離
精製方法に関する。更に、本発明の第４の発明は、カオ
トロピックイオン存在下で実施することを特徴とする上
記第３の発明の核酸の分離精製方法に関する。更にま
た、本発明の第５の発明は、上記第３又は第４の発明の
方法により核酸を精製するためのキットであって、核酸
吸着能を有する物質を構成の必須要件とする核酸精製の
ためのキットに関する。
発明の第１の発明はトラップ装置と強制分散設備からな
ることを特徴とする分離装置に関する。本発明の第２の
発明は、トラップ装置を使用する核酸の分離精製方法に
おいて、該トラップ装置を用いる処理の少なくとも一つ
の処理に、上記第１の発明の分離装置を用いることを特
徴とする核酸の分離精製方法に関する。また、本発明の
第３の発明は、細胞膜を有する核酸源自体に核酸吸着能
を有する物質を作用させることを特徴とする核酸の分離
精製方法に関する。更に、本発明の第４の発明は、カオ
トロピックイオン存在下で実施することを特徴とする上
記第３の発明の核酸の分離精製方法に関する。更にま
た、本発明の第５の発明は、上記第３又は第４の発明の
方法により核酸を精製するためのキットであって、核酸
吸着能を有する物質を構成の必須要件とする核酸精製の
ためのキットに関する。
【０００５】本発明者らは上記課題を解決するために鋭
意検討した結果、トラップ装置を用いる核酸精製の処理
工程において、該装置によるトラップ物を核酸精製に要
する試薬中に分散する際、強制的に分散エネルギーを与
えることにより核酸の回収率が顕著に改善されることに
着目し、強制分散設備を有する分離装置を開発するに至
った。なお本明細書における分散とは、懸濁、混和など
固体−液体あるいは液体−液体を均一化することを指
す。一方、核酸精製においてカオトロピックイオンを含
有する緩衝液と不溶性の核酸保持体を併用することによ
り細胞の溶解工程及び核酸の分離工程を同時に行えるこ
とを明らかにした。更に本方法を上記装置に応用するこ
とにより、短時間で収率よく核酸を精製できることを明
らかにし、本発明を完成するに至った。
意検討した結果、トラップ装置を用いる核酸精製の処理
工程において、該装置によるトラップ物を核酸精製に要
する試薬中に分散する際、強制的に分散エネルギーを与
えることにより核酸の回収率が顕著に改善されることに
着目し、強制分散設備を有する分離装置を開発するに至
った。なお本明細書における分散とは、懸濁、混和など
固体−液体あるいは液体−液体を均一化することを指
す。一方、核酸精製においてカオトロピックイオンを含
有する緩衝液と不溶性の核酸保持体を併用することによ
り細胞の溶解工程及び核酸の分離工程を同時に行えるこ
とを明らかにした。更に本方法を上記装置に応用するこ
とにより、短時間で収率よく核酸を精製できることを明
らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。第１の発明は、トラップ装置と強制分散設備か
らなることを特徴とする分離装置に関する。該装置のト
ラップ装置とは混合物より目的物のみを選択的にトラッ
プできる物であればよい。例えば、細胞培養液から細胞
を選択的にトラップする場合、細胞培養液を含む容器に
遠心力をかけることにより細胞を沈殿させ上清を除去す
ることにより細胞をトラップする装置のほか、例えば孔
径０．３〜１．０μｍの孔を有するボロシリケートガラ
ス膜繊維等のトラップフィルターを保持した容器に細胞
培養液を入れ、加圧ろ過、吸引ろ過あるいは遠心ろ過に
より細胞をフィルター上にトラップする装置などが挙げ
られる。該装置に用いるトラップ容器は、通常円筒状の
容器にトラップフィルターを保持していればよく、トラ
ップ容器の性質、形状は通常の分離方法、例えば減圧ろ
過、加圧ろ過、遠心ろ過等に使用できる性質、形状であ
れば良く、フィルターの容器とトラップフィルターは組
立て式でも一体式でもよい。
明する。第１の発明は、トラップ装置と強制分散設備か
らなることを特徴とする分離装置に関する。該装置のト
ラップ装置とは混合物より目的物のみを選択的にトラッ
プできる物であればよい。例えば、細胞培養液から細胞
を選択的にトラップする場合、細胞培養液を含む容器に
遠心力をかけることにより細胞を沈殿させ上清を除去す
ることにより細胞をトラップする装置のほか、例えば孔
径０．３〜１．０μｍの孔を有するボロシリケートガラ
ス膜繊維等のトラップフィルターを保持した容器に細胞
培養液を入れ、加圧ろ過、吸引ろ過あるいは遠心ろ過に
より細胞をフィルター上にトラップする装置などが挙げ
られる。該装置に用いるトラップ容器は、通常円筒状の
容器にトラップフィルターを保持していればよく、トラ
ップ容器の性質、形状は通常の分離方法、例えば減圧ろ
過、加圧ろ過、遠心ろ過等に使用できる性質、形状であ
れば良く、フィルターの容器とトラップフィルターは組
立て式でも一体式でもよい。
【０００７】一方、本発明における分離装置の強制分散
設備とは、例えば、トラップ装置によるトラップ物を液
体中に分散させる場合に用いる、自然分散力に加え外部
よりのエネルギーで強制的に分散させるための設備を指
す。強制分散設備には、例えば、振とう装置、超音波発
生装置、バブリング装置等が挙げられる。
設備とは、例えば、トラップ装置によるトラップ物を液
体中に分散させる場合に用いる、自然分散力に加え外部
よりのエネルギーで強制的に分散させるための設備を指
す。強制分散設備には、例えば、振とう装置、超音波発
生装置、バブリング装置等が挙げられる。
【０００８】上記分離装置は、例えば、核酸の分離精製
方法に用いることができる。細胞内核酸を精製する場
合、細胞を溶解し核酸を細胞より抽出する工程と、核酸
と他の細胞内含有物とを分離する工程とに大別できる。
両工程にトラップ装置を使用するが、装置の小型化、軽
量化の面でトラップフィルターを用いた装置が好まし
い。特に構造の簡素化の面で減圧ろ過を利用したトラッ
プ装置が好ましい。
方法に用いることができる。細胞内核酸を精製する場
合、細胞を溶解し核酸を細胞より抽出する工程と、核酸
と他の細胞内含有物とを分離する工程とに大別できる。
両工程にトラップ装置を使用するが、装置の小型化、軽
量化の面でトラップフィルターを用いた装置が好まし
い。特に構造の簡素化の面で減圧ろ過を利用したトラッ
プ装置が好ましい。
【０００９】細胞溶解工程に使用するトラップフィルタ
ーは、核酸を保持する微生物又は細胞や、該微生物又は
細胞の破壊物が適当に分散した状態で保持できる膜が良
く、また該膜上で微生物又は細胞の分離や、分離した微
生物又は細胞の破壊等が行えるものが望ましく、例えば
保留粒子径０．３〜１．０μｍの孔を有するボロシリケ
ートガラス繊維膜が使用できるが、微生物又は細胞の保
持能力、核酸を含有する微生物又は細胞内成分の分離時
間等より保留粒子径０．４〜０．８μｍの孔径の膜が好
ましく、この範囲の保留粒子径を有する膜より、試料に
合せ選択すれば良い。なお、保留粒子径は均一であって
も良いし、０．４〜０．８μｍの範囲で分布していても
良い。また膜面積、膜厚等は試料の性状、処理量、好ま
しい処理時間等に合せ選択すれば良い。
ーは、核酸を保持する微生物又は細胞や、該微生物又は
細胞の破壊物が適当に分散した状態で保持できる膜が良
く、また該膜上で微生物又は細胞の分離や、分離した微
生物又は細胞の破壊等が行えるものが望ましく、例えば
保留粒子径０．３〜１．０μｍの孔を有するボロシリケ
ートガラス繊維膜が使用できるが、微生物又は細胞の保
持能力、核酸を含有する微生物又は細胞内成分の分離時
間等より保留粒子径０．４〜０．８μｍの孔径の膜が好
ましく、この範囲の保留粒子径を有する膜より、試料に
合せ選択すれば良い。なお、保留粒子径は均一であって
も良いし、０．４〜０．８μｍの範囲で分布していても
良い。また膜面積、膜厚等は試料の性状、処理量、好ま
しい処理時間等に合せ選択すれば良い。
【００１０】一方、核酸と他の細胞内含有物とを分離す
る工程において、カオトロピックイオン存在下で核酸が
選択的に吸着する水不溶性の核酸吸着担体を用いること
ができる。該担体としては、シリカゲル、ガラスパウダ
ーが挙げられるが、目的核酸の物理的安定性の面から粒
子径は２μｍ〜１０μｍの範囲が好ましい。この場合核
酸吸着担体保持用トラップフィルターとしては目詰まり
防止のため、孔径０．５μｍ〜１μｍの膜が好ましい。
更に該膜は、核酸吸着体より核酸を溶出する際に核酸の
吸着が少ない膜が好ましく、例えば、ポリテトラフルオ
ロエチレン製フィルターが挙げられる。
る工程において、カオトロピックイオン存在下で核酸が
選択的に吸着する水不溶性の核酸吸着担体を用いること
ができる。該担体としては、シリカゲル、ガラスパウダ
ーが挙げられるが、目的核酸の物理的安定性の面から粒
子径は２μｍ〜１０μｍの範囲が好ましい。この場合核
酸吸着担体保持用トラップフィルターとしては目詰まり
防止のため、孔径０．５μｍ〜１μｍの膜が好ましい。
更に該膜は、核酸吸着体より核酸を溶出する際に核酸の
吸着が少ない膜が好ましく、例えば、ポリテトラフルオ
ロエチレン製フィルターが挙げられる。
【００１１】上記トラップフィルターを用いた細胞内の
核酸の精製方法の態様として、以下の方法が例示され
る。 （Ａ）細胞を細胞溶解工程用トラップ装置のトラップフ
ィルター上にトラップする工程、（Ｂ）細胞溶解工程用
トラップ装置に細胞懸濁用液を注入し、細胞を懸濁する
工程、（Ｃ）細胞溶解工程用トラップ装置に細胞溶解用
液を注入し、細胞を溶解し粗核酸溶液を得る工程、
（Ｄ）核酸吸着体が注入された核酸分離工程用トラップ
装置に粗核酸溶液を移送する工程、（Ｅ）核酸分離工程
用トラップ装置中で粗核酸溶液と核酸吸着体を混合する
工程、（Ｆ）核酸吸着体を核酸分離工程用トラップ装置
のトラップフィルター上にトラップする工程、（Ｇ）核
酸分離工程用トラップ装置に核酸溶出溶液を注入し、核
酸吸着体より核酸を溶出する工程、
核酸の精製方法の態様として、以下の方法が例示され
る。 （Ａ）細胞を細胞溶解工程用トラップ装置のトラップフ
ィルター上にトラップする工程、（Ｂ）細胞溶解工程用
トラップ装置に細胞懸濁用液を注入し、細胞を懸濁する
工程、（Ｃ）細胞溶解工程用トラップ装置に細胞溶解用
液を注入し、細胞を溶解し粗核酸溶液を得る工程、
（Ｄ）核酸吸着体が注入された核酸分離工程用トラップ
装置に粗核酸溶液を移送する工程、（Ｅ）核酸分離工程
用トラップ装置中で粗核酸溶液と核酸吸着体を混合する
工程、（Ｆ）核酸吸着体を核酸分離工程用トラップ装置
のトラップフィルター上にトラップする工程、（Ｇ）核
酸分離工程用トラップ装置に核酸溶出溶液を注入し、核
酸吸着体より核酸を溶出する工程、
【００１２】上記工程において、工程（Ｂ）、（Ｃ）、
（Ｅ）及び（Ｇ）において、本発明装置の強制分散設備
によりトラップ装置内容物を均一に分散させることによ
り核酸の精製効率が顕著に向上する。上記トラップ容器
を用いる場合、強制分散設備として、例えば回転型振と
う機構を有する設備を用いた場合、トラップ装置を振幅
２ｍｍ〜３ｍｍ、７２０ｒｐｍで振とうさせる。
（Ｅ）及び（Ｇ）において、本発明装置の強制分散設備
によりトラップ装置内容物を均一に分散させることによ
り核酸の精製効率が顕著に向上する。上記トラップ容器
を用いる場合、強制分散設備として、例えば回転型振と
う機構を有する設備を用いた場合、トラップ装置を振幅
２ｍｍ〜３ｍｍ、７２０ｒｐｍで振とうさせる。
【００１３】次に減圧吸引に適したトラップ容器と減圧
吸引を利用したトラップ装置と振とう装置を有する本発
明の分離装置を用いたプラスミドＤＮＡを保持する微生
物よりプラスミドＤＮＡの精製方法を、アルカリＳＤＳ
法に準じ更に説明する。
吸引を利用したトラップ装置と振とう装置を有する本発
明の分離装置を用いたプラスミドＤＮＡを保持する微生
物よりプラスミドＤＮＡの精製方法を、アルカリＳＤＳ
法に準じ更に説明する。
【００１４】（Ａ）細胞を細胞溶解工程用トラップ装置
のトラップフィルター上にトラップする工程、プラスミ
ドＤＮＡを含有する微生物、例えばプラスミドｐＵＣ１
９を含有する大腸菌ＪＭ１０９株（ Escherichia coli
ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９）を培養し、例えばＯＤ600 約
６の培養液を調製した場合、例えば図１に示す容器を用
いることができる。図１において、１は孔径０．４５μ
ｍのセルロース混合エステル製膜（ミリポア社製）、２
はポリプロピレン製容器である。本容器を第１トラップ
容器と命名した。孔径０．４５μｍのセルロース混合エ
ステル製膜を保持した第１トラップ容器を使用すれば減
圧下で、約２．５ｍｌの培養液を約１５分間でろ過で
き、培養菌体がトラップフィルター上に保持される。
のトラップフィルター上にトラップする工程、プラスミ
ドＤＮＡを含有する微生物、例えばプラスミドｐＵＣ１
９を含有する大腸菌ＪＭ１０９株（ Escherichia coli
ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９）を培養し、例えばＯＤ600 約
６の培養液を調製した場合、例えば図１に示す容器を用
いることができる。図１において、１は孔径０．４５μ
ｍのセルロース混合エステル製膜（ミリポア社製）、２
はポリプロピレン製容器である。本容器を第１トラップ
容器と命名した。孔径０．４５μｍのセルロース混合エ
ステル製膜を保持した第１トラップ容器を使用すれば減
圧下で、約２．５ｍｌの培養液を約１５分間でろ過で
き、培養菌体がトラップフィルター上に保持される。
【００１５】（Ｂ）細胞溶解工程用トラップ装置に細胞
懸濁用液を注入し、細胞を懸濁する工程、例えば上記培
養液２．５ｍｌに含有される細胞をトラップした場合、
第１トラップ容器に懸濁用試薬の必要量、例えば１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）の
場合３００μｌを注入し、少なくとも１５分間の振とう
動作により懸濁する。この操作により、トラップされた
菌体が細胞懸濁液中に均一に分散化され、（Ｃ）工程に
おける菌体溶解の効率が向上する。なおプラスミドＤＮ
Ａを精製する場合、本工程における懸濁用試薬には
（Ｃ）工程においてＲＮＡを分解するためのＲＮＡ分解
酵素、例えばリボヌクレアーゼＡを終濃度１００μｇ／
ｍｌ添加しておく。
懸濁用液を注入し、細胞を懸濁する工程、例えば上記培
養液２．５ｍｌに含有される細胞をトラップした場合、
第１トラップ容器に懸濁用試薬の必要量、例えば１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）の
場合３００μｌを注入し、少なくとも１５分間の振とう
動作により懸濁する。この操作により、トラップされた
菌体が細胞懸濁液中に均一に分散化され、（Ｃ）工程に
おける菌体溶解の効率が向上する。なおプラスミドＤＮ
Ａを精製する場合、本工程における懸濁用試薬には
（Ｃ）工程においてＲＮＡを分解するためのＲＮＡ分解
酵素、例えばリボヌクレアーゼＡを終濃度１００μｇ／
ｍｌ添加しておく。
【００１６】（Ｃ）細胞溶解工程用トラップ装置に細胞
溶解用液を注入し、細胞を溶解し粗核酸溶液を得る工
程、次に細胞溶解液、例えば0.2N水酸化ナトリウム／
1.0％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を、その必要量、例
えば上記培養液２．５ｍｌの場合２００μｌを添加し、
１分間振とうする。続いて中和液、例えば２．５Ｍ酢酸
カリウム（pH4.8 ）の必要量、例えば上記培養液２．５
ｍｌの場合２００μｌを添加し、２分間振とうする。本
工程により、ＲＮＡが分解される一方、染色体ＤＮＡ、
不要タンパク質が変性し不溶化される。
溶解用液を注入し、細胞を溶解し粗核酸溶液を得る工
程、次に細胞溶解液、例えば0.2N水酸化ナトリウム／
1.0％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を、その必要量、例
えば上記培養液２．５ｍｌの場合２００μｌを添加し、
１分間振とうする。続いて中和液、例えば２．５Ｍ酢酸
カリウム（pH4.8 ）の必要量、例えば上記培養液２．５
ｍｌの場合２００μｌを添加し、２分間振とうする。本
工程により、ＲＮＡが分解される一方、染色体ＤＮＡ、
不要タンパク質が変性し不溶化される。
【００１７】（Ｄ）核酸吸着体が注入された核酸分離工
程用トラップ装置に粗核酸溶液を移送する工程、次いで
減圧によって第１トラップ容器よりＤＮＡを含む処理液
体を前もって設置された核酸分離工程用トラップ容器内
に回収する。なおこの核酸分離工程用トラップ容器は、
例えば核酸保持体として粒子径５．０μｍのシリカゲル
粒子を用いた場合、例えば図２に示す容器を用いること
ができる。図２において、３は孔径１．０μｍのポリテ
トラフルオロエチレン製膜（アドバンテック社製）、４
はポリプロピレン製容器である。本容器を第２トラップ
容器と命名した。孔径１．０μｍのポリテトラフルオロ
エチレン製膜を保持した第２トラップ容器を用いる本工
程において、該容器内にはあらかじめゲル溶液、例え
ば、５０ｍｇ／ｍｌシリカゲル／７Ｍ塩酸グアニジン／
２ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を
適量加えておく。本工程により（Ｃ）工程で不溶化され
た物質と粗核酸溶液とを分離することができる。
程用トラップ装置に粗核酸溶液を移送する工程、次いで
減圧によって第１トラップ容器よりＤＮＡを含む処理液
体を前もって設置された核酸分離工程用トラップ容器内
に回収する。なおこの核酸分離工程用トラップ容器は、
例えば核酸保持体として粒子径５．０μｍのシリカゲル
粒子を用いた場合、例えば図２に示す容器を用いること
ができる。図２において、３は孔径１．０μｍのポリテ
トラフルオロエチレン製膜（アドバンテック社製）、４
はポリプロピレン製容器である。本容器を第２トラップ
容器と命名した。孔径１．０μｍのポリテトラフルオロ
エチレン製膜を保持した第２トラップ容器を用いる本工
程において、該容器内にはあらかじめゲル溶液、例え
ば、５０ｍｇ／ｍｌシリカゲル／７Ｍ塩酸グアニジン／
２ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を
適量加えておく。本工程により（Ｃ）工程で不溶化され
た物質と粗核酸溶液とを分離することができる。
【００１８】（Ｅ）核酸分離工程用トラップ装置中で粗
核酸溶液と核酸吸着体を混合する工程、上記第２トラッ
プ容器を約５分間振とうし、内液を十分に混和する。こ
れによりシリカゲル粒子とＤＮＡの吸着作用が促進され
る。
核酸溶液と核酸吸着体を混合する工程、上記第２トラッ
プ容器を約５分間振とうし、内液を十分に混和する。こ
れによりシリカゲル粒子とＤＮＡの吸着作用が促進され
る。
【００１９】（Ｆ）核酸吸着体を核酸分離工程用トラッ
プ装置のトラップフィルター上にトラップする工程、次
いで、減圧によって核酸を吸着した核酸保持担体をフィ
ルター上にトラップする。この工程により、（Ｄ）工程
で得られた粗核酸溶液中の核酸とその他不純物とを分離
することができる。該核酸保持体を洗浄する工程を加え
ると、更に得られる核酸の純度が上がる。例えば、上記
方法で得られた核酸吸着体を適量のエタノールを含んだ
洗浄液、例えば５０％エタノール／１００ｍＭ 塩化ナ
トリウム／２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭ トリス塩
酸（pH7.5 ）を添加し、減圧により液体を廃棄すること
によりシリカゲル粒子を洗浄する。この洗浄操作を２回
繰り返すことにより第２トラップ容器内に残存する微量
の不純物を洗い流すことができる。この洗浄の際に振と
う操作を加えることによって、より洗浄作用を高めるこ
とが可能である。
プ装置のトラップフィルター上にトラップする工程、次
いで、減圧によって核酸を吸着した核酸保持担体をフィ
ルター上にトラップする。この工程により、（Ｄ）工程
で得られた粗核酸溶液中の核酸とその他不純物とを分離
することができる。該核酸保持体を洗浄する工程を加え
ると、更に得られる核酸の純度が上がる。例えば、上記
方法で得られた核酸吸着体を適量のエタノールを含んだ
洗浄液、例えば５０％エタノール／１００ｍＭ 塩化ナ
トリウム／２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭ トリス塩
酸（pH7.5 ）を添加し、減圧により液体を廃棄すること
によりシリカゲル粒子を洗浄する。この洗浄操作を２回
繰り返すことにより第２トラップ容器内に残存する微量
の不純物を洗い流すことができる。この洗浄の際に振と
う操作を加えることによって、より洗浄作用を高めるこ
とが可能である。
【００２０】（Ｇ）核酸分離工程用トラップ装置に核酸
溶出溶液を注入し、核酸吸着体より核酸を溶出する工
程、洗浄の終了したシリカゲル粒子を約２分間減圧する
ことによってシリカゲルを乾燥させる。次に適量の溶出
液、例えば滅菌水あるいはＴＥ溶液〔10mMトリス塩酸
（pH8.0 ) / 1mM EDTA〕を添加後、第２トラップ容器よ
り減圧によってプラスミドＤＮＡを含んだ溶出液を容
器、例えばエッペンドルフチューブに回収する。本工程
にも振とう操作を加えることによって核酸の回収率を向
上させることが可能である。
溶出溶液を注入し、核酸吸着体より核酸を溶出する工
程、洗浄の終了したシリカゲル粒子を約２分間減圧する
ことによってシリカゲルを乾燥させる。次に適量の溶出
液、例えば滅菌水あるいはＴＥ溶液〔10mMトリス塩酸
（pH8.0 ) / 1mM EDTA〕を添加後、第２トラップ容器よ
り減圧によってプラスミドＤＮＡを含んだ溶出液を容
器、例えばエッペンドルフチューブに回収する。本工程
にも振とう操作を加えることによって核酸の回収率を向
上させることが可能である。
【００２１】なお（Ａ）工程における細胞懸濁液にＲＮ
ａｓｅを添加することにより操作時間が短縮される。例
えばＲＮａｓｅの場合細胞懸濁液に終濃度１００μｇ／
ｍｌのＲＮａｓｅＡになるよう添加すればよい。更に該
細胞懸濁液に菌体特有の細胞壁を溶解する酵素を添加す
ることにより核酸の収率が向上する。例えば大腸菌を用
いる場合、リゾチームを細胞懸濁液に終濃度４ｍｇ／ｍ
ｌになるよう添加し用いれば良い。
ａｓｅを添加することにより操作時間が短縮される。例
えばＲＮａｓｅの場合細胞懸濁液に終濃度１００μｇ／
ｍｌのＲＮａｓｅＡになるよう添加すればよい。更に該
細胞懸濁液に菌体特有の細胞壁を溶解する酵素を添加す
ることにより核酸の収率が向上する。例えば大腸菌を用
いる場合、リゾチームを細胞懸濁液に終濃度４ｍｇ／ｍ
ｌになるよう添加し用いれば良い。
【００２２】また、上記のように溶菌成分を減圧法によ
りろ過する場合は、必要に応じて消泡剤を使用しても良
く、消泡剤としては例えばアデカノール（旭電化工業社
製）、エイノール（バイオット社製）、ニッサンディス
ホームＣＢ４４２（日本油脂社製）等より選択し、例え
ば、細胞溶解工程における中和液に０．０５％のエイノ
ールを添加すれば良い。また減圧度を調整することによ
ってろ液の発泡や飛散を防止することができ、例えばエ
イノール０．０５％存在下真空度を−６５０ｍｍＨｇ付
近に調整することにより、発泡を完全に抑制することが
できる。
りろ過する場合は、必要に応じて消泡剤を使用しても良
く、消泡剤としては例えばアデカノール（旭電化工業社
製）、エイノール（バイオット社製）、ニッサンディス
ホームＣＢ４４２（日本油脂社製）等より選択し、例え
ば、細胞溶解工程における中和液に０．０５％のエイノ
ールを添加すれば良い。また減圧度を調整することによ
ってろ液の発泡や飛散を防止することができ、例えばエ
イノール０．０５％存在下真空度を−６５０ｍｍＨｇ付
近に調整することにより、発泡を完全に抑制することが
できる。
【００２３】プラスミドＤＮＡを含有する微生物又は細
胞の負荷量が多い場合は、例えば保留粒子径０．８μｍ
の孔を有するボロシリケートガラス繊維膜を使用すれば
良い。例えば保留粒子径０．８μｍの孔を有するボロシ
リケートガラス繊維膜（アドバンテック社製：ＧＡ−２
００）を使用することにより、前出Escherichia coliＪ
Ｍ１０９／ｐＵＣ１９のＯＤ600 約６の培養液１．５ｍ
ｌが減圧下で約３分でろ過でき、プラスミドＤＮＡを含
有する分離液も約５分で採取することができる。
胞の負荷量が多い場合は、例えば保留粒子径０．８μｍ
の孔を有するボロシリケートガラス繊維膜を使用すれば
良い。例えば保留粒子径０．８μｍの孔を有するボロシ
リケートガラス繊維膜（アドバンテック社製：ＧＡ−２
００）を使用することにより、前出Escherichia coliＪ
Ｍ１０９／ｐＵＣ１９のＯＤ600 約６の培養液１．５ｍ
ｌが減圧下で約３分でろ過でき、プラスミドＤＮＡを含
有する分離液も約５分で採取することができる。
【００２４】上記プラスミドＤＮＡの調製方法において
は、本発明のトラップ装置に多数サンプル処理用の吸引
ろ過機構を採用することによって、短時間に、多数のサ
ンプル処理を行うことができる。なお、本発明の装置を
用いた核酸精製の場合、必ずしも上記全工程を実施する
必要はない。例えば、酵素反応を行った反応液中から核
酸を精製する場合、工程（Ａ）〜（Ｃ）は不要であり、
工程（Ｄ）〜（Ｇ）を実施すればよい。またＲＮＡを精
製したい場合は、各工程に用いる試薬をＲＮＡ精製に適
した試薬に変更すればよい。
は、本発明のトラップ装置に多数サンプル処理用の吸引
ろ過機構を採用することによって、短時間に、多数のサ
ンプル処理を行うことができる。なお、本発明の装置を
用いた核酸精製の場合、必ずしも上記全工程を実施する
必要はない。例えば、酵素反応を行った反応液中から核
酸を精製する場合、工程（Ａ）〜（Ｃ）は不要であり、
工程（Ｄ）〜（Ｇ）を実施すればよい。またＲＮＡを精
製したい場合は、各工程に用いる試薬をＲＮＡ精製に適
した試薬に変更すればよい。
【００２５】第３の発明は、細胞膜を有する核酸源自体
に核酸吸着能を有する物質を作用させることを特徴とす
る核酸の分離精製方法である。本明細書における細胞膜
を有する核酸源とは、原形質膜のみで覆われた細胞が好
ましく、例えば、血液中に含まれる白血球細胞が挙げら
れる。しかし、植物細胞、微生物細胞であっても細胞壁
が除去された状態であれば何ら問題はない。この場合、
細胞壁は完全に除去されていなくともよく、低張液中で
細胞がバーストする程度に除去されていればよい。
に核酸吸着能を有する物質を作用させることを特徴とす
る核酸の分離精製方法である。本明細書における細胞膜
を有する核酸源とは、原形質膜のみで覆われた細胞が好
ましく、例えば、血液中に含まれる白血球細胞が挙げら
れる。しかし、植物細胞、微生物細胞であっても細胞壁
が除去された状態であれば何ら問題はない。この場合、
細胞壁は完全に除去されていなくともよく、低張液中で
細胞がバーストする程度に除去されていればよい。
【００２６】核酸吸着能を有する物質としては、例え
ば、平均分子量７００００のポリエチレンイミン（ＰＥ
Ｉ）等の溶媒可溶性の陰イオン交換体、陰イオン交換基
を溶媒不溶性の担体に結合させた陰イオン交換体、高濃
度カオトロピックイオン存在下核酸を選択的に吸着させ
るガラスパウダーやシリカゲルが挙げられる。本発明に
おいては、高濃度カオトロピックイオン存在下で核酸と
選択的吸着能を有するガラスパウダーやシリカゲルが特
に好適である。何故なら高濃度、例えば６Ｍ以上のグア
ニジン塩酸を溶解した溶液中で細胞を懸濁すると細胞が
溶解されるからである。すなわち、細胞膜を有する核酸
源を上記性質を有するガラスパウダーと共に高濃度カオ
トロピックイオンを含む緩衝液中で懸濁することにより
細胞溶解工程と核酸と細胞内不純物との分離を同時に実
施することができる。
ば、平均分子量７００００のポリエチレンイミン（ＰＥ
Ｉ）等の溶媒可溶性の陰イオン交換体、陰イオン交換基
を溶媒不溶性の担体に結合させた陰イオン交換体、高濃
度カオトロピックイオン存在下核酸を選択的に吸着させ
るガラスパウダーやシリカゲルが挙げられる。本発明に
おいては、高濃度カオトロピックイオン存在下で核酸と
選択的吸着能を有するガラスパウダーやシリカゲルが特
に好適である。何故なら高濃度、例えば６Ｍ以上のグア
ニジン塩酸を溶解した溶液中で細胞を懸濁すると細胞が
溶解されるからである。すなわち、細胞膜を有する核酸
源を上記性質を有するガラスパウダーと共に高濃度カオ
トロピックイオンを含む緩衝液中で懸濁することにより
細胞溶解工程と核酸と細胞内不純物との分離を同時に実
施することができる。
【００２７】カオトロピックイオンとは、水の構造を破
壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエン
トロピーの減少を抑制する効果を有するイオンである。
イオン種によって水の溶媒構造を破壊する性質は異なっ
ており、例えば、陰イオンではＣＢｒ3 ＣＯＯ- （トリ
ブロモ酢酸イオン）＞ＣＣｌ3 ＣＯＯ- （トリクロロ酢
酸イオン）＞ＳＣＮ- （チオシアン酸イオン）、ＨＮＣ
（ＮＨ2 ）2 （グアニジニウム）＞Ｉ- （ヨードイオ
ン）、ＣｌＯ4 - （過塩素酸イオン）＞ＮＯ3 -（硝酸
イオン）、陽イオンではＢａ2+（バリウムイオン）＞Ｃ
ａ2+（カルシウムイオン）＞Ｍｇ2+（マグネシウムイオ
ン）＞Ｌｉ+ （リチウムイオン）＞Ｃｓ+（セシウムイ
オン）、Ｎａ+ （ナトリウムイオン）、Ｋ+ （カリウム
イオン）、Ｒｂ+ （ルビジウムイオン）の順でカオトロ
ピシティーは低下する〔堀尾、山下編集、蛋白質・酵素
の基礎実験法：株式会社南江堂、第２２〜２３頁（１９
８１）〕。本発明においては、イオン種に限定はない
が、上記した陰イオンの系列のうち、上位に記載したイ
オン種がより好ましい。カオトロピックイオンを生成す
る試薬としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸ナトリ
ウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸リチウム、塩化リチ
ウム等が挙げられる。
壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエン
トロピーの減少を抑制する効果を有するイオンである。
イオン種によって水の溶媒構造を破壊する性質は異なっ
ており、例えば、陰イオンではＣＢｒ3 ＣＯＯ- （トリ
ブロモ酢酸イオン）＞ＣＣｌ3 ＣＯＯ- （トリクロロ酢
酸イオン）＞ＳＣＮ- （チオシアン酸イオン）、ＨＮＣ
（ＮＨ2 ）2 （グアニジニウム）＞Ｉ- （ヨードイオ
ン）、ＣｌＯ4 - （過塩素酸イオン）＞ＮＯ3 -（硝酸
イオン）、陽イオンではＢａ2+（バリウムイオン）＞Ｃ
ａ2+（カルシウムイオン）＞Ｍｇ2+（マグネシウムイオ
ン）＞Ｌｉ+ （リチウムイオン）＞Ｃｓ+（セシウムイ
オン）、Ｎａ+ （ナトリウムイオン）、Ｋ+ （カリウム
イオン）、Ｒｂ+ （ルビジウムイオン）の順でカオトロ
ピシティーは低下する〔堀尾、山下編集、蛋白質・酵素
の基礎実験法：株式会社南江堂、第２２〜２３頁（１９
８１）〕。本発明においては、イオン種に限定はない
が、上記した陰イオンの系列のうち、上位に記載したイ
オン種がより好ましい。カオトロピックイオンを生成す
る試薬としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸ナトリ
ウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸リチウム、塩化リチ
ウム等が挙げられる。
【００２８】したがって、用いるイオン種によってガラ
スパウダーなどの核酸吸着体に核酸を吸着させるための
有効濃度も異なり、例えば、シリカゲルを用いた場合、
細胞懸濁液中で、塩酸グアニジンは３Ｍ以上、ヨウ化ナ
トリウムは３Ｍ以上溶解されていることが好ましい。ま
た、上記細胞溶解液のｐＨは核酸が安定なｐＨに調整さ
れていることが好ましい。例えば、ヒトより得られた全
血１容量に対し、ゲル溶液、例えば５０ｍｇ／ｍｌシリ
カゲル／７Ｍ塩酸グアニジン／２ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）１０容量を添加し振とう混
和することにより、細胞が溶解され、抽出された核酸が
シリカゲルに吸着する。得られたシリカゲルを前記シリ
カゲル洗浄液で洗浄後、前記核酸溶出液で溶出すること
により、タンパクなどの不純物含量の低い核酸を得るこ
とができる。
スパウダーなどの核酸吸着体に核酸を吸着させるための
有効濃度も異なり、例えば、シリカゲルを用いた場合、
細胞懸濁液中で、塩酸グアニジンは３Ｍ以上、ヨウ化ナ
トリウムは３Ｍ以上溶解されていることが好ましい。ま
た、上記細胞溶解液のｐＨは核酸が安定なｐＨに調整さ
れていることが好ましい。例えば、ヒトより得られた全
血１容量に対し、ゲル溶液、例えば５０ｍｇ／ｍｌシリ
カゲル／７Ｍ塩酸グアニジン／２ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）１０容量を添加し振とう混
和することにより、細胞が溶解され、抽出された核酸が
シリカゲルに吸着する。得られたシリカゲルを前記シリ
カゲル洗浄液で洗浄後、前記核酸溶出液で溶出すること
により、タンパクなどの不純物含量の低い核酸を得るこ
とができる。
【００２９】臨床分野等では多検体の全血、培養細胞等
からのＤＮＡの抽出が頻繁に行われているが、上記の工
程を利用することにより、より容易に核酸を抽出、精製
することが可能である。該方法に第１の発明の装置を適
用すると、更に容易に核酸の精製を実施することができ
る。
からのＤＮＡの抽出が頻繁に行われているが、上記の工
程を利用することにより、より容易に核酸を抽出、精製
することが可能である。該方法に第１の発明の装置を適
用すると、更に容易に核酸の精製を実施することができ
る。
【００３０】この場合、細胞溶解工程用トラップ装置は
不要であり、核酸分離工程用トラップ装置のみでよく、
以下に示す態様が例示される。 （Ａ）核酸分離工程用トラップ装置に細胞懸濁液及びゲ
ル溶液を注入し、細胞を溶解及び核酸を核酸吸着体に吸
着させる工程、（Ｂ）核酸吸着体を核酸分離工程用トラ
ップ装置のトラップフィルター上にトラップする工程、
（Ｃ）核酸分離工程用トラップ装置に核酸溶出液を注入
し、核酸吸着体より核酸を溶出する工程、
不要であり、核酸分離工程用トラップ装置のみでよく、
以下に示す態様が例示される。 （Ａ）核酸分離工程用トラップ装置に細胞懸濁液及びゲ
ル溶液を注入し、細胞を溶解及び核酸を核酸吸着体に吸
着させる工程、（Ｂ）核酸吸着体を核酸分離工程用トラ
ップ装置のトラップフィルター上にトラップする工程、
（Ｃ）核酸分離工程用トラップ装置に核酸溶出液を注入
し、核酸吸着体より核酸を溶出する工程、
【００３１】次に、該方法をヒト血液よりＤＮＡを抽出
する場合を例として更に詳細に説明する。 （Ａ）核酸分離工程用トラップ装置に細胞懸濁液及びゲ
ル溶液を注入し、細胞を溶解及び核酸を核酸吸着体に吸
着させる工程、ヒト血液細胞を含む体外摘出試料、例え
ば、公知の抗凝固処理を施したヒト全血１００μｌを前
記第２トラップ容器に注入し、次にゲル溶液、例えば５
０ｍｇ／ｍｌシリカゲル／７Ｍ塩酸グアニジン／２ｍＭ
ＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）の場合７
００μｌを注入する。本工程により、血液細胞が溶解さ
れると共に抽出された核酸がシリカゲルに吸着される。
本工程において振とう操作を行うことにより、細胞の溶
解効率及び核酸のシリカゲルへの吸着効率が向上する。
する場合を例として更に詳細に説明する。 （Ａ）核酸分離工程用トラップ装置に細胞懸濁液及びゲ
ル溶液を注入し、細胞を溶解及び核酸を核酸吸着体に吸
着させる工程、ヒト血液細胞を含む体外摘出試料、例え
ば、公知の抗凝固処理を施したヒト全血１００μｌを前
記第２トラップ容器に注入し、次にゲル溶液、例えば５
０ｍｇ／ｍｌシリカゲル／７Ｍ塩酸グアニジン／２ｍＭ
ＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）の場合７
００μｌを注入する。本工程により、血液細胞が溶解さ
れると共に抽出された核酸がシリカゲルに吸着される。
本工程において振とう操作を行うことにより、細胞の溶
解効率及び核酸のシリカゲルへの吸着効率が向上する。
【００３２】（Ｂ）核酸吸着体を核酸分離工程用トラッ
プ装置のトラップフィルター上にトラップする工程、次
いで減圧によって第２トラップ容器のフィルター上にシ
リカゲルをトラップする。本工程により核酸とその他細
胞内不純物とを分離することができる。該シリカゲル粒
子を洗浄する工程を加えると、更に得られる核酸の純度
が上がる。例えば、上記方法で得られた核酸吸着体を適
量のエタノールを含んだ洗浄液、例えば５０％エタノー
ル／１００ｍＭ 塩化ナトリウム／２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／１０ｍＭ トリス塩酸（pH7.5 ）を添加し、減圧に
より液体を廃棄することによりシリカゲル粒子を洗浄す
る。この洗浄操作を２回繰り返すことにより第２トラッ
プ容器内に残存する微量の不純物を洗い流すことができ
る。この洗浄の際に振とう動作を加えることによって、
より洗浄作用を高めることが可能である。
プ装置のトラップフィルター上にトラップする工程、次
いで減圧によって第２トラップ容器のフィルター上にシ
リカゲルをトラップする。本工程により核酸とその他細
胞内不純物とを分離することができる。該シリカゲル粒
子を洗浄する工程を加えると、更に得られる核酸の純度
が上がる。例えば、上記方法で得られた核酸吸着体を適
量のエタノールを含んだ洗浄液、例えば５０％エタノー
ル／１００ｍＭ 塩化ナトリウム／２．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／１０ｍＭ トリス塩酸（pH7.5 ）を添加し、減圧に
より液体を廃棄することによりシリカゲル粒子を洗浄す
る。この洗浄操作を２回繰り返すことにより第２トラッ
プ容器内に残存する微量の不純物を洗い流すことができ
る。この洗浄の際に振とう動作を加えることによって、
より洗浄作用を高めることが可能である。
【００３３】（Ｃ）核酸分離工程用トラップ装置に核酸
溶出液を注入し、核酸吸着体より核酸を溶出する工程、
洗浄の終了したシリカゲル粒子を約２分間減圧すること
によってシリカゲルを乾燥させる。次に適量の溶出液、
例えば滅菌水、TE溶液〔10mMトリス塩酸（pH8.0 ) / 1m
M EDTA〕を添加後、第２トラップ容器より減圧によって
核酸を含んだ溶出液を容器、例えばエッペンドルフチュ
ーブに回収する。本工程にも振とう操作を加えることに
よって核酸の回収率を向上させることが可能である。
溶出液を注入し、核酸吸着体より核酸を溶出する工程、
洗浄の終了したシリカゲル粒子を約２分間減圧すること
によってシリカゲルを乾燥させる。次に適量の溶出液、
例えば滅菌水、TE溶液〔10mMトリス塩酸（pH8.0 ) / 1m
M EDTA〕を添加後、第２トラップ容器より減圧によって
核酸を含んだ溶出液を容器、例えばエッペンドルフチュ
ーブに回収する。本工程にも振とう操作を加えることに
よって核酸の回収率を向上させることが可能である。
【００３４】なお該方法は必ずしも本発明の分離装置で
行わなくとも良く、別途市販の分離容器、例えばSuprec
01（宝酒造社製）などを利用して手動で行うこともでき
る。更に該方法は従来法に比べ用いる試薬数が少なく、
このことは試薬分注回数の減少につながる。したがって
試料数が増えるほど従来法に比べ核酸精製に要する時間
は更に減少する。更に該方法により、微生物細胞より環
状二本鎖プラスミドＤＮＡを調製する場合は、上記工程
（Ａ）の前に細胞壁除去操作、工程（Ｄ）の後にゲノム
ＤＮＡ及びＲＮＡ分離操作を行うことにより高純度な環
状二本鎖プラスミドＤＮＡを得ることができる。細胞壁
除去操作は、例えば、大腸菌の場合、大腸菌をリゾチー
ムを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で懸濁し、室温で５分間放置することにより実施する
ことができる。
行わなくとも良く、別途市販の分離容器、例えばSuprec
01（宝酒造社製）などを利用して手動で行うこともでき
る。更に該方法は従来法に比べ用いる試薬数が少なく、
このことは試薬分注回数の減少につながる。したがって
試料数が増えるほど従来法に比べ核酸精製に要する時間
は更に減少する。更に該方法により、微生物細胞より環
状二本鎖プラスミドＤＮＡを調製する場合は、上記工程
（Ａ）の前に細胞壁除去操作、工程（Ｄ）の後にゲノム
ＤＮＡ及びＲＮＡ分離操作を行うことにより高純度な環
状二本鎖プラスミドＤＮＡを得ることができる。細胞壁
除去操作は、例えば、大腸菌の場合、大腸菌をリゾチー
ムを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
中で懸濁し、室温で５分間放置することにより実施する
ことができる。
【００３５】ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ分離操作は、例え
ば、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを含む核酸溶液１容量
に対し、0.2N 水酸化ナトリウム／ 1.0％ラウリル硫酸ナ
トリウム溶液を２容量添加し混和後、氷中５分間放置し
ＲＮＡの分解及びゲノムＤＮＡの変性を行う。この後、
2.5M酢酸カリウム（pH4.8 ）を１．５容量添加し混和後
氷中で１０分間放置することによりゲノムＤＮＡを不溶
化させる。該液を１４０００ｇ、１０分間遠心処理に付
し、変性ゲノムＤＮＡを沈殿させ除去する。得られた上
清にエタノールを添加しプラスミドＤＮＡを沈殿させる
ことにより、高純度な二本鎖プラスミドＤＮＡが得られ
る。
ば、環状二本鎖プラスミドＤＮＡを含む核酸溶液１容量
に対し、0.2N 水酸化ナトリウム／ 1.0％ラウリル硫酸ナ
トリウム溶液を２容量添加し混和後、氷中５分間放置し
ＲＮＡの分解及びゲノムＤＮＡの変性を行う。この後、
2.5M酢酸カリウム（pH4.8 ）を１．５容量添加し混和後
氷中で１０分間放置することによりゲノムＤＮＡを不溶
化させる。該液を１４０００ｇ、１０分間遠心処理に付
し、変性ゲノムＤＮＡを沈殿させ除去する。得られた上
清にエタノールを添加しプラスミドＤＮＡを沈殿させる
ことにより、高純度な二本鎖プラスミドＤＮＡが得られ
る。
【００３６】第５の発明は、該方法による核酸精製用の
キットを提供する。該キットは、上記したような核酸吸
着能を有する物質を構成の必須要素としてなる。要すれ
ば、例えば、細胞より核酸を得る場合は、細胞内より核
酸を抽出するための試薬等を構成要素として含めること
ができる。例えば、核酸吸着能を有する物質としてシリ
カゲルを用いる場合、核酸の分離試薬としての上記グア
ニジン塩酸溶液中にシリカゲルを懸濁させたゲル溶液
が、同時に細胞内より核酸を抽出するための試薬とな
る。
キットを提供する。該キットは、上記したような核酸吸
着能を有する物質を構成の必須要素としてなる。要すれ
ば、例えば、細胞より核酸を得る場合は、細胞内より核
酸を抽出するための試薬等を構成要素として含めること
ができる。例えば、核酸吸着能を有する物質としてシリ
カゲルを用いる場合、核酸の分離試薬としての上記グア
ニジン塩酸溶液中にシリカゲルを懸濁させたゲル溶液
が、同時に細胞内より核酸を抽出するための試薬とな
る。
【００３７】
【実施例】以下に本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも
のでは無い。
明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも
のでは無い。
【００３８】実施例１
（１）細胞溶解工程用トラップ容器の作製
図１に示す構造を有する細胞溶解工程用トラップ容器を
作製した。該容器は吸引ろ過に適した構造とした。 （２）核酸分離工程用トラップ容器の作製 図２に示す構造を有する核酸分離工程用トラップ容器を
作製した。該容器は吸引ろ過に適した構造とした。 （３）分離装置の作製 第１トラップ容器及び第２トラップ容器を固定できる吸
引装置を、振幅２ｍｍ〜３ｍｍ、振とう数０〜８００ｒ
ｐｍの能力を有する回転型振とう装置上に固定し、吸引
装置全体を振とうできる分離装置を作製した。図３は該
装置の模式図である。図３において、５はトラップ容
器、６はトラップ容器固定器具、７は回転型振とう装
置、８は減圧発生装置、９は廃液受け皿を示す。
作製した。該容器は吸引ろ過に適した構造とした。 （２）核酸分離工程用トラップ容器の作製 図２に示す構造を有する核酸分離工程用トラップ容器を
作製した。該容器は吸引ろ過に適した構造とした。 （３）分離装置の作製 第１トラップ容器及び第２トラップ容器を固定できる吸
引装置を、振幅２ｍｍ〜３ｍｍ、振とう数０〜８００ｒ
ｐｍの能力を有する回転型振とう装置上に固定し、吸引
装置全体を振とうできる分離装置を作製した。図３は該
装置の模式図である。図３において、５はトラップ容
器、６はトラップ容器固定器具、７は回転型振とう装
置、８は減圧発生装置、９は廃液受け皿を示す。
【００３９】実施例２ プラスミドDNA pUC19 の精製
（１）大腸菌JM109/pUC19 の培養
プラスミドpUC19 で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（10g ト
リプトン、5g酵母エキス、5g塩化ナトリウム／リット
ル）２．５ｍｌに植菌し、培養温度３７℃、振とう速度
１６０ｒｐｍにて１６時間培養し、ＯＤ600 約６の培養
液を調製した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（10g ト
リプトン、5g酵母エキス、5g塩化ナトリウム／リット
ル）２．５ｍｌに植菌し、培養温度３７℃、振とう速度
１６０ｒｐｍにて１６時間培養し、ＯＤ600 約６の培養
液を調製した。
【００４０】（２）ｐＵＣ１９ＤＮＡの調製
第１トラップ容器内に培養液２．５ｍｌを供し、−６０
０ｍｍＨｇ、約１５分間の減圧によってフィルター膜面
に菌体をトラップした。以後本明細書実施例における減
圧はすべて−６００ｍｍＨｇで行った。次に１００μｇ
／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む細胞懸濁用試薬〔１０ｍＭ
ＥＤＴＡ／５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）〕を
３００μｌ添加し、振幅２〜３ｍｍ、７２０ｒｐｍ、２
０分間の振とう操作により菌体を懸濁した。以後本明細
書実施例における振とう操作は、すべて振幅２〜３ｍ
ｍ、７２０ｒｐｍで実施した。該細胞懸濁液に２００μ
ｌの溶菌用試薬（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１．０％
ラウリル硫酸ナトリウム）を加えて１分間振とう動作を
加えた。更に中和溶液〔２．５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４．８）〕を２００μｌ添加して２分間振とうし、１０
分間の減圧によりプラスミドＤＮＡを含む粗核酸溶液を
第１トラップ容器下部よりあらかじめゲル溶液〔５０ｍ
ｇ／ｍｌシリカゲル（粒径：５μｍ、富士シリシア化学
社製）／７Ｍ塩酸グアニジン／２ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）〕を加えた第２トラップ容
器に採取した。３分間の振とう処理を行い、次に減圧を
４分間行い第２トラップ容器下部より不純物を含む液体
を廃棄してシリカゲルをトラップし、５００μl の洗浄
液〔５０％エタノール／１００ｍＭ 塩化ナトリウム／
２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭ トリス塩酸（pH7.5
）〕を添加後２分間の減圧により洗浄液を廃棄した。
更に再度洗浄液を500 μl 添加後減圧廃棄を３分間行
い、120 μl の滅菌水をシリカゲルに加えて１分間の振
とうを加えた。最後に２分間の減圧により第２トラップ
容器下部からエッペンドルフチューブにＤＮＡを含む溶
液を約１００μｌを回収した。その内１５μｌを電気泳
動して確認したところ、染色体ＤＮＡの混在は認められ
ず、確認されたＤＮＡの泳動位置より該ＤＮＡはｐＵＣ
１９ＤＮＡであることが確認された。一方、上記精製操
作において各工程の振とう操作を行わず同様のプラスミ
ドＤＮＡの精製を行った。振とう操作を加えない場合、
第２トラップ容器にプラスミドＤＮＡを含む粗核酸溶液
が回収できないなどの症状が発生した。これらの結果を
表１に示す。
０ｍｍＨｇ、約１５分間の減圧によってフィルター膜面
に菌体をトラップした。以後本明細書実施例における減
圧はすべて−６００ｍｍＨｇで行った。次に１００μｇ
／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む細胞懸濁用試薬〔１０ｍＭ
ＥＤＴＡ／５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）〕を
３００μｌ添加し、振幅２〜３ｍｍ、７２０ｒｐｍ、２
０分間の振とう操作により菌体を懸濁した。以後本明細
書実施例における振とう操作は、すべて振幅２〜３ｍ
ｍ、７２０ｒｐｍで実施した。該細胞懸濁液に２００μ
ｌの溶菌用試薬（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１．０％
ラウリル硫酸ナトリウム）を加えて１分間振とう動作を
加えた。更に中和溶液〔２．５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４．８）〕を２００μｌ添加して２分間振とうし、１０
分間の減圧によりプラスミドＤＮＡを含む粗核酸溶液を
第１トラップ容器下部よりあらかじめゲル溶液〔５０ｍ
ｇ／ｍｌシリカゲル（粒径：５μｍ、富士シリシア化学
社製）／７Ｍ塩酸グアニジン／２ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）〕を加えた第２トラップ容
器に採取した。３分間の振とう処理を行い、次に減圧を
４分間行い第２トラップ容器下部より不純物を含む液体
を廃棄してシリカゲルをトラップし、５００μl の洗浄
液〔５０％エタノール／１００ｍＭ 塩化ナトリウム／
２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭ トリス塩酸（pH7.5
）〕を添加後２分間の減圧により洗浄液を廃棄した。
更に再度洗浄液を500 μl 添加後減圧廃棄を３分間行
い、120 μl の滅菌水をシリカゲルに加えて１分間の振
とうを加えた。最後に２分間の減圧により第２トラップ
容器下部からエッペンドルフチューブにＤＮＡを含む溶
液を約１００μｌを回収した。その内１５μｌを電気泳
動して確認したところ、染色体ＤＮＡの混在は認められ
ず、確認されたＤＮＡの泳動位置より該ＤＮＡはｐＵＣ
１９ＤＮＡであることが確認された。一方、上記精製操
作において各工程の振とう操作を行わず同様のプラスミ
ドＤＮＡの精製を行った。振とう操作を加えない場合、
第２トラップ容器にプラスミドＤＮＡを含む粗核酸溶液
が回収できないなどの症状が発生した。これらの結果を
表１に示す。
【００４１】
【表１】
表１
──────────────────────────────────
工程 1+ 2 + 3 + 1 - 2 + 3 + 1 + 2 - 3 + 1+ 2 + 3 -
収量 10.6μg (約 0.3μg) (約 0.2μg) 3.3 μg
──────────────────────────────────
【００４２】なお、表１の工程項において、１、２、３
は以下の工程を示す。 １；第１トラップ容器にトラップされた菌体を懸濁用試
薬で懸濁する工程 ２；１工程で懸濁した菌体を溶菌させる工程 ３；２工程で得られた粗核酸液とシリカゲル懸濁液とを
混和する工程 また各数字の後ろに付した＋は該工程において振とう操
作を実施したことを、−は該工程において振とう操作を
実施しなかったことを示す。一方収量の項におい
て、（）は精製途中段階でフィルターが詰ったことを示
す。なお上記値は、フィルターが詰まってもそのまま操
作を実施した場合の値である。
は以下の工程を示す。 １；第１トラップ容器にトラップされた菌体を懸濁用試
薬で懸濁する工程 ２；１工程で懸濁した菌体を溶菌させる工程 ３；２工程で得られた粗核酸液とシリカゲル懸濁液とを
混和する工程 また各数字の後ろに付した＋は該工程において振とう操
作を実施したことを、−は該工程において振とう操作を
実施しなかったことを示す。一方収量の項におい
て、（）は精製途中段階でフィルターが詰ったことを示
す。なお上記値は、フィルターが詰まってもそのまま操
作を実施した場合の値である。
【００４３】表１から明らかなように、一部工程に振と
う操作を加えなかった場合のプラスミドＤＮＡの回収量
は全工程に振とう操作を加えた場合の約３分の１から約
５０分の１であり、特に菌体懸濁工程及び溶菌工程にお
ける振とう操作により収量が顕著に増加した。
う操作を加えなかった場合のプラスミドＤＮＡの回収量
は全工程に振とう操作を加えた場合の約３分の１から約
５０分の１であり、特に菌体懸濁工程及び溶菌工程にお
ける振とう操作により収量が顕著に増加した。
【００４４】（３）精製ＤＮＡの純度確認
（２）において１+ ２+ ３+ 工程で調製したｐＵＣ１９
ＤＮＡ約０．５μｇを１箇所切断する制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造社製）１０単位を含む反応液中で３７℃、１
時間で消化し、０．７％アガロース電気泳動で評価し
た。その結果環状のｐＵＣ１９ＤＮＡが一箇所で切断さ
れて直鎖状になっておりその反応を阻害していなかっ
た。更に該プラスミドを蛍光プライマーを用いたジデオ
キシ法によりシークエンスを行ったところ、明りょうな
シグナルが確認された。すなわち制限酵素、シークエン
ス反応を阻害しない純度の高いｐＵＣ１９ＤＮＡの精製
が可能であった。
ＤＮＡ約０．５μｇを１箇所切断する制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造社製）１０単位を含む反応液中で３７℃、１
時間で消化し、０．７％アガロース電気泳動で評価し
た。その結果環状のｐＵＣ１９ＤＮＡが一箇所で切断さ
れて直鎖状になっておりその反応を阻害していなかっ
た。更に該プラスミドを蛍光プライマーを用いたジデオ
キシ法によりシークエンスを行ったところ、明りょうな
シグナルが確認された。すなわち制限酵素、シークエン
ス反応を阻害しない純度の高いｐＵＣ１９ＤＮＡの精製
が可能であった。
【００４５】実施例３ プラスミドＤＮＡ ｐＢＲ３２
２の精製 大腸菌HB101 をpBR322で形質転換したものを実施例２と
同様にして培養を行い、pBR322の精製も実施例２に記載
した方法と同様に行った。
２の精製 大腸菌HB101 をpBR322で形質転換したものを実施例２と
同様にして培養を行い、pBR322の精製も実施例２に記載
した方法と同様に行った。
【００４６】
【表２】
表２
─────────────────────────────────
工程 1+ 2 + 3 + 1 - 2 + 3 + 1 + 2 - 3 + 1 + 2 + 3 -
収量 5.5 μg (約 0.4μg) (約 1.1μg) 1.5μg
─────────────────────────────────
【００４７】表２における各項の記載は、表１に準じ
る。
る。
【００４８】一般にｐＢＲ３２２はｐＵＣ１９よりもそ
の回収量が少ないことが知られているが、表２に示した
ように精製段階での振とうを与えない場合はｐＵＣ１９
の場合と同様にその回収量が減少していることが確認さ
れた。更に１+ ２+ ３+ 工程で精製したｐＢＲ３２２の
０．５μｇ分を１０単位分の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒
造社製）で切断したところ良好な切断パターンが電気泳
動の結果から得られた。以上実施例１及び２から強制分
散処理装置を有する本装置によって大腸菌からのプラス
ミド回収率を顕著に改善できることが明らかとなった。
の回収量が少ないことが知られているが、表２に示した
ように精製段階での振とうを与えない場合はｐＵＣ１９
の場合と同様にその回収量が減少していることが確認さ
れた。更に１+ ２+ ３+ 工程で精製したｐＢＲ３２２の
０．５μｇ分を１０単位分の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒
造社製）で切断したところ良好な切断パターンが電気泳
動の結果から得られた。以上実施例１及び２から強制分
散処理装置を有する本装置によって大腸菌からのプラス
ミド回収率を顕著に改善できることが明らかとなった。
【００４９】実施例４ ヒト培養細胞からのＤＮＡの精
製 ＰＢＳで洗浄したヒト培養細胞１００μｌ（１ｘ１０4
〜１×１０6 個）を第２トラップ容器に注入し、実施例
２の（２）記載のＲＮａｓｅＡを含有する細胞懸濁用試
薬を１００μｌ及び０．２％ ＳＤＳ溶液を２００μｌ
添加し、５分間の振とうを行った。その後実施例２の
（２）記載のゲル溶液５００μｌを添加し、振とう操作
により５分間混合した。第２トラップ容器を３分３０秒
間減圧してシリカゲルをトラップし、実施例２の（２）
記載の洗浄液３００μｌを添加し４分間の振とうを加え
てゲルの洗浄を行った。２分間減圧してシリカゲルをト
ラップし、再度洗浄処理を施した後、５００μｌの洗浄
液を添加して２分間の減圧により洗浄を行った。１５０
μｌの滅菌水をシリカゲルに添加して、１５分間の振と
うを加えてシリカゲルからＤＮＡを溶出させ、最後に２
分間の減圧により、ＤＮＡを含む溶出液をエッペンドル
フチューブに回収した。この結果約４μｇのＤＮＡが得
られ、その内の約０．２μｇを１０単位の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで３７℃、１時間切断し電気泳動で確認したとこ
ろＤＮＡは消化された。したがって該方法により得られ
たＤＮＡは、制限酵素反応を阻害しないことが明らかと
なった。
製 ＰＢＳで洗浄したヒト培養細胞１００μｌ（１ｘ１０4
〜１×１０6 個）を第２トラップ容器に注入し、実施例
２の（２）記載のＲＮａｓｅＡを含有する細胞懸濁用試
薬を１００μｌ及び０．２％ ＳＤＳ溶液を２００μｌ
添加し、５分間の振とうを行った。その後実施例２の
（２）記載のゲル溶液５００μｌを添加し、振とう操作
により５分間混合した。第２トラップ容器を３分３０秒
間減圧してシリカゲルをトラップし、実施例２の（２）
記載の洗浄液３００μｌを添加し４分間の振とうを加え
てゲルの洗浄を行った。２分間減圧してシリカゲルをト
ラップし、再度洗浄処理を施した後、５００μｌの洗浄
液を添加して２分間の減圧により洗浄を行った。１５０
μｌの滅菌水をシリカゲルに添加して、１５分間の振と
うを加えてシリカゲルからＤＮＡを溶出させ、最後に２
分間の減圧により、ＤＮＡを含む溶出液をエッペンドル
フチューブに回収した。この結果約４μｇのＤＮＡが得
られ、その内の約０．２μｇを１０単位の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで３７℃、１時間切断し電気泳動で確認したとこ
ろＤＮＡは消化された。したがって該方法により得られ
たＤＮＡは、制限酵素反応を阻害しないことが明らかと
なった。
【００５０】実施例５ ヒト全血からのＤＮＡの精製
１）従来法によるＤＮＡの精製
公知の３種類の抗凝固処理、つまりクエン酸、ＥＤＴ
Ａ、ヘパリン処理を行ったヒト全血８０μｌを第２トラ
ップ容器に注入し、ＲＮａｓｅを含む実施例２の（２）
記載の懸濁用試薬を１００μｌ及び０．２％ ＳＤＳ溶
液を１５０μｌを添加し、３分間の振とう処理を行っ
た。そこに実施例２の（２）と同様に調製したゲル溶液
を７００μｌを加えて、５分間の振とうを与えた後、３
分３０秒間減圧してフィルター下部より不純物を含む液
体を廃棄してシリカゲルをトラップした。３００μｌの
洗浄液を添加後、４分間の振とうを行いゲルをよく洗浄
し、２分間の減圧によりシリカゲルをトラップした。同
様の操作を再度繰り返した後、５００μｌの洗浄液を添
加して２分間の減圧によりシリカゲルをトラップした。
最後に１５０μｌの滅菌水をシリカゲルに添加して振と
うを１分間操作を行い、減圧によりフィルター下部より
ＤＮＡを含む溶液をエッペンドルフチューブに回収し
た。全工程に要した時間は約６０分であった。その結果
３種類の試料からいずれも約２μｇのＤＮＡが得られ、
その一部（約２００ｎｇ）のＤＮＡ溶液を実施例２の
（３）と同様に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した結果、Ｄ
ＮＡは消化された。またヒト染色体ＤＮＡのβ−globin
領域を増幅させるプライマーを用いてＰＣＲを行ったと
ころ増幅反応の阻害もなくＤＮＡ断片の良好な増幅が見
られ、本方法で調製したＤＮＡがＰＣＲ法の鋳型として
適切であることが確認された。
Ａ、ヘパリン処理を行ったヒト全血８０μｌを第２トラ
ップ容器に注入し、ＲＮａｓｅを含む実施例２の（２）
記載の懸濁用試薬を１００μｌ及び０．２％ ＳＤＳ溶
液を１５０μｌを添加し、３分間の振とう処理を行っ
た。そこに実施例２の（２）と同様に調製したゲル溶液
を７００μｌを加えて、５分間の振とうを与えた後、３
分３０秒間減圧してフィルター下部より不純物を含む液
体を廃棄してシリカゲルをトラップした。３００μｌの
洗浄液を添加後、４分間の振とうを行いゲルをよく洗浄
し、２分間の減圧によりシリカゲルをトラップした。同
様の操作を再度繰り返した後、５００μｌの洗浄液を添
加して２分間の減圧によりシリカゲルをトラップした。
最後に１５０μｌの滅菌水をシリカゲルに添加して振と
うを１分間操作を行い、減圧によりフィルター下部より
ＤＮＡを含む溶液をエッペンドルフチューブに回収し
た。全工程に要した時間は約６０分であった。その結果
３種類の試料からいずれも約２μｇのＤＮＡが得られ、
その一部（約２００ｎｇ）のＤＮＡ溶液を実施例２の
（３）と同様に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した結果、Ｄ
ＮＡは消化された。またヒト染色体ＤＮＡのβ−globin
領域を増幅させるプライマーを用いてＰＣＲを行ったと
ころ増幅反応の阻害もなくＤＮＡ断片の良好な増幅が見
られ、本方法で調製したＤＮＡがＰＣＲ法の鋳型として
適切であることが確認された。
【００５１】２）短時間処理によるヒト全血からのＤＮ
Ａの精製 １）記載の３種類のヒト全血１００μｌを第２トラップ
容器に注入し、これに実施例２の（２）記載のゲル溶液
１ｍｌを添加後、１１分間の振とう処理を行った。その
後４分間の減圧により不純物の廃棄とシリカゲルの回収
を行い、その後は実施例３の場合と同様にして、ゲルの
洗浄を行った後核酸の回収を行った。なお、全工程に要
した時間は約４５分であった。その結果３種類の試料か
らいずれも約２．５μｇの核酸が回収され、実施例４記
載の方法と同等の核酸回収率が得られた。また、１）で
用いたβ−globin領域を増幅させるプライマーを用いて
ＰＣＲ反応を行ったところ良好なＤＮＡ増幅が確認さ
れ、一方制限酵素による切断反応の阻害も認められず、
純度も１）記載の方法により調製した核酸と同等である
ことが確認された。上記の結果より明らかなように、３
試料を用いた場合従来法１）では約６０分要していた核
酸精製工程を約４５分に短縮することができた。また従
来法に比べ核酸精製に用いる試薬、すなわち細胞懸濁試
薬、細胞溶解試薬が不要となった。
Ａの精製 １）記載の３種類のヒト全血１００μｌを第２トラップ
容器に注入し、これに実施例２の（２）記載のゲル溶液
１ｍｌを添加後、１１分間の振とう処理を行った。その
後４分間の減圧により不純物の廃棄とシリカゲルの回収
を行い、その後は実施例３の場合と同様にして、ゲルの
洗浄を行った後核酸の回収を行った。なお、全工程に要
した時間は約４５分であった。その結果３種類の試料か
らいずれも約２．５μｇの核酸が回収され、実施例４記
載の方法と同等の核酸回収率が得られた。また、１）で
用いたβ−globin領域を増幅させるプライマーを用いて
ＰＣＲ反応を行ったところ良好なＤＮＡ増幅が確認さ
れ、一方制限酵素による切断反応の阻害も認められず、
純度も１）記載の方法により調製した核酸と同等である
ことが確認された。上記の結果より明らかなように、３
試料を用いた場合従来法１）では約６０分要していた核
酸精製工程を約４５分に短縮することができた。また従
来法に比べ核酸精製に用いる試薬、すなわち細胞懸濁試
薬、細胞溶解試薬が不要となった。
【００５２】実施例６ 核酸精製用キットの構築
ヒト全血用核酸精製キット（１００回分）として以下の
ものを構築した。 ゲル溶液 １００ｍｌ ７Ｍ 塩酸グアニジン ２ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５） ５ｇ シリカゲル 洗浄液 ５５ｍｌ ２００ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ ＥＤＴＡ ２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５） （ただし、用時１００％エタノールを等量混合） 核酸溶出液 １５ｍｌ １０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０） １ｍＭ ＥＤＴＡ
ものを構築した。 ゲル溶液 １００ｍｌ ７Ｍ 塩酸グアニジン ２ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５） ５ｇ シリカゲル 洗浄液 ５５ｍｌ ２００ｍＭ 塩化ナトリウム ５ｍＭ ＥＤＴＡ ２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５） （ただし、用時１００％エタノールを等量混合） 核酸溶出液 １５ｍｌ １０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０） １ｍＭ ＥＤＴＡ
【００５３】
【発明の効果】本発明のトラップ装置と強制分散設備か
らなることを特徴とする分離装置により、簡便で迅速な
核酸の精製が可能となる。また本発明の核酸精製方法に
より従来のものに比べ格段に迅速、簡便な核酸精製方法
が提供される。
らなることを特徴とする分離装置により、簡便で迅速な
核酸の精製が可能となる。また本発明の核酸精製方法に
より従来のものに比べ格段に迅速、簡便な核酸精製方法
が提供される。
【図１】細胞溶解工程用トラップ容器の構造を示す模式
図である。
図である。
【図２】核酸分離工程用トラップ容器の構造を示す模式
図である。
図である。
【図３】本発明の分離装置の１例の構造を示す模式図で
ある。
ある。
１：細胞溶解工程用トラップフィルター、２：容器、
３：核酸分離工程用トラップフィルター、４：容器、
５：トラップ容器、６：トラップ容器固定器具、７：回
転型振とう装置、８：減圧発生装置、９：廃液受け皿
３：核酸分離工程用トラップフィルター、４：容器、
５：トラップ容器、６：トラップ容器固定器具、７：回
転型振とう装置、８：減圧発生装置、９：廃液受け皿
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(72)発明者 加藤 郁之進
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造
株式会社中央研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA19 AA20 CA01 CA11 CA20
GA30 HA20
Claims (5)
- 【請求項１】 トラップ装置と強制分散設備からなるこ
とを特徴とする分離装置。 - 【請求項２】 トラップ装置を使用する核酸の分離精製
方法において、該トラップ装置を用いる処理の少なくと
も一つの処理に請求項１記載の分離装置を用いることを
特徴とする核酸の分離精製方法。 - 【請求項３】 細胞膜を有する核酸源自体に核酸吸着能
を有する物質を作用させることを特徴とする核酸の分離
精製方法。 - 【請求項４】 カオトロピックイオン存在下で実施する
ことを特徴とする請求項３記載の核酸の分離精製方法。 - 【請求項５】 請求項３又は４記載の方法により核酸を
精製するためのキットであって、核酸吸着能を有する物
質を構成の必須要件とする核酸精製のためのキット。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP09442897A JP2003144149A (ja) | 1997-03-31 | 1997-03-31 | 分離装置及びその使用方法 |
| PCT/JP1998/001455 WO1998043724A1 (en) | 1997-03-31 | 1998-03-30 | Isolation apparatus |
| TW87104843A TW416867B (en) | 1997-03-31 | 1998-03-31 | Separation apparatus, separation method, nucleic acid separation purification method, nucleic acid separation purification kit |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09442897A JP2003144149A (ja) | 1997-03-31 | 1997-03-31 | 分離装置及びその使用方法 |
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|---|---|
| JP2003144149A true JP2003144149A (ja) | 2003-05-20 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (3)
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-
1998
- 1998-03-30 WO PCT/JP1998/001455 patent/WO1998043724A1/ja active Application Filing
- 1998-03-31 TW TW87104843A patent/TW416867B/zh not_active IP Right Cessation
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