TW416867B - Separation apparatus, separation method, nucleic acid separation purification method, nucleic acid separation purification kit - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消f合作社印絮 技術範疇 本發明係關於分離裝置，以及核酸、蛋白質等生體物質 之分離方法。背景技術 藉考遣傳工程技術之進步，以做爲遗傳情報之載體之核 酸、及蛋白質等生體物質爲對象之研究頗有進展。核酸大 體分爲RNA及DNA，根據其機能又可分類爲數種。舉例 D之’ 體爲與宿主之染色體分開且在細胞内自行增殖之 寄生性複製子，其在重组DNA實驗中廣被用在載體（遺傳 密碼之運送站）。質體之一般精製法，有伯姆葆姆 (Birmboim，H. C_ )及桃利（Doly, J.)之鹼性溶菌法（Birmb〇im， H.C.及 Doly，J‘，Nucleic Acids Research，第 7 卷，第 1513〜1523頁），及何姆斯（Holmes, D.S.)等人之煮滞法 [Holmes, D.S.，Analytical Biochemistry，第 114 卷，第 193頁（1981 )]。 另一方面’爲了調節生物本來之機能，以編碼各生物固 有之遺傳情報之染色體组DNA爲對象之研究盛行。^在 已開發出各種染色體组DNA之精製方法，舉例言之，從 動物等有核細胞抽出DNA及精製可以利用馬默（Marmur，N‘）及史丹佛（Stafford, D.W.)之方法[Manniir，N.， Stafford，D.W. ’ Nucleic Acids Research，第 3 卷，第 2303頁（ 1975 )] ’以及其乏變化法[ 1982年，冷泉港實驗室發 行，T. Maniatis 等人著，Molecular Cloning, A LaboratoryManual ’ 第 86〜96 頁]。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本U ) t— . n τ - I -- I 味 —-L-1 - -τ I . I · 經濟部中央標举局男工消费合作社印采 416867 A7 __________B7 五、發明説明（2 ) 在上述方法中，爲了除去混在細胞内之其他成分，例如 蛋白質等’不得不使詩、氯仿等危險落劑，$ 了解決該 問題’已開發出各種方法。舉例言之，用適當的界面活性 劑溶解細胞後，將該溶解液用適當的核酸酵素及蛋白酵素 處理，再藉著添加離液序列高之物質（cha〇tr〇picagem)從 核酸中將殘留之蛋白質變性及除去，然後藉著透析該液而 調製核酸之方法[特開昭63_91〇93號]。又如利用核酸於存 在高濃度之離液序列高之物質如過氣酸鈉或碘化鈉等下， 會選擇性地結合於玻璃上之性質，使用溶解有離液序列高 之物質之緩衝液，以及在該缓衝液中使用能選擇性吸附核 故之溶媒不溶性載體而進行核酸之分離及精製之方法。關 於該方法’例如有：馬克等人之方法，其係在保有質體之 大腸菌依照伯姆葆姆之方法以鹼_SDS處理繼而中和處理 後所得到之含質體溶液中，進行乙醇沉澱處理及5 M氣化 裡處理’然後使用離液序列高之物質及玻璃粉末而調製質 月里 DNA [Marko Μ. A•等人 ’ Analytical Biochemistry，第 121卷，第382〜387頁（ 1982)];卡特等人之方法，其係從 馬克等人之方法中省去乙醇沉殿處理及5 Μ氣化麵處理步 驟之方法[Carter，Μ. 及 Milton, I.D.，Nucleic Acids Research ’第2 1卷’第1044頁（1993 )];克利斯坦森等人 之方法，其係將存在於M13噬菌了體粒子内之一 DNA鏈用離 液序列高之物質及玻<璃纖據器精製[Kristensen，T.等 人’ Nucleic Acids. Research，第 1 5 卷，第 5507〜5516 頁 ( 1987)];以及布姆等人之方法，其係藉著將全血等生物 -5- ^ ί--’裂-----一—訂------線 (諳先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸乐尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（2丨0XW7公釐） ~~ ~ 經"·部中央標丰局具工消費合作社印^ 416367 αί _______Β7____________ 五、發明説明（3 ) 試料懸浮於含有離液序列高之物質及氧化矽粒子之緩衝液 中，而將試料所含之細胞中核酸精製[Boom, R.等人， Journal of Clinical Microbiology，第 28 卷，第 495〜503 頁 (1990)]。又，在本説明書中使用之「核酸吸附體」沒有 特別限定，意指於離液序列高之物質存在下，能選擇性吸 附核酸之容媒不溶性載體。 再者，已知離液序列高之陰離子能溶解瓊脂糖凝膠，亦 曾報告使用離液序列高之物質以及玻璃粒子或玻璃纖維而 將存在於違脂糖凝勝中之核酸精製之方法[Vogelstein, Β. 等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ，第 76 卷，第 615~619 頁 ( 1979) ; Carton, W‘C.等人，Analytical Biochemistry，第 101 卷，第 339〜341 頁（1980)]。 雖然核酸之分離精製爲現在遺傳密碼操作之基本，但浪 費時間，而且依照此等方法以手操作進行多種試料之核酸 之分離精製時’由於微量必須熟練，因此常可見到因實驗 者不同而回收量及純度有所差異。爲了解決該問題，雖然 將公知方法自動化之機器已被發售，但各裝置仍有起因於 採用之核酸分離精製方法及該裝置之機構所引起之問題， 諸如質體DNA等對象試料有限制，處理試料數少，回收 量不安定’要取得設置場所，精.製需要時間及高價等。 本發明之目的爲改C用於先前生體物質之分離方法之截 留裝置，以解決上述問題。 -6 - 適用中國國家標準（ CNTsiA4^格（2ϊ〇ϋ公釐] -----r·----裝-------訂------咏 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 416387 五、發明説明（4 ) 發明之揭示 本發明概略而言，本發明之第ί發明係關於一種從混合 物分離出目的物之分離裝置，其特徵爲具備將混合物中i 截留對象物予以截留之裝置，以及將強制分散力施於該哉 田裳置所截留之截留對象物及/或截留前含有截留對象物 之液體，以使截留對象物及/或截留前之截留對象物分散 之強制分散裝置。 再者，本發明之第2發明係關於使用第j發明之分離裝 置之生體物質之分離方法。 本發明之第3發明係關於一種核酸之分離精製方法，其 特徵爲具有下列步驟： (a) 進行細啤之溶解以及細胞溶解物之強制分散，而得 到粗核酸溶液之步隸； (b) 使前述步驟（a )得到之粗核酸溶液中之核酸，於強 制分散下截留於核酸吸附體之步驟；以及 (c) k則述步驟（b )截留核酸之核酸吸附體中，於強制 分散下;客出核酸之步驟。 . 再者，本發明之第4發明係關於一種用於上述第3發明 之核酸分離精製方法中之核酸分離精製用套组。 本發明者爲了解決上述問題而銳意檢討，結果發現在使 用截田襞置之生體物質（以核酸二蛋白質爲代表）之精製及 處步驟中’於將該裝置截留之對象物分散於精製該截留 對象物所集要之試藥中時，藉著賦予截留對象物之分散物 強制刀教力’能夠顯著改善該截留對象物之回收率及被回 本錄尺^ 用中 I —1 - . -一 - - ~ - — - ί I 1 士 衣 ^^1« I » I I 先閑¾背面之>±意事if再填巧本Ϊ ) 恕濟部中央榡準局負工消費合作社印繁 1TΜ------L---------- m 11 ·. 第87HM843號專利_請案 中文說明書修正頁(88年1月） A7 B7 五、發明説明（5 ) 416S67 I n ---- - - ---士民—----1-1 丁 (請先閲讀背面之注意事項再填离本頁) 收之該截留對象物之純度’因而開發出具備強制分散震置 之分離裝置。又，在本發明中，「分散」係指將懸浮、混 合等之固體-液體或液體-液體均—化之意。 圖式之簡單說明 第1圖為顯示細胞溶解步驟用之截留容器之構造之模式圖d 第2圖為顯示核酸分離步騾用之截留容器之構造之模式圖。 第3圖為顯示本發明之分離裝置之1例之構造之模式圖。 元件符號之對照說明 1 細胞溶解步騾用之截留濾器； 2 容器； 3 核酸分離步驟用之截留濾器； 4 容器； 5 截留容器； 6 截留容器固定器具； 7 回轉型振動裝置； 8 減壓裝置； 9 .廢液受納皿。 實施本發明之最佳形態 以下，將具體說明本發明。 第1發明係關於一種從混合物分離出目的物之分離裝置 ’其特徵為具備將混合物中之截留對象物予以截留之裝置 ’以及將強制分散力施於該截留裝置所截留之截留對象物 及/或截留前含有截留對象物之液體，以使截留對象物及/ 或截留前之截留對象物分散之強制分散裝置。 做為上述混合物者，無特殊限制，可被列舉之例有動物 細胞、植物細胞、細菌細胞、身體组織等之培養物及彼等 之溶解物以及化學合成物等。又，做為前述溶解物者，包 -8- _____—_________ 張尺度適5中SS家標这（CNS 1 A4i.i格ί 公沒） A7 416367 -____B7 五、發明説明（6 ) ^-----〜____ 含藉一般方法將動物細胞 '植物細胞、細_名 織等破壞，並溶解於適當緩衝液者^ 囷’田胞及身體組 在本説明書中，所謂「截留對象物」 、 ' 成'〉昆合妨I + τί*ν 分離出目的物之時在各個步驟中被截留 ·奶义中 田〈物。舉例专夕 在分離核酸之場合，係指從細胞培養 ^ ， Μ 丫觀留之「^ 胞」，及從細胞溶解物中被截留之「核酸」。 ， 再者，在本説明書中’ Γ目的物」係指從混合物中 之目的物質，例如，從前述列舉之混合物中所分離出' ’ 酸、蛋白質、肽、抗體及化合物等a " 做爲前述分離裝置之截留裝置’以能從混合物中僅將截 留對象物選擇性地截留者爲較佳。例如，從細胞培養液選 擇性截留細胞之場合，除藉施加離心力於含細胞培養液之 容器而使細胞沉澱並藉除去上清液而截留細胞之裝置之 外’可舉之例尚有在保持截留濾器之容器中加入細胞培養 液’該截留濾、器由具有孔极爲〇. 3〜1 · 0 ju m之孔之硼沙酸鹽 玻璃膜纖維等製成，然後藉著減壓過濾、加壓過濾或離心 過濾等機構將細胞過濾及截留之裝置。用於該裝置之截留 容器，以能保持截留濾器之一般圓筒狀容器爲較佳，截留 容器之性質及形狀爲能用於一般分離方法，例如藏展過濾 法 '加壓過攄法及離心過濾、.法等之性質及形狀爲較佳’保 持濾器之容器與截留濾器爲组裝^式及一體式皆可。就裝置 之小型化及輕量化而f，以使用截留濾器之裝置爲較佳。 更特定而言，在構造之簡化方面，利用.滅壓過遽之截留裝 置爲較佳。 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐} (讀先閎讀背面之注意事項再填荇本頁} 竿 訂_ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印策 A7 416867 ----—______B7_____ 五、發明説明（7 ) 另—方面’本發明分離裝置之強制分散裝置’例如用在 知截留裝置截留之截留對象物分散於液體中之場合，係指 用自然分散力加上來自外部之能量予以強制分散之裝置。 強制分散裝置可被列舉之例有振動裝置，超音波產生裝置 或輪轂裳置。 在本發明之分離裝置中，截留裝置與強制分散裝置可被 直接連結’亦可經由將截留裝置截留之截留對象物或前述 強制分散裝置分散之分散物（即含有截留前之截留對象物 I液體）在該二裝置間移送（即從截留裝置移送至強制分散 裝置’或從強制分散裝置移送至截留装置）之移送機構間 接連結。 關於截留裝置與強制分数裝置被直接連結之分離裝置， 可被列舉之例爲具有能賦予保持截留濾器之容器強制分散 力之構造之分離裝置。例如藉由振動裝置直接賦予保持截 留遽器之容器強制分散力並藉減壓過濾進行截留之構造 (亦即能使減壓過濾裝置全體振動之分離裝置等）。 截留裝置與強制分散裝置經由前述移送機構而被間^連 結之分離裝置，例如截留裝置與強制分散裝置藉著移送被 截留之截留對象物或其分散物本身之試管、吸量管等移送 機構間接連結之分離裝置’或者藉著將截留裝置本身移送 至強制分散裝置之移送機構或將L強制分散裝置本身移送至 截留裝置之機構，而邊間接連結之分離裝置。 在本發明之分離裝置中，由於具有如此之構成，因此能 一面藉前述截留裝置從混合物截留住截留對象物，—面藉 -10- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4〗見格（2】OX 297公€ 一 -——- (請先閲讀背面之注意事項再填艿本頁 '裝. 、?τ 經满部中决標準局肩工消f合作社印絮 416867 A7 五、發明説明（8 ) 經漭部中央標準局员工消费合作社印^ 該強制f散裝置將被截留之截留對象物分散於液體中。再 者，亦能將含有截留前之截留對象物之液體預先提供至前 迷強制分散裝置，而在將截留前之截留對象物充分分散之 後或者與分散同時’將截留對象物從混合物中截留。 本發明t分離裝置之操作，能藉自動控制裝置自動化， 乂及有效率地進行目的物之分離。亦即，本發明之分離较 置尚具備可控制截留裝置，強制分散裝置，以及可選擇性· 存在疋#送機構 < 各個操作按照操作手册操作之控制機構 者’亦在本發明之範園内。 在本發明I分離裝置中，能藉前述截留裝置從混合物中 將截留對象物截留，並藉強制分散裝置將被截留之截留對 象物分散於液體而分離之目的物，例如有細胞内核酸、蛋 白具抗姐等。再者’藉著將含有截留前之截留對象物之 液體預先提供至前述強制分敢裝置，並在將截留前之截留 對象物无分分散之後，將截留對象物從混合物中截留而分 離之目的物，例如有電泳後凝膠中之核酸，電泳後凝勝中 之蛋白質，電泳後凝膠中之肽等。藉著將含有截留前之截 留對象物之液體預先提供至前述強制分散裴置，並在將截 留前之截留對象物分教之同時，將截留對象物從混合物中 截留而分離之目的物，例如有細胞内核酸、蛋白質、抗體 等。 — 几月致 第2發明係關於使用•前述第1發明之分離襞置之生體物 質之分離方法。前述分離裝置，例如能被用於生體：質 (例如核酸、蛋白質 '抗體等）之精製。蛋白質之精製之一 -11 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS)A4規格（2ΐ〇χ297公楚〉 f辞先閱讀背面之注意事項再填^C本頁) 裝 -11 " 經漭部中央掉準局員工消资合作社印$! 416367 at ___________B7 五、發明説明（9 ) 例爲使用蛋白質精製所用之不溶性载體及蛋白質溶液之批 式處理，本發明心分離裝置適合用於該批式處理。亦即在 本發明之分離裝置之截留容器中添加蛋白質溶液及蛋白質 精製用不溶性載體後，藉著用本發明之分離裝置之強制分 散裝置將蛋白質精製用不 、溶性載體分散於蛋白冑溶液中， $促使欲吸附於不溶性載體之物質吸附於載體。做爲蛋白 質精製用不溶性載體者，爲—般用於蛋白質精製之樹脂， =如離子交換樹脂、親和層析用樹脂、疏水層析用樹脂 等。，者，本發明之分㈣置，亦能用於蛋白質溶液之緩 衝液交換。例如，在本發明之分離裝置之截留容器中’安 裝有可以截冑目^白質且一般用於蛋白f精製之差分 膜’在該容器中添加目的蛋白質溶液後，藉著進行過濾操 作而能將溶液中之蛋合質濃縮。繼而將要交換组成之緩衝 液添加至前述截留容器中，以稀釋濃縮之蛋白質，並再度 施行過濾操作。必要時，藉著反覆進行過濾操作，能夠^ 行蛋白質溶液之緩衝成分之交換。在藉著前述過濾操作稀 釋之時，經由使用強制分散裝置將截留容器内之液體充分 分散及混合，能夠將緩衝液成分之交換效率提高。再者: 藉著將前述差分膜交換成適於核酸溶液滾縮之差分膜，則 除了能將本發明之分離裝置用於核酸溶液之緩衝成分之交 換等外，本發明之分離裝置亦也用於核酸之分離精製方 法 3 . _ 本發明之第二發明係關於一種核酸之分離精製方法，並 特徵爲具有下列步驟： ” -12 本纸張尺度適用中國國家標準_ ( CNS )祕桃（2】〇χ297公瘦 -----f---.批衣--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫木頁〕 訂 經濟部中央標準局貝工消费合作社印繁 416367 A7 B7 五、發明説明（10 ) ~~~~ (a) 進行細胞之溶解以及細胞溶解物之強制分散，而得 到粗核酸溶液之步驟； (b) 使前述步驟（a)得到之粗核酸溶液中之核酸，於強 制分散下截留於核酸吸附體之步騾；以及 (c) 從前述步驟（b)截留核酸之核酸吸附體中，於強制 分散下溶出核酸之步驟。 在步驟（a)中之細胞較佳於強制分散下被溶解。 在進行前述強制分散之時’可以同樣使用前述本發明之 分離裝置所用之強制分散裝置。亦即，藉著使用振動裝 置’超音波產生裝置及輪轂裝置等，可以進行強制分散。 在本發明中，「於強制分散下溶解」，「於強制分散下 戴留」或「於強制分散下溶出」包含與溶解、截留或溶出 操作同時進行強制分散之態樣，以及溶解、截留或溶出操 作之後進行強制分散之態樣。藉此，溶解、截留及溶出效 率提高。 又，在本發明之核酸之精製分離方法中，藉著使用前述 弟1發明所記載之分離裝置’能夠迅速且簡便地回收高純 度核酸。 舉例言之，在精製細胞内核酸之場合，大體分爲藉著溶 解細胞從細胞中抽出含核酸之細胞溶解物之步躁（細胞溶 解步驟），以及核酸與其他細胞包含有物分離之步骤（核酸 分離步驟）。本發明之~裝置可同時用於此二步撒。 用於細胞溶解步驟之截留濾器，爲能將保持核酸之微生 物或細胞，以及微生物或細胞之破壞物保持適當分散狀態 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS > A4規格（2丨OX：Z97公釐） -I I— ^1. I » —I— I * 士k _ I n _ ^^1 τ. - I I I _ I 來 (請先閱讀背面之注意事項再填爲本頁) A7 B7 416^B7 五、發明説明（11 ) 之膜爲佳，再者期望在該膜上進行微生物或細胞之分離， 以及被分離之微生物或細胞之破壞。前述截留過遽器 例言之，雖然可使用具有保留粒子徑爲〇3〜1〇㈣之 硼矽酸鹽玻璃纖維膜，但從微生物或細胞之保持能力、本 有核酸之微生物或細胞内成分之分離時間言之，以具有σ 留粒子徑爲0.4〜O.hm之孔之膜爲較佳，並宜在具有該^ 園之保留粒子徑之膜中選擇適合於試料者。又，保留二子 徑以均一爲佳，且以在0.4〜〇.8//m之範圍内爲佳。， 膜面積、膜厚等以選擇適合試料之性狀、處理量或處理時 間等者爲佳。 ^ 再一方面’在核酸分離步驟中，例如，可以使用藉分子 量差異分離之差分膜。例如，在特開昭63_91〇93號記載之 方法中，雖然核酸與其他物質之最終分離使用透析法，但 在該方法適用於本發明之分離裝置之場合，可以將最後步 驟之溶液注入用差分膜做爲截留遽器之截留容器中，然後 反覆進行藉減壓過濾濃縮以及用核酸保存用液稀釋。差分 膜之差分度宜依照所期望之核酸之分子量而適當選擇。舉 例言之’在微生物之染色體DNA之場合，分子量隨微生 物之種類而異’ 一般而言宜使用安裝差分度爲50000以上 之濾器之截留濾器。差分膜以核酸之吸附量少之膜爲較 佳，例如適合使用愛美康（Amic^n)公司製之γ Μ系（纖維 素）;慮器等。 再者，在核酸分離步驟中，可以使用於離液序列高之離 子存在下，能選擇性吸附核酸之水不溶性核酸吸附載體。 __·14· 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) .‘\4規& 210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填{is本fj 裝 -訂 經濟部中央標苹局貝工消费合作社印絮 416367 A7 B7 五、發明説明（12 該核酸吸附載體之形狀沒有特殊限定，粒子狀或纖維狀皆 可。做爲粒子狀之核酸吸附载體者，例如有矽膠粒子、玻 離粉，但從目的核酸之物理安定性方面言之，粒子徑在2 "m〜l〇^m之範園内爲較佳a做爲如此之粒子狀核酸吸附 體，例如可以使用妙膠（富士秒膠公司製）、EasytraP Ver· 2 (寶酒製造公司製）中之玻璃粉。在該場合，做爲核 酸吸附體保持用之截留濾器，爲了防止堵塞，以孔徑爲 〇.5Mm〜l"m之膜爲較佳。再者，該膜以從核酸吸附體溶 出核酸之時核酸之吸附量少之膜爲較佳。例如，聚四氟乙 烯製l濾器。在纖維狀之核酸吸附體之場合，可以使用形 成爲濾器狀之截留容器之濾器。做爲該濾器者，例如可= 利用華特曼（Whatman )公司製之gf/C濾器等。 經漪部中决標準局貞工消费合作社印製 做爲離液序列高之物質者，爲能破壞水之溶媒構造，而 對於疏水性物質與水接觸之時所引起水之蝻（entr〇py )減 少有抑制效果之物質；離液序列高之離子則爲有上述性質 工離子°破壞水溶媒構造之性質隨離子之種類而異，例如 離液序列，在陰離子方面，依照CBoCOO—(三溴乙酸彳艮離 子）> CCUCOO·(三氣乙酸根離子）〉SCN-(硫氰酸根離子） 〉hnc(nh2)2胍離子>Γ(碘離子）> C10,（氯酸根離子）〉 NCV (硝酸離子）之順序下降；陽離子方面，依照如2+ > Ca2+ > Mg2+ > Ll+ > Cs+、Na^、:K+、Rb+ 之順序下降[掘 尾m集’蛋白f酵之基礎實驗法：株式會社南 >工堂’第22〜23頁0981)]。在本發明中，離子之種類沒有 限定，上述陰離子之序财，以序列在前之離子爲較佳。 -15- 本纸紅度關tl齡辟（ΓΝ5)Α4^(2]〇χ297^· 416367 經济部中央橾卑局兵工消费合作社印繁 A7 B7 五、發明説明（13 ) 生成離液序列高之離子之試藥例如有鹽酸狐、硫氰酸 '破 化納、過氯酸链、氣化鋰等。 因而，使核酸吸.附於玻璃等核酸吸附體之有效濃度随離 子之種類而異’例如使用矽膠之場合，在細胞懸浮液中較 佳溶解3M以上之鹽酸胍及3M以上之破化鈉。 本發明之核酸之分離精製方法，更詳細言之，例如由以 下之步驟所组成。 (A) 將細胞截留於細胞溶解步驟用之截留裝置之截留濾器 上之步骤， (B) 將細胞懸浮液注入細胞溶解步驟用之截留裝置中，並 將在前述步驟（A )被截留於該截留裝置之細胞予以懸浮之 步驟， (C) 將細胞;容解用液注入細胞溶解步驟用之截留裝置中， 並將在前述步驟（B )被懸浮之細胞溶解，而得到粗核酸溶 液之步驟， (D) 將前述步驟（C )得到之粗核酸溶液移送至保持核酸吸 附體之核酸分離步驟用之截留裝置中之步驟， - (E) 在核酸分離步驟用之截留裝置中，將在前述步骤（D) 被移送之粗核酸溶液與核酸吸附體接觸之步驟， (F) 將在削述步驟（E)得到之核酸吸附體與液狀成分分離 之步驟， ： (G) 將核酸浴出落液注入核酸分離步驟用之截留裝置中， 然後從前述步驟（F)得到之核酸吸附體溶出核酸之步驟。 在進行上述核酸之分離精製方法中之（B) ' (c)、及 _________ ____-16- 本紙张尺度也T中国® *標準（CNS ) A4規格（210X297公费） ------------裝——^^——訂------練 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 416867 A7 B7 五、發明説明（14 (G)時，藉著用本發明裝置之強制分散裝置賦予強制分教 力而使截留裝置内之内谷物均一分散，核酸之分離精製效 率可以顯著上升。使用上述截留容器之場合，使用例如有 回轉型振動機構之裝置做爲強制分散裝置，而使截留裝置 以2mm~3mm振幅，720 rpm之速度振動。 接下來，依照卡特之方法，更具體說明使用具有截留裝 置（利用適於減壓過濾之截留容器及減壓過濾）及振動裝置 之本發明分離裝置’從保持質體DNA之微生物精製質體 DNA之方法。 (A) 將細胞截留於細胞溶解步驟用之截留裝置之截留遽器 上之步驟 在培養含有質體DNA之微生物，例如保持質體puc 19之 大腸菌JM109株（以下稱爲大腸菌JM109/pUC19 )，並調製 〇D600爲約6之培養液之場合，例如能夠使用第i圖所示之 容器。 在第1圖中，1爲孔徑爲0.4 5 " m之纖維素混合醋製之膜 (Millipore公司製），2爲聚丙烯製容器。 · 本容器被命名爲第1截留容器。 ^使用保持孔徑爲0.4 5 " in之纖維素混合醋製之膜之第1 截留容器’可以於減壓下，經约1 5分鐘時間過滤2 5毫升 之培養液’培養菌體則被保持於7截留濾器上。 ..- (B) 將細胞懸浮液注乂細胞溶解步驟用之截留裝置中，並 將在前述步银（A)被截留於該截留裝置之細胞予以懸浮之 步騍 -17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ------ -----I^衣__ (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 银 經濟部中央標隼局t貝工消费合作社印¾ 赶濟部中央標準局男工消费合作社印聚 4 ⑽ 67 a? B7 五 '發明説明（15 ) 例如，上述2.5毫升培養液所含之細胞被截留之場合， 在第1截留容器中注入細胞懸浮用液之必要量，例如1〇 mMEDTA/50 mMTris 鹽酸（pH 7.5)之場合爲 30〇"1，然後 藉著振動15分鐘（720 rpm)而使之懸浮。藉著該操作，被 截留之菌體能均勻分散於細胞懸浮液中，因此（C)步骤中 菌體溶解之效率上升。 (C) 將細胞溶解用液注入細胞溶解步驟用之截留裝置中， 並將在前述步驟（B )被懸浮之細胞溶解，而得到粗核酸溶 液之步驟 接下來添加細胞溶解液’例如0.2N氫氧化納/ 1. 十二 基硫酸鈉溶液’其之需要量例如在上述2.5毫升培養液之 場合爲200 // 1 ’然後於72〇 rpm振動1分鐘。繼而添加中和 液，例如2.5M乙酸鉀（pH 4.8)，其之需要量例如在上述 2.5毫升培養液之場合爲2〇0#1，並振動2分鐘。藉著本步 驟’細胞被溶解，同時染色體DNA及蛋白質被變性及不 溶化。由於藉著強制分散裝置之強制分散力，細胞溶解以 及染色體DNA及蛋白質之不溶化順利地進行，因此被回 收之質體DNA之產量及純度均提高。又在本説明書中， 氫氧化鈉被簡稱爲NaOH，十二基硫酸鈉被簡稱爲SDS。 (D) 將前述步驟（C )得到之粗核酸溶液移送至保持核酸吸 附體之核酸分離步驟用之截留裝^置中之步驟 接下來藉著減壓操存，將含核酸之處理液體從第丨截留 谷器回收至被預先設置之核酸分離步驟.用截留容器内。藉 著本步驟，可以將在步驟（C)中之不溶化物質與粗核酸溶 18- ---·--_----裝---.———訂------级 (請先聞讀背面之注意事項再填{pr本頁) 千 I - 經濟部中央標率局員工消贽合作社印^ A7 B7 五、 416S67 **—~**^-| I . 發明説明（16 ) 液分離…該核酸分離步驟用之截留容器，於使用粒子 :馬5,0"m之矽膠粒子之場合，使用第2圖所示之容 存°在第2圖中，3爲；„ ^馬l‘〇"m之聚四氟乙烯製之膜 (先進技術公司製），4爲聚丙烯製容器。 本谷器被命名爲第2戴留交哭 .i m y 吸W谷崙。在使用保持孔徑爲ι，〇" 二之聚四氟乙晞製膜之第2截留容器之本步财，從預防 忒料擴散所造成t核酸之分離精製用試藥污染之觀點言 又，較佳事先添加適量之核酸吸附體懸浮液，例如5 0毫 克/¾升矽膠粒子/7M鹽酸胍/2mMEDTA/1〇 mM Tris鹽酸 (PH 7.5)。

另一方面，使用濾器狀之核酸吸附載體之場合，例如可 以使用將第2圖所π容器之聚四氟乙烯製膜換裝成截留濾 器之截留容器。較佳在該容器内，預先添加適量之含有離 液序列向心物質之緩衝液’例如7 Μ鹽酸胍/ 2 mM EDTA /10 mM Tris 鹽酸（pH 7.5 )。 (e)在核酸分離步驟用之截留裝置中，將在前述步驟 所移送之粗核酸溶液與核酸吸附體接觸之步驟 在使用矽膠粒子做爲上述核酸吸附載體之核酸之分離精 製方法之場合，將第2截留容器於720 rpm振動5分鐘，並 將内液充分混合。藉此可以促進矽膠粒子與核酸之吸附作 用。 另一方面，使用將;^留濾器固定之截留容器之場合，藉 著進行減壓操作使粗核叙溶液通過截留濾器，而使核酸吸 附於玻璃濾器。藉著在減壓操作之前將截留容器振動約1 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 丁 -5 經漪部中央標準局員工消费合作社印製 416367 A7 --------;___B7 五、發明説明（17 ) 分鐘而使内液无分混合，可以促進玻璃遽器與核酸之吸附 作用(截田作用）。再者，藉著使用將上述玻璃濾器固定之 截留容器之方法，本操作可與下述步驟⑺同時實施。 (Ο將在前述步驟（E)得到之核酸吸附體與液狀成分分離 之步驟 ”接下來’在用矽膠粒子做爲核酸吸附體之場合，藉著減， 壓操作將吸附核酸之核駿吸附保持載體截留於濾器上。藉 著該步驟，將（D)步驟得到之粗核酸溶液中之核酸與其他 不純物分離。 若本步驟附加洗淨核酸吸附體之步驟，則所得核酸之純 度將進-步提高。例如，在保持上述方法得到之核酸吸附 體ι截留容器中，添加含適量乙醇之洗淨液[乙醇之最終 濃度較佳爲40% (V/V)以上]，例如5 〇 %乙醇（v/vm 〇〇 mM 氣化鈉/2.5 mMEDTA/lOmMTds鹽酸（pH 7.5)(以下稱爲 矽膠洗淨液），並藉減壓操作廢棄液體而洗淨核酸吸附 體。藉著進行該洗淨操作至少二次，能夠洗除殘存於第二 截留容器内之微量不純物。在將矽膠粒子用做核酸吸附體 之場合，藉著於洗淨之時附加振動操作，可以使洗淨作用 提南。 (G)將核故溶出溶液注入核酸分離步驟用之截留裝置中， 然後從前述步驟（F)得到之核酸吸一附體溶出核酸之步驟 藉著將洗淨結束之知酸吸附體減壓操作約2分鐘而乾 燥。繼而將適量之溶出液’例如減菌水或TE溶液（i 〇毫 升Tds鹽酸（PH 8.0)/1 mMEDTA)，添加至第2截留容器 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- --L--.·----裝------訂------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局負工消资合作社印51 416367 a7 --------B7 五、發明説明（18 ) 後，料減壓操作從第2截留容器將含有質體DNA之溶出 液回收於容器（例如eppen(i〇rf試管）中。 在將矽膠粒予用於核酸吸附體之場合，本步驟藉著附加 振動操作，可以使核酸之回收率上升。 藉上述操作得到之核酸可用各種遣傳工程之方法處理。 舉例言之，藉上述方法得到之DNA除了可以藉使用限制 酵素進行切斷處理外，亦可用做以PCR (聚合酵素鏈反應） 爲代表之核酸擴增方法之模版（tetnplate )。 又’爲了得到適合做爲鹼基序列解析法（藉二去氧法）之 梃版I高純度質體DNA，在上述方法之步驟)之前，例 如在步驟（C ) ’若附加RNase處理則較佳。藉著附加該操 作’可以減少RNA所引起之僞陽性訊號。例如，使用 RNaSeA之場合，若在細胞懸浮用液中添加RNaseA並使其 终濃度爲1 00 # g/ml則較佳。再者，藉著將溶解菌體特有 之如胞壁之酵素添加至該細胞懸浮用液中，核酸之產率會 提高。例如’使用大腸菌之場合’若將溶菌酵素添加至細 胞懸浮用液中並使其終濃度爲4 mg/ml則較佳。 ’ 又’如上述藉著減壓操作將溶菌成分過濾之場合，如需 要，亦可使用消泡劑，做爲消泡劑者，例如可選自 Adecanol (旭電化工工業公司製）、Einol (生物公司製）及 Nissandesfoam CB442 (日本脂戈司製），例如於細胞溶 解步驟時，若將0.05%~之Einol添加至中和液中則佳。又， 藉著調整減壓度可以防止液體之發泡及飛散。例如在 0.05% Einol存在下，藉著將眞空度調整至65〇 mmHg附 -21 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） r--^----裝------訂-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填艿本頁) 經濟部中决標隼局兵工消费合作社印策 416367 A7 B7 五、發明説明（19 ) 近，可以冗全抑制發泡。此外，若將與水以任意比例混合 之有機落媒添加至核酸精製分離所用之試藥中，而使水溶 液之表面張力減低，則除消泡作用外，尚能改善過濾膜之 通液能力。例如，於前述步驟（E)中，在本説明書記載之 第2截留容器内，於35〜4.5M鹽酸胍存在下使1)^^八吸附於 矽膠之場合’若添加終濃度爲2〇% (v/v)之乙醇，則在 DNA之吸附量與未添加乙醇之場合幾乎相同且眞空度爲 約65〇 minHg之情況下，能使通液時間縮短至約} 2分鐘至 约6分鐘。 在含有質體DNA之微生物或細胞之負荷量相對於截留容 器之截留面積爲多之場合，使用例如具有保留粒子徑爲 0 · 8 " m之孔之糊矽酸鹽玻璃纖維爲佳。舉例言之，藉著使 用具有保留粒子徑爲〇.8#m之孔之硼矽酸鹽玻璃纖維（先 進技術公司製：GA_2〇〇)，前述大腸菌JM1〇9/pUCl9之 〇D60()爲約6之培養液1.5毫升，於減壓下可以經3分鐘滤 過’含有質體DNA之分離液亦可經約5分鐘收取s 又’使用粒子狀之核酸吸附體且質體DNA藉著上述步骤 (A)〜（G)精製時，若使用由第1圖所示細胞溶解步祿用之 截留容器（第1截留容器），第2圖所示核酸分離步驟用之 截留容器（第2截留容器）’第3圖所示之分離裝置，試料 及試藥之移送機構以及自動控制/機構所组成之核酸分離装 置，則可以如下所述逄照（1)至（21)之順序全自動進行。 (1)知保持質體之微生物之培養液2.5¾升添加到第1截留 容器内（本步驟僅用手操作進行）。 -22- 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（2丨〇'〆297公釐） r—I;----裝---訂———_---m (請先閱讀背面之注意事項4填巧本頁) A7 416367_B7____ 五、發明说明（20 ) (2) 藉減壓過滤，使上述步骤（1 )添加之培養液中之細胞 截留於濾器之膜上。 (3) 將細胞懸浮用液300 " 1移送及添加至上述步驟2供截 留細胞之第1截留容器中。 (4) 藉著強制分散裝置振動第1截留容器，並將被截留之 細胞懸浮於前述步驟（3 )之細胞懸浮用液中。 (5) 將細胞溶解用液200 ju 1移送至進行前述步驟（4 )後之第 1截留容器内。 (6) 藉強制分散裝置振動進行前述步驟（5 )後之第1截留容 器，並於強制分散下溶解細胞。 (7) 將中和液200 ju 1移送及添加至在前述步驟（6 )進行細胞 溶解後之第1截留容器内。 (8) 藉強制分散裝置振動第1截留容器，於強制分散下， 箾述步驟（7)添加之中和液進行中和。 (9) 將核酸吸附體懸浮液移送並添加至第2截留容器内。 (10) 藉減壓過濾使步驟（8)之後之第1截留容器内液體進 行過遽’然後將濾液移送並添加至步骤（9 )之後之第2截 留容器内。 (11) 藉強制分散裝置振動第2截留容器，於強制分散下， 將則述步驟（1 〇)得到之濾液中之核酸吸附於核酸吸附體 上。 - (12) 藉減壓過濾，將―在前述步驟（11)吸附核酸之核酸吸 附體截留於濾器膜面上。 ()知洗淨液500/ί1移送並添加至截留前述步驟（12)之核 本紙張尺度相 (請先閱讀背面之注意事項再填艿本頁 .装. 丁 -1¾ 經濟部中央標準局負工消費合作社印褽 A7 416S67 _____ B7 _____ 五、發明説明（21 ) 酸吸附體之第2截留容器内。 (14) 藉強制分散裝置振動第2截留容器，於強制分散下將 核酸吸附體與在前述步驟（IS)移送之洗淨液混合，並洗淨 該核酸吸附體。 (15) 藉減壓過濾，將在前述步驟（14)被洗淨之核酸吸附 體截留於濾器膜面上。 (16) 將洗淨液500/^1移送並添加至在前述步驟（15)截留核 酸吸附體之第2截留容器内。 (17) 藉強制分散裝置振動第2截留容器，於強制分散下將 核酸吸附體與在前述步騍（16)移送之洗淨液混合，並洗淨 該核酸吸附體。 (18) 藉減壓過;慮，將在前述步驟（17)被洗淨之核酸吸附 體截留於濾器膜面上。 (19) 將滅菌水120 1移送並添加至在前述步驟（18 )截留核 酸吸附體之第2截留容器内。 (20) 藉強制分散裝置振動第2截留容器，於強制分散下將 核酸吸附體與在前述步驟（丨9 )移送之洗淨水混合，並從該 核酸吸附體溶出質體DNA » (21) 藉減壓過濾將含有在前述步驟（2〇)溶出之質體dna 之濾液採收至eppendorf試管内》 藉著以上操作’質體DNA可被了分離精製。 —方面’由上述步樣（A)〜（G)組成之核酸之分離精製方 法’雖然適於精製如質體DNA般之環狀DNA，但對於臨 床上被經常進行之從全血或培養細胞抽出染色體Dna而 -24 ** 本紙杀尺度適用中同113家標卒^(：1^)八4^格（21()^297公楚) ~ (^先聞讀背面之注意事項再填寫本頁〕 裝. -訂 經濟部中央標準局I工消費合作社印製 經濟部中央標準局另工消贫合作社印製 416367 A7 B7 五、發明説明（22 ) 言’則不適用。在此種直鏈狀DNA之場合，在下述步驟 中’藉著使用本發明之裝置，可以較容易地抽出核酸及精 製。又，藉著使用第2圖所示之核酸分離步驟用截留容器 (第2截留容器），第3圖所示之分離裝置，試料、試藥之 移送機構以及自動控制機構所组成之核酸分離裝置，全自 動進行亦有可能。又，下述步驟所用之核酸，以僅有原生 質膜包覆爲較佳’例如血液中所含之白血球細胞。但是縱 使僅藉界面活性劑（例如SDS )無法溶解細胞之植物細胞及 微生物細胞，如果在細胞壁被除去之狀態，則沒有任何問 題。在該場合，即使細胞壁未被完全除去亦佳，如果在低 張液中細胞以脹破程度被除去則佳。 精製來自上述核酸源之核酸之場合，不需要供細胞溶解 步驟用之截留裝置，僅有核酸分離步驟用之截留裝置即 可，使用粒狀之核酸吸附體之場合，例如可如下所述進 行0 核酸之分離精製方法，例如可進行下述步驟： (i) 在供核酸分離步驟用之截留裝置中使細胞溶解‘步 驟。 (ii) 將核酸吸附體懸浮液注入核酸分離步驟用之截留裝 置中，以及使前述步驟（i )所得之細胞溶解液與核酸吸附 體接觸之步驟。 - (iii) 使前述步驟（ii)所得之核酸吸附體與液狀成分分離之 步驟，以及 (iv) 將核酸溶出液注入供核酸分離步驟用之截留裝置 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----=---ά---.---ΐτ——I----^ - . . - (¾先間讀背面之注意事項再填ΐϊτ本頁) 416867 A7 B7 五、發明説明（23 ) 中，以及從前述步驟（iii)得到之核酸吸附體溶出核酸之步 骤。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 接下來，以從人類血液抽出DNA之場合爲例更詳細説明 該方法。 (i) 在供核酸分離步聲用之截留裝置中使細胞溶解之步骤 將含有人類血液細胞之體外摘出試料，例如公知之進行 抗凝固處理之人類全血lOOyl，注入前述第2截留容器， 接下來爲了稀釋體外摘出試料，注入稀釋用藥之必需量， 例如 10 mM EDTA/50 mM Tris 鹽酸（pH 7.5)之場合爲 100" 1 °接下來注入細胞溶解用液之必需量，例如0.2% SDS之 場合爲150 ^ 1，然後藉著至少5分鐘之振動操作（！ 7〇〇 rpm) 溶解細胞。藉著該操作’在步驟（ii)使細胞容解液與核酸 吸附體接觸之步驟中，可以提高細胞溶解液中所含核酸對 核酸吸附體之選擇性吸附效率。 (ii) 將核酸吸附體懸浮液注入核酸分離步驟用之截留裝 置中’以及使前述步騍（i)所得之細胞溶解液與核酸吸附 體接觸之步驟 · 經濟部中央標準局^貝工消费合作社印紫 用例如矽膠粒子作爲核酸吸附體之場合，例如將與核酸 吸附體與離液序列高之物質之溶液混合所成之核酸吸附體 懸浮液[例如，在5 〇毫克/毫升矽膠粒子/7m鹽酸胍/2mM EDTA/lOmM Tds鹽酸（PH 7·^) 4場合爲700 "丨]注入步驟 (i)所得到之細胞溶解*·液中 '藉著本步驟，血液細胞被溶 解，同時被抽出之核酸吸附於矽膠粒子上。在本步據中， 藉著進行振動操作，細胞之溶解效率及核酸吸附於矽膠粒 •26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 416867 五、發明説明（24 ) 子之效率上升。更佳者，將適當的有機溶媒添加至核酸吸 附體％浮液中，例如在被例示之核酸吸附體懸浮液之場 合，添加乙醇並使其終濃度爲40%(v/v)，若使用該添加 有機溶媒之核酸吸附體懸浮液，在DNA對吸膠粒子之吸 附量幾乎沒有改變下，步驟(iii)中核酸吸附體與液狀成分 之分離所需之時間可以縮短。 另方面，使用安裝有玻璃濾器之第2截留容器之場 合，藉著將離液序列高之物質之溶液[例如，在7M鹽酸胍 /2mMEDTA/10mMTns鹽酸（pH75)之場合爲则叫注入 步驟⑴所得之細胞溶解液，可以使血液細胞溶解。此時 進行振動操作能使細胞之溶解效率上升。接下來進行減壓 操作，並藉著將細胞溶解液通過玻璃遽器，而使核酸吸附 於玻璃濾器。在本操作之場合，亦以在核酸吸附體懸浮液 中添加適當的有機溶媒[例如終濃度爲4〇%(v/v)之乙醇] 爲較佳。本操作可兼有下述步驟（iU)之一部份。 (111)使則述步驟（11 )所得之核酸吸附體與液狀成分分離 之步驟 將秒勝粒子用做核酸吸附體之場合，藉減壓操作，將欢 膠粒子截留於第2截上 哉爾今盜又濾器上。藉本步驟能將核酸 與其他細胞内之不純物分離β 在本步驟中^•附力α洗淨核酸吸附體之步驟，則所得核酸 =純度㈣—步提高：^上述方法所得之核酸吸附 月立中添加含適量乙醇之潘.立 、 先淨液（乙醇之終濃度較佳爲40%

V/V)以上）’例如 5〇% 乙醇（V/V)/1QQ mM NaCl/2.5 mM ---r------裝-----—.11------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局M工消費合作社印"

A7 416867 ________ B7 五、發明説明（25 ) — EDTA/lOmMTHs鹽酸（pH 7.5)，然後藉減壓蒸餾廢棄液 體並洗淨核酸吸附體。藉著重覆該洗淨操作至少二次，口 將殘存於第2截留容器内之微量不純物洗除。辟矽膠粒Ζ 用做核酸吸附體之場合，於洗淨之時藉著附加振動操作， 可以將洗淨作用更爲提高。在本步驟（lli)中，使用濾器形 狀之核酸吸附體之場合，將含適量乙醇之洗淨液[與將矽 勝粒子用作步驟（ii)中吸附核酸之濾器之場合相同]注入 截留裝置中。藉著重覆該洗淨操作至少二次，可將殘存於 第2截留容器内之微量不純物洗除。 ' (iv)將核酸溶出液注入核酸分離步驟用之截留裝置中， 以及從前述步驟（iii)得到之核酸吸附體溶出核酸之步碟 將洗淨終了之核酸吸附體減壓操作2分鐘，以使之乾 燥°接下來添加適量之落出液’例如滅菌水、T e溶液 [10mM Tris 鹽酸（pH 8.0)/1 mM EDTA]，然後藉減壓操 作，將含核酸之溶出液從第2截留容器回收至例如 eppendorf試管等容器中。在將矽膠粒子用做核酸吸附體 之場合，藉著在本步驟中附加振動操作，可以使核酸之回 收率提南。在本步膝（iv)中’在將滤器用做核酸吸附體之 場合，藉著將洗淨終了之核酸吸附體減壓操作2分鐘而使 之乾燥。接下來添加適量之溶出液，例如滅菌水、τ E溶 液[10mM Tris鹽酸（pH 8.0)/1 EDTA ]，然後藉減壓操 作，將含核酸之溶出~液從第2截留容器回收至容器例如 eppendorf 試管中。 在目的核酸爲DNA之場合，使細胞溶解液與核酸吸附體 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ---r--一----裝--^--.--丨訂------妹 (讀先聞讀背面之注意事項再填芎本頁) 經濟部中央標羋局Μ工消費合作社印奴 416367 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 B7五、發明説明（26 ) 接觸之前，藉著施行RNase處理，可以得到RNA之含量低 之更高純度之DNA。例如，藉著在稀釋用試藥中添加含 終濃度爲100 " g/ml之RNAaseA之容液，可以在步驟（i)中 同時進行RNA之分解。 上述操作所得之DNA除了藉限制酵素進行切斷處理外， 尚能用做例如以PCR爲代表之核酸擴增方法之模版。又， 藉著上述操作得到之DNA，具有用做LA PCR ( Long and Accurate PCR )之模版所需之純度（已知低純度之模版D N A 會阻害反應）。 一方面，在藉著上述步驟（i)至（iv)所組成之核酸之分 離精製方法，從微生物細胞調製環狀雙股質體DNA之場 合，在步驟（i)之前進行細胞壁除去操作，在步驟（iv )之 後進行染色體DNA與RNA之分離操作，能夠得到蛋白質 含量及RNA含量均低之高純度環狀雙股質體DNA。 細胞壁除去操作，例如在大腸菌之場合，藉著將太腸菌 用含有溶菌酵素之50 mM Tns鹽酸缓衝液（pH 7.5 )懸浮， 及放置於室溫5分鐘而實施。 染色體DNA與RNA之分離操作，例如相對於含環狀雙股 質體DNA之核酸溶液1體積，添加0.2N NaOH/l.O% SDS溶 液2體積並混合後，放置於.冰中5分鐘，以進行RNA之分 解及染色體DNA之變性。其後，身加2.5M乙酸鉀（pH 4.8 ) 1.5體積並混合後，藉~著在冰中放置1 〇分鐘而使染色體 DNA不溶化。將該液於14000 g進行離心處理1 0分鐘，以 使變性染色體DNA沉澱而除去。藉著在所得之上清液中 -29- 本紙張尺度適用中國國家標辛（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (讀先閏讀背面之注意事項再填尹？本頁) nn —fl^i 訂 * ——：——Ί-I .-------- 416367 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印Μ _____B7五、發明説明（27 ) 〜 添加乙醇並使質體DNA沉澱，得到高純度之雙股質體 DNA。 在由上述步驟（A)〜（G)或步驟（i)〜（iv)所组成之核酸之 分離精製方法中’藉著在本發明之截留裝置中採用多個取 樣處理用之減壓過濾機構，能夠在短時間内進行多個取樣 處理。 又’使用本發明裝置之核酸分離精製方法，不限於上述 方法。例如，從已進行酵素反應之反應液中精製核酸之場 合’在由步驟（A)~(G)组成之核酸之精製分離方法中， 不需要步驟（A)〜（C) ’實施步驟（D)〜（G)即可。在該場 合’於步驟（D)，可以移送已進行酵素反應之反應液，而 取代移送前述步驟（C )所得到之粗核酸溶液。又，由步驟 (i)〜（iv)所組成之核酸之分離精製方法，除了適用於分離 精製存在於細胞中之核酸之外，亦適用於從道脂糖凝膠回 收D N A ’及依據克利斯坦森之方法’從噬菌體粒子回收 D N A »即在上述步驟中’使用含核酸之瓊脂糖凝膠或嗤 菌體粒子懸浮液替代細胞懸浮液，並依照上述細胞溶_步 驟以及核酸與細胞内不純物之分離步驟同時實施之核酸分 離精製方法，進行DNA之回收。 又，在藉步驟（i)〜（iv)所组成之核酸之分離精製方法精 製細胞内所含RNA之場合’必須一確認各步骤所用之試藥爲 適於RNA精製之試藥Γ例如—確認爲不含^^邮6之試藥。 第4發明爲提供一種供第3發明用之分離精製用套组， 其至·少含有具有核酸吸附能力之物質。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標半（CNS ) A4規格（2:0X297公釐） (祷先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} .裝· 訂 Μ 416367 A7 經满部中央標皁局負工消費合作社印戈 B7五、發明説明（28 ) 該套组，以如上所述之具有核酸吸附能力之物質爲構成 之必需要素。如果需要，例如在從細胞得到核酸之場合， 可以含有能從細胞内抽出核酸之試藥（細胞溶解用液等）等。 舉例言之，可以使用矽膠粒子以做爲具有核酸吸附能力 之物質，以及SDS溶液等以做爲細胞溶解用液。 在本發明之方法中，特別是從細胞分離出DNA之場合， 藉著將細胞之溶解步驟與溶解物中夾雜物之除去步驟加以 組合，能夠有效率地分離出高純度之目的DNA。特別是 該DNA之分離用套组，藉著含有央雜物分解用之RNA分 解酵素（RNase)，能夠做爲分離高純度DNA用之套組。 又，可以將細胞溶解用、蛋白質凝固用之界面活性劑做爲 套組之含有物。 以下藉實例更具體地説明本發明，但本發明不爲此等實 例所限。實例1 (1) 細胞溶解步驟用之截留容器之製作 製作具有第1圖所示構造之細胞溶解步驟用截留容器。 該容器爲適合減壓過濾之構造。 (2) 核酸分離步驟用之截留.容器之製作 製作具有第2圖所示構造之核孽分離步驟用截留容器。 該容器爲適合減壓過邊之構造。 (3) 分離裝置之製作 能固定第1截留容器及第2截留容器之吸引裝置被固定 -31 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 416367 A7 B7 五、發明説明（29 經"部中央標羋局哀工消費合作社印製 於振幅爲2mm〜3mm及振動速度爲0~800 rpm之回轉型振動 裝置上，且回轉型振動裝置能振動整個吸引裝置之分離裝 置被製作。第3圖即爲該裝置之模式圖。在第3圖中，$爲 截留容器，6爲截留容器固定器具，7爲回轉型振動裳置 及9爲廢液受納jnt。 實例2 質體DNA pUC19之精製 (1) 大腸菌JM109/pUC19之培養 將被質體PUC19轉型之大腸菌JM109接種於含50"g/ml安 比西林（ampicilin)之LB培養基（1〇克胰化腺' 5克酵母萃 、取物、5克氯化鈉/公升）2.5毫升中，於培養溫度爲37χ： 及振動速度爲160rpm下培養16小時，以調製〇D6qq爲約6 之培養液。 (2) pUC19DNA之調製 將2 · 5毫升培養液供應至第【截留容器内，藉著於_ mmHg減壓約15分鐘而將菌體截留於濾器膜面。在本説明 書之以下實例中’減壓均係於_6〇〇 mmHg進行。接下來， 添加含100 " g/ml之RNaseA之細胞懸浮用液[1〇mM £0丁八/5〇111?^1'1：15鹽酸（口8 7.5)] 3 00"1’並藉著在振幅爲 2〜3 mm及720 rpm之條件下振動2〇分鐘而將菌體懸浮。在 本説明書之以下實例中，振動操作均係於振幅爲2〜3瓜爪 及72〇rpm之條件下實施。之溶菌用試藥（〇2n Na〇H ’ 1.0%SDS)添知至（胞懸浮液中並振動】分鐘。然 後添加200 "1中和溶液[2.5M乙酸鉀（pH 4 8)]並振動二分 鐘，藉減壓10分鐘，將含質體DNA之粗核酸溶液從第^截 -32 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS )如規格（210χ297公楚） f靖先閃讀背面之注意事項再填寫本頁〕 裝 Τ -° i 416367 A7 B7 五、發明説明（3〇 留容益下部，採收至預先添加有核酸吸附體懸浮液 xng/mM夕膠粒子（粒徑：，富士矽化學公司製）/7财鹽 酸胍/2 mM EDTA/lOmM Tris 鹽酸（PH 7.5)]之第 2截留 ^

器中y進行3分鐘之振動操作，然後進行減壓々分鐘並2 來自第2截留容器下邵之含不純物之液體廢棄，及截留矽 膠粒子’添加5〇0 Μ 1洗淨液[50%乙醇（v/v)/1(JmM

NaCl/2‘5 mM EDTA/lOmM Tris 鹽酸（PH 7_5)]後減壓 2 分 鐘，並廢棄洗淨液。再度添加500 ^ 1洗淨液後進行減壓3 分鐘並廢棄洗淨液，將12〇 ^ 1之滅菌水加至第2截留容器 内並振動1分鐘。最後藉減壓2分鐘，從第2截留容器下部 將含DNA之溶液約1 〇〇 V 1回收至eppendorf試管中。將其中 之1 5 ^ 1進行電泳以確認時’未發現混合有染色體dna， 從被確認之DNA之泳動位置可以確認該DNA爲 pUC19DNA。 另一方面，在上述精製操作中，在未進行各步驟之振動 操作下以同樣方式進行質體DNA之精製。在未進行振動 操作之場合，在第2截留容器發生未回收到含質體DNA之 粗核酸溶液之情況。此等結果被示於表1中。 經济-部中央標準局貝工消費合作社印製 ^^^1 ft I-I · tu -I ^^^1 ^^^1 \、 ,-¾ - - (請先閲讀背面之注意事碩再填i本頁) 表1 步驟 1+ 2 十 3 + 1- 2+ 3十- 1+2-3 + 1+2+3- 產量 1〇.6ur . .(約 0.·蚱gf f約 〇_) 3.3 pg 又，在表1之步騍中，1，2及3表示以下之步驟。 1 :將在第1截留容器被截留之菌體用細胞懸浮用液懸浮 之步驟。 -33- 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 416367 經濟部中央標準局负工消f合作社印製 A7 B7 五、發明説明（31 ) ~~~ ~ 2:將在前述步驟丨被懸浮之菌體予以溶菌之步驟。 3·將在前述步驟2得到之粗核酸溶液與核酸吸附體懸浮 液混合之步驟。 又，各數字之後附加之「+」表示在該步驟中有實施振 動操作，「-」表示在該步驟中未實施振動操作。 另方面在產里項中，（）表示在精製過程中濾器堵 塞。再者，上述値，爲即使濾器堵塞仍照樣操作之値。 從表1可以明白，一部份步驟未進行振動操作者之質體 DNA之回收量爲全部步驟皆進行振動操作者之約三分之 —至約五十分之一，特別是在菌體懸浮步驟及溶菌步驟 中.，藉著振動操作產量顯著地増加。 (3) 精製DNA之純度之確認 在前述（2)中，將1+ 2+ 3+步驟所調製之dna約0.5yg， 在含有1 0單位之能將PUC19DNA之1個部位切斷之限制酵 素EcoRI (寶酒製造公司製）之反應液中，消化1小時，然 後用0.7 %瓊脂糖電泳以評價。結果，環狀puc 19DNA成爲 在1個部位被切斷之直鏈狀，限制酵素之反應未受到阻 害。再者’用邊免體做爲模版’用Fluorescein Primer M49 (寶酒製造公司製）做爲螢光引子，用BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit (寶酒製造公司製）依照二去氧法進行定序 列時’確ό忍有明確之訊號。亦即jj*以精製得到不會阻堂限 制酵素及定序列反應之高純度pUC 19DNA。 實例3 質體DNA pBRS 22之精製 以與實例2相同之方法，將大腸菌HB101用PBR322轉 -34- 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填1t5本頁) -裝 訂 A7 B7 形，並進行培養，然後按照實例2記 PBR322之精製。 戰疋万法同樣進仃

表2中各項之記載，如同在表j中者。 416867 五、發明説明（32 表2 雖然已知PBR322 ”UC19相比，其回收量一般較少， 但=表2心’在精製階段未實施振動操作者，與啊9 (情況一樣’回收量降低。 再者时，將〇.5"g之於1+2+3+步驟所精製得之p膨22， 用10早位（限制酵素BamHI (寶酒製造公司製）於抓切 斷1小時，從電泳結果得到良好切斷之圖譜。 從以上實例1及2可以明白，藉著具有強制分散處理裝 置之本發明裝置，能夠顯著改善質體從大腸菌之回收率。 又，雖然該結果未記載，但可以了解本方法得到之質體 DNA溶液之蛋白質含量非常低。 · 實例4來自人類培養細胞之dn A之精製 將用PBS洗淨之人類培養細胞（HL_60 (ATCC CCL_24〇)) 100 A 1 (lxl04〜1x1 〇ό個）注入第2截留容器中，添加實例2 之（2)記載之含有RNase Α之細胞懸浮用液1〇〇 ^ 1及〇 2% SDS溶液200 /d，然後遽行5.穿邊r振動。其後添加實例2之 (2)記載之核酸吸附體懸浮液500/W，並藉振動搡作5分鐘 而混合。將第2截留容器減壓3分3 0秒以截留矽膠粒子， 添加實例2之（2 )記載之洗淨液300 a 1並振動4分鐘，以進 35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（2丨〇'乂297公釐） ---1-----政-------1Τ------^ - ' · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 經满部中央標率局劳工消费合作社印11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） 416367 A7 B7 五、發明説明（33 ) 行矽膠粒子之洗淨。減壓2分鐘以截留矽膠粒子，再度施 行洗淨處理後，添加500 μ 1之洗淨液並藉2分鐘之減壓進 行洗淨。將150 ^1之滅菌水添加至矽膠中，振動1 5分鐘並 k砍膠粒子中溶出DNA ’最後藉2分鐘減壓’將含DNA之 溶出液回收至eppendorf試管中。其結果爲得到約4 " g之 DNA。接下來在得到之核酸試料中，測定主要做爲蛋白 男之極大吸收波長之280nm附近之波長光之吸光度 (OD28q) ’以及測定主要做爲核酸之極大吸收波長之26〇nm 附近之波長光之吸光度（〇D26〇)。計算OD26〇/OD28。比値， 而得到其値爲1.85。由於含有核酸之TE緩衝液之 〇〇26〇/〇〇280比値一般在1.8〜2.0之範園内，所以可以明白 本方法所杆到之核版試料之蛋白質含量非常低。 接下來將得到之核酸中之約0.2 A g用1 〇單位之限制酵素 EcoRI於37°C切斷1小時’並藉電泳確認時，確認DNA被 消化。因此可以明白藉著該方法得到之DNA，不會阻宜 限制酵素反應。 實例5從人類全血精製DNA ' (1)用SDS細胞溶解法進行DNA之精製^將進行公知之 三種抗凝血處理（即檸檬酸、EDTA、肝素處理）之全血8〇 "1注入第2截留容器中，添.力σ含有RNase之實例2之（2 )記 載之細胞懸浮用試藥100 "1及0.1% SDS溶液150 " 1，然後 進行3分鐘、720 rpm乏振動操作。在其中添加與實例2之 (2)同樣調製之核酸吸附體懸浮液7〇〇 " 1，施予5分鐘、 720 rpm之振動後，減壓3分3 0秒以從濾器下部抽除含不 -36- --- ---：-----裝-------訂----.——.V (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 416367 _____ ___B7_ 五、發明説明（34 ) ------- -- I - - - - I— . -ei— _ .1! ^LJ *τ - . {請先閱讀背面之注意事項再填艿.尽買) 純物之液體，並截留矽膠粒子。添加3〇〇jul之洗淨液後， 進行4分鐘、720 Tpm之振動操作而將矽膠粒子洗淨。藉減 壓2分鐘以截留矽膠粒子，再度進行同樣之操作，添加5〇〇 洗淨液並藉2分鐘之減壓截留矽膠粒子。最後將15“ 1之減菌水添加至第2截留容器中，進行1分鐘之振動操作 (720 rpm ) ’藉減壓從滤器下部將含〇ΝΑ之溶出液回收至， eppendorf試管中《對1個試料進行2處理，共計進行6處 理。全部過程需要之時間爲約6 〇分鐘。結果，三種試料 之任一種，皆爲每1 〇 "丨試料得到約〇 25 " g之Dna。計算 各核酸試料之OD26〇/OD28〇比値，結果各爲1.85，由此可以 明白本方法所得到之核酸試料之蛋白質含量非常低。 (2) 接下來將實例5之（1 )得到之核酸試料嘗試用於各 種遣傳工程手段。首先將得到之各核酸之約0.2 # g，以與 t例2之（3 )同樣之方式用限制酵素EcoRI消化，結果DNA 被消化。因此可以明白藉著實例5之（1 )所示之方法得到 之DNA，不會阻害限制酵素反應。 經漭部中央標準局K工消费合作社印$! (3) 將實例5之（1 )得到之核酸試料做爲模版，用具有 序列表之序列編號：1及序列编號：2所示之鹼基序列之 寡核施酸做爲引子，用TaKaRa PCR Amplification Kit (寶 酒製造公司製）或LA PCRTMKit Ver. 2 (寶酒製造公司製）進 行核酸之擴增反應。又，PCR之赞環次數，在使用TaKaRa PCR Amplification Kit 之場合爲 25 回’在使用 LA PCRTMKit Ver. 2之場合爲30回。得到之擴增DNA片段藉瓊脂糖凝膠 電泳確認。又，瓊脂糖凝膠中之核酸，於用EtBr染色瓊脂 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公澄） 416367 五、發明说明（35 ) 糖凝膠後，藉著照射254 nm之紫外線所得到之螢光而被檢 出。其結果顯示，對於用任一核酸試料做爲模版之核酸擴 増反應，被推定爲約410 bp長之DNA片段之擴增反應未受 到阻害。 另一方面，將實例5之（1 )得到之核酸試料做爲模版，用 具有序列表之序列编號：3及序列编號：4所示之鹼基序 列之寡核苷酸做爲引子，用LA PCRTMKit Ver. 2 (寶酒製造 公司製）進行核酸之擴增反應。又，PCR之循環次數爲2 5 回。得到之擴增DNA片段藉瓊脂糖凝膠電泳確認。其結 果顯示，對於用任一核酸試料做爲模版之核酸擴增反應， 被推定爲约17.5 kbp長之DNA片段之擴增反應未受到阻 害。 實例6核酸之分離精製用套组之構築 用下述者構築質體DNA精製套组（100回份） 質體DNA精製套組（100回份） 經濟部中央標率局與工消资合作社印製 (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞懸浮用液7 5毫升 50 mM，葡萄糖 10 mM EDTA 25 mM Tris 鹽酸（pH 8.0 ) (使用時，溶解RNaseA並使其終濃度爲1 〇〇 a g/mi ) 細胞溶解用液7 5毫升 0.2N NaOH — '

1% SDS 中和用液 7 5毫升 •38- 本紙張尺度適用中國國家標车（CNS ) A4規格（2丨〇X2〇7公瘦） 416S67 A7 B7 五、發明説明（36 ) 2.5M 乙酸鉀（pH 4.8) 核酸吸附體懸浮液100毫升 7 Μ 鹽酸胍 2 mM EDTA 10 mM Tris 鹽酸（pH 7.5)

5 g 碎膠 洗淨液5 5毫升 200 mM NaCl 5 mM EDTA 2〇1111^丁1^鹽酸（？117.5) (使用時，與等量100%乙醇混合） 核酸溶出液 1 5毫升 10 mM Tris 鹽酸（pH 8.0 )

1 mM EDTA 用下述者構築人類全血用核酸精製套組（100回份） 人類全血用核酸精製套組f 100回份） 細胞懸浮用液7 5毫升 10 mM Tris 鹽酸（pH 8.0 )

1 mM EDTA (使用時，溶解RNaseA並使其終濃度爲100 // g/ml ) 細胞溶解用液7 5毫升 0.2% SDS ^ 核酸吸附體懸浮液100毫升 7 Μ 鹽酸胍 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ---1--.---扣衣-----—ΪΤ------Μ . . Η (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經"部中央標準局兵工消费合作社印架 A7 416S67 B7 五、發明説明（37 )

2 mM EDTA 10 mM Tris 鹽酸（pH 7. 5 ) 5 g 矽膠 洗淨液 5 5毫升 200mM NaCl 5 mM EDTA 2OmM Tris 鹽酸（pH 7.5 ) (使用時，與等量100%乙醇混合） 核酸溶出液 15毫升 10 mM Tris 鹽酸（pH 8.0 ) 1 mM EDTA 產業上之利用可能性 藉著本發明之分離裝置，能簡便且迅速地精製核酸、蛋 白質、肽等生體物質。 序列表 序列編號：1 序列之長度：2 0 序列之類型：核酸 股數：單股 拓璞學類型：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DN入） 序列： " " GAAGAGCCAA GGACAGGTAC 20 序列·編號：2 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---L--:---來------—.π------i (请先閲讀背面之注意事項再填艿本頁) 經漭部中决桴準局負工消費合作社印 416867 A7 B7 五、發明説明（38 ) 序列長度：2 1 序列之類型：核酸 股數：單股 拓璞學類型：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA ) 序列： GGAAAATAGA CCAATAGGCA G 21 序列编號：3 序列之長度：3 5 序列之類型：核酸 股數：單股 拓璞學類型：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： ACATGATTAG CAAAAGGGCC TAGCTTGGAC TCAGA 35 序列編號：4 序列長度：3 5 . 序列之類型：核酸 股數：單股 經濟部中央標率局t只工消费合作社印^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 拓璞學類型：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列： > . 〆 _产 TGCACCTGCT CTGTGATTAT GACTATCCCA CAGTC 35 -41 - 本紙掁尺度適巧中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. …修正

   各八七一〇四八四三號專利申請案 ί文生請專利範圍修正本(八十七年七月、 穴、申請專利範圍 410367 1. —種從混合物分離出目的物之分離裝置，其特徵爲具備 將混合物中之截留對象物予以截留之裝置，以及將強制 分散力施於該截留裝置所截留之截留對象物及/或截留 前含有截留對象物之液體，以使截留對象物及/或截留 前之截留對象物分散之強制分散裝置。 2. 根據申請專利範圍第1項之分離裝置，其中截留裝置具 備保持截留濾器之容器，以及減壓過濾' 加壓過慮或離 /心過濾之機構。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之分離裝置，其中強制分 政裝爲振動裝置，超音波產生裝置或輪數裝置a 4 根據申請專利範圍第1項之分離裝置，其 中截留裝置與強制分散裝置可被直接連結，或者經由將 截留裝置截留之截留對象物或用強制分散裝置分散之含 有截留前截留對象物之液體在該二裝置間移送之移送機 構來連結。 5·根據申請專利範圍第2項之分離裝置，其 中對保持截留濾器之容器賦予強制分散力。 6，根據申請專利範圍第5項之分離裝置，其中藉振動裝置 職予保持截留遽器之容器強制分散力’以及藉減壓過遽 進行截留。 7.—種生體物質之分離方法，其隽使用截留裝置之生體物 質之分離方法，其特徵爲在使用截留裝置之處理中，至 少有一處理採用申請專利範圍第i至6項中饪—項之分 離裝置。 表纸乐足度適用中國國家#準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝-----^--訂卜！----線 - (請先閔讀背面之注意事碩再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 六 416S67

   '申請專利範圍 經濟部中央標準局員工消費合作杜印袈 8’根據申請專利範圍第7項之分離方法，其中生體物質爲 核酸_ 3 9·—種核酸之分離精製方法，其特徵爲具有下列步驟： (a) 進行細胞之溶解以及細胞溶解物之強制分教，而 得到粗核酸溶液之步驟； (b) 使前述步驟（a)得到之粗核酸溶液中之核酸，於 強制分散下截留於核酸吸附體之步驟：以及 ， （c) 從前述步驟（b )截留核酸之核酸吸附體中，於強 制分散下溶出核酸之步驟。 1〇.根據申請專利範圍第9項之分離精製方法，其中在步騍 (a)中’於強制分散下進行細胞之溶解。 η·根據申請專利範圍第9或1 〇項之分離精製方法，其中藉 著至少—種選自振動裝置，超音波產生裝置及輪轂裝置 所組成群中之強制分散裝置進行強制分散。 12.根據申請專利範圍第9項之分離精製方 法’其中使用申請專利範圍第1至6項中任一項之分離 裝置進行核酸之分離a - 13.. 心 根據申請專利範圍第9項之分離精製方法，其中核酸爲 DNA。 14. ~種用於申請專利範圍第9至1 3項中任_項之核酸之分 離猜製方法中之核酸分離精製用套组，其至少含有核酸 吸附體。 15. 根據申請專利範圍第1 4項之套組，其尚含有細胞溶解 用液。 -2· 制tsg]家標隼（ CNS ) A4iW«- { 210X297^ I | - 1 I t—1 I I— II —I- - I -.1^^--- - (請先E讀背面，ίν注意事項再填寫本頁) "* 416367 AS B8 CS D8 ^、申請專利範圍16.根據申請專利範圍第1 4或1 5項之套组分解酵素。 其尚含有RNA 請 先 閔 讀 背 ιδ 之- i 審 再填寫奘 本衣 頁 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標牟（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐）