JPH03105251A - 試料調製装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸等の生体物質の試料を調製する装置に係り
，特に生体試料を分子量の差を用いて自動的に分離する
試料調製装置に関する。

〔従来の技術〕

分子量分離が必要なプロセスには、ニュークリック，ア
シツズ，リサーチ　１　５，　５　２　９（１９８７年
）　　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ　１　５　，　ｐ　５　２　９（１９８７））に記載
の次のプロセスがある。二種類のプライマーを用いて、
ＤＮＡポリメラーゼ，ｄＮＴＰをＤＮＡ試料に注入して
ゲノム中の一部の配列部位を増幅する。この増幅断片の
有無，断片長を調べることによってある程度の情報を得
られるが、個人識別や感染症等の確定診断結果を得るた
めには増幅断片の配列を解析する。まず検出用の標識プ
ライマーをアニールし、ＤＮＡポリメラーゼ，相補鎖の
伸長／停止剤であるｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合液を添加
してシーケンシング反応を行わせる．シーケンシング反
応を信頼良く行うには、増幅プライマーの鋳型ＤＮＡへ
のアニールを防いだりｄＮＴＰ／ｄ　ｄＮＴＰの比率を
制御するために、増幅反応に用いられたプライマー及び
ｄＮＴＰを除去する。これには分子量の差を利用して膜
分離する方法が用いられてきた。

上記一連のプロセスの内、ＤＮＡ試料に熱サイクルをか
けて特定配列部位を増間するプロセスが特開昭６２　−
　２４０８６２号に、またシーケンシング反応について
は特開平１−　９７８６３号に記載のように自動化され
た。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術では、増幅ＤＮＡ断片をプライマーやｄＮ
ＴＰから分離する煩雑な操作が自動化されておらず、増
幅からシーケンシングまでを一貫して自動化できず、サ
ンプルを他の装置に移しかえたりするのに時間がかかっ
た。また増幅ＤＮＡ断片を分子量分離するプロセス自体
、時間と労力がかかり、操作者の負担は重かった。この
ために全所要時間６時間の内，約４０％が実作業時間に
必要であった。

本発明の目的は、分子量分離プロセスとその前後のプロ
セスを機械化して自動化率を高め、ＤＮＡ解析における
試料調製作業負担を大幅に増減できる装置を提供するこ
とにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明の装置においては、
少なくとも分子量分離膜を備えた容器，前記容器を搭載
して液体に遠心加速度をかける遠心分離機、前記容器を
搬送する容器搬送機を設ける。

また上記目的を達或するために、前記遠心分離機に代え
て、前記容器の分子量分離膜の傷面を加圧する加圧機を
設ける。

〔作用〕

容器に備えられた分子量分離膜では、溶液中の所定値よ
り小さい分子量の物質が濾過され、膜の上面には所定値
より大きい分子量の物質が残る。

前記容器においては膜下面の空気が容器外側と連通して
濾過動作がスムーズに行えるよう構威されている。本発
明においてはさらに濾過速度を高くするために、前記容
器に遠心加速度をかける方法あるいは空気圧をかける方
法を用いた。

増幅したＤＮＡ断片を分子量分離する場合は、インキュ
ベータ増幅反応が終わった溶液分注機を用いて分子量分
離膜付きの容器に移し，かつバツファを加え、容器搬送
機を用いて前記容器を遠心分離機あるいは加圧機にセッ
トして、遠心加速度をかけたりあるいは分子量分離膜上
方から加圧して濾過する。次いで前記容器を再度分注機
に搬送してバッファを加えて遠心分離機あるいは加圧機
に搬送して濾過する。この濾過動作を所定回数繰り返し
て増幅ＤＮＡ断片を増幅反応に用いたプライマーとｄＮ
ＴＰから分離した後、分子量分離膜上側に残った増幅Ｄ
ＮＡ断片を含む溶液を用いてシーケンシング反応を実施
する。

これによって分子量分離プロセスとその前後のプロセス
を自動化できるので、プロセスの自動化率を高められる
。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例の全体装置構或を第３図により説
明する。図において１は試料・試薬を貯蔵・保温・搬送
するのに用いられる容器を示し、はめあい可能なふたと
一体成形でつくられている。

本実施例では容器１が試料・試薬を混合するスペースを
兼ねている。ｌ８は容器１と同じ外径を有する分子量分
ｒａｌｌｓＷ付容器である。この構造については第２図
を用いて後に説明する。

７は容器１または容器１８に液体を分注する分注機，２
は分注機７に容器１または容器１８を搬送するターンテ
ーブルで、図示しないモータにより駆動される。３はタ
ーンテーブル２によって搬送された容器１のふたを開く
ふた開機構、４はターンテーブル２によって搬送された
容器ｌのふたを閉じるふた閉機構、５は分注機７に供給
される使い捨てチップ、６は使い捨てチツプ５を供給す
るチップ供給機、１５はターンテーブル２とチップ供給
機６との間に設けられたチップ廃棄孔である。

８は密閉容器で、その内溶液は図示されない空気配管，
電磁弁，空気タンク，圧力調整弁，真空ポンプを用いて
，ターンテーブル２上の容器１または１８に圧送される
。

９は保冷室で冷蔵保存室９ａ，冷凍保存室９ｂよりなる
。１０は容器１内の液体を加温するインキュベータで、
ふた開閉部材１０ａ，外箱１０ｂ，容器を搭載して加温
する金属ブロック１０ｃ．図示されないヒータ，及び冷
凍サイクルを利用する金属ブロック１０ｃの冷却部材よ
りなる。

１１は遠心分離機で、第１図と第３図を用いて後述する
。

１２は混合機で、エアシリンダ１２ａにより駆動される
容器押さえ機構１２ｂ，容器方向修正機構１２ｃ，ボル
テツクスミキサ１２ｄよりなる。

１３はふたが開かれた容器１を固定し、容器１を反転し
て容Ｍｉｌ内の液体を廃棄する容器反転機で、容器固定
台１３Ｃ，モータ１３ａ，歯車１３ｂよりなる． １４は容器１または容器１８を分注機７，遠心分離機１
１，混合機１２，保冷室９，インキュベータ１０，容器
反転機１３，容器廃棄孔ｌ６間に搬送する容器搬送機で
、Ｘ軸駆動機構用のモータ１４ａ，カップリング１４ｂ
，ボールネジ１４ｃ，ガイド部材１４ｄ、図示しないＹ
軸駆動機構用のモータ，カップリング，ボールネジ，ガ
イド部材１４ｄ，上下移動機構１４ｅ，容器保持機構１
４ｆよりなる。

また分注機７，遠心分離機１１、混合機１２，保冷室９
，インキュベータ１０，容器反転機１３，容器搬送機１
４を制御するコントローラ（図示せず）が機械室ｌ７内
に設けられている．遠心分離機１１の構或を第１図，第
２図に示す。

第ｌ図に示したように、少なくとも容器１８が挿入され
る容器挿入孔１１ａ、容器挿入孔１１ａをもつアングル
ロータｌｌｂ、図示されない高速回転モータに直結した
軸１１ｃに、カム機構ｌｉｄ，カム機構１１ｄとを回転
するためのエアシリンダ１１ｅ，カム機構ｌｉｄと連動
するレバー１１ｆ，レバー１１ｆに取り付けられたロー
ラ１１ｇ，ローラｌｌｇをカムｌｌｄ側に押しつける図
示しない弾性部材，ローラｌｌｇを回転して位置決め動
作を行うパルスモータｌｌｈ，外枠１１ｉ，容器１８を
容器搬送機１４を用いて出し入れするときに容器挿入孔
１１ａの中心軸を容器搬送機ｌ４の上下移動方向に一致
させるための角度調節機（図示せず）よりなる． 分子量分離膜付容器１８は第２図に示したように、分子
量分離膜１８ａ，分子量分離膜１８ａの基台↓８ｂ，○
リング１８ｃ，容器壁１８ｄ，１８ｅよりなり、遠心分
離機１１において遠心加速度をかけることにより１８ｄ
の側に濃縮液１８ｆ，１８ｅの側に濾液１８ｇがたまる
。なお基台１８ｂと容器１８ｅの間にはすき間１８ｉを
設けて、空気が自由に出入りでき，濾過動作がスムーズ
に行えるように構或されている。

第４図を用いて分子量分離手段として遠心分離機１１に
代えて、分子量分離膜上側を加圧する加圧機を用いる第
二実施例を説明する。

加圧機１９は，加圧配管１９ａを内包する配管接着部１
９ｂ，図示しないエアシリンダあるいはモータを用いて
配管接着部１９ｂを上下移動する上下移動機構１９０，
変形可能な配管１９ｄ，電磁弁１９ｅ，配管１９ｆ，高
圧源１９ｇ，空気抜き穴１９ｈを有する容器１８の固定
台１９ｉよりなる６分子量分離動作を行うときは、まず
ＤＮＡ試料とバツファが注入された容器１８を容器搬送
機１４を用いて固定台１９ｉにセットし、次いで上下移
動機構１９ｃを用いて配管１９ａを有する接着部１９ｂ
を容器１８に押し付け、電磁弁１９ｅを切換えて所定時
間加圧する。加圧し終わった後は上下移動機構１９ｃを
用いて配管接着部１９ｂを容器１８から離し、容袋搬送
機構工４を用いて容器１８を固定台１９ｉから運び出す
。第二実施例の全体構成は、遠心分離機工１が加圧機１
９に代わった点以外は同じである。

以上の実施例におけるＤＮＡ増幅，分子量分離，シーケ
ンシング反応の自動プロセスを次に示す。

ヒトのＤＮＡには、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
の方法〔モレキュラ　クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ）　　２　８　０　−　２　８　１　
　（　１　９　８　２　））に従って抽出したものを用
いた。

１μｇの上記ゲノムＤＮＡを１　０　ｍ　Ｍ　トリス（
Ｔｒｉｓ）ＨＣＱ（ｐＨ７．５），５０ｍＭＫＣｕ，２
．５ｍＭ　Ｍｇ（，Ｑｚ，１００／Ａｇ／ｍＱゼラチン
，Ｑ．５μＭ増幅用プライマー，１．５ｍＭｄＡＴＰ，
ｍ　Ｍ　ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐを含有する初期体積１００μ悲
の水溶性反応液中に希釈した。これに４０μαの鉱油を
重層した後、９８℃で１０分間加熱してゲノムＤＮＡを
変性し、次いで５０℃に冷却した。ここにサーマス・ア
クアテイカスからの２μαのポリメラーゼを添加し、こ
のＤＮＡサンプルにつき次の熱サイクルをインキュベー
タを用いて繰返して２５サイクルの増幅を行った． １）３分間にわたる５０℃から９４℃への加熱２）プラ
イマー及びＤＮＡをアニールさせるための９４℃から５
０℃までの３分間にわたる冷却３）プライマー延長生或
物を生ぜしめるための７０℃での２分間の保温 最終サイクル後、サンプルを７２℃でさらに１０分間イ
ンキユベートして最終延長反応を完結させた。増幅反応
に用いたプライマーの配列は５　’　−ＡＴＧＣＴＡＡ
ＧＴＴＡＧＣＴＴＴＡＣＡＧ−　３　’及び５′ＡＣＡ
ＧＴＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＣ−　３　’で、ヒ
トミトコンドリアＤＮＡの一部を増幅して１２１ｂＰの
増幅断片が生じるようにした。

このようにして得られたＤＮＡ断片を、分画分子量３０
０００の分子量分離膜付容器に移して，遠心加速度をか
けるかあるいは加圧して分子量分離した。遠心分離機を
使う場合は遠心加速度３０００Ｇを３０分かけ、加圧機
を使う場合は高圧側から圧力２　ｋｇ／ａｊを１０分か
けて分離した。バツファを加えて分離動作を１回繰返し
た。分子量分離膜上部に残った濃縮液と膜を透過した濾
過を８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動分離
し、エチジウムブロマイドで染色して検出した。

その結果、濃縮液には１２１ｂｐのバンド１本のみが認
められて、増幅プライマーは認められなかった。さらに
濾液に関しては増幅プライマーのみが認められ、この結
果本自動プロセスにより増幅ＤＮＡ断片を精度良く分子
量分離できることを確かめた。

次いで増幅ＤＮＡ断片３ρｍｏｌｅを，蛍光標識プライ
マ−３ｐｍｏｌｅ（５’　−ＡＴ＊ＴＣＣＣＣＴＡＡＡ
ＡＡＴＣＴＴＴＧＡ−３’　），１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＱ（ｐＨ７．５），で３分間加熱し４２℃で２０
分間保温し室温で５分間冷却した。これにサーマス・ア
クアテイカスからの２μ党のポリメラーゼを添加して４
等分し，相補鎖合戒の伸長／停止剤であるｄＮＴＰ／ｄ
ｄＮＴＰの混合液を１．２μ党　添加して７０℃で３分
間加熱した後、２μＱのフォルムアミドを加え、さらに
７５℃で５分間加熱して相補鎖合或反応を停止させ自動
プロセスを終了させた。

この反応液を６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気
泳動分離し、Ａｒレーザを用いて蛍光を励起してＤＮＡ
断片群を検出したところ、該当する塩基配列に相当する
ＤＮＡ断片群を検出できた。

このことから増幅に用いられたプライマー，　ｄＮＴＰ
が充分分離され、シーケンシング反応を信頼良く行えた
ことが確かめられた。

以上述べたように，本実施例によればＤＮＡ増幅分子量
分離，シーケンシング反応を自動で信頼良く行える。ま
たＤＮＡ増幅からシーケンシング反応までを行うには、
６〜７時間かかるが、本発明によりプロセスを１台の装
置で連続して処理できるので，操作者の負担は大幅に軽
減される。

〔発明の効果〕

以上述べたように本発明によれば、分子量分離とその前
後のプロセスを併せて機械化できるので、自動化率が高
まり、ＤＮＡ解析における操作者の試料調製作業負担を
大幅に軽減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は遠心分離機の平面図、第２図は分子量分離動作
を示す遠心分離機の断面図、第３図は本発明の一実施例
による試料調製装置の全体構戊の斜視図、第４図は加圧
分離機の断面図である。 ７・・・分注機、９・・・保冷室、１０・・・インキュ
ベータ、１１・・・遠心分離機、１４・・・容器搬送機
、１８・・・分子量分離膜付容器、ｌ９・・・加圧機。 不 回 竿 ４ 回

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体を移送する分注機、試料・試薬を保存する保冷
   室、試料を加温するインキュベータ、機構の動作を制御
   するコントローラ、試料や試薬を混合するスペースを有
   する試料調製装置において、分子量分離膜を備えた容器
   、前記容器を搭載して液体に遠心加速度をかける遠心分
   離機、前記容器を搬送する容器搬送機を具備することを
   特徴とする試料調製装置。 ２、請求項第１項記載の遠心分離機に代えて、前記容器
   の分子量分離膜の上面を加圧する加圧機を設けたことを
   特徴とする試料調製装置。