JPH03154869A

JPH03154869A - Ｄｎａ分析用自動前処理システム

Info

Publication number: JPH03154869A
Application number: JP29436989A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Kajie; 梶江　慎一; Yasushi Mizuno; 康水野
Original assignee: Tonen Corp
Current assignee: Tonen General Sekiyu KK
Priority date: 1989-11-13
Filing date: 1989-11-13
Publication date: 1991-07-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はＤＮＡの塩基配列分析を行うための全自動前処
理システムに関するものである。

〔従来の技術〕

従来、ＤＮＡ塩基配列分析として放射活性ラベルを行っ
てＤＮＡフラグメントの電気泳動後にオートラジオグラ
フィーによってラダーを読む化学分解法、酵素法が知ら
れている。

化学分解法は、ＤＮＡ断片の一端を高放射活性のｓａｐ
で標識した後、塩基特異的な化学修飾を部分的に施して
修飾塩基との間のリン酸ジエステル結合の切断によって
末端に標識を持つ断片を得、これを変成条件下でゲル電
気泳動してオートラジオ、グラフィーで検出すると、末
端標識をもつＤＮＡ断片はその末端から化学修飾切断点
までの長さに応じて泳動されてくるので、各塩基に特異
的な部分切断物を同時に泳動することにより、その移動
度の相互関係から塩基配列を決定することができるもの
である。

酵素法は、ＤＮＡポリメラーゼの重合酵素反応を利用し
た塩基配列決定法であり、ＤＮＡ断片を含むＭ１３−本
１１ＤＮＡにプライマーＤＮＡをアニーリングさせ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼでの相補型ＤＮＡ合成反応を行わせ、
この際、４種類の反応系をつ（す、各反応系に基質とし
て４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸−（ｄＮＴＰ
）とチェーンターミネータとして１１１ｉ［のジデオキ
シリボヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を適当な濃
度比で加えたものを用意すると、例えばｄｄＧＴＰを加
えた場合には、ｄＮＴＰが順次付加され相補鎖ＤＮＡが
５′→３′方向へ伸長する際、ｄＧＴＰの付加反応ごと
にある確率で一部の相補１［ＤＮＡ断片はｄｄＧＴＰを
取り込み、ｄｄＧＴＰは糖部分の３′の位置に水酸基を
・欠いているために伸長反応はそこで停止するので、ｄ
ｄＣ；ＴＰ、ｄｄＣＴＰＳｄｄＡＴＰＳｄｄＴＴＰを加
えることによって、塩基配列としてグアニン、シトシン
、アデニン、チミンのところで伸長反応を特異的に停止
したさまざまな長さのＤＮＡ断片を得ることができ、こ
の反応の際に一つのｄＮＴＰのα位を高放射活性のｓｔ
ｐで標識しておけば各ＤＮＡ断片は５０％尿素存在下で
のポリアクリルアミドゲル電気泳動後、オートラジオグ
ラフィーにより検出できるものである。

しかし、これらの方法は放射活性ラベルを用いなければ
ならないため扱いが面倒であるとともに、分析の前処理
をすべて人手によっているため、分析に長時間を要する
という問題があった。そこで放射活性ラベルの代わりに
蛍光色素ラベルを用い、電気泳動時にリアルタイムにレ
ーザ光による泳動パターンを認識し、このパターンをコ
ンピュータ解析することで塩基配列を自動決定するＤＮ
Ａシーケンサ−が提案され、その前処理を自動化する口
、ポットシステムも提案されている。

〔発明が解決しようと、する！ＩＩ！］しかしながら従
来のＤＮＡ前処理システムは液体処理を中心とした自動
化であって、液体の分注と恒温保持だけの自動化にすぎ
ず、その他分析に必要な混合等を行っておらず、必要な
場合には別途そのための処理を行わなければならないた
め分析の高能率化を達成することはできなかった。

本発明は上記課題を解決するためのもので、ＤＮＡの塩
基配列決定のための前処理として、分注、恒温保持のみ
でなく、混合処理、濃縮処理等すべての必要な処理を全
自動で行うようにしたＤＮＡ分析用自動前処理システム
を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ＤＮＡサンプルに蛍光ラベルブライマーを加
えてアニーリングした後、酵素反応によりＤＮＡを伸長
させ、さらに濃縮するに際してすべての工程を全自動で
行えるようにしたことを特徴とするものである。また、
蛍光プライマーは光に不安定であるが、本発明の自動前
処理システムを暗室で運転すれば長時間に及ぶ多数のサ
ンプル処理に際して蛍光ブライマーを保護することがで
きる。

第１図は本発明のシステムの概念図である０図中、１は
制御装置、２は表示手段、３は入力手段、４はメモリ、
５はグリップ・移送手段、６は分注手段、７はキャンプ
着脱装置、８は加熱・保温手段、９は冷却手段、１０は
混合手段、１１は遠心分離手段である。

第１図において、計算機からなる制御装置１はフロッピ
ーディスク等からなるメモリ４から制御プログラムを読
み込んでシステム全体をシーケンス制御しており、キー
ボード等の入力手段より各種メニューの選択、プログラ
ムの変更等が行えるようになっている。そして、入力し
た内容、演算結果等は適宜ＣＲＴ等からなる表示手段２
に表示される。グリップ・移送手段５は、μｌオーダー
のＤＮＡサンプルを入れたチューブを把持して移送し、
所定の位置にセットする０分注手段６は、分註機やシリ
ンジハンドからなり、チューブ内へ適宜サンプルや緩衝
液を分注する。キャップ４４脱装置７はキャップを把持
してチューブを回転させることにより、ネジ込みでチュ
ーブにキャップを付けたり、外したりする。この場合、
キャップ着脱装置によるキャップの把持に代えてキャッ
プの把持はグリップ・移送手段５により行い、チューブ
の回転をキャップ着脱手段で行うようにしてもよい、加
熱・保温手段８はサンプルを加熱して反応を促進するも
のであり、冷却手段９はサンプルの保存や、沈澱を促進
させるためのものである。

混合手段１０は振動を与えることにより異なる液体試料
を混合撹拌させるためのものである。遠心分離手段１１
は、試料の濃縮、チューブ壁に付着した試料の洗い落と
しを行うためのものである。

このような構成により、ＤＮＡ分析のための前処理をす
べて自動化することができる。

〔作用〕本発明は、回転ロボットにより円形状に配置された各種
装置に所定のシーケンスでキャップ付のサンプルチュー
ブを把持・移送してそれぞれの処理をおこなうに際し、
すべての処理を自動化したものであり、まずサンプルチ
ューブを所定位置にセットし、蛍光ラベルプライマー、
緩衝液を加え、混合することによりアニーリングし、そ
の後基質とＤＮＡポリメラーゼを加えて酵素反応により
ＤＮＡを伸長させ、さらに酵素反応を停止させた後、沈
澱剤を加えて沈澱させるとともに、遠心分離機で冷却し
つつ遠心分離することにより濃縮をおこなうようにして
おり、キャップ付のサンプルチューブを使用することに
より混合処理時のサンプルの散失及び高温保持時の液体
の蒸発を防止し、混合、遠心処理によりμｌオーダーの
液体の混合をマイクロチューブ中で確実におこなうとと
もに、冷却遠心分離によりＤＮＡの濃縮を行うことが可
能となる。

〔実施例〕

以下、実施例を説明する。

第２図は本発明のシステムの具体的な配置図、第３図は
回転ロボットの外観図、第４図はグリップ、ハンドの構
造を示す図、第５図はシリンジハンドの概略構造を示す
図、第６図はキャンプ着脱装置の概略構造を示す図、第
７図は遠心骨＃機の構造を説明するための図である０図
中、２１はコントローラ、２２．２３はパワーコントロ
ーラ、２４はＣＲＴ、２５はキーボード、２６はフロッ
ピーディスクドライブ、３１は回転ロボット、３２は分
取・分注機、３３〜３６は空チユーブラック兼分取・分
注ラック、３７はサンプル分注ラック、３８は試薬用ラ
ック、３９は９５％エタノールボトル、４０はグリップ
ハンド、４１は常温ラック、４２は氷温ラック、４３は
ボルテクサー、４４は遠心分離機、４５は常温ラック、
４６はチップラツク、４７は７０％エタノールボトル、
４８は廃液ボトル、４９はキャップステーション、４９
ａはキャップ着脱部、４９ｂはキャップ置き場、４９ｃ
はチェー１置き場、５２はキャップラック、５３．５４
はインキユベータ、５５はシリンジハンド、５６は冷却
遠心分離機、６１は回転台、６２は駆動用ワイヤー、６
３はアーム支持部、６４はアーム、７０はハンド本体、
７１は支持摺動部材、７２はフィンガ、７３はフィンガ
グリップ、７５はマイクロチューブ、７６はキャップ、
８０はシリンジハンド、８１はロッド、８２はシリンジ
、８３はピストン、９１はジョーズ、９２はチューブ支
持台、９３はグリップハンド、９３ａ。

９３ｂはグリップフィンガ、９４はロッド、９５はスク
リューロッド、１００はローター、１０１〜１０４はパ
ケット、１０１ａ〜１０４ａは回転軸である。

コントローラ２１は計算機からなり、ＣＲＴ２４、キー
ボード２５、フロッピーディスクドライブ２６を備えて
以下の各装置を制御しており、パワーコントローラ２２
．２３は各装置への信号用電力（１２Ｖ）供給を制御し
ている。

３１は回転ロボットで、第３図に示すように回転台６１
上に設置され、駆動用ワイヤー６２で上下動するアーム
支持部６３に支持されたアーム６４を回転させ、その先
端に取り付けられたハンド本体７０でマイクロチューブ
７５を把持し、回転し、て所定位置に移送してセットす
る機能を有しており、ハンド本体はアームに沿って摺動
可能であるとともに、アームに対して回転してマイクロ
チューブ内の溶液を排出することができ、さらに先端の
ハンド本体は交換可能であり、本発明ではシリンジハン
ドが取り付けられるようになっている。

３２は分取・分注機であり、空チユーブラック兼分取・
分注ラック３３〜３６、サンプル分注ラック３７、試薬
用ラック３８等にセットされたチューブからシリンジを
使用して液体を吸い取って分注したり、あるいはエタノ
ールボトル３９からエタノールを吸い取って分注したり
するものである。

グリップハンド４０は第４図に示すように、ハンド本体
７０に摺動可能に取りつけられた支持部材７１によりフ
ィンガ７２が矢印方向に駆動され、フィンガグリップ７
３でマイクロチューブ７５を把持したり離したりするこ
とができるようになっている。

ラック４１．４５は常温用のものでサンプル入りマイク
ロチューブを１６本までセットしておくことが可能であ
る。

氷温ラック４２は水冷で４℃に保持されており、分析用
のサンプルが最初ここにセットされており、また処理過
程で４℃に冷却する必要がある場合にもここにセットさ
れる。

４３はボルテクサーであり、チューブをここにセットし
て振動を与え、異なる液体の混合撹拌を行わせるための
ものである。

４４．５６は遠心分離機であり、本システムにおいては
遠心分離機４４は２０００〜３０００ｒｐｍ回転程度の
低速用で、主と、してチューブ壁に付着した試料を洗浄
して異なる試料を混合させるため等に使用し、遠、Ｃ，
分離機５６は４℃に冷却して沈澱を生じやすくし、１１
００００ｒｐ程度の高速で回転させて遠心分離により濃
縮を行うために使用する。遠心分離機の構造は、第７図
に示、すようにローター１００内に４ケのパケットｌｏ
ｔ〜１０４が設けられ、ローターを回転させるとこのパ
ケットがそれぞれ各軸１０１ａ−１０・４ａに対、して
９０６回転するようになっており、このパケットの中に
キャップをしたマイクロチューブをセットすることによ
り試料がその底部に濃縮されるようになっている。

４６はシリンジハンド用のチップを置いてお（ためのラ
ックである。シリンジハンドは第５図に示すように、シ
リンジ８２が一体となっており、シリンジハンド８０に
設けられたモータ（図示せず）により上下方向に駆動さ
れるピストン８３により上下動するロッド８１が挿入さ
れ、ラックに置かれているチューブに対して注射器のよ
うにして先端から液を吸い込んだり、排出して分注する
ために使用する。

４７は沈澱洗浄用の７０％エタノールが入れられている
ボトルである。

４８は廃液ボトルで濃縮後の上清や、使用済のチップを
廃棄するためのものである。

キャップステーション４９はキャップ着脱部４９　ａ　
ｓキャップ置き場４９ｂ、チューブ置き場４９ｃを有し
ており、キャップ着脱部５０でキャップの着脱を行い、
外したキャップをキャップ置き場４９ｂやキャップラッ
ク５２に置くものであり、チューブ置き場４９ｃはキャ
ップを開けたチューブを一装置いておくためのものであ
る。キャップステーション４９は、第６図に示すように
、チューブ支持台９２に左右方向に移動可能なジョーズ
９１を有しており、これを駆動してチューブを挟み、一
方、スクリューロッド９５にネジ係合しているロッド９
４に取り付けられたグリップハンド９３のグリップフィ
ンガ９３ａ、９３ｂにより、ネジ込みでチューブ７５に
取り付けられているキャップ７６をグリップし、チュー
ブ支持台９２を回転することによりキャップを取り外し
、取り外したキャップはキャップ置き場４９ｂやキャッ
プラック５２に置いておき、取りつける際にはグリップ
ハンドによりキャップを持ってきてチューフ゛上端にセ
ットし、チューブを逆回転することによりキャップ締め
することができるようになっている。なお、上記説明で
はキャップの着脱時におけるキャップのグリップ、キャ
ップの移送をキャップステーションにおけるグリップハ
ンドで行うようにしたが、この機能を回転ロボット３１
のグリップハンド４０で行うようにしてもよく、このよ
うにすることにより制御を単純化することが可能である
。

インキュベータ５３．５４は所定温度で反応を行わせる
ための恒温槽であり、インキュベータ５３は６０℃、イ
ンキュベータ５４は１６℃に加熱・保温されるようにな
っている。

次に、以上のような構成からなる本発明のシステムによ
る操作の流れを４サンプルを例にして説明する。

まず、ロボットアームにグリップハンドを着ける。この
操作はアームをグリップハンド４０の所まで延ばして行
う。

（１）サンプルの入ったチューブを４℃（氷温）のラッ
ク４２から取ってキャップを外し、チューブを分注目３
２のサンプル用ラック３７にセットする。これを４種類
のサンプルについて順次行う。

（２）サンプルＤＮＡを１０ｕｌづつ、１種類につき４
本、計１６本分、分注機３２の分取・分注ラック３６に
セットされている空チューブに分注する。

（３）サンプルの入ったチューブを分注機のラック３７
から取り、キャップをチューブにつけ、チューブを室温
ラック４１に戻す、これを４種類のサンプルについて順
次行う。

（４）蛍光ラベルプライマーの入ったチューブを氷温の
ラック４２から取り、分注機のブライマー用ラック３８
にチューブをセントし、これを４種のプライマーである
Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ａ（アデニン）、Ｃ（
シトシン）について順次行う。

（５）分注８１３２によりプライマーを４種のＤＮＡサ
ンプルの入ったチューブに４μ２づつ分注し、これを４
種のプライマー（Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｃ）について順次行い、
計１６回（本）の分注を行うことになる。

（６）プライマーを分注機のラックから取ってチューブ
を氷温のラック４２に戻す、これを４種のプライマーに
ついて順次行う。

（７）緩衝液を、チューブのセットされている分注機の
ラックから３μｉづつ分注機上の１６本のサンプルの入
ったチューブに分注する。

（８）混合サンプルの入ったチューブを分注機上のラッ
クから取り、キャップ用ラック５２からキャップを持っ
てきてキャップを取りつけ、−旦チューブを４°Ｃのラ
ンクにセットする。これを４種のプライマーに対応する
もの、４種のＤＮＡサンプルに対応するもので計１６本
行う。

以上の（１）〜（８）の工程で鋳型ＤＮＡと蛍光ラベル
プライマーとが緩衝液で混合されたことになる。

次に、低速遠心分離機４４のロータ位置を■番の位置に
セットする。

（９）サンプルの入ったチューブを４℃のラック４２か
ら取り、チューブを遠心分離機のロータにセットする。

これを、ロータを１ポジシヨンづつ動かしながら、４本
のチューブを遠心分離機４４にセットする。

この状態で遠心分離機を２００Ｏｒｐｍ＋で数秒間遠心
し、均一混合を保証するための前処理として、少量試料
をチューブ底部に集める。

（１０）試料を間違えないようにするために、■番の位
置にロータの位置を動かしてチューブを遠心ロータから
取り出し、ボルテクサ−４３にセットして振動撹拌しサ
ンプルを混合する。

混合により試料が飛散してチューブ壁に付着してしまい
、十分混合しない恐れがあるので、チューブを再び遠心
分離機にセットし、ボルテクサーによる混合を４本のチ
ューブについてすべて行った後、２０００ｒｐｍで数秒
間遠心する。

（１１）チューブを遠心分離機のロータ位置■番から取
り出して４℃のラックにチューブをセットし、ロータの
位置を１番づつ動かしながら、４本のチューブについて
こもを行う。

（９）〜（１１）の掻作をもう３組について行い、４種
のＤＮＡサンプルに対応するすべてのチューブについて
、計１６本のチューブの処理を行うことになる。

（，１２）４℃のラックからチューブを取り、６０℃の
ラック５３にチューブをセットする。これを１６本のサ
ンプルについてすべて行い、６０℃で５分間保温する。

これは、すべて熱変性するための処理で、不適正な位置
にプライマーが結合している可能性があるので熱変性す
るためのものである。

（１３）６０℃のラックからチューブを取り、常温のラ
ック４５にチューブをセットする。これを１６本のサン
プルについてすべて行い、室温で３０分間放置する。こ
うして６０℃から室温まで徐冷することによりプライマ
ーを適正な位置に結合させて部分的な２本鎖を形成する
。

（１４）チューブを常温のラック４５から取り、４℃の
ラック４２にセットする。これを１６本のサンプルにつ
いてすべて行い、次の処理のために４℃で５分間冷却す
る。

以上の処理により鋳型ＤＮＡとプライマーの部分的な２
本鎖が形成され、アニーリング処理が行われたことにな
る。

（１５）５分間冷却したチューブを４℃のラック４２か
ら取り、キャップをチューブから外し、キャップはキャ
ップ用ラック５２上に置く、そしてキャップを外したチ
ューブを分注機３２の分注用ラック３６にセットする。

これを１６本のチューブ全てについて行う。

（１６）酵素反応基質の入ワたチューブを４°Ｃのラッ
ク４２から取り、分注機３２上のプライマー兼酵素反応
基質用ラック３日にチューブをセットする。これを４種
の基質（Ｇ、　Ｔ、　Ａ、　Ｃ）について順次行う。

（１７）次に（５）と同じ処理を行い、酵素反応基質を
４種類のＤＮＡサンプルの入ったチューブに４μｉづつ
分注（Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｃの順番はプライマーの種類に対応
させる）し、これを、４種のプライマーについて順次行
う、計１６本のチューブに分注を行うことになる。

（１８）酵素反応基質の入ったチューブを分注機３２の
ラック３８から取り、チューブを氷温のラック４２に戻
し、これを４種（Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｃ）の１質について順次
行う。

（１９）次に（７）と同様に酵素をチューブのセットさ
れている分注機上のラックから２９１１づつ、分注機上
の１６本のサンプルの入ったチューブに分注する。

（２０）（８）と同様に混合サンプルの入ったチューブ
を分注機上のラックから取り、キャップ用ラックの上に
置かれているキャップを取りつける。

チューブを４℃のラックにセントする。これを４種の基
質に対応するもの、４種のＤＮＡに対応するもので１６
本行う。

そして（９）〜（１１）と同様に低速遠心・ポルテック
ス・低速遠心を行って混合する。この操作を４回繰り返
すことは前と同じである。

（２１）４°Ｃのラック４２からチューブを取り、チュ
ーブを１６°Ｃのラック５４にセットし、これを１６本
のチューブすべてについて行う。

１６°Ｃで３０分間保温するようにする。この処理によ
り、ＤＮＡの伸長反応が起こり、鋳型ＤＮＡの配列に従
って相補ＤＮＡ鎖が形成される。

（２２）チューブを１６°Ｃのラック５４から取り、チ
ューブを６０°Ｃのラックにセットする。これを１６本
のチューブすべてについて行い、６０°Ｃで１０分間加
熱する。この加熱処理によりＤＮＡポリメラーゼを失活
させて伸長反応を停止させる。

（２３）チューブを６０℃のラックから取り、４°Ｃの
ラック４２にセットする。これを１６本のチューブすべ
てについて行つ。

（２４）チューブを４°Ｃのラック４２から取り、キャ
ップをチューブから外してキャップ用ラック上５２に置
き、キャップを外したチューブを分注機３２の分注用ラ
ンク３６にセットする。これを１６本のチューブすべて
について行う。

（２５）酢酸ナトリウムを分注機上にセットされている
チューブから３．Ｏｕｌ、づつ、分注機上の１６本のサ
ンプルの入ったチューブに分注する。これは塩濃度を上
げて沈澱を生じゃすくするためである。

（２６）さらに沈澱剤としてエタノールを分注機の専用
ラインを通して、１００ｕｌづつ分注機上の１．６本の
チューブに分注する。

（２７）（８）と同様に混合サンプルの入ったチューブ
を分注機上のラックがら取り、キャップ用ラック５２上
に置かれているキャップを取り付け、チューブを４℃の
ラック４２にセットする。

これを４種の基質に対応するもの、４種のＤＮＡサンプ
ルに対応するもので１６本行う。

（２日）サンプルの入ったチューブを４°Ｃのラックか
ら取り出し、サンプルチューブの内容をボルテクサー４
３で混合し、チューブを４℃のラック４２にセットする
。これを１６本のチューブすべてについて行う、この場
合は液体の量が多いために壁面に付着した試料を集める
ための遠心分離は不要である。

（２９）チューブを４℃のラックがら取り、キャップを
チューブから外してキャップ用ラック５２の上に置き、
キャップを外したチューブを、再び４°Ｃのラックにセ
ットする。これを１６本のチューブすべてについて行う
。

（３０）ロボットアームに着いているハンドを外して、
所定の場所に置き、ロボットアームにシリンジハンドを
着ける。

（３１）シリンジハンドの先にチップをチンブラック４
６から取って着け、１種のＤＮＡサンプルについてＣ６
５μｆｆｉ、Ａ６５μｆｆｉ、Ｔｌ３０μ１Ｇ１３０μ
２となるように分注を行い、分注後、チップを廃液ボト
ル４日の中に捨てる。これを４種のＤＮＡサンプルにつ
いて行う、混合されたサンプルのチューブが４本できる
。ここで、Ｃ，Ａ。

Ｔ、Ｃを上記割合としたのは蛍光の強さがＴ、　　Ｇは
Ｃ，Ａに対して半分の強さであるので、これを揃えるた
めである。

（３２）シリンジハンドをロボットアームから外し、所
定の場所に置き、グリップハンドをロボットアームに着
ける。

（３３）上記のように混合したチューブを４°Ｃのラッ
クから取り、キャップラック５２から持ってきたキャッ
プをチューブに着け、チューブを４°Ｃのラックにセッ
トする。これを４本のチューブについて行う。

（３４）チューブを４°Ｃのラックから取り、冷却遠心
分離機のロータ位置を２番にセットする。遠心分離機ロ
ータパケット■にチューブをセットし、冷却遠心分離機
のロータ位置を１つづつ動かしながら４本のチューブを
すべて遠心分離機にセットする。そして、１０分間冷却
後１１００００ｒｐで３０分遠心する。１０分間冷却の
冷却はＤＮＡを完全に沈澱させるためのものであり、１
１００００ｒｐで３０分遠心することによりＤＮＡを完
全にチューブ底部に集めて濃縮する。

（３５）冷却遠心分離機の蓋を開き、ロータ位置を０番
にしてチューブをロータから取り出し、チューブからキ
ャップを外して上清のエタノールを廃液ボトルに捨て、
チューブをキャップ着脱装置のチューブ置場４９ｃにセ
ットする。

（３６）遠心分離機ロータ位置を０番にして上と同じ操
作を２番目のチューブについて行う。

（３７）遠心分離機ロータ位置を０番にして、上と同じ
操作を行う。

（３８）遠心弁Ｈａロータ位置を０番にして、上と同じ
操作を行う。

（３９）ロボットアームに着いているグリップハンドを
外してロボットアームにシリンジハンドを着ける。

（４０）チップをチップラツク４６から取り、シリンジ
の先に着け、７０％エタノールをボトル４７から３５０
＃ｊ！吸い取り、チューブ置場１番にあるチューブの中
に７０％エタノールを分注し、これを４本のチューブに
ついて行う、チップを廃液ボトルに捨てる。７０％エタ
ノールの分注はＤＮＡの沈澱に残存している塩類等を洗
浄するためのものである。

（４１）シリンジハンドをロボットアームから外し、所
定の場所に置き、グリップハンドをロボットアームに着
ける。

（４２）チューブをチューブ置場１番から取り、キャッ
プをチューブに取り着けて冷却遠心分離機のロータ位置
を１番にし、チューブを遠心分離機のロータにセットす
る。

（４３）２番目のチューブについても同様に遠心骨、離
機にセットする。

（４４）３番目のチューブについても同様に遠心分離機
にセットする。

（４５）４番目のチューブについても同様に遠心分離機
にセットする。

遠心分離機中でチューブを１０分間冷却後、１１０００
０ｒｐで１０分遠心し、ＤＮＡを完全に沈澱させるとと
もに、チューブ底部に集めて濃縮し、遠心分離機のロー
タの位置を１番にする。

（４，６）１番のチューブを遠心分ＮＩｌから取り出し
、キャップを外し、グリップハンドの回転動作を利用し
て上清のエタノールを廃液ボトル４８に捨て、キャップ
をチューブに取り着けてチューブを４℃ラックに戻して
保存する。

遠心分離機のロータの位置を１番づつ動かして、上のエ
タノールを捨てる操作を４本のチューブについて行う。

グリップハンドをロボットアームから外し、所定の場所
に置く、そして、蛍光物質が光に対して不安定であるた
め、−時暗所で保存する。

実際には、さらに負圧状態で遠心分離にかけて乾燥をお
こなって、シーケンサ−にかけることになる。

以上の処理により、アニーリング、ＤＮＡ伸長、濃縮が
全自動で行われたことになる。

なお、１６サンプルの処理を行う場合には、前記（１）
〜（３３）までを４サイクル行うと１６本のチューブが
完成し、前記（３４）番の冷却遠心以鋒はロータの４ケ
所のパケット穴すべてを用い、１６本のチューブを１度
に遠心処理し、エタノール廃液、エタノール分注の操作
は再び４本づつ４サイクル行えばよい。

なお、本実施例では冷却温度を４℃としたが、これは水
冷での冷却のためであり、他の冷却媒体を使用してさら
に冷却温度を下げてもよいことは言うまでもない。

【発明の効果〕

以上のように本発明によれば、ＤＮＡ分析用前処理をす
べて自動化することができ、特に混合と遠心分離により
、チューブ壁面に付着する試料を完、全に落とし去るこ
とができるのでμｌオーダーの液体をマイクロチューブ
中で確実に混合することができ、さらにキャップ付のマ
イクロチューブを用いているので混合時のサンプルの散
失及び高温時の液体の蒸発を防ぐことができる。また、
冷却遠心分離機を用いることによりＤＮＡ試料の遠心分
離とｖａ縮を行うことか可能である。さらに、本発明に
おいては制御装置のプログラムを変更するだけで処理工
程の追加、変更等を容易に行うことができ、多様な前処
理に対応することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のシステムの概念図、第２図は本発明の
システムの具体的な配置図、第３図は回転ロボットの外
観図、第４図はグリップハンドの構造を示す図、第５図
はシリンジハンドの概略構造を示す図、第６図はキャブ
着脱装置の概略構造を示す図、第７図は遠心分離機の構
造を説明するた検の図である。２１・・・コントローラ、３１は回転ロボット、３２は
分取・分注機、３３〜３６・・・空チユーブラック兼分
取・分注ラック、３７・・・サンプル分注ラック、３８
・・・試験用ラック、３９・・・９５％エタノールボト
ル、４０・・・グリップハンド、４１・・・常温ラック
、４２・・・氷温ラック、４３・・・ボルテクサ、４４
・・・遠心分離機、４５は常温ラック、４６・・・チッ
プラツク、４７・・・７０％エタノールボトル、４８・
・・廃液ボトル、４９・・・キャップステーション、５
２・・・キャップラック、５３．５４・・・インキユベ
ータ、５５はシリンジハンド、５６・・・冷却遠心分離
機、６１は回転台、６２・・・駆動用ワイヤー、６３・
・・アーム支持部、６４・・・アーム、７０・・・ハン
ド本体、７２・・・フィンガ、７３・・・フィンガグリ
ップ、７６・・・キャップ、８０・・・シリンジハンド
、８１・・・ロッド、８２・・・シリンジ、８３・・・
ピストン、９１・・・ジョーズ、９２・・・チューブ支
持台、９３・・・グリップハンド、９３ａ、９３ｂはグ
リップフィンガ、９４・・・ロッド、９５・・・スクリ
ューロッド、１００・・・ローター、１０１〜１０４・
・・バケント。出　　願　　人　　東燃株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ＤＮＡサンプルに蛍光ラベルプライマーを加えて
アニーリングした後、酵素反応によりＤＮＡを伸長させ
るとともに、濃縮するようにしたＤＮＡ分析用自動前処
理システムであって、ＤＮＡサンプルを入れたサンプル
容器を把持して移送し、所定位置にセットする把持移送
手段と、サンプル、プライマー、緩衝液等を分注する分
注手段と、サンプル容器へのキャップの着脱を行うキャ
ップ着脱手段と、サンプルを所定温度に加熱して保温す
る加熱・保温手段と、サンプルを冷却する冷却手段と、
サンプル容器を振動させて攪拌する混合手段と、低速回
転用の第１の遠心分離手段と、高速回転用の第２の遠心
分離手段と、前記各手段をシーケンス制御する制御手段
とを備え、アニーリング処理、伸長処理および濃縮処理
を全自動化したことを特徴とするＤＮＡ分析用自動前処
理システム。
（２）アニーリング処理は把持・移送手段と分注手段と
によりＤＮＡサンプルに蛍光ラベルプライマーを加え、
混合手段および第１の遠心分離手段とにより混合するこ
とを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ分析用自動前処理
システム。
（３）ＤＮＡ伸長処理はアニーリングしたＤＮＡサンプ
ルに把持・移送手段と分注手段とにより基質と酵素を加
え、更に第１の遠心分離手段と混合手段により混合した
後、所定温度で反応させることにより行われることを特
徴とする請求項１記載の、ＤＮＡ分析用自動前処理シス
テム。
（４）濃縮処理は伸長処理したＤＮＡサンプルに把持・
移送手段と分注手段とにより沈澱剤を加え、冷却手段と
第２の遠心分離手段とにより冷却しつつ遠心分離して濃
縮することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ分析用自
動前処理システム。
（５）把持移送手段は上下動および回転可能なアームと
、アームの先端に着脱可能に取り付けられたグリップハ
ンドからなることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ分
析用自動前処理システム。
（６）分注手段はピストン運動によりシリンジチップへ
の液体の吸入、排出をおこなうシリンジハンドからなる
請求項１記載のＤＮＡ分析用自動前処理システム。
（７）キャップ着脱手段は、チューブの下部を把持して
回転させる手段を備え、把持移送手段によりキャップを
把持した状態でチューブを回転させることによりキャッ
プの着脱を行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ
分析用自動前処理システム。
（８）キャップ着脱手段は、キャップ把持手段とチュー
ブの下部を把持して回転させる手段とを備え、キャップ
を把持した状態でチューブを回転させることによりキャ
ップの着脱を行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮ
Ａ分析用自動前処理システム。