DD262672A1 - Verfahren zur immobilisierung und zum nachweis von biomakromolekuelen, biologischen materialien und niedermolekularen verbindungen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Immobilisierung von Biomakromolekuelen, biologischen Materialien und niedermolekularen Verbindungen. Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von aktivierten Polystyrenoberflaechen zur Immobilisierung oder zum Nachweis von Biomakromolekuelen wie Proteine, Nukleinsaeuren, biologischen Materialien wie Mikroorganismen, Zellen, Viren sowie von niedermolekularen Verbindungen wie Haptene, Pharmaka, Farbstoffe. Die Anwendungsgebiete sind die pharmazeutische Industrie, die Biowissenschaften, die Biotechnologie und die Medizin. Durch Verwendung von Polystyrenoberflaechen als feste Phase, die mit Organosilanen der Formel (XRn)n Si R4-numgesetzt wurden wo X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, Isocyano-, Diazo-, Epoxy-, Isothiocyano-, Nitroso-, Sulfhydryl- oder Halocarbonyl-Gruppe und R eine Alkyl-, Alkylphenyl- oder Phenyl-Gruppe sind, waehrend R fuer eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Gruppe steht, wobei n den Wert zwischen 0-20 und n den Wert zwischen 1-3 besitzen, wird eine hohe Bindungskapazitaet und die Wiederverwendbarkeit, auch nach mehrmaliger Benutzung, durch einfaches Regenerieren erreicht.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf den Nachweis und auf die Immobilisierung von Biomakromoleküle^wie Proteine, Nukleinsäuren, biologischen Materialienwie Mikroorganismen, Zellen, Viren sowie auf niedermolekulare Verbindungen(wie Haptene, Pharmaka, Farbstoffe.
Insbesondere findet die Erfindung in der pharmazeutischen Industrie, den Biowissenschaften, in der Biotechnologie sowie in der Medizin Verwendung.
Spezifische und empfindliche immunologische Methoden zur quantitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Viren, Mikroorganismen usw. erlangten in den letzten Jahren eine herausragende Bedeutung in der medizinischen und biowissenschaftlichen Forschung sowie in der klinischen Praxis. Insbesondere die als Immunoassays bezeichneten Methoden zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen usw. haben eine weite Verbreitung gefunden, da sie die Vorteile der hohen Spezifität immunologischer Reaktionen mit der extrem hohen Sensivität des Detektionssystems (Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay, Fluoroimmunoassay etc.) in sich vereinigen.
Unter den zahlreichen beschriebenen Varianten hat die sogenannte Festphasentechnik („Solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden wird und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht, eine weite Verbreitung gefunden. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K.J.Catt und G.W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der adsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyren, angewandt (Übersicht: J. E. Herrmann: Methode in Enzymol. 73 [1981] 239)
Allerdings ist dieses Verfahren mit einigen Nachteilen verbunden:
— Die Beladungsdichte an Plastmaterialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial, die zur Verfügung stehende Oberfläche sowie die Größe des Proteins limitiert.
— Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J.E.Herrmann, R.M.Hendry, M.F.Collins: J. Clin. Microbiol. 10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W.Schößler, G.Wegner: Z. med. Labordiagn. 24 [1983] 177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.
— Die mit Proteinen beladenen Plastmaterialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so daß sehr wertvolle und nur aufwendig zu präparierende Proteine verloren gehen.
— Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probenzahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.
— Die Möglichkeiten einer Standardisierung sind bei diesem Verfahren begrenzt.
Ziel der Erfindung ist es, den Nachweis und die Immobilisierung von Biomakromolekülen, biologischen Materialien und niedermolekularen Verbindungen billiger, schneller und effektiver zu machen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Festkörperoberfläche auf der Basis von Polystyren zu entwickeln, die ein hohes Bindungsvermögen aufweist und die jederzeit über einen längeren Zeitraum und nach mehrmaliger Benutzung durch Regenerierung wiederverwendbar ist.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch Verwendung von Polystyrenfestkörperoberflächen, die mit Organosilanen der Formel
(XRV)nSi R4^1
umgesetzt wurden, wo
X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, Epoxy-, lsothiocyano-, Nitroso-, Sulfhydryl- oder Halocarbonyl-Gruppe R' eineAlkyhAlkylphenyl-oderPhenyl-Gruppeund
R eine Alkoxy-, Phenoxy-oder Halogen-Gruppe sind und
η die Werte 1-3 und η 0-20 besitzt.
Die aktivierten Polystyren-Festkörperoberflächen werden direkt über die entsprechenden funktionellen Gruppen oder aber unter Vermittlung von homo- oder heterobifunktionellen Reagenzien auf an sich bekannte Art und Weise mit den zu bindenden Proteinen, Nukleinsäuren, niedermolekularen Liganden, Zellen, Mikroorganismen und anderen biologischen Materialien umgesetzt.
Das erfolgt beispielsweise so, daß die Polystyren-Festkörperoberflächen mit Gemischen aus Organosilanen, die sich aus y^Aminopropyltriethoxysilan und Glycidoxypropyltriethoxysilan zusammensetzen, aktiviert werden und die nunmehr an der Festkörperoberfläche befindlichen Amino- und Epoxy-Gruppen mit Proteinen direkt oder unter Vermittlung von Glutardialdehyd reagieren.
Die an die aktivierte Polystyrenoberfläche gebundenen biologisch aktiven Liganden sind über lange Zeit auch unter extremen Bedingungen stabil und aktiv. Die unspezifischen Bindungen an so aktivierte Polystyrenoberflächen sind gering.
Die an die aktivierten Polystyren-Festkörperoberflächen gebundenen Proteine, wie Antigene und Antikörper, Nukleinsäuren, niedermolekulare Liganden, Mikroorganismen, Zellen und andere biologisch aktive Materialien werden zur Trennung und Isolierung entsprechender Wechselwirkungspartner oder vor allem zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischen Wechselwirkungspartnern im Festphasen-Immunassay eingesetzt. Hierbei können nach Ablauf der Immunreaktion die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe durch Dissoziation herbeiführende Reagenzien schonend gespalten und die mit Antigenen bzw. Antikörpern beladenen Träger wieder im Immunoassay eingesetzt werden. Die als feste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form. Besonders geeignet sind zylindrische, kugelförmige oder planare Körper, aber auch würfelförmige oder kegelförmige lassen sich verwenden. Das Volumen der Körper beträgt mindestens 1 \im3 und sollte 15cm3 nicht überschreiten. Bei planaren Körpern ist weniger das Volumen als eine reproduzierbare, zur Verfugung stehende Fläche pro Probe von Bedeutung. Diese sollte 0,001 cm2 nicht unter- und 5cm2 nicht überschreiten. Die Formkörper sind kompakt oder hohl, wobei die Hohlräume geschlossen oder offen sind. Die Formkörper können als individuelle Matrix für jede Probe zur Verfügung stehen, jedoch auch mehrere Proben gleichzeitig aufnehmen, wobei durch geeignete Vorrichtungen ein Vermischen derselben vermieden werden muß. In der Praxis häufig verwendete Formkörper für Immunoassays sind Polystyrenkugeln, -röhrchen, aber vor allem -mikrotitrationsplatten. Wichtig hierbei ist, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Formkörper leicht zu handhaben sind und eine hinreichend große und definierte Oberfläche besitzen.
Die nicht denaturierenden Medien zur Dissoziation der Antigen-Antikörper-Komplexe können aus den unterschiedlichsten Substanzen bestehen, die auf unterschiedlichste Art und Weise die multifaktoriellen Bindungen derartiger Komplexe zu spalten in der Lage sind. Hierzu sind vor allem stark saure Puffer, wie HCI-Glycin-Puffer pH 2,2-2,8, chaotropische Ionen, wie MgCI2, KSCN und NaJ, sowie die Polarität des Puffers reduzierende Verbindungen, wie Dioxan und Ethylenglykol, zu rechnen.
Nach Ablauf der Immunreaktion werden die gebundenen Immunreaktanden durch die beschriebenen die Dissoziation herbeiführenden Agenzien abgespalten, so daß die gebundenen Antigene bzw. Antikörper für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfügung stehen.
Die erfindungsgemäße Verwendung der aktivierten Polystyrenoberflächen insbesondere im Festphasen-(Enzym-) Immunoassay zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:
— Durch die kovalente Bindung von Antigenen bzw. Antikörpern lassen sich wesentlich höhere Beladungsdichten erzielen. Diese führen ebenso wie die verbesserte sterische Zugänglichkeit des Proteins — bedingt durch den Spacer — zu einer höheren Empfindlichkeit im Immunoassay.
— Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Immunreaktanden während der notwendigen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert.
— Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer erheblichen Reduzierung der Kosten in der klinischen Routine und biowissenschaftlichen Forschung, da die bisher als Einweggefäße benutzten Polystyren-Materialien mehrfach eingesetzt werden können.
— Durch die Bindung der Antigene bzw. Antikörper an die Polystyren-Oberfläche können diese unter Anwendung von geeigneten Dissoziationsreagenzien wiederholt und reproduzierbar im Immunoassay eingesetzt werden. Dadurch werden mitunter sehr wertvolle und teure Proteine eingespart, was wiederum entscheidend zu einer Kostenreduzierung bei der Ausführung von Immunoassays beiträgt.
— Durch die Immobilisierung der Antigene bzw. Antikörper an Polystyren-Oberflächen ergeben sich günstige Voraussetzungen der Fertigung einfach zu handhabender und standardisierter Testkits für kommerzielle Hersteller derartiger Kits.
— Die an aktivierte Polystyrenoberflächen gebundenen biologisch aktiven Verbindungen sind über lange Zeiträume auch unter extremen Bedingungen stabil und aktiv.
Im folgenden wird die Erfindung an einigen Beispielen erläutert, wobei diese keinen Anspruch auf Vollständigkeit erheben.
Polystyrenröhrchen (4ml, Durchmesser 9mm, Höhe 40 mm, VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden mit einem Gemisch aus y-Aminopropyltriethoxysilan und Glycidoxypropyltriethoxysilan (Haftvermittler 6130, VEB Chemiewerk Nünchritz, DDR) durch Füllen in Kontakt gebracht und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen des Haftvermittlers und Trocknen im Vakuum werden die Röhrchen dreimal mit 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, gewaschen und mit 200μΙ 125J-IgG (gerichtet gegen das Enzym alkalische Phosphatase) in einer Konzentration von 10 Mg/ml (0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8) versetzt und 4h bei 370C inkubiert. Nach Absaugen der überschüssigen Proteinmenge und nachfolgendem intensiven dreimaligem Waschen mit jeweils 2 ml PBS-Puffer, der 0,05%Tween 20 und 0,02% NaN3 enthält, wird die gebundene Proteinmenge durch Messung der Radioaktivität unter Mitführung der eingesetzten Proteinlösung als Standard bestimmt.
Danach werden die Poiystyrenröhrchen wiederum zehnmal mit o.g. PBS-Puffer gewaschen und erneut die gebundene Proteinmenge durch Bestimmung der Radioaktivität bestimmt. Die so mit 125J-IgG beladenen Röhrchen werden anschließend mehrfach im Enzymimmunoassay (s. Beispiel 4) eingesetzt. Nach einem Zeitraum von vier Wochen wird die gebundene Proteinmenge wiederum durch Bestimmung der Radioaktivität ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 zusammengefaßt.
Polystyrenröhrchen (4mi, VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Haftvermittler 6130 aktiviert und anschließend mit 3% Glutardialdehyd versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Nach Absaugen des überschüssigen Reagenz und nachfolgendem dreimaligen Waschen werden die Röhrchen mit je 200 μΙ 125J-IgG (gerichtet gegen das Enzym alkalische Phosphatase) in den Konzentrationen von 10μg/ml und 50μg/ml versetzt und 4h bei 37°C inkubiert. Nach Absaugen der überschüssigen Proteinmenge und nachfolgendem Waschen wird die gebundene Proteinmenge, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Messung der Radioaktivität bestimmt. Auch hier erfolgt eine mehrmalige Bestimmung der gebundenen Proteinmenge nach weiteren Waschzyklen sowie Einsatz der Röhrchen im Enzymimmunoassay. Die Ergebnisse sind auch in Tab. 1 dargestellt.
Polystyrenkugeln (6mm Durchmesser, Northumbria, England) werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Haftvermittler 6130 und Glutaraldehyd aktiviert und nachfolgend mit 125J-IgG in der Konzentration von 10 μg/ml gebunden. Die weitere Behandlung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 2 angeführt. Auch diese Ergebnisse sind aus Tab. 1 ersichtlich.
Tabellei: Bestimmung der Bindung von 125-J-lgG an Polystyren (alle Werte repräsentieren Zehnfachbestimmungen, zur Vergleichbarkeit wurde die gebundene Proteinmenge auf gleiche Flächeneinheiten bezogen; als Referenz erfolgte die Bindung von 125J-IgG durch Adsorption mit einem Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH9,6)
Proteinbindung
I.Messung
(drei Waschzyklen)
2. Messung
(weitere zehn Waschzyklen)
3. Messung (nach mehrmaligem. Eins. i. EIA)
adsorptiv: Polystyrenröhrchen 10μg/ml
50μg/ml Polystyrenkugeln
760ng/cm2 1 598 ng/cm2
1150 ng/cm2
700 ng/cm2 1 464 ng/cm2
1 026 ng/cm2
488 ng/cm2 1 110 ng/cm2
522 ng/cm2
chemisch aktiviert entsprechend Beispiel 1
Polystyrenröhrchen 10μg/ml
669 ng/cm2
598 ng/cm2
488 ng/cm2
chemisch aktiviert entsprechend Beispiel 3 Polystyrenröhrchen 10μg/ml 50μg/ml
1 149 ng/cm2
2 283 ng/cm2
1 023 ng/cm2
2 047 ng/cm2
1 047 ng/cm2
2 047 ng/cm2
| chemisch aktiviert entsprechend | 1 504 ng/cm2 | 1 327 ng/cm2 | 1 327 ng/cm2 |
| Beispiel 2 | |||
| Polystyrenkugeln | |||
| 10μg/ml | |||
Die entsprechend den Beispielen 1 bis 3 aktivierten und mit 125J-IgG (gerichtet gegen das Enzym alkalische Phosphatase) beladenen Polystyrenträger werden, wie in den Beispielen 1 bis 3 angeführt, zunächst dreimal (I.Messung) und anschließend weitere zehnmal (2. Messung) mit einem PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 und 0,02% NaN3 enthält, gewaschen und nachfolgend mit 1 m Ethanolamin für 2 h bei 37°C behandelt. Dadurch werden eventuell noch freie reaktive Gruppen auf der Festkörperoberfläche blockiert.
Nach erneutem Waschen mit o.g. Puffer werden die Polystyrenträger mit dem Enzym alkalische Phosphatase (Boehringer-Mannheim, BRD) in einer Konzentration von 1,5IU/mg in o.g. PBS-Puffer versetzt und 20h bei 4°C inkubiert. Nach Entfernung des nicht gebundenen, überschüssigen Enzyms durch viermaliges Waschen mit angegebenem PBS-Puffer wird die Enzymaktivität an der festen Phase durch Hydrolyse von 4-Nitrophenylphosphat in 1 m Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, und photometrische Bestimmung des Reaktionsproduktes bei 405 nm nach vorherigem Stoppen mit 2 η NaOH bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab.2 zusammengefaßt.
Tabelle2: Vergleich der Antikörperreaktivität an Polystyren durch Messung der Enzymaktivität (Zehnfachbestimmungen)
Proteinbindung
PS-Röhrchen (Beispiel 1) PS-Röhrchen (Beispiel 2) PS-Kugeln
(Beispiel 3)
•^g/ml 1^gZmI/ 10pg/ml 50pg/ml
Enzymaktivität
A405nm 1,504 0,469 0,861
0,689
Kommerzielle Polystyrenröhrchen (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, aktiviert und mit je 200μΙ humanen IgG in einer Konzentration von 37μg/ml versetzt und 2h bei Raumtemperatur und anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Entfernen des überschüssigen Proteins durch Waschen, wie in Beispiel 4, werden eventuell noch freie reaktive Gruppen mit 1 m Ethanolamin (2h, 370C) geblockt. Nach erneutem Waschen werden die Polystyrenröhrchen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-antihuman-lgG-Antikörper und derti Enzym alkalische Phosphatase, für 4h bei 370C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit angegebenen PBS-Puffer wird die Enzymaktivität durch photometrische Messung, wie in Beispiel 4 angeführt, bestimmt.
Unabhängig davon werden Polystyrenröhrchen auf bekannte Art und Weise durch adsorptive Bindung in einem 0,1 m Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, mit humanemJgG in dergleichen Konzentration beladen und parallel mit o.g. Konjugat unter identischen Bedingungen bestimmt. Die Ergebnisse des Vergleiches sind in Tab. 3 dargestellt.
Tabelle 3: Vergleich der immunologischen Reaktivität von humanem IgG in Abhängigkeit von dem Bindungsverfahren (Zehnfachbestimmungen)
adsorptive Bindung chemische Bindung
Enzymaktivität
A405nm 0,253 1,050
Eine kommerzielle Mikrotitrationsplatte aus Polystyren (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) mit 96 Vertiefungen wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, aktiviert und anschließend mit je 200 μΙ humanem Immunglobulin G in einer Konzentration von 20 μg/ml in einem 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, versetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nachfolgend werden die nunmehr mit humanem IgG beladenen Vertiefungen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-anti-human-lgG-Antikörper und dem Enzym alkalische Phosphatase, — wie in Beispiel 5 angeführt — inkubiert und die Enzymaktivität, wie in Beispiel 4 beschrieben, unter Einsatz eines vertikal messenden Photometers (MTF 10, VDE Berlin-Buch der AdW der DDR) bestimmt, wobei die Enzym reaktion durch 0,2m EDTA gestoppt wurde. Unabhängig davon wurde eine Mikrotitrationsplatte, analog Beispiel 5, adsorptiv mit humanem IgG in gleicher Konzentration beladen und unter ansonsten identischen Bedingungen behandelt. Die Ergebnisse sind in Tab.4 dargestellt.
Nach Ablauf der Immunreaktion und Beendigung des Enzymimmunoassays werden die gebundenen Immunreaktanden durch Inkubation der Mikrotritrationsplatte mit 3m KSCN (30 min, 370C) und anschließend 1 m NaCI (30 min, 370C) abgespalten, so daß die mit humanem IgG beladene Platte für einen erneuten Einsatz zur Verfugung steht. Diese wird nun wiederum mit angegebenem Konjugat versetzt und die Enzymaktivität bestimmt. Die Ergebnisse eines dreimaligen Einsatzes einer solchen Mikrotitrationsplatte sind ebenfalls aus Tab. 4 ersichtlich.
Tabelle 4: Vergleich der Immunreaktion von humanem IgG unter mehrfachem Einsatz
Proteinbindung
| adsorptive Bindung | 0,280 | I.Messung | chemische Bindung 2. Messung | 3. Messung |
| Enzymaktivität A405nm | 1,173 | 0,878 | 0,890 | |
+ Da bei adsorptiver Bindung während der im Enzymimmunoassay erforderlichen Wasch- und Inkubationsschritte erhebliche Proteinmengen desorbiert werden (s. Tab. 1) wurde diese Mikrotitrationsplatte nur einmal eingesetzt.
Eine kommerzielle Mikrotitrationsplatte (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, aktiviert und anschließend im trockenen Zustand mit einem vertikal messenden Photometer (MTF, VDE AdW der DDR) gegen eine nicht aktivierte Mikrotitrationsplatte gemessen. Die gemessenen Extinktionen lagen in allen Fällen unter 0,01 Extinktionseinheiten.
Polystyrenröhrchen (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, aktiviert und nachfolgend an diese gereinigter humaner Faktor VIII in einer Konzentration von 3,3pg/ml in einem 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, gebunden. Nach Entfernung der nicht gebundenen, überschüssigen Faktor Vlll-Moleküle durch Waschen in bekannter Art und Weise wird im folgenden der Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Faktor Vlll-Antigen (W. Schößler, M.Stepanauskas, C.Dittrich, H.Heine: Acta biol. med. germ. 41 [1982] 263; W.Schößler, M.Stepanauskas, C.Dittrich: Acta biol. med. germ.41 [1982 695] in der beschriebenen Art und Weise ausgeführt. Hierzu werden die Röhrchen mit einem Inkubationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem im Überschuß vorhandenen Kaninchen-anti-human-Faktor-VIII-Antikörper versetzt und 6h bei 370C inkubiert.
Nach erneutem Waschen werden 200μΙ eines Konjugates, bestehend aus einem Ziege-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym alkalische Phosphatase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 4 und 6 beschrieben, bestimmt. Nach Ablauf des Enzymimmunoassays werden die Polystyrenröhrchen mit je 0,5 ml 0,2 m HCI-Glycin-Puffer, pH 2,8, für 30 Minuten bei Raumtemperatur versetzt, so daß die gebundenen Immunreaktanden vollständig abgespalten werden und die mit humanem Faktor VIII beladenen Röhrchen erneut im Enzymimmunoassay — analog Beispiel 6 — eingesetzt werden können.
Kommerzielle Polystyrenröhrchen werden, wie in Beispiel 1,2 und 8 angeführt, mit humanem Faktor VIII beladen und im folgenden in der beschriebenen Art und Weise zur Bestimmung des Faktor-Vlll-Antigens im Enzymimmunoassay eingesetzt. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt allerdings mit einem Konjugat, bestehend aus einem Schaf-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxidase. Nach Entfernung der nicht gebundenen Konjugatmoleküle durch dreimaliges Waschen wird die Enzymaktivität mit2,2'-Azino-di-(3-ethyl)-benzthiazolin-sulfonat (6) (ABTS) (Boehringer-Mannheim, BRD) und H2O2 und photometrische Messung bei 418nm bestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays werden die Röhrchen zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend mit einem der folgenden Dissoziationsreagenzien für 1 h bei Raumtemperatur versetzt: 1) PBS-Puffer, 2 m NaCI und 5%Dioxan enthaltende) 1 m KSCN, 3) 3m KSCN, 4) 4,5 m MgCI2,5) 1 m NaJ, 6) HCI-Glycin-Puffer, pH 2,8,7) HCI-Glycin-Puffer, pH 2,2.
Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem Faktor VIII beladenen Röhrchen erneut reproduzierbar im Enzymimmunoassay eingesetzt werden können.
Polystyren-Latex mit einer Partikelgröße von 475 nm und spezifischen Oberfläche von 12,2m2/g (Hersteller: Institut für Polymerchemie der AdW der DDR, Teltow-Seehof) wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und anschließend mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Enzym Meerrettichperoxidase (Staatliches Institut für Immunpräparate und Nährmedizin, Berlin) der mit 125J-radioaktiv markiert wurde, in der Konzentration von 2mg/ml umgesetzt. Parallel hierzu wird der gleiche Polystyren-Latex mit genanntem Antikörper adsorptiv in einem 0,01 m Phosphat-Puffer, pH 8,2, umgesetzt. Nach Absaugen der überschüssigen Proteinmenge und nachfolgendem zweimaligen Waschen mit PBS-Puffer wird die gebundene Proteinmenge durch Messung der Radioaktivität unter Mitführung der eingesetzten Proteinlösung als Standard bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 5 dargestellt.
Tabelle 5: Vergleich der Bindung von 125J-IgG an Polystyren-Latex
Proteinbindung adsorptive Bindung kovalente Bindung
4 500 mg/m2 9 869 mg/m2
Die nach Beispiel 10 aktivierten und mit dem monoklonaden Antikörper—gerichtet gegen das Enzym Meerrettichperoxidase— umgesetzten Latices werden in eine Säule gefüllt und mit kommerzieller Peroxidase der RZ0,2 (RZ = Reinheitszahl = Awanm/ A280nm) beladen. Nach Elution der ungebundenen Proteine mit PBS-Puffer wird die Peroxidase mit 2m Kaliumthiocyanatlösung eluiert. Das so isolierte und gereingte Enzym besitzt eine RZ von 1,4.
Claims (3)
1. Verfahren zur Immobilisierung und zum Nachweis von Biomakromolekülen, biologischen Materialien sowie von niedermolekularen Verbindungen durch Bindung an Polystyren, gekennzeichnet dadurch, daß Polystyrenfestkörperoberflächen verwendet werden, die mit Organisilanen der Formel
(XR'n')n Si R4_n
umgesetzt wurden, wo
X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, lsothiocyano-, Epoxy-, Nitroso-, Sulfhydryl oder Halocarbonyl-Gruppe
R' eine Alkyl-, Alkylphenyl-oder Phenyl-Gruppe und
R eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Gruppe sind und η die Werte 1-3 und η' 0-20 besitzt.
R eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Gruppe sind und η die Werte 1-3 und η' 0-20 besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Polystyrenfestkörperoberflächen Oberflächen von dreidimensional nutzbaren Formkörpern, wie Kugeln, Halbkugeln, Zylindern, Würfel, Kegel sind, wobei die Formkörper Kompakt- und/oder Hohlkörper sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Polystyrenfestkörperoberflächen Oberflächen von zweidimensional nutzbaren planaren Körpern sind, deren Oberfläche in regelmäßige sich einander abgrenzende Bezirke eingeteilt ist.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30537686A DD262672A1 (de) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | Verfahren zur immobilisierung und zum nachweis von biomakromolekuelen, biologischen materialien und niedermolekularen verbindungen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30537686A DD262672A1 (de) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | Verfahren zur immobilisierung und zum nachweis von biomakromolekuelen, biologischen materialien und niedermolekularen verbindungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD262672A1 true DD262672A1 (de) | 1988-12-07 |
Family
ID=5591067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD30537686A DD262672A1 (de) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | Verfahren zur immobilisierung und zum nachweis von biomakromolekuelen, biologischen materialien und niedermolekularen verbindungen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD262672A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0453060A2 (de) | 1990-04-19 | 1991-10-23 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von antinukleären Antikörpern |
-
1986
- 1986-04-02 DD DD30537686A patent/DD262672A1/de unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0453060A2 (de) | 1990-04-19 | 1991-10-23 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von antinukleären Antikörpern |
| EP0453060A3 (en) * | 1990-04-19 | 1991-11-27 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Method for determination of antinuclear antibodies |
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|---|---|---|---|
| RPV | Change in the person, the name or the address of the representative (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
| IF04 | In force in the year 2004 |
Expiry date: 20060403 |