MX2012001376A

MX2012001376A - Cebada y usos de la misma.

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Publication number: MX2012001376A
Application number: MX2012001376A
Authority: MX
Inventors: Matthew Kennedy Morell; Zhongyl Li
Original assignee: Commw Scient Ind Res Org
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2012-09-07
Also published as: US20210289730A1; KR101806299B1; MY159360A; AU2010278678B9; AU2010278678A1; CA2769311A1; UA116969C2; EP2458974A1; US20120129805A1; US10154632B2; WO2011011833A1; ZA201200766B; EA201270200A1; BR112012002114A2; EP2458974A4; US11026384B2; NZ597971A; JP2013500022A; JP5982282B2; CN102933072B

Abstract

La invención proporciona grano de cebada que comprende un nivel o actividad reducida de proteína Ha de almidón sintasa y un contenido de almidón de por lo menos 41% (p/p) y métodos para producir, identificar y usar el mismo. El grano puede comprender un contenido de amilasa de por lo menos 50%, un contenido de ß-glucano de 5-9% (p/p) o mayor que 9% (p/p) y/o un contenido de fructano de 3-11% (p/p). El fructano puede comprender un grado de polimerización de aproximadamente 3 a aproximadamente 12. Por ejemplo, la planta y grano comprende un alelo de sex6-292 y/o una mutación de amol. Un producto alimenticio o de bebida, y métodos para producir un producto alimenticio o de bebida, que comprenden obtener o producir el presente grano y procesar el grano para producir el producto. También se contemplan métodos para mejorar uno o más indicadores de salud en un mamífero que comprenden administrar una composición que comprende el presente grano de cebada o un producto que comprende el mismo.

Description

CEBADA Y ÜSOS DE LA MISMA CAMPO La presente memoria descriptiva describe plantas de cebada modificadas y el grano de estas que comprende un nivel o una actividad reducida de la proteina SSIIa, y exhibe componentes amiláceos y no amiláceos deseables con un rendimiento relativamente alto.

FUNDAMENTOS La semilla de cebada natural contiene aproximadamente de un 50 a un 60% de almidón, contenido en su endospermo, compuesto por aproximadamente un 25% de amilosa y un 75% de amilopectina . La amilosa es una cadena de grupos glucosilo mayoritariamente lineal con enlaces a- (1-4) y con algunas cadenas de glucano con enlaces a- (1-6), y tiene un peso molecular de 104 a 105. La amilopectina es un glucano muy ramificado, en el que las cadenas de grupos glucosilo con enlaces a- (1-4), compuestas mayoritariamente por 3-60 unidades glucosilo, se conectan por medio de enlaces a- (1,6), de modo que aproximadamente un 5-6% de los enlaces entre grupos glucosilo son enlaces a- (1,6), y tiene un peso molecular de 105 a 106.

Un grupo de enzimas que participan en la biosintesis del almidón de cereales incluye las ADP-glucosa-pirofosforilasas (EC 2.7.7.27), almidón-sintasas (EC 2.4.1.21), enzimas ramificantes de almidón (EC 2.4.1.18) y enzimas desrramificantes de almidón (EC 3.2.1.41 y 3.2.1.68). El primer paso que debe tener lugar durante la síntesis del almidón es la síntesis de la ADP-glucosa a partir de Glucosa-l-P y ATP, catalizada por la enzima ADP-glucosa-pirofosforilasa . A continuación, la ADP-glucosa se utiliza como sustrato para la síntesis de almidón por medio de almidón-sintasas que transfieren glucosa al extremo no reductor de la cadena de grupos glucosilo con enlaces a- (1-4) preexistente de almidón. Las cadenas de glucano ramificadas del almidón, unidas por enlaces a- (1-6), son formadas por enzimas ramificantes de almidón por escisión de una región del glucano con enlaces a-(1-4) y la posterior transferencia del glucano corto a una posición del glucano con enlaces a- (1-4) del almidón. Las cadenas de glucano con enlaces a- (1-6) en exceso son eliminadas por enzimas desrramificantes para mantener al almidón en una estructura definida (remítase a los artículos de revisión de Kossmann and Lloyd, Crit Rev Plant Sci, 19: 171-226, 2000; Rahman et al., J Cereal Sci, 31: 91-110, 2000; Smith, Biomacromolecules, 2: 335-341, 2001; Morell et al., Euphytica, 119: 55-58, 2001; Morell et al., J Appl Glycosci, 50: 217-224, 2003a; Morell et al., Control of starch biosynthesis in vascular plants and algae. En: Plaxton WC, McManus MT (ed.) Control of primary metabolism in plants. Annual plant reviews, vol 22, Blackwell, Oxford, págs. 258-289, 2006; Ball and Morell, Annu Rev Plant Biol, 54: 207-233, 2003; James et al., Curr Opin Plant Biol, 6: 215-222, 2003; Tetlow et al., J Exp Bot, 55: 2131-2145, 2004).

Se han identificado diez genes de almidón-sintasa en el genoma del arroz (Hirose and Terao, Planta, 220: 9-16, 2004) y se han agrupado en cinco clases diferentes: almidón-sintasa unida al gránulo (GBSS), almidón-sintasa I (SSI), almidón-sintasa II (SSII), almidón-sintasa III (SSIII) y almidón-sintasa IV (SSIV) (Li et al., Funct Integr Genomics, 3: 76-85, 2003). Hay dos isoformas de GBSS (GBSSI y GBSSII), una isoforma de SSI, tres isoformas de SSII (SSIIa [SSII-3], SSIIb [SSII-2] y SSIIc [SSII-1] ) , dos isoformas SSIII (SSIIIa [SSIII-2] y SSIIIb [SSIII-1]), y dos isoformas SSIV (SSIVa [SSIV-1] y SSIVb [SSIV-2]) en arroz (Hirose and Terao, 2004 {supra); Fujita et al., Plant Physiol, 144: 2009-2023, 2007). Las proteínas correspondientes a SSI, SSIIa y GBSSI han sido detectadas en gránulos de almidón, mientras que la proteína SSIIIa solamente se ha detectado en la fase soluble de amiloplástidos (Li et al., Plant Physiology, 123: 613-624, 2000) . La función precisa de estas almidón-sintasas de forma individual y conjunta en la determinación de la estructura final del gránulo de almidón sigue sin estar claramente definida, aunque se han caracterizado las funciones potenciales de algunas almidón-sintasas en diferentes órganos y diferentes especies .

Los imitantes en almidón-sintasas han sido útiles para determinar las funciones en algunas especies de cereales. GBSSI desempeña una función fundamental en la biosíntesis de amilosa (Ball et al., Cell 86(3): 349-52, 1996), pero también puede contribuir a la síntesis de las largas cadenas de amilopectina (Maddelein et al., J Biol Chem. 269(40): 25150-7, 1994; Denyer et al., Plant Physiol. 112(2) : 779-85, 1996). Se ha estudiado el efecto de mutantes portadores de una mutación anuladora en GBSSI sobre las propiedades del almidón en la cebada y el trigo (Andersson et ai, J. Cereal Sci 30: 183-191, 1999; Yamamori and Quynh, Theor Appl Genet, 100: 32-38, 2000) . La cebada mutante portadora de una mutación anuladora en GBSSI tenía menos del 5% del contenido de amilosa en comparación con la natural (Andersson et al., 1999 (supra)). Un mutante de trigo portador de una mutación anuladora en GBSSI también presentaba un contenido bajo de amilosa (Kim et al., J Cereal Sci, 37: 195-204, 2003; Miura et al., Euphytica, 108: 91-95, 1999; Miura et al .,Euphytica , 123: 353-359, 2002). El trigo mutante portador de una mutación anuladora en GBSSI también presentaba una temperatura máxima de gelatinización y una entalpia superiores que el natural, según se determinó mediante calorimetría diferencial de barrido (CDB) (Yasui eü al., J Cereal Sci, 24: 131-137, 1996).

Se cree que SSI, SSIIa y SSIII participan principalmente en la síntesis de amilopectina en lo que respecta a la prolongación de subgrupos específicos de extremos no reductores disponibles en la molécula de almidón. Los estudios en mutantes portadores de una mutación anuladora en SSI de arroz y Arabidopsis mostraron que la SSI participa en la biosíntesis de las pequeñas cadenas exteriores del clúster de la amilopectina (8 - 12 dp) en el almidón de hojas de Arabidopsis (Delvalle et al., Plant J. 43(3): 398-412, 2005) y en el almidón de endospermo del arroz (Fujita et al., Plant Physiol. 140: 1070-1084, 2006). El almidón de mutantes de cebada y trigo en SSIIa presentaba un incremento en las cadenas de DP3-8, lo cual indica que la enzima SSIIa desempeña un papel en la prolongación de las cadenas de glucano más cortas de DP3-8 a cadenas de glucano más largas de DP12-35 (Morell et al., Plant J. 34: 173-185, 2003b; Yamamori et al., Theor Appl Genet, 101: 21-29, 2000; onik-Rose et al., Theor Appl Genet, 115: 1053-1065, 2007) . La pérdida de SSIIIa en maíz y arroz confería un fenotipo de amilosa incrementada, con una reducción de la proporción de cadenas muy largas (DP >50 en maíz o DP>30 en arroz) , y una temperatura de gelatinización ligeramente reducida (Jane et al., Cereal Chem. 76: 629-637, 1999; Fujita et al., 2007 (supra)). Los mutantes de Arabidopsis, defectuosos para SSIV, parecen tener menos granulos de almidón pero más grandes en el plástido, y se ha sugerido que la proteína SSIV desempeña una función en la iniciación de la formación de gránulos de almidón (Roldan et al., Plant J. 49: 492-504, 2007) .

Se ha demostrado que un mutante en SSIIa de cebada tiene un fenotipo de amilosa elevada con un contenido de almidón reducido y un peso de semilla reducido debido a la reducción de la biosintesis del almidón. Las lineas imitantes de cebada M292 y M342, que eran homocigóticas para una mutación anuladora en el gen que codifica SSIIa, se obtuvieron después de la mutagénesis de granos de la variedad de cebada 'Himalaya' con azida sódica. Las semillas mutantes se seleccionaron inicialmente del grano de la progenie de la población mutagenizada en función de un fenotipo de grano encogido. Las lineas mutantes se caracterizaron además por sus propiedades de almidón alteradas, un nivel y una actividad de la proteina SSIIa reducidos, y genéticamente por la presencia de un codón de terminación prematura en la región codificante de la proteina del gen que codifica SSIIa ( orell et al., 2003b (supra) , incorporado en su totalidad a la presente por referencia) . Esto provocó la pérdida de la enzima SSIIa en el endospermo. Sin embargo, el grano mutante en SSIIa también presentaba un contenido de almidón sustancialmente reducido y esto se asoció con una reducción moderada del rendimiento cuando, las plantas de cebada se cultivaron en el campo. No se sabia si se podría mejorar el rendimiento ni cómo conseguirlo, manteniendo el fenotipo de amilosa elevada.

Por lo tanto, se necesita una cebada con un alto contenido de amilosa con un rendimiento agronómico mejorado.

COMPENDIO En esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se sobreentenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un elemento o número entero indicado, o de un grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero, o grupo de elementos o números enteros.

Tal como se utilizan en la presente, las formas singulares "un", "una/o" y "el/la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se hace referencia a "una mutación", esta incluye una única mutación, asi como también dos o más mutaciones; cuando se hace referencia a "un agente", este incluye un agente, asi como también dos o más agentes; y asi sucesivamente .

Se hace referencia a secuencias de nucleótidos y aminoácidos empleando un número identificador de secuencia (SEQ ID NO:). Los SEQ ID NOs : corresponden numéricamente a los identificadores de secuencia <400>1 (SEQ ID NO:l), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc. En la Tabla 8 se proporciona un resumen de identificadores de secuencia. Después de las reivindicaciones se proporciona un listado de secuencias.

En la presente, los genes y demás material genético (p. ej . , ARNm, constructos de ácido nucleico, etc.) se representan en cursiva, mientras que los productos de su expresión proteica no se representan en cursiva. Por lo tanto, el polipéptido almidón-sintasa II (SSII) es el producto de expresión de secuencias de ácidos nucleicos de SSII.

Se proporcionan ejemplos representativos de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de moléculas SSIIa en el listado de secuencias que se describe más detalladamente en la Tabla 8.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que el autor hace referencia en esta memoria descriptiva se recopilan al final de la descripción.

Cuando se hace referencia en esta memoria descriptiva a cualquier publicación anterior (o información derivada de esta) o a cualquier asunto conocido, no supone ni se debe interpretar como reconocimiento o admisión, o cualquier forma que sugiera que dicha publicación anterior (o la información derivada de esta) o asunto conocido forme parte del conocimiento general en el campo de aplicación al que se refiere esta memoria descriptiva.

Cada una de las realizaciones descritas en la presente se debe aplicar mutatis mutandis a cada una y todas las realizaciones a menos que se indique específicamente lo contrario.

En una realización, la presente invención proporciona grano de cebada que comprende un nivel o una actividad reducida . de la proteína SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) . El grano, los productos de este y los métodos para obtener, identificar o utilizar el grano se caracterizan por al menos estos dos rasgos. En particular, el "contenido de almidón" es el contenido de almidón del grano entero ya que "el contenido de almidón" de, por ejemplo, el grano pulido, será superior. En algunas realizaciones, el grano de cebada comprende un contenido de almidón de al menos un 43% (p/p) , al menos un 45% (p/p) , al menos un 47% (p/p) , al menos un 50% (p/p) o comprende un contenido de almidón de un 41-65% (p/p) .

En una realización relacionada, el grano comprende un contenido de amilosa de al menos un 50% o al menos un 60% como una proporción del almidón total en el grano. Además, en algunas realizaciones, el grano comprende un contenido de ß-glucano de un 5-9% (p/p) o superior a un 9% (p/p) .

En otra realización, el grano comprende un contenido de fructano de un 3-11% (p/p) o un 4-11%. Convenientemente, el fructano comprende un grado de polimerización de aproximadamente 3 a aproximadamente 12.

En otra realización relacionada, el grano comprende una mutación en un gen endógeno que codifica un polipéptido con actividad SSIIa, donde la mutación reduce la expresión del gen que codifica SSIIa en una planta de cebada o produce la expresión de SSIIa con un nivel o una actividad reducida. En una realización ilustrativa, se proporciona una planta o grano que son homocigóticos para el alelo sexé>-292. En algunas realizaciones, el nivel de SSIIa es reducido por una molécula de ácido nucleico exógena que reduce la expresión de un gen que codifica SSIIa en una planta de cebada. En la presente, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico exógena comprende un gen quimérico de silenciamiento génico, una molécula antisentido, una ribozima, una molécula de cosupresión, ARNbc, ARN horquillado o microARN que reduce la expresión de SSII endógeno.

En una realización preferida, la presente invención proporciona grano de cebada que comprende además una variación genética que reduce la actividad de un gen amol. Convenientemente, según se describe posteriormente en la presente, la actividad del gen amol se reduce en relación con un control no modificado, tal como la reducción relativa al grano de cebada de la variedad Himalaya. En un ejemplo ilustrativo, la variación genética comprende una mutación en un gen amol. En otro ejemplo, la planta o el grano de esta son homocigóticos para el alelo amol -AC38 (Schondelmaier et al., Plant Breeding, 109: 274-281, 1992, incorporado en su totalidad a la presente por referencia) . En una realización, el grano de cebada comprende una mutación en un gen amol y una actividad reducida de una almidón-sintasa que no sea SSIIa, preferentemente un nivel reducido de GBSS, más preferentemente un nivel reducido de GBSSI. El grano también puede comprender un nivel incrementado de lisina (>4 g por 100 g de proteína) . Este tipo de grano se puede obtener cruzando la variedad de cebada Prowashonupana y una cebada que contenga un locus mutante en amol tal como High Amylose Glacier.

El grano puede estar en cualquier forma útil, tal como, sin carácter limitante, grano entero o partido, triturado, pulido, molido, granulado, arrollado o perlado.

La presente invención se extiende a una planta de cebada capaz de producir los granos que se describen en la presente y también a la harina o harina integral de cebada producida a partir del grano.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona grano de cebada que comprende un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) , donde el grano comprende un gen SSIIa mutante y un gen amol mutante . En algunas realizaciones, la mutación SSIIa es el alelo sex6-292. En algunas realizaciones, el grano que comprende una mutación que supone la pérdida de función de SSIIa, tal como la mutación sex6-292, y una mutación amol se obtiene o se produce y procesa para producir un producto alimentario o una bebida.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un producto alimentario o una bebida, donde el método comprende: (i) obtener o producir grano de cebada como el descrito anteriormente; y (ii) procesar el grano para producir el producto. El producto se puede seleccionar convenientemente entre el grupo conformado por harina, harina integral, almindón, salvado, ß-glucano, fructano, un polisacárido no amiláceo y grano partido, triturado, pulido, molido, granulado, arrollado o perlado. El grano de cebada procesado se puede emplear directamente, o en otra realización, el grano procesado se mezcla con uno o más ingredientes adicionales para preparar el producto alimentario o la bebida. En alguna realización, los métodos comprenden además (iii) comprobar el nivel o el tipo de almidón, el contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacáridos no amiláceos, fibra dietética o almidón resistente en el grano de cebada o el producto de este.

En algunas realizaciones, el producto alimentario o la bebida es un grano, harina, cereal de desayuno, galleta, panqué, barrita de muesli, fideo, un agente edulcorante, un aditivo hipocalórico, un agente espesante, una fibra dietética, un agente texturizante, un conservante, un agente probiótico o similar, o cualquier combinación de estos. El producto alimentario puede ser un producto alimentario extrudido, tal como cereales de desayuno extrudidos o botanas, o un producto en copos o arrollado. El producto alimentario puede ser un ingrediente alimentario tal como un ingrediente para hornear o mezclas para hornear.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir una planta de cebada o que permite producir grano con un nivel o actividad reducida de la proteina SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41%, donde el método comprende: (i) introducir en dicha planta un agente que reduce el nivel o la actividad de la almidón-sintasa II (SSII) endógena en la planta en relación con una planta de control, o una mutación en un gen endógeno que codifica SSII en - Il ¬ la planta, y (ii) seleccionar la planta de cebada que produce el grano. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además introducir en la planta una variación genética que reduce la actividad de un gen amol. Los agentes comprenden convenientemente una molécula de ácido nucleico que reduce la expresión del gen SSII endógeno, tal como un gen quimérico de silenciamiento génico, una molécula antisentido, una ribozima, una molécula de cosupresión, ARNbc, ARN horquillado u otra molécula de ácido nucleico exógena que reduce la expresión de SSII endógeno.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además comprobar el nivel, la actividad y/o el tipo de almidón, el contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en el grano de cebada o un producto de este. En algunas realizaciones, los métodos comprenden analizar la planta con uno o más marcadores genéticos. En alguna realización, el nivel o la actividad reducida de la proteina SSIIa es inferior a un 25%, inferior a un 10%, inferior a un 5%, o esencialmente se carece de ella en relación con la de una planta de control, o la planta antes de introducir el agente o la mutación.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para producir grano de cebada como el descrito que comprende los pasos de cultivar una planta de cebada y recolectar el grano. En otra realización, la presente invención proporciona la planta, el grano, la harina o harina integral descritos en la presente que se utilizan o se pueden utilizar en la producción de un producto con el fin de incrementar el nivel de almidón resistente, fibra dietética, carbohidrato hidrosoluble, ß-glucano, fructano o carbohidrato no amiláceo en dicho producto, o para reducir el índice glucémico (IG) de dicho producto. Se utiliza fructano, almidón o ß-glucano aislado de una planta, grano o harina integral del la presente invención, por ejemplo, en un alimento como un agente edulcorante, un aditivo hipocalórico, un agente espesante, una fibra dietética, un agente texturizante, un conservante, un agente probiótico o similares, o cualquier combinación de estos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se utiliza grano, harina, harina integral, almidón, ß-glucano o fructano aislado de una planta, grano, harina o harina integral de la presente invención en la producción de un producto alimentario para incrementar el nivel de almidón resistente, fibra dietética, carbohidrato hidrosoluble, ß-glucano o fructano en dicho producto alimentario o para reducir el índice glucémico (IG) de dicho producto alimentario. En algunas realizaciones, se incrementan los niveles de amilosa, ß-glucano y fructano, y preferentemente almidón resistente. Por consiguiente, la presente invención contempla un producto alimentario que comprende un ingrediente alimentario en un nivel de al menos un 10%, expresado en peso seco, donde el ingrediente alimentario es el grano de cebada descrito en la presente que comprende al menos un 41% de almidón (p/p) , o harina o harina integral obtenida a partir de este, donde la harina o harina integral comprende un nivel o una actividad reducida de SSIIa y un constructo de almidón de al menos un 41% (p/p) . En algunas realizaciones, la harina o harina integral comprende un 3-11% de fructano (p/p) o un 4-11% (p/p) de fructano expresado en peso.

En algunas realizaciones, la harina o harina integral comprende un contenido de ß-glucano de un 5-9% (p/p) o superior a un 9% (p/p) . En otras realizaciones, la harina o harina integral comprende un 50% o un 60% de amilosa como una proporción de almidón total en la harina o harina integral.

En una realización ilustrativa, la cebada comprende el alelo sex6-292.

En otra realización ilustrativa, el producto se selecciona entre el grupo compuesto por pan, bollos, cereales de desayuno, pastel, galleta, masa, galletas saladas, panqués, pizza, croissants, bagels, pretzels, pasta, fideos, ingredientes para hornear, mezclas para hornear, sopa, salsa, agente espesante, productos de confitería, tortillas, barras de granóla, botanas y otros productos a base de harina. El producto puede ser una bebida tal como una bebida energética o un batido.

En otra realización, la presente invención proporciona el uso de un grano o harina aislada de una planta o grano como los descritos en la presente en la producción de un producto alimentario para incrementar el nivel de uno o dos o más de los siguientes: almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en el producto alimentario.

En otra realización, la invención proporciona un método para identificar una variedad de grano de cebada que tiene niveles elevados de uno, dos o más de los siguientes: almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente. En algunas realizaciones, el método comprende (i) obtener grano de cebada modificado respecto al almidón mediante síntesis o catabolismo y (ii) determinar la cantidad de uno, dos o más de los siguientes: almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en el grano. En otras realizaciones, el método comprende (iii) comparar el nivel en (ii) con el de el grano natural que no ha sido modificado respecto al almidón mediante síntesis o catabolismo, o un grano de una planta progenitora o de otra de control. En otras realizaciones más, el método comprende seleccionar el grano si el nivel o los niveles en (ii) aumentan en el grano modificado. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la mutagénesis o la transformación celular de la planta antes del paso (i) . En realizaciones preferidas, el grano de cebada comprende una mutación en un gen amol y una actividad reducida de una almidón-sintasa que puede ser SSIIa , SSIIIa o GBSS, tal como un nivel reducido de GBSSI. Tal grano se puede obtener cruzando el mutante de cebada M292 u otra cebada que comprende el alelo sex6-292 o la variedad Prowashonupana y una cebada que contiene un locus mutante en amol tal como la variedad High Amylose Glacier.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la cantidad de almidón, y el nivel o los niveles de amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en grano de cereales, tal como grano de cebada, que comprende el paso de obtener grano que comprende al menos un 41% de almidón (p/p) de acuerdo con la presente invención, procesar el grano para extraer el almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente, y medir la cantidad extraída de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente para determinar la cantidad de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en el grano.

En otra realización, la invención proporciona un método para preparar un alimento o una bebida que comprende mezclar el grano de cebada o un producto obtenido a partir de este, mediante los métodos descritos en la presente, con otro ingrediente alimentario o bebida. Por lo tanto, el método comprende: (i) obtener o producir grano de cebada que comprenda un nivel reducido o una actividad de la proteina SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) ; y (ii) procesar el grano para producir el producto. El producto se puede seleccionar convenientemente entre el grupo conformado por harina, harina integral, almindón, salvado, ß-glucano, fructano, un polisacárido no amiláceo y grano partido, triturado, pulido, molido, granulado, arrollado o perlado. El método comprende además mezclar el producto con otro producto alimentario o bebida o uno de sus precursores.

La invención comprende además un método para proporcionar almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente para mejorar uno o más indicadores de la salud en un mamífero, donde el método comprende administrar al mamífero una composición que comprende grano de cebada, harina o harina integral de. este, o un alimento o una bebida obtenida a partir de este, que comprende un nivel o una actividad reducida de la proteína SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) o el producto alimentario que se describe en la presente. En alguna realización, el grano, harina, almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente está en forma de un producto alimentario, una bebida o una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el grano o harina está en forma de un producto de fructano. En alguna realización, el indicador o indicadores de la salud son un número mayor de bacterias intestinales beneficiosas, un numero menor de focos de criptas aberrantes, absorción de minerales incrementada, nivel reducido de insulina, índice glucémico reducido, carga glucémica reducida, glucosa en sangre reducida, presión arterial reducida, peso corporal reducido, nivel de colesterol en sangre reducido, nivel incrementado de colesterol HDL, densidad ósea incrementada, niveles elevados de calcio, movimiento intestinal más frecuente o perfil cardiovascular en suero sanguíneo mejorado.

En una realización relacionada, la invención proporciona un método para paliar uno o más síntomas de una afección asociada con unos niveles bajos de almidón dietético, contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto por vía oral grano como el descrito en la presente o un producto procesado que comprende uno o más de los siguientes: almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente, obtenidos a partir de dicho grano, durante un tiempo y en condiciones suficientes para paliar uno o más síntomas .

En algunas realizaciones del método, la afección se selecciona del grupo conformado por diabetes, obesidad, enfermedad cardiovascular, hipertensión, estreñimiento, osteoporosis y cáncer.

Todo sujeto que se pueda beneficiar de los presentes métodos o composiciones queda contemplado. El término "sujeto" incluye, sin carácter limitante, seres humanos y primates no humanos, ganado, tal como ganado bovino, porcino o gallinas, o crías, tales como terneras, terneros o cochinillos, animales de compañía, tales como perros o gatos, caballos, animales para pruebas de laboratorio, animales salvajes que viven en cautividad, reptiles y anfibios, peces y pájaros. Un sujeto, independientemente de si es un organismo humano o no humano, se puede denominar paciente, individuo, sujeto, animal, huésped o destinatario. En una realización particular, el sujeto es un ser humano.

El resumen anterior no es una enumeración exhaustiva de todas las realizaciones de la presente invención ni se debe interpretar de ningún modo como tal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación fotográfica de semillas que muestra la morfología de las semillas. Las líneas utilizadas eran líneas naturales (HH21 y HH61), mutantes en amol (HH17 y HH30) , mutantes en SSIIa (HH35 y HH 50), mutantes dobles en SSIIa-amol (HH4 y HH88) derivadas de la población BC3F6 del cruce entre Himalaya292 y HAG. También se utilizaron dos líneas parentales y dos líneas de control.

La Figura 2 es un diagrama de barras que ilustra el contenido de almidón como un porcentaje en peso seco de semilla para cuatro genotipos; natural, SSIIa-amol, sslla-amol y sslla-amol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS La Tabla 1 proporciona el contenido de AR y el nivel de IG de harina integral de cebada.

La Tabla 2 proporciona el contenido de AR y el nivel de IG de pan producido utilizando un 100% de harina integral de cebada.

La Tabla 3 proporciona un análisis estadístico de los efectos del genotipo sobre el contenido de AR de pan producido con un 30% o un 100% de harina de cebada.

La Tabla 4 proporciona el contenido de AR y el nivel de IG de pan producido con un 30% de harina de cebada.

La Tabla 5 proporciona un análisis estadístico de los efectos del genotipo sobre el contenido de AR (mg de AR por g de almidón) de pan producido con un 100% de harina de cebada.

La Tabla 6 proporciona un análisis estadístico de los efectos del genotipo sobre el contenido de AR (mg de AR por g de almidón) de pan producido con un 30% de harina de cebada.

La Tabla 7 proporciona un análisis estadístico de los efectos del genotipo sobre el nivel de IG de 10 g de pan producido con un 30% o un 100% de harina de cebada.

La Tabla 8 proporciona una descripción de las SEQ ID NOs gue se proporcionan en la presente.

La Tabla 9 proporciona una subclasificación de aminoácidos.

La Tabla 10 proporciona sustituciones de aminoácidos ilustrativas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de las ventajas agronómicas de cebada mutante en SSIIa, ínter alia, el hecho de que se puedan incrementar niveles elevados de amilosa y fructano aún más en una variedad que comprende una mutación que supone una pérdida de función en el gen SSIIa junto con una variación genética que reduce la actividad de un gen amol. En particular, como se muestra en la Figura 2, los mutantes dobles de cebada presentaron niveles incrementados de almidón frente a los mutantes únicos para SSIIa.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona grano de cebada que comprende un nivel o una actividad reducida de la proteina SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) . En una realización relacionada, el grano comprende un contenido de amilosa de al menos un 50% o al menos un 60% como una proporción del almidón total en el grano. Además, en algunas realizaciones, el grano comprende un contenido de ß-glucano de un 5-9% (p/p) o superior a un 9% (p/p) · En otra realización, el grano comprende un contenido de fructano de un 3-11% (p/p) o un 4-11%. En otra realización, el contenido de lisina en el grano es de al menos 4 g por 100 g de proteina.

El almidón está compuesto únicamente de residuos glucosidicos, y se encuentra como dos tipos de moléculas, amilosa y amilopectina, que se pueden distinguir por su peso molecular u otras propiedades. Las moléculas de amilosa son polímeros lineales esenciales compuestos por unidades glucosídicas con enlaces -1,4, mientras que la amilopectina es una molécula muy ramificada con enlaces glucosidicos -1,6 que enlazan muchas cadenas lineales de unidades glucosídicas con enlaces a-1,4· La amilopectina está compuesta por moléculas grandes de diferentes tamaños comprendidos entre varias decenas de miles a cientos de miles de unidades de glucosa, con aproximadamente un 5% de ramificaciones a-1,6. En cambio, la amilosa está compuesta por moléculas de diferentes tamaños que varían entre varios cientos o varios miles de residuos glucosídicos con menos de un uno por ciento de ramificaciones (para obtener más información, remítase a Buléon et al., International Journal of Biological Macromolecules, 23: 85-112, 1998) . Los almidones de cereales naturales suelen contener un 20-30% de amilosa mientras que el resto es amilopectina.

La síntesis de almidón en el endospermo de plantas superiores es llevada a cabo por un grupo de enzimas que catalizan cuatro etapas fundamentales. Primero, la ADP-glucosa-pirofosforilasa activa el precursor monomérico del almidón sintetizando ADP-glucosa a partir de G-l-P y ATP. En segundo lugar, el donante de glucosilo activado, la ADP-glucosa, es transferido al extremo no reductor de un enlace al-4 preexistente por acción de almidón-sintasas . En tercer lugar, las enzimas ramificantes de almidón introducen puntos de ramificación escindiendo una región de glucano con enlace a-1,4 y a continuación transfiriendo la cadena escindida a una cadena aceptora, de este modo se forma un nuevo enlace a-1,6. Las enzimas ramificantes de almidón son las únicas enzimas que pueden introducir enlaces a-1,6 en a-poliglucanos y, por lo tanto, desempeñan una función esencial en la formación de amilopectina. Por último, las enzimas desrramificantes de almidón eliminan algunos de los enlaces de las ramificaciones, aunque su mecanismo de acción se desconoce.

A pesar de que sea obvio que al menos estas cuatro actividades son necesarias para la síntesis de gránulos de almidón normales en plantas superiores, en el endospermo de plantas superiores existen muchas isoformas de cada una de las cuatro actividades, y las funciones especificas de isoformas individuales han sido sugeridas sobre la base de un análisis mutacional o modificando los niveles de expresión génica utilizando métodos transgénicos . En el endospermo de cereales existen cuatro clases de almidón-sintasa : una isoforma localizada exclusivamente dentro del gránulo de almidón, la almidón-sintasa unida al gránulo (GBSS) , que es esencial para la síntesis de amilosa; dos formas repartidas entre el gránulo y la fracción soluble (la SSI, Li et al., Plant Physiology, 120: 1147-1155, 1999a, la SSII, Li et al., Theoretical and Applied Genetics, 98: 1208-1216, 1999b) ; y una cuarta forma que está localizada por completo en la fracción soluble, la SSIII (Cao et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 373: 135-146, 2000; Li et al., 1999b (supra); Li et al., 2000 (supra)). Se ha demostrado que las mutaciones en SSII y SSIII alteran la estructura de la amilopectina (Gao et al., Plant Cell, 10: 399-412, 1998; Craig et al., Plant Cell 10: 413-426, 1998). No se ha descrito ninguna mutación que ejerza una función sobre la actividad de SSI.

En el endospermo de cereales se expresan tres formas de enzima ramificante: la enzima ramificante I (SBEI), la enzima ramificante lia (SBEIIa) y la enzima ramificante Ilb (SBEIIb) (Hedman and Boyer, Biochemical Genetics, 20: 483-492, 1982; Boyer and Preiss, Carbohydrate Research, 61: 321-334, 1978; Mizuno et al., Journal of Biochemistry, 112: 643-651, 1992; Sun et al., The New Phytologist, 137: 215-215, 1997). El alineamiento de secuencias SBE ha revelado que existe un grado alto de similitud secuencial tanto a nivel nucleotídico como aminoacídico, y permite agruparlas en las clases SBEI, SBEIIa y SBEIIb.

En plantas superiores existen dos tipos de enzimas desrramificantes y se definen según sus especificidades para sustratos: enzimas desrramificantes de tipo isoamilasa y enzimas desrramificantes de tipo pullulanasa ( yers et al., Plant Physiology, 122: 989-997, 2000) . En maíz y en arroz, las mutaciones en sugary-1 se asocian con una deficiencia de ambas enzimas desrramificantes (James et al., Plant Cell, 7: 417-429, 1995; Kubo et al., Plant Physiology, 121: 399-409, 1999). Sin embargo, la mutación causal comparte ubicación con el gen de las enzimas desrramificantes de tipo isoamilasa.

Se ha demostrado que una forma mutante de cebada, denominada M292 o M342, tiene un fenotipo de almidón con amilosa elevada y un fenotipo de almidón con amilopectina reducida. Este fenotipo ofrece presuntos beneficios para la salud humana (Morell et al., Plant J. 34: 173-185, 2003b; Topping et al., Starch/Stárke 55: 539-545, 2003; Bird et al., J. Nutr. 134: 831-835, 2004a; Bird et al. Br. J. Nutr. 92: 607- 615, 2004b) . Se debe a una mutación en el gen de la almidón-sintasa lia (SSIIa) localizado en el cromosoma 7H de la cebada, tal como se describe en la solicitud de patente internacional PCT/AU01/01452 (Publicación N.° WO 02/37955) cuyo contenido se incorpora a la presente por referencia.

La mutación en sex6 de cebada se obtuvo como resultado de la presencia de un codón de terminación en el gen de la almidón-sintasa lia (SSIIa) . El codón de terminación produjo la terminación prematura de la traducción del transcrito. La proteína SSIIa no se pudo detectar en el endospermo de este mutante (Morell et al. 2003 (supra)). La pérdida de actividad de SSIIa produjo una reducción del 80% en la síntesis de amilopectina, y el resto de polímeros de la amilopectina presentaron, en general, una distribución de la longitud de las cadenas alterada y, por lo tanto, una relación amilosa:amilopectina alterada, de modo que el almidón del grano contenia aproximadamente un 70% de amilosa.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona mejoras en la utilidad de plantas de cebada ya que incrementa el rendimiento de componentes amiláceos y no amiláceos en el grano. La modificación se puede limitar a granos o, como alternativa, la modificación puede estar repartida por la planta, en diferentes tejidos y partes de esta. Tal como se utilizan en la presente, "modificando" o "modificado" se refieren a un cambio en la planta o grano, que puede ser un incremento o reducción de la cantidad, actividad, ritmo de producción, tasa de inactivación, tasa de degradación, retardo de la activación, activación más temprana, adición o eliminación de material, mutación o cualquier combinación de estos, mientras haya un nivel o una actividad reducida de la almidón-sintasa II. Los términos incluyen un incremento o una reducción del nivel funcional de un gen o proteina de interés. Se debe sobreentender que "nivel funcional" se refiere al nivel de proteina activa. El nivel funcional es una combinación del nivel real de proteina presente en la célula huésped y la actividad especifica de la proteina. Por consiguiente, el nivel funcional se puede modificar, p. ej . , incrementando o reduciendo la concentración de proteina real en la célula huésped, lo cual se puede conseguir fácilmente alterando la expresión de un gen que codifique la proteina. El nivel funcional también se puede modificar modulando la actividad especifica de la proteina. Dicho incremento o reducción de la actividad especifica se puede conseguir expresando una variante de la proteina con actividad especifica superior o inferior, o reemplazando el gen endógeno que codifica la proteina relevante con un alelo que codifica dicha variante. El incremento o disminución de la actividad especifica también se puede conseguir modificando la expresión de una molécula efectora. En ciertas realizaciones, el nivel de expresión de una secuencia codificante adecuada o la actividad o la cantidad de una enzima se selecciona de modo que sea al menos aproximadamente un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 80% o incluso al menos aproximadamente un 100%, al menos un 200%, al menos un 500% o al menos un 1000% superior, o al menos aproximadamente un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% inferior a un nivel de expresión de referencia, o se reduzca hasta un nivel indetectable .

Otra forma de diferenciar la reducción requerida del nivel o la actividad de SSII es cuantificando el nivel incrementado o el incremento de varias formas de fructano en una planta modificada o su grano.

Tal como se utilizan en la presente, "modif cando", "alterando", "incrementado", "incrementado", "reduciendo", "reducido", "inhibido", "muíante" o similares se consideran en términos relativos, es decir, en comparación con el estado natural o inalterado o de control. En algunas realizaciones, una planta natural es una "planta de control" adecuada. Sin embargo, en muchas situaciones, la planta de control debe ser seleccionada por el experto utilizando sus conocimientos técnicos .

El "nivel de una proteína" se refiere a la cantidad de una proteína particular, por ejemplo, SSII, que se puede medir de cualquier modo conocido en la técnica tal como, por ejemplo, análisis de Western blot u otros métodos inmunológicos .

El "nivel de actividad enzimática" se refiere a la cantidad de una enzima particular medida en un ensayo enzimático.

La "actividad de la proteína SSIIa" se refiere a la cantidad de una enzima particular medida en un ensayo enzimático.

Se podría apreciar que puede que el nivel de actividad de una enzima se altere en un mutante si se produce una proteína más o menos activa, pero no el nivel de expresión de la proteína (cantidad) de la propia proteína. Por el contrario, puede que la cantidad de proteína se altere pero la actividad siga siendo la misma (por unidad proteica) . Las reducciones tanto en cantidad como actividad también son posibles como, por ejemplo, cuando la expresión de un gen que codifica la enzima se reduce transcripcional o postranscripcionalmente . En ciertas realizaciones, la reducción en el nivel de proteína o actividad de SSII es de al menos un 40% o de al menos un 60% en comparación con el nivel de proteína o actividad en el grano de cebada no modificada, o al menos un 75%, al menos un 90% o al menos un 95%. La reducción en el nivel de la proteína o la actividad enzimática o la expresión génica puede tener lugar en cualquier etapa del desarrollo de la hoja, la semilla o el grano, particularmente durante el día cuando tiene lugar la fotosíntesis, o durante la etapa de llenado del grano mientras se está sintetizando el almidón en el endospermo en desarrollo, o en todas las etapas del desarrollo del grano hasta la madurez. El término "natural", tal como se utiliza en la presente, goza de su significado habitual en el campo de la genética e incluye cebada, cultivares o genotipos que no se han modificado como se indica en la presente. Algunas variedades de cebada "natural" preferidas se describen en la presente tales como, por ejemplo, el cultivar Himalaya.

El fenotipo modificado se puede conseguir mediante la inhibición parcial o total de la expresión de un gen SSIIa. Se aplican técnicas muy conocidas en la técnica, tales como SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia, a granos hidrolizados y no hidrolizados, y a fracciones de estos, para identificar las plantas o el grano en que se han producido modificaciones en las enzimas formadoras de almidón. Estos métodos incluyen el análisis de plantas mediante métodos descritos en la presente o además mediante métodos tales como técnicas de análisis en micromatrices, electroforesis, cromatografía (incluida la cromatografía en papel, cromatografía en capa fina, cromatografía de gases, cromatografía de gases-líquidos y cromatografía de líquidos de alta resolución) . Los componentes separados se suelen identificar por comparación de los perfiles de separación con patrones de concentración conocida o mediante técnicas analíticas tales como espectrometría de masas espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Por ejemplo, se puede hacer referencia al Ejemplo 9, Robinson, The Organic Constituents of Higher Plants, Cordus Press, North Amherst, EE. UU., 1980; Adams et al., Anal. Biochem. , 266: 77-84, 1999; Veronese et al., Enz. Microbial Tech., 24: 263-269, 1999; Hendrix et al., J. Insect Physiol., 47: 423-432, 2001; Thompson et al., Carbohydrate Res., 331: 149-161, 2001; y las referencias citadas en estos. Los carbohidratos se pueden determinar utilizando protocolos estándares con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica.

Se puede conseguir alterar el nivel o la actividad de SSIIa introduciendo una o más variaciones genéticas en la planta de cebada. Es decir, las variaciones genéticas producen, directa o indirectamente, la alteración del nivel o la actividad enzimática de parte de la planta durante su crecimiento o desarrollo y, como consecuencia, las modificaciones de la enzima, el almidón y el fructano descritas en la presente. La variación genética puede ser un polinucleótido heterólogo que se introduce en la planta o una célula progenitora, por ejemplo, mediante transformación o mutagénesis. La variación genética se puede introducir posteriormente en códigos genéticos diferentes por cruzamiento, como bien se sabe en el campo del cultivo selectivo. En algunas realizaciones, el nivel o la actividad funcional de SSIIa se reduce hasta un nivel inferior a aproximadamente un 80%, inferior a un 70%, inferior a un 60%, inferior a un 50%, inferior a un 40%, inferior a un 30%, inferior a un 20% o inferior a un 15%, . y convenientemente inferior a aproximadamente un 10%, inferior a un 9%, inferior a un 8%, inferior a un 7%, inferior a un 6%, inferior a un 5%, inferior a un 4%, inferior a un 3%, inferior a un 2% o inferior a un 1% respecto a una planta de control correspondiente para conseguir niveles elevados de componentes amiláceos y no amiláceos, preferentemente en la proporción de amilosa del contenido de almidón del grano. En una realización preferida, los niveles elevados con al menos el doble de los de los' controles. Preferentemente, en esta realización, esta reducción produce un incremento sustancial de polisacárido no amiláceo, tal como niveles de fructano, generalmente, de al menos aproximadamente un 50% o un 55% y más especialmente de al menos aproximadamente un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o un incremento superior en el nivel de fructano respecto a una planta de control correspondiente cultivada en las mimas condiciones ambientales. La cantidad de nivel o actividad reducida de SSIIa requerida puede depender de otros factores tales como los factores ambientales de la especie o cepa vegetal. Sin embargo, se considera que cualquier optimización, que pueda ser necesaria en tal caso, se puede conseguir empleando métodos rutinarios incluidos los descritos en la preséntese pueden conseguir niveles reducidos de SSIIa en tejidos de cualquier parte de la planta, por ejemplo, utilizando un promotor constitutivo para dirigir la expresión de un polinucleótido heterólogo que reduce la expresión de SSIIa. Preferentemente, se puede conseguir en tejidos sumidero, más preferentemente, en endospermo en desarrollo, utilizando un promotor regulado por el desarrollo o especifico para un tejido. "Célula sumidero" y "tejido sumidero", tal como se utilizan en la presente, se refieren a células, tejidos u órganos que comprenden un aporte neto de carbono orgánico que ha entrado en las células de una forma que no sea por fijación de dióxido de carbono, es decir, como azúcares u otros carbohidratos. En plantas, los tejidos sumidero incluyen todos los tejidos no fotosintéticos, asi como también los tejidos fotosintéticos con un aporte neto de carbono orgánico fijado por otras células fotosintéticas o bien obtenido del medio o entorno que los rodea de otra manera que no sea por fijación directa de dióxido de carbono.

Genes En algunas realizaciones, la presente invención supone la modificación de la actividad de un gen, y la construcción y el uso de genes quiméricos. Tal como se utiliza en la presente, el término "gen" incluye cualquier secuencia de desoxirribonucleótidos que incluya una región codificante de una proteina o que se transcribe en una célula pero no se traduce, asi como también regiones no codificantes o reguladoras asociadas. Estas regiones asociadas suelen estar situadas adyacentes a la región codificante o la región transcrita tanto en el extremo 5' como 3' y tienen una extensión de aproximadamente 2 kb a cada lado. A este respecto, el gen puede incluir señales de control tales como promotores, potenciadores, señales de terminación y/o poliadenilación que están asociados de forma natural con un gen dado, o señales de control heterólogas en cuyo caso el gen se denomina "gen quimérico". Las secuencias que están situadas antes del extremo 5' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que están situadas después del extremo 3' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término "gen" engloba tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen.

Los términos "gen de la almidón-sintasa II", "SSII" o similares, tal como se utilizan en la presente, se refieren a una secuencia de nucleótidos que codifica la almidón-sintasa II (SSII) en la cebada, que podrá ser fácilmente distinguida de otras almidón-sintasas u otras proteínas por los expertos en la técnica. En una realización preferida, un gen SSII de cebada se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede estar presente o que se aisla de la cebada o se deriva de esta, que comprende nucleótidos con una secuencia que comparte al menos un 80% identidad con la secuencia de ADNc que se muestra en la figura SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el gen SSII es un gen SSIIa, o la proteína SSII es una proteína SSIIa, pudiéndose aplicar ambos a cualquiera o a todos los aspectos de la invención que se describe en la presente. La secuencia de nucleótidos del ADNc del gen SSIIa de 292 se expone en SEQ ID NO: 9.

Una forma genómica o clon de un gen que contiene la región transcrita se puede interrumpir con secuencias no codificantes denominadas "intrones", "regiones interpuestas" o "secuencias interpuestas". Un "intrón", tal como se utiliza en la presente, es un segmento de un gen que se transcribe como parte de un transcrito de ARN primario pero no está presente en la molécula de ARNm maduro. Los intrones se eliminan o "escinden" del transcrito primario o nuclear; por lo tanto, el ARN mensajero (ARNm) carece de intrones. Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores . "Exones", tal como se utiliza en la presente, se refiere a regiones de ADN correspondientes a las secuencias de ARN que están presentes en el ARNm maduro o la molécula de ARN maduro en los casos en los que la molécula de ARN no se haya traducido. Un ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de aminoácidos en un polipéptido naciente. El término "gen" incluye una molécula sintética o de fusión que codifica todas o algunas de las proteínas de la invención descritas en la presente, y una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las anteriores. Se puede introducir un gen en un vector adecuado para el mantenimiento extracromosómico en una célula o para la intregración en el genoma huésped.

Tal como se utiliza en la presente, un "gen quimérico" se refiere a todo gen que no sea un gen nativo en su ubicación nativa. Normalmente, un gen quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o codificantes de proteínas que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprende secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se deriven de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de forma diferente a la natural. El término "endógeno" se utiliza en la presente para hacer referencia a una sustancia que normalmente está presente o se produce en una planta no modificada que está en el mismo estado de desarrollo que la planta objeto de estudio. Un "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Tal como se utiliza en la presente, "molécula de ácido nucleico recombinante" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido construida o modificada mediante tecnologia de ADN recombinante. Los términos "polinucleótido foráneo", "polinucleótido exógeno" o "polinucleótido heterólogo" y similares se refieren a cualquier ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula mediante manipulaciones experimentales. Estos incluyen secuencias génicas que se encuentran en esa célula siempre y cuando el gen introducido contenga alguna modificación (p. ej . , una mutación, la presencia de un gen marcador seleccionable, etc.) respecto al gen natural. Los genes foráneos o exógenos pueden ser genes que se insertan en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva ubicación en el huésped nativo o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El término "modificado genéticamente" incluye la introducción de genes en células mediante transformación o transducción, la mutación de genes en células y la alteración o modulación de la regulación de un gen en una célula u organismos los cuales han sido sometidos a estos procesos o su progenie.

Polinucleótidos La presente invención, que incluye la descripción, tablas y listados de secuencias, se refiere a diversos polinucleótidos. Tal como se utilizan en la presente, los términos "polinucléotido" , "ácido nulecio" o "molécula de ácido nucleico" se refieren a un polímero de nucleótidos, que puede ser ADN, ARN o una combinación de ambos, e incluye ARNm, ARNc, ADNc, ARNt, ARNip, ARNhc y ARNh. Puede ser ADN o ARN de origen celular, genómico o sintético, por ejemplo, preparado en un sintetizador automático, y puede estar combinado con carbohidrato, lipidos, proteina u otros materiales, marcado con un grupo fluorescente o de otro tipo, o acoplado a un soporte sólido para llevar a cabo una actividad particular definida en la presente, o puede comprender uno o más nucleótidos modificados de origen no natural, con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. El polímero puede ser monocatenario, o esencial o parcialmente bicatenario. Un ejemplo de una molécula de ARN parcialmente bicatenaria es ARN horquillado (ARNh), ARN horquillado corto (ARNhc) o ARN autocomplementario que incluyen un tallo bicatenario formado por apareamiento de bases entre una secuencia de nucleótidos y su complemento y una secuencia en forma de bucle que une covalentemente la secuencia de nucleótidos y su complemento. "Apareamiento de bases", tal como se utiliza en la presente, se refiere a el apareamiento de bases estándar entre nucleótidos, incluidos los pares de bases G:U. "Complementario" quiere decir que las bases de dos polinucleótidos se pueden aparear (hibridar) en parte de las extensiones de los polinucleótidos, o en toda la extensión de uno o de ambos. Un "polinucleótido hibridado" quiere decir que las bases del polinucleótido están de hecho apareadas con su complemento. El término "polinucleótido" y el término "ácido nucleico" se utilizan indistintamente en la presente.

"Aislado" se refiere a un material que está sustancial o esencialmente exento de componentes que normalmente le acompañan en su estado nativo. Tal como se utilizan en la presente, los términos "polinucleótido aislado" o "molécula de ácido nucleico aislado" se refieren a un polinucleótido que está al menos parcialmente separado, preferentemente sustancial o esencialmente exento, de las secuencias de polinucleótidos del mismo tipo a las que está asociado o ligado en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado" incluye un polinucleótido que ha sido purificado o separado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, p. ej . , un fragmento de ADN que ha sido extraído de las secuencias que suelen ser adyacentes al fragmento. Preferentemente, el polinucleótido aislado también está al menos un 90% exento de otros componentes tales como proteínas, carbohidratos, lípidos, etc. El término "polinucleótido recombinante" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a un polinucleótido formado in vitro por manipulación de ácido nucleico en una forma en la que no se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el polinucleótido recombinante puede estar en forma de un vector de expresión. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen un ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional conectado operablemente a la secuencia de nucleótidos.

La presente invención se refiere al uso de oligonucleótidos . Tal como se utiliza en la presente, "oligonucleótidos" se refiere a polinucleótidos con una longitud de hasta 50 nucleótidos. Pueden ser ARN, ADN o combinaciones o derivados de ambos. Los oligonucleótidos suelen ser moléculas monocatenarias relativamente cortas con una longitud de 10 a 30 nucleótidos, normalmente de 15-25 nucleótidos. Cuando este tipo de oligonucleótido se utiliza como sonda o como cebador en una reacción de amplificación, el tamaño mínimo de este oligonucleótido es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre el oligonucleótido y una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico diana. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos, más preferentemente de al menos 18 nucleótidos, más preferentemente de al menos 19 nucleótidos, más preferentemente de al menos 20 nucleótidos, incluso más preferentemente de al menos 25 nucleótidos.

Los polinucleótidos utilizados como sonda suelen estar conjugados con una marca detectable tal como un radioisótopo, hapteno, una enzima, biotina, una molécula fluorescente o una molécula quimioluminiscente . Los oligonucleótidos de la invención son útiles en métodos para detectar un alelo de un gen SSII u otro gen asociado a un rasgo de interés, por ejemplo, niveles de almidón o fructano modificados. Tales métodos, por ejemplo, emplean la hibridación de ácidos nucleicos y en muchos casos incluyen la prolongación del cebador oligonucleotidico por acción de una polimerasa adecuada (como las que se utilizan en PCR) .

Una variante de un oligonucleótido de la invención incluye moléculas de diferentes tamaños de, y/o que se pueden hibridar, por ejemplo, con el genoma del cereal que es próximo al de las moléculas oligonucleótidicas especificas que se definen en la presente. Por ejemplo, las variantes pueden comprender nucleótidos adicionales (tales como 1, 2, 3, 4 o más) o menos nucleótidos, siempre y cuando se sigan hibridando con la región diana. Además, se pueden sustituir algunos nucleótidos sin detrimento de la capacidad del oligonucleótido para hibridarse con la región diana. Además, se pueden diseñar fácilmente variantes que se hidridan cerca de, por ejemplo, a 50 nucleótidos, la región del genoma de la planta en la que se hibridan los oligonucleótidos específicos definidos en la presente. Las sondas, oligonucleótidos y similares se basan en las secuencias descritas en la presente o en versiones corregidas de estas o variantes de estas u homólogos funcionales de otras plantas de cereales.

Los términos "variante de un polinucléotido", "variante" y similares se refieren a polinucleótidos o sus formas complementarias que comparten una identidad sustancial con una secuencia polinucleotidica de referencia. Estos términos también engloban polinucleótidos que se diferencian de un polinucléotido de referencia por la adición, deleción o sustitución de al menos un nucleótido. Por consiguiente, los términos "variante polinucleotidica" y "variante" incluyen polinucleótidos en los cuales se han añadido, eliminado o reemplazado uno o más nucleótidos por otros diferentes. A este respecto, hay constancia en la técnica de que se pueden realizar ciertas alteraciones, que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones, en un polinucleótido de referencia de modo que el polinucleótido alterado conserve la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia. Por consiguiente, estos términos engloban polinucleótidos que codifican polipéptidos que exhiben actividad enzimática u otro tipo de actividad reguladora, o polinucleótidos que se pueden utilizar como sondas selectivas u otros agentes hibridantes. En particular, esto incluye polinucléotidos que codifican la misma secuencia polipeptidica o de aminoácidos pero que varían en la secuencia de nucleótidos por redundancia del código genético. Los términos "variante polinucleotidica" y "variante" también incluyen variantes alélicas naturales.

"Corresponde a" o "que corresponde a" se refieren a un polinucleótido (a) que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica o complementaria a toda o la mayor parte de una secuencia polinucleotidica de referencia o (b) que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de un péptido o una proteína. Esta frase también incluye en su alcance un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos de un péptido o una proteína de referencia. Los términos utilizados para describir las relaciones secuenciales entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad secuencial", "porcentaje de identidad secuencial", "sustancialmente idéntica/s" e "idéntica/s" , y se definen con respecto a un número mínimo de nucleótidos o residuos aminoacídicos, o en toda su extensión. Los términos "identidad secuencial" e "identidad" se utilizan indistintamente en la presente para hacer referencia al grado de identidad entre secuencias en términos de nucleótido a nucleótido o en términos de aminoácido a aminoácido en una ventana, de comparación. Por lo tanto, un "porcentaje identidad secuencial" se calcula comparando dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que se encuentra la base de ácido nucleico idéntica (p. ej . , A, T, C, G, U) o el residuo aminoacídico idéntico (p. ej . , Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y et) en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad secuencial .

El % de identidad de un polinucleótido se puede determinar mediante un análisis GAP (programa GCG) (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) con una penalización por la creación de gap (hueco) = 5 y una penalización por la extensión de gap = 0.3. A menos que se establezca lo contrario, la secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 45 nucleótidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 45 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 150 nucleótidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 150 nucleótidos. Más preferentemente, la secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 300 nucleótidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 300 nucleótidos, de al menos 400, de al menos 500 o de al menos 600 nucleótidos en cada caso. También se puede hacer referencia a la familia BLAST de programas como, por ejemplo, la descrita en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997. Se puede encontrar una descripción detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994- 1998, Capitulo 15.

Se indica que unas secuencias de nucleótidos o aminoácidos son "esencialmente similares" cuando tales secuencias comparten una identidad secuencial de al menos un 80 %, particularmente de al menos un 85%, más particularmente de al menos un 90%, especialmente de al menos un 95% y más especialmente son idénticas. Es evidente que cuando se describen secuencias de ARN como esencialmente similares o correspondientes a secuencias de ADN, o si se indica que comparten un cierto grado de identidad secuencial con dichas secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.

En lo que respecta a los polinucleótidos definidos, se apreciará que valores del % de identidad superiores a los proporcionados anteriormente supondrán realizaciones preferidas. Por lo tanto, cuando proceda, en vista de los valores mínimos del % de identidad, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia polinucleotídica que comparta al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99%, más preferentemente al menos un 99.1%, más preferentemente al menos un 99.2%, más preferentemente al menos un 99.3%, más preferentemente al menos un 99.4%, más preferentemente al menos un 99.5%, más preferentemente al menos un 99.6%, más preferentemente al menos un 99.7%, más preferentemente al menos un 99.8% e incluso más preferentemente al menos un 99.9% de identidad con la SEQ ID NO. relevante nominada, tal como SEQ ID NO: 1 o de 3 a 6.

Preferentemente, un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido con actividad SSII tiene una longitud superior a 800 nucleótidos, preferentemente superior a 900 e incluso más preferentemente superior a 1000 o 2000 nucleótidos .

Los polinucleótidos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con moléculas naturales, una o más mutaciones que sean deleciones, inserciones o sustituciones de residuos nucleotídicos . Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, sometiendo el ácido nucleico a mutagénesis dirigida) .

La presente invención se refiere a la rigurosidad de las condiciones de hibridación para definir el grado de complementariedad de dos polinucleótidos. "Rigurosidad", tal como se utiliza en la presente, se refiere a las condiciones de temperatura y fuerza iónica, y a la presencia o ausencia de ciertos solventes orgánicos, durante la hibridación y el lavado. Cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor será el grado de complementariedad entre una secuencia de nucleótidos diana y la secuencia polinucleotidica marcada (sonda) . "Condiciones rigurosas" se refiere a condiciones de temperatura e iónicas en las cuales solo se hibridarán secuencias de nucleótidos con una alta frecuencia de bases complementarias. Tal como se utiliza en la presente, el término "se híbrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad alta o rigurosidad muy alta" describe condiciones para la hibridación y el lavado. Se puede obtener más información sobre cómo llevar a cabo reacciones de hibridación en Ausubel et al., (ed. ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 6.3.1-6.3.6., 1989. En dicha referencia, se describen métodos acuosos y no acuosos, y se puede utilizar cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación especificas a las que se hace referencia en la presente son las siguientes: 1) las condiciones de hibridación de rigurosidad baja son para la hibridación en 6 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 45 °C, seguida de dos lavados en 0.2 X SSC, SDS al 0.1% a 50-55 °C; 2) las condiciones de hibridación de rigurosidad media son para la hibridación en 6 X SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0.2 X SSC, SDS al 0.1% a 60 °C 3) las condiciones de hibridación de rigurosidad alta son para la hibridación en 6 X SSC a 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0.2 X SSC, SDS l 0.1% a 65 °C y 4) las condiciones de hibridación muy altas son para la hibridación en tampón de fosfato de sodio 0.5 M, SDS al 7% a 65 °C, seguida de uno o más lavados en 0.2 X SSC, SDS al 1% a 65 °C.

Polipéptidos Los términos "polipéptido" y "proteína" generalmente se usan indistintamente. Los términos "proteínas" y "polipéptidos", tal como se utilizan en la presente,' también incluyen variantes, mutantes, modificaciones, análogos y/o derivados de los polipéptidos de la invención descritos en la presente. Tal como se utiliza en la presente, "polipéptido sustancialmente purificado" se refiere a un polipéptido que se ha separado de los lípidos, ácidos nucleicos, otros péptidos y otras moléculas con los cuales está asociado en su estado nativo. Preferentemente, el polipéptido sustancialmente purificado está exento al menos un 90% de otros componentes con los cuales está asociado en su estado natural. "Polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido preparado utilizando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un polinucleótido recombinante en una célula, preferentemente una célula vegetal y más preferentemente una célula de una planta de cereal.

Algunos polipéptidos ilustrativos con actividad SSII se exponen en el listado de secuencias y se describen en la Tabla 8. Por consiguiente, la presente invención propone, sin limitación, la modificación de polipéptidos SSII que poseen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 2 y sus variantes naturales, versiones corregidas de estas y variantes como las descritas en la presente tales como variantes con una identidad secuencial de aproximadamente un 80%.

En lo que respecta a un polinucleótido definido, se apreciará que valores del % de identidad superiores a los proporcionados anteriormente supondrán realizaciones preferidas. Por lo tanto, cuando proceda, en vista de los valores mínimos del % de identidad, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que comparta al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99%, más preferentemente al menos un 99.1%, más preferentemente al menos un 99.2%, más preferentemente al menos un 99.3%, más preferentemente al menos un 99.4%, más preferentemente al menos un 99.5%, más preferentemente al menos un 99.6%, más preferentemente al menos un 99.7%, más preferentemente al menos un 99.8% e incluso más preferentemente al menos un 99.9% de identidad con la SEQ ID NO. 2 relevante nominada.

El % de identidad de un polipéptido relativo a otro polipéptido se puede determinar mediante un análisis GAP (programa GCG) (Needleman and Wunsch, 1970 (supra)) con una penalización por la creación de gap =5 y una penalización por la extensión de gap =0.3. La secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 15 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 50 aminoácidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 50 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 100 aminoácidos. Incluso más preferentemente, la secuencia objeto de estudio tiene una longitud de al menos 250 aminoácidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 250 aminoácidos.

Tal como se utiliza en la presente, fragmento "biológicamente activo" de un polipéptido es una porción de un polipéptido de la invención, de longitud menor que la del polipéptido completo, que mantiene una actividad definida del polipéptido completo. En una realización particularmente preferida, el fragmento biológicamente activo es capaz de sintetizar almidón para producir cadenas de amilosa con un DP (grado de polimerización) de al menos 15. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser de cualquier tamaño, siempre que mantengan la actividad definida, pero preferentemente tienen una longitud de al menos 200 o de al menos 250 residuos aminoacidicos .

Los mutantes en secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la presente · invención se pueden preparar introduciendo cambios nucleotidicos adecuados en un ácido nucleico de la presente invención o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Estos mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos. Se puede realizar una combinación de deleción, inserción y sustitución para obtener el constructo final, siempre que el producto peptídico final posea las características deseadas.

Se pueden preparar péptidos mutantes (alterados) empleando técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención se puede someter a mutagénesis in vitro. Este tipo de técnicas de mutagénesis in vitro incluyen la subclonación del polinucleótido para obtener un vector adecuado, la transformación del vector en una cepa "mutadora", tal como E. coli XL-1 red (Stratagene) , y la propagación de la bacteria transformada durante un número adecuado de generaciones. En otro ejemplo, los polinucleótidos de la invención se someten, a técnicas de transposición de secuencias de ADN como las descritas detalladamente por Harayama, Trends Biotechnol . 16: 76-82, 1998. Estas técnicas de transposición de secuencias de ADN pueden incluir genes relacionados con los de la presente invención, tales como los genes SSII de especies vegetales que no sean, el trigo ni la cebada, y/o incluyen diferentes genes de la misma planta que codifican proteínas similares tales como los genes de la almidón-sintasa I o III del trigo o la cebada. Los productos derivados de ADN mutado/alterado se pueden cribar fácilmente utilizando técnicas descritas en la presente para determinar si poseen, por ejemplo, actividad de almidón-sintasa.

[0001] Al diseñar mutantes en secuencias de aminoácidos, la ubicación del sitio de la mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la característica o las características que se deseen modificar. Estos sitios en los que se pueden ubicar las mutaciones se pueden modificar de forma individual o en serie, p. ej . , (1) sustituyendo primero con selecciones de aminoácidos conservadoras y después con selecciones más radicales dependiendo de los resultados obtenidos, (2) eliminando el residuo diana o (3) insertando otros residuos adyacentes al sitio ubicado.

Las deleciones en secuencias de aminoácidos generalmente suelen variar de aproximadamente 1 a 15 residuos, más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 residuos y normalmente de aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.

Los mutantes producidos mediante sustitución tienen al menos un residuo aminoacídico en la molécula polipeptídica eliminada y un residuo diferente insertado en su lugar. Estos sitios de sumo interés para la mutagénesis por sustitución incluyen sitios identificados como el o los sitios activos. Otros sitios de interés son aquellos en los que residuos particulares obtenidos de cepas o especies diferentes son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos sitios, especialmente aquellos que pertenecen a una secuencia que contiene al menos otros tres sitios conservados de forma idéntica, se sustituyen preferentemente de una forma relativamente conservadora. Este tipo de sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 10 con el titulo "sustituciones ilustrativas".

Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir de varias formas, que incluyen la producción y recuperación de polipéptidos naturales, la producción y la recuperación de polipéptidos recombinantes, y la síntesis química de los polipéptidos. En una realización, un polipéptido aislado de la presente invención se produce cultivando una célula capaz de expresar el polipéptido en condiciones eficaces para producir el polipéptido y recuperar el polipéptido. Una célula preferida para el cultivo es una célula recombinante de la presente invención. Las condiciones eficaces de cultivo incluyen, pero no se limitan a, medios eficaces, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y el contenido de oxígeno que permitan la producción del polipéptido. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que se cultive una célula para producir un polipéptido de la presente invención. Dicho medio normalmente comprende un medio acuoso que contiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilable, y sales, minerales, metales y otros nutrientes adecuados tales como vitaminas. Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microvaloración y placas de Petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, un pH y con un contenido de oxígeno adecuado para una célula recombinante. Un experto en la técnica estará familiarizado con estas condiciones de cultivo.

La presente invención se refiere a elementos que están conectados o ligados operablemente. Las expresiones "conectado operablemente" o "ligado operablemente" y similares se refieren a un ligamiento entre elementos del polinucleótido con una relación funcional. Normalmente, las secuencias de ácido nucleico conectadas operablemente están ligadas de forma contigua y son, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y están en el mismo marco de lectura. Una secuencia codificante está "conectada operablemente a" otra secuencia codificante cuando la ARN-polimerasa trascriba las dos secuencias codificantes en un único ARN, que si se traduce, se traduce posteriormente como un único polipéptido que contiene aminoácidos derivados de ambas secuencias codificantes. Las secuencias codificantes no necesitan ser contiguas entre sí, siempre que al final las secuencias expresadas se procesen para producir la proteína deseada .

Tal como se utilizan en la presente, se entenderá que los términos "secuencia de acción cis", "elemento de acción cis" o "región reguladora cis" o "región reguladora" o términos similares se refieren a cualquier secuencia de nucleótidos, que cuando se encuentra en una posición adecuada y está conectada respecto a una secuencia genética expresable, es capaz de regular, al menos en parte, la expresión de la secuencia genética. Los expertos en la técnica sabrán que una región reguladora cis puede ser capaz de activar, silenciar, potenciar, reprimir o alterar el nivel de expresión y/o la especificidad para un tipo de célula y/o la especificidad para una etapa de desarrollo de una secuencia génica a nivel transcripcional o postranscripcional . En ciertas realizaciones de la presente invención, la secuencia de acción cis es una secuencia activadora que potencia o estimula la expresión de una secuencia genética expresable.

"Conectar operablemente" un elemento promotor o potenciador a un polinucleótido transcribible quiere decir someter el polinucleótido transcribible (p. ej . , un polinucleótido que codifica una proteina u otro transcrito) al control regulador de un promotor, que entonces controla la transcripción de dicho polinucleótido. En la construcción de combinaciones de gen estructural/promotor heterólogo, se prefiere generalmente colocar el promotor o una de sus variantes a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del polinucleótido transcribible que sea aproximadamente la misma que la distancia entre el promotor y la región codificante de la proteina que este controla en su entorno natural; es decir, el gen del que se deriva el promotor. Como bien se sabe en la técnica, algunas variaciones de esta distancia son aceptables sin que ello suponga la pérdida de función. De forma análoga, el posicionamiento preferido de un elemento de la secuencia reguladora (p. ej . , un operador, potenciador, etc.) con respecto a un polinucleótido transcribible que este debe controlar se define como el posicionamiento del elemento en su entorno natural; es decir, los genes de los que se deriva.

"Promotor" o "secuencia promotora", tal como se utilizan en la presente, se refieren a una región de un gen, generalmente precedente (5') a la región codificante de ARN, que controla la iniciación y el nivel de transcripción en la célula de interés. Un "promotor" incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genómico clásico, incluidas las secuencias de la caja TATA y la caja CCAAT, asi como también elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activantes, potenciadores y silenciadores previos) que alteran la expresión del gen en respuesta a estímulos ambientales y/o debidos al desarrollo, o de una forma específica para un tejido o para un tipo de célula. Un promotor está colocado normalmente, pero no necesariamente (por ejemplo, algunos promotores PolIII) , antes de un gen estructural, cuya expresión regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor suelen estar colocados a una distancia máxima de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción del gen. Los promotores pueden contener elementos reguladores específicos adicionales, en posiciones más alejadas del sitio de inicio para potenciar aún más la expresión en una célula y/o para alterar el ritmo o la inducibilidad de la expresión de un gen estructural al cual están conectados operablemente.

"Promotor constitutivo" se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia transcrita ligada operablemente en muchos o todos los tejidos de una planta. El término "constitutivo", tal como se utiliza en la presente, no indica necesariamente que un gen se exprese al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia gama de tipos de células, aunque normalmente se puede detectar alguna variación en el nivel. "Expresión selectiva", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la expresión casi exclusiva en órganos específicos de la planta, tales como, por ejemplo, el endospermo, embrión, hojas, fruto, tubérculos o raíz. En una realización, un promotor se expresa en todo tejido fotosintético, que puede corresponder a todas las partes aéreas de la planta, por ejemplo, un promotor que participa en la expresión de un gen requerido para la fotosíntesis tal como los promotores de la subunidad pequeña de la rubisco. El término también se refiere a la expresión en etapas específicas del desarrollo en un órgano, tales como en la embriogénesis incipiente o tardía, o en diferentes etapas de la madurez; o a la expresión que puede ser inducida por ciertas condiciones ambientales o tratamientos. Por lo tanto, la expresión selectiva puede contrastar con la expresión constitutiva, la cual se refiere a la expresión en muchos o todos los tejidos de una planta en la mayoría o todas las condiciones experimentadas por la planta.

La expresión selectiva también puede producir la compartimentación de los productos de la expresión génica en etapas del desarrollo, tejidos u órganos específicos de la planta. La compartimentación en zonas subcelulares específicas, tales como el endospermo, citosol, vacuola o espacio apoplástico, se puede conseguir incluyendo en la estructura del producto génico señales adecuadas para el transporte hasta el compartimento celular requerido o, en el caso de orgánulos semiautónomos (plástidos y mitocondrias) , integrando el transgén con secuencias reguladoras adecuadas directamente en el genoma de los orgánulos.

Un "promotor específico para un tejido" o "promotor específico para un órgano" es un promotor que se expresa preferentemente en un tejido u órgano en comparación con muchos otros tejidos u órganos, preferentemente la mayoría, sino todos, los demás tejidos u órganos en una planta. Normalmente, el promotor se expresa a un nivel 10 veces superior en el tejido u órgano específico que en otros tejidos u órganos. Un promotor específico para un tejido ilustrativo es el promotor para el gen de las gluteninas de peso molecular alto (HMW) , Bxl7, que se expresa preferentemente en el endospermo en desarrollo de plantas de cereales. Otros promotores específicos para el endospermo incluyen el promotor de gluteninas de alto peso molecular, el promotor de SSI del trigo y el promotor de BEII del trigo. Otros promotores específicos para el endospermo se pueden obtener fácilmente a partir de genes que codifican enzimas biosintéticas del almidón o proteínas de almacénamiento en el grano en desarrollo.

Los promotores contemplados por la presente invención pueden ser nativos de la planta huésped que se ha de transformar o se pueden derivar de una fuente alternativa, en la que la región es funcional en la planta huésped. Otras fuentes incluyen los genes de ADNt de Agrobacterium, tales como los promotores de genes para la biosíntesis de la nopalina, octapina, manopina u otros promotores de la opina; promotores de plantas, tales como promotores de la ubiquitina como el promotor Ubi del gen ubi-1 del maíz, Christensen et al., (1996) (remítase, p. ej . , a la Patente de EE. UU. N.° 4.962.028) o promotores de la actina; promotores específicos para un tejido (remítase, p. ej . , a la Patente de EE. UU. N.° 5.459.252 de Conkling et al.; WO 91/13992 de Advanced Technologies); promotores de virus (incluidos virus específicos para un huésped), o promotores total o parcialmente sintéticos. Muchos promotores que son funcionales en plantas mono- y dicotiledóneas son muy conocidos en la técnica (remítase, por ejemplo, a Greve, J. Mol. Appl. Genet., 1: 499-511, 1983; Salomón et al., EMBO J. , 3: 141-146, 1984; Garfinkel et al., Cell, 27: 143-153, 1983; Barker et al., Plant Mol. Biol., 2: 235-350, 1983; incluidos varios promotores aislados de plantas y virus tales como el promotor del virus del mosaico del coliflor (CaMV 35S, 19S) . Se conocen muchas regiones promotoras específicas para un tejido. Otras regiones de iniciación de la transcripción que proporcionan preferentemente la transcripción en ciertos tejidos o en ciertas condiciones de crecimiento, incluyen aquellos genes que codifican la napina, ACP de semillas, zeína u otras proteínas de almacenamiento de las semillas. También se conocen promotores específicos de la fruta, uno de ellos es el promotor E8, descrito por Deikman et al., EMBO J., 2: 3315-3320, 1998 y DellaPenna et al., Plant Cell, 1: 53-63, 1989. Los métodos no limitantes para evaluar la actividad promotora son los descritos por Medberry et al., Plant Cell, 4: 185-192, 1992; Medberry et al., Plant J. 3: 619-626, 1993, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed.). Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1989, y McPherson et al. (Patente de EE. UU. N.° 5.164.3.16).

Como alternativa o además, el promotor puede ser un promotor inducible o un promotor regulado por el desarrollo que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido introducido en una etapa del desarrollo adecuada de la planta. Otras secuencias de acción cis que se pueden emplear incluyen potenciadores transcripcionales y/o traduccionales . Los expertos en la técnica estarán familiarizados con las regiones potenciadoras y pueden incluir un codón de iniciación de la traducción ATG y secuencias adyacentes. El codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante del polinucleótido foráneo o exógeno para garantizar la traducción de toda la secuencia. Las señales de control de la traducción y los codones de iniciación pueden tener diferentes orígenes tanto naturales como sintéticos. Las regiones de iniciación de la traducción pueden proceder de la fuente de la región de iniciación de la transcripción, o de un polinucleótido foráneo o exógeno. La secuencia también se puede derivar de la fuente del promotor seleccionado para dirigir la transcripción y se puede modificar específicamente para incrementar la traducción del ARNm.

El constructo de ácido nucleico de la presente invención normalmente comprende una secuencia no traducida 3 ' de aproximadamente 50 a 1000 pares de bases nucleotídicas que puede incluir una secuencia de terminación de la transcripción. Una secuencia no traducida 3' puede contener una señal de terminación de la transcripción que puede o no incluir una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de llevar a cabo el procesado del ARNm. Una señal de poliadenilación se caracteriza por llevar a cabo la adición de tractos de ácido poliadenilico al extremo 3' del precursor del ARNm. Las señales de poliadenilización se suelen reconocer por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3', aunque no es inusual que existan variaciones. Las secuencias de terminación de la transcripción que no incluyen una señal de poliadenilación incluyen terminadores para la ARN-polimerasa Poli o PolIII que comprenden una secuencia de cuatro o más timidinas. Algunos ejemplos de secuencias no traducidas 3' adecuadas son las regiones no traducidas transcritas 3' que contienen una señal de poliadenilación del gen de la nopalina- sintasa (nos) de Agrojbacterium tumefaciens (Bevan et al., Nucí. Acid Res., 11: 369, 1983) y el terminador del transcrito T7 del gen de la octopina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens. Como alternativa, las secuencias no traducidas 31 adecuadas se pueden derivar de genes vegetales, tales como el extremo 3' de los genes de inhibidores de proteasas I o II de la papa o el tomate, los genes de proteínas de almacenamiento de la soja y el gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5-bisfosfato- caborxilasa (ssRUBISCO), aunque también se pueden emplear otros elementos 3' con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Como alternativa, se pueden obtener secuencias reguladoras no traducidas 3' de novo como, por ejemplo, las descritas por An, Methods in Enzymology, 153: 292, 1987, que se incorpora a la presente por referencia.

Debido a que la secuencia de ADN insertada entre el sitio de iniciación de la transcripción y el principio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia líder 5' no traducida (5'UTR), puede afectar a la expresión génica, también se puede emplear una secuencia líder particular. Las secuencias líderes adecuadas incluyen aquellas que comprenden secuencias seleccionadas para dirigir la expresión óptima de la secuencia de ADN foránea o endógena. Por ejemplo, estas secuencias líder incluyen una secuencia consenso preferida que puede incrementar o mantener la estabilidad del ARNm y prevenir la iniciación inadecuada de la traducción tal como, por ejemplo, la descrita por Joshi, Nucí. Acid Res. 15: 6643, 1987.

Además, se pueden emplear secuencias de direccionamiento para dirigir la enzima codificada por el polinucleótido foráneo o exógeno hasta un compartimento intracelular, por ej.emplo, hasta el cloroplasto, en células vegetales o hasta el entorno extracelular . Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de péptido señal o de tránsito puede estar ligada operablemente a una secuencia que codifica una enzima seleccionada de la invención en cuestión, de modo que el péptido señal o de tránsito, una vez traducido, puede transportar la enzima hasta un destino intra- o extracelular particular y opcionalmente se puede eliminar a continuación postraduccionalmente . Los péptidos señal o de tránsito actúan facilitando el transporte de proteínas a través de membranas intracelulares, p. ej . , membranas del retículo endoplasmático, vacuolas, vesículas, plástidos, mitocondrias y el plasmalema. Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento puede dirigir una proteína deseada hasta un orgánulo particular, tal como una vacuola o un plástido (p. ej . , un cloroplasto), en vez de al citosol. Por consiguiente, el constructo de ácido nucleico de la invención puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito plastídico ligada operablemente entre una región promotora y el polinucleótido foráneo o exógeno.

Vectorea La presente invención incluye el uso de vectores para manipular o transferir constructos genéticos. "Vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago o virus vegetal, en la cual se puede insertar o clonar una secuencia de ácido nucleico. Un vector contiene preferentemente uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicarse de forma autónoma en una célula huésped definida, incluidos una célula o tejido diana, o una célula o tejido progenitor de esta, o se puede integrar en el genoma del huésped definido, de modo que la secuencia clonada sea reproducible . Por consiguiente, el vector puede ser un vector que se replica de forma autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej . , un plásmido circular cerrado o lineal, un elemento extracromosómico, un minieromosorna o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar su autoreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula, se integra en el genoma de la célula receptora y se replica junto con el cromosoma o los cromosomas en el que se ha integrado. Un sistema vectorial puede comprender un único vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula huésped o transposón. La selección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula en la que se introduce el vector. El vector también puede incluir un marcador de selección, tal como un gen de resistencia a antibióticos, un gen de resistencia a herbicidas u otro gen que se pueda utilizar para seleccionar transformantes adecuados. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con este tipo de genes.

El constructo de ácido nucleico de la invención se puede introducir en un vector tal como un plásmido. Los vectores plastidicos suelen incluir secuencias de ácido nucleico adicionales que proporcionan una selección, amplificación y transformación fáciles del cásete de expresión en células eucariotas y procariotas, p. ej . , vectores derivados de pUC, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP o vectores derivados de pBS. Las secuencias de ácido nucleico adicionales incluyen orígenes de replicación para proporcionar una replicación autónoma del vector, genes marcadores selecciónateles, preferentemente que codifican resistencia a antibióticos o herbicidas, múltiples sitios de clonación únicos que proporcionan múltiples sitios para insertar secuencias de ácido nucleico o genes codificados en el constructo de ácido nucleico, y secuencias que potencian la transformación de células procariotas o eucariotas (especialmente vegetales) .

"Gen marcador" se refiere a un gen que imparte un fenotipo distintivo a células que expresan el gen marcador y, por lo tanto, permite diferenciar estas células transformadas de células que no tienen el marcador. Un gen marcador seleccionable confiere un rasgo que se puede "seleccionar" en función de la resistencia a un agente selectivo (p. ej . , un herbicida, antibiótico, radiación, calor u otro tratamiento perjudicial para las células no transformadas) . Un gen marcador cribable (o gen indicador) confiere un rasgo que se puede identificar mediante observación o análisis, es decir "cribando" (p. ej . , ß-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática que no está presente en células no transformadas) . El gen marcador y la secuencia de nucleótidos de interés no necesitan estar ligados.

Para facilitar la identificación de transformantes, el constructo de ácido nucleico comprende preferentemente un gen marcador seleccionable o cribable como, o además de, el polinucleótido foráneo o exógeno. La posible selección de un marcador no es crucial siempre que sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células vegetales seleccionadas. El gen marcador y el polinucleótido foráneo o exógeno de interés no necesitan estar ligados, ya que la transformación conjunta de genes no ligados como la que se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 4.399.216, también es un proceso eficiente para la transformación de plantas.

Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son marcadores que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina, kanamicina, eritromicina, cloramfenicol o tetraciclina . Los marcadores seleccionables ilustrativos para la selección de transformantes vegetales incluyen, pero no se limitan a, un gen hyg que codifica resistencia a la higromicina B; un gen de la neomicina-fosfotransferasa (npt) que confiere resistencia a la kanamicina, paromomicina, G418 y similares como, por ejemplo, el descrito en Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183, 1985; un gen de la glutationa-S-transferasa de hígado de rata que confiere resistencia a herbicidas derivados de la glutationa como, por ejemplo, el descrito en EP-A 256223; un gen de la glutamina-sintetasa que confiere, al sobreexpresarse, resistencia a inhibidores de la glutamina-sintetasa tales como fosfinotricina como, por ejemplo, el descrito en WO 87/05327; un gen de la acetiltransferasa de Streptomyces viridochromogenes que confiere resistencia al agente selectivo fosfinotricina como, por ejemplo, el descrito en EP-A 275957; un gen que codifica una 5-enolshikimato-3-fosfato-sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a la N-fosfonometilglicina como, por ejemplo, el descrito en Hinchee et al., Biotech. 6: 915, 1988, un gen bar que confiere resistencia al bialaphos como, por ejemplo, el descrito en WO 91/02071; un gen de la nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia al bromoxinilo (Stalker et al., Science, 242: 419, 1988); un gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) que confiere resistencia al metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem. 263: 12500, 1988); un gen de la acetolactato-sintasa mutante (ALS), que confiere resistencia a la imidazolinona, sulfonilurea u otros productos químicos que inhiben la ALS (EP-A-154 204); un gen de la antranilato-sintasa mutado que confiere resistencia al 5-metiltriptófano; o un gen de la dalapón-deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida.

Los marcadores cribables preferidos incluyen, pero no se limitan a, un gen uidA que codifica una enzima ß-glucuronidasa (GUS) para la que se conocen varios sustratos cromogénicos ; un gen de la ß-galactosidasa que codifica una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos; un gen de la aequorina (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 126: 1259-68, 1985), que se puede emplear en la detección de bioluminiscencia sensible al calcio; un gen de la proteína fluorescente verde (Niedz et al., Plant Cell Reports, 14: 403, 1995); y un gen de la luciferasa (luc) (Ow et al., Science, 234: 856, 1986) , que permite la detección de bioluminiscencia y otros conocidos en la técnica. "Molécula indicadora", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal que se puede identificar mediante análisis, la cual facilita la determinación de la actividad promotora por referencia al producto proteico.

Métodos para modificar la expresión gónica El nivel de una proteina, por ejemplo, una enzima que participa en la síntesis de almidón en el endospermo en desarrollo de una planta de cebada, se puede modular incrementando el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteina en una célula vegetal o reduciendo el nivel de expresión de un gen que codifica la proteina en la planta, lo cual produce una alteración de la acumulación de fructano en el grano. El nivel de expresión de un gen se puede modular alternado el número de copias por célula, por ejemplo, introduciendo un constructo genético sintético que comprenda la secuencia codificante y un elemento de control de la transcripción que esté conectado operablemente a esta y que sea funcional en la célula. Se puede seleccionar una pluralidad de transformantes y se pueden cribar para seleccionar aquellos con un nivel favorable de expresión del transgén y/o especificidad para dicha expresión debido a influencias de secuencias endógenas en la proximidad del sitio de integración del transgén. Un nivel favorable y un patrón de expresión del transgén son aquellos que dan como resultado un incremento sustancial de los niveles de fructano. Esto se puede detectar mediante un simple análisis del grano de los transformantes. Como alternativa, una población de grano mutagenizado o una población de plantas de un programa de cultivo selectivo se pueden cribar para detectar lineas individuales con una acumulación alterada de fructano.

Se puede conseguir reducir la expresión génica mediante la introducción y la transcripción de un "gen quimérico silenciador de genes" introducido en la célula vegetal. El gen quimérico silenciador de genes se puede introducir de forma estable en el genoma de la célula vegetal, preferentemente, el genoma nuclear, o se puede introducir de forma transitoria, por ejemplo, en un vector vírico. Tal como se utiliza en la presente, "efecto silenciador de genes" se refiere a la reducción de la expresión de un ácido nucleico diana en una célula vegetal, la cual se puede conseguir introduciendo un ARN silenciador. Dicha reducción puede ser el resultado de la reducción de la transcripción, incluida la reducción por metilación de remodelado de cromatina, o de la modificación postranscripcional de moléculas de ARN, incluida la modificación por degradación de ARN, o ambas. El silenciamiento génico supone la anulación de la expresión del ácido nucleico o gen diana y ejerce un efecto parcial en cuanto a su extensión o duración. Es suficiente que el nivel de expresión del ácido nucleico diana en presencia del ARN silenciador sea menor que en ausencia de este. El nivel de expresión se puede reducir al menos aproximadamente un 40%, o al menos aproximadamente un 50%, o al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 99%. El ácido nucleico diana puede ser un gen que participa en la síntesis o el metabolismo del almidón, por ejemplo, la degradación del almidón, pero también puede incluir otros genes endógenos, exógenos o transgenes, tales como genes víricos, que puede que no estén presentes en la célula vegetal en el momento de la introducción del transgén.

Moléculas de ARN antisentido Se pueden utilizar técnicas antisentido para reducir la expresión génica de acuerdo con la invención. Se debe interpretar que la expresión "ARN antisentido" se refiere a una molécula de ARN que es complementaria a al menos una porción de una molécula de ARNm específica y capaz de reducir la expresión del gen que codifica el ARNm. Esta reducción normalmente se produce de una forma dependiente de la secuencia y se cree que se produce por interferencia en un evento postranscripcional tal como el transporte de ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma, la estabilidad del ARNm o la inhibición de la traducción. El uso de métodos antisentido es muy conocido en la técnica (remítase, por ejemplo, a Hartmann and Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer, 1999) . El uso de técnicas antisentido en plantas ha sido revisado por Bourque, Plant Sci. 105: 125-149, 1995 y Sénior, Biotech. Genet. Engin. Revs. 15: 79-119, 1998. Bourque, 1995 (supra) enumera un gran número de ejemplos de cómo se han utilizado secuencias antisentido en sistemas vegetales como método para la inactivación génica. También afirma que puede que no sea necesario conseguir un 100% de inhibición de toda la actividad enzimática ya que la inhibición parcial es más que probable que produzca un cambio cuantificable en el sistema. Sénior, 1998 (supra) afirma que los métodos antisentido son en la actualidad una técnica muy establecida para manipular la expresión génica.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "un polinucleótido antisentido que se híbrida en condiciones fisiológicas" quiere decir que el polinucleótido (que es parcial o completamente monocatenario) es al menos capaz de formar un polinucleótido bicatenario con un ARN que es producto del gen que se desea inhibir, normalmente el ARNm que codifica una proteína como las que se proporcionan en la presente, en condiciones normales en una célula. Las moléculas antisentido pueden incluir secuencias que corresponden a los genes estructurales o a secuencias que controlan la expresión génica o el evento de corte y empalme. Por ejemplo, la secuencia antisentido puede corresponder a la región codificante del gen diana, o la región no traducida 5' (UTR) o la 3' -UTR, o una combinación de estas. Puede ser complementaria en parte a secuencias de intrones, que se pueden escindir durante o después de la transcripción, pero es preferentemente complementaria únicamente a las secuencias de exones del gen diana. En vista de la divergencia generalmente superior de los UTR, seleccionar estas regiones como diana proporciona mayor especificidad de inhibición del gen.

La longitud de la secuencia antisentido debería ser de al menos 19 nucleótidos contiguos, preferentemente de al menos 25 o 30 o 50 nucleótidos, y más preferentemente de al menos 100, 200, 500 o 1000 nucleótidos, hasta un máximo que es igual a la longitud completa del gen que se desea inhibir. Se puede utilizar la secuencia completa complementaria a todo el transcrito génico. La longitud más preferida es de 100-2000 nucleótidos. El grado de identidad entre la secuencia antisentido y el transcrito diana debería ser de al menos un 90% y más preferentemente un 95-100%. Obviamente, la molécula de ARN antisentido puede comprender secuencias no relacionadas que pueden actuar para estabilizar la molécula.

Se pueden preparar fácilmente constructos genéticos para expresar un ARN antisentido uniendo una secuencia promotora a una región del gen diana en una orientación "antisentido" que, tal como se utiliza en la presente, se refiere a la orientación inversa relativa a la orientación de la transcripción y la traducción (si tiene lugar) de la secuencia en el gen diana de la célula vegetal. Por consiguiente, esta invención también proporciona una molécula de ácido nucleico tal como un ADN quimérico que codifica un ARN antisentido de la invención, incluidas las células, tejidos, órganos, plantas, grano y similares que comprenden la molécula de ácido nucleico.

Ribozixnas El término "ribozima", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ARN que reconoce específicamente un ARN sustrato distintivo y cataliza su escisión. Normalmente, el ribozima contiene una región de nucleótidos que son complementarios a una región del ARN diana, la cual permite que el ribozima se hibride específicamente con el ARN diana en condiciones fisiológicas, por ejemplo, en la célula en la que actúa la ribozima, y una región enzimática denominada en la presente "dominio catalítico" . Los tipos de ribozimas que son particularmente útiles en esta invención son la ribozima cabeza de martillo (Haseloff and Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988; Perriman et al., Gene, 113: 157-163, 1992) y la ribozima horquilla (Shippy et al., Mol. Biotech. 12: 117-129, 1999) . El ADN que codifica las ribozimas se puede sintetizar utilizando métodos muy conocidos en la técnica y se puede incorporar en un constructo genético o vector de expresión para que se exprese en la célula de interés. Por consiguiente, esta invención también proporciona una molécula de ácido nucleico tal como un ADN quimérico que codifica una ribozima de la invención, incluidas las células, tejidos, órganos, plantas, grano y similares que comprenden la molécula de ácido nucleico. Normalmente, el ADN que codifica la ribozima se inserta en un cásete de expresión bajo el control de un promotor y una señal de terminación de la transcripción que actúan en la célula. Los sitios de escisión de la ribozima específicos en cualquier ARN diana potencial se pueden identificar escaneando la molécula diana en busca de sitios de escisión de la ribozima que incluyen las secuencias trinucleotídicas GUA, GUÜ y GUC. Una vez identificadas, las secuencias cortas de ARN de entre aproximadamente 5 y 20 ribonucleotidos correspondientes a la región del gen diana 5' y 3' del sitio de escisión se pueden evaluar según las características estructurales predichas, tales como la estructura secundaria, que pueden hacer que la secuencia oligonucleotídica sea menos adecuada. Cuando se emplean, las ribozimas se pueden seleccionar entre el grupo compuesto por ribozimas cabeza de martillo, ribozimas horquilla, ribozimas cabeza de hacha, ribozimas satélite de tritón, ribozimas de Tetrahymena y ribozimas de la RNasa P, y están diseñadas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica basados en la secuencia del gen diana (por ejemplo, remítase a la Patente de EE. UU. N.° 5.741.679). La idoneidad de las dianas candidato se puede evaluar también comprobando su accesibilidad para la hibridación con oligonucleótidos complementarios, utilizando ensayos de protección frente a ribonucleasas.

Al igual que con los polinucleótidos antisentido descritos en la presente, las ribozimas de la invención deberían ser capaces de hibridarse con una molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm que codifica un polipéptido provisto como SEQ ID NO: 2) en "condiciones fisiológicas", es decir, las condiciones en el interior de una célula, especialmente las condiciones en una célula vegetal tal como una célula de trigo o cebada.

Interferencia por ARN/ARN bicatenario Tal como se utiliza en la presente, "molécula de ARNbc introducida artificialmente" se refiere a la introducción de una molécula de ARNbc, que puede, p. ej . , tener lugar de forma endógena por transcripción partiendo de un gen quimérico que codifica dicha molécula de ARNbc, sin embargo, no se refiere a la conversión de una molécula de ARN monocatenario en un ARNbc dentro de la célula eucariota o célula vegetal. La interferencia por ARN (ARNi) es particularmente útil para reducir específicamente la expresión de un gen o inhibir la producción de una proteina particular. Sin que ello suponga ceñirse a ninguna teoría, Waterhouse et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 95: 13959-13964, 1998 han proporcionado un modelo para el mecanismo mediante el cual se puede utilizar ARNbc para reducir la producción de proteina. Esta tecnología se basa en la presencia de moléculas de ARNbc que contienen una secuencia que es esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte de este. Convenientemente, el ARNbc se puede producir a partir de un único promotor en un vector recombinante o célula huésped, donde las secuencias sentido o antisentido se transcriben para producir un ARN horquillado en el que las secuencias sentido y antisentido se hibridan para formar la región de ARNbc con una secuencia interpuesta o región espadadora que forma una estructura de bucle, de modo que el ARN horquillado comprende una estructura de tronco con forma de horquilla. El diseño y la producción de moléculas de ARNbc adecuados para la presente invención entra dentro de las competencias de un experto en la técnica, en particular teniendo en cuenta Waterhouse et al., 1998 (supra) , Smith et al., Nature, 407: 319-320, 2000, WO 99/53050, WO 99/49029 y WO 01/34815. Por consiguiente, esta invención también proporciona una molécula de ácido nucleico tal como un ADN quimérico que codifica un ARN bicatenario tal como un ARN horquillado de . la invención, incluidas las células, tejidos, órganos, plantas, grano y similares que comprenden la molécula de ácido nucleico.

En un ejemplo, se introduce un- ADN que dirige la síntesis de uno o más productos de ARN, al menos en parte bicatenario, con homología respecto al gen diana que se desea inactivar. Por lo tanto, el ADN comprende tanto secuencias sentido como antisentido que, cuando se transcriben como ARN, se pueden hibridar para formar la región de ARN bicatenario. En una realización preferida, las secuencias sentido y antisentido están separadas por una región espadadora que comprende un intrón que, cuando al transcribirse a ARN, se escinde. Se ha demostrado que esta disposición produce una mayor eficiencia en el silenciamiento génico (Smith et al., 2000 (supra) ) . La región bicatenaria puede comprender una o dos moléculas de ARN, trascritas a partir de una o dos regiones de ADN. El ARNbc se puede clasificar como ARNh largo, que posee regiones sentido y antisentido largas que pueden ser en mayor parte complementarias, pero no necesitan ser totalmente complementarias (normalmente forman una región con bases apareadas de más de aproximadamente 100 bp, preferentemente de entre 200 y. 1000 bp) . El ARNh también puede ser menor y la porción bicatenaria puede variar en tamaño de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 bp, o de 30 a aproximadamente 100 bp (remítase a WO 04/073390, incorporado a la presente por referencia) . Se cree que la presencia de la región de ARN bicatenario estimula una respuesta de un sistema vegetal endógeno que procesa el ARN bicatenario en forma de oligonucleótidos con una longitud de 21-24 nucleótidos y también utiliza estos oligonucleótidos para la escisión específica para una secuencia del transcrito de ARN homólogo del gen diana de la planta, de este modo se reduce o elimina eficazmente la actividad del gen diana.

La longitud de las secuencias sentido y antisentido que se hibridan debería ser para cada una de al menos 19 nucleótidos contiguos, preferentemente de al menos 27 o 30 o 50 nucleótidos, y más preferentemente de al menos 100, 200 o 500 nucleótidos, hasta un máximo que es igual a la secuencia completa correspondiente al transcrito génico completo. Las longitudes más preferidas son de 100-2000 nucleótidos. El grado de identidad entre las secuencias sentido y antisentido, y el transcrito dirigido debería ser de al menos un 85%, preferentemente de al menos un 90% y más preferentemente un 95-100%. Cuanto mayor es la secuencia, menos riguroso es el requisito de la identidad secuencial global. Obviamente, la molécula de ARN puede comprender secuencias no relacionadas que pueden actuar para estabilizar la molécula. La molécula de ARN puede ser un híbrido entre diferentes secuencias dirigidas a ARN diana diferentes, el cual permite reducir la expresión de más de un gen diana, o puede ser una secuencia que corresponde a una familia de genes diana relacionados tal como una familia de multigenes. Las secuencias utilizadas en el ARNbc preferentemente corresponden a secuencias exónicas del gen diana y pueden corresponder a secuencias no traducidas 5' y/o 3', o secuencias que codifican una proteína, o cualquier combinación de estas.

El promotor utilizado para expresar el constructo formador de ARNbc puede ser cualquier tipo de promotor si el ARNbc resultante es específico para un producto génico en el linaje celular escogido como diana que se ha de destruir. Como alternativa, el promotor puede ser específico para un linaje al expresarse únicamente en células de un linaje en desarrollo particular. Esto puede suponer una ventaja cuando se observa un cierto solapamiento en homología con un gen que se expresa en un linaje celular no escogido como diana. El promotor también puede ser inducible por factores controlados externamente o por factores ambientales intracelulares . Normalmente, la molécula de ARN se expresa bajo el control de un promotor de la ARN- polimerasa II o ARN-polimerasa III. Los ejemplos de este último incluyen promotores de ARNt o ARNnp.

Otro ARN silenciador puede ser "ARN no poliadenilado" que comprenda al menos 20 nucleótidos consecutivos con una identidad secuencial de al menos un 95% respecto al complemento de una secuencia de nucleótidos de un transcrito de ARN del gen diana, como el descrito en WO 01/12824 o US 6.423.885 (ambos documentos se incorporan a la presente por referencia) . Otro tipo más de ARN silenciador es una molécula de ARN, como la descrita en WO 03/076619 (incorporado a la presente por referencia) , que comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos con al menos un 95% de identidad secuencial respecto a la secuencia del ácido nucleico diana o su complemento, y que comprende además una región en mayor parte bicatenaria como la descrita en WO 03/076619.

La regulación con microARN es una rama especializada del sistema de silenciamiento de ARN que avanzó hasta la regulación de genes, divergiendo del ARNi/PTGS convencinonal . Los microARN son una clase especifica de ARN pequeños que están codificados en elementos similares a genes organizados en una repetición invertida parcial característica. Cuando se transcriben, los genes de microARN originan ARN precursores horquillados con bases apareadas parcialmente a partir de los cuales se procesan microARN posteriormente. Los microARN suelen tener una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos. Los microARN liberados se incorporan a complejos de tipo RISC que contienen un subgrupo particular de proteínas Argonaute que ejercen la represión génica específica para una secuencia, (remítase, por ejemplo, a Millar and Waterhouse, Funct Integr Genomics, 5: 129-135, 2005; Pasquinelli et al., Curr Opin Genet Develop 15: 200-205, 2005; Almeida and Allshire, Trends Cell Biol . 15: 251-258, 2005, incorporados a la presente por referencia) .

Cosupresión Otro método de biología molecular que se puede utilizar para reducir específicamente la expresión génica es la cosupresión. El mecanismo de cosupresión no se comprende completamente pero se cree que implica el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS, por sus siglas en inglés) , en ese sentido, puede ser muy similar a muchos ejemplos de supresión antisentido. Implica la introducción de una copia extra de un gen o un fragmento de este en una planta en la "orientación sentido" con respecto a un promotor para su expresión, que, tal como se utiliza en la presente, se refiere a la misma orientación que la transcripción y la traducción (si tiene lugar) de la secuencia relativa a la secuencia en el gen diana. El tamaño del fragmento sentido, su correspondencia con regiones del gen diana y su grado de homología con el gen diana son como para las secuencias antisentido descritas anteriormente. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia génica interfiere con la expresión del gen vegetal diana. Se hace referencia a la memoria descriptiva de la Patente WO 97/20936 y la memoria descriptiva de la Patente Europea 0465572 para formas de implementar métodos de cosupresión. Las moléculas de ARN antisentido, de cosupresión o bicatenario también pueden comprender una región de ARN en mayor bicatenario, que comprende preferentemente una señal de localización nuclear, como se describe en WO 03/076619.

Cualquiera de estas tecnologías para reducir la expresión génica se puede utilizar para reducir coordinadamente la actividad de múltiples genes. Por ejemplo, una molécula de ARN se puede dirigir contra una familia de genes relacionados afectando a una región común de los genes. Como alternativa, otros genes no relacionados se pueden ver afectados por la inclusión de múltiples regiones en una molécula de ARN, al tener cada región un gen diferente como diana. Esto se puede conseguir fácilmente fusionando las múltiples regiones bajo el control de un único promotor.

Métodos para introducir ácidos nucleicos en células vegetales/transformación Se dispone de varias técnicas para introducir moléculas de ácido nucleico en una célula vegetal huésped con las cuales estarán familiarizados los expertos en la técnica. El término "transformación" se refiere a la alteración del genotipo de un organismo, por ejemplo, una bacteria o una planta, introduciendo un ácido nucleico foráneo o exógeno. "Transformante" quiere decir un organismo alterado de dicha forma. Como se utiliza en la presente, el término "transgénico" se refiere a una planta modificada genéticamente en la que el genoma endógeno se suplementa o modifica mediante la integración o el mantenimiento estable en una forma no integrada replicable de un gen o una secuencia foránea o exógena introducida. "Transgen" se refiere a un gen o una secuencia foránea o exógena que se introduce en el genoma de una planta. La molécula de ácido nucleico se puede integrar de forma estable en el genoma de la planta o se puede replicar como un. elemento extracromosómico. "Genoma" se refiere al complemento genético heredado total de la célula, planta o parte de la planta, e incluye moléculas de ADN cromosómico, ADN plastídico, ADN mitocondrial y ADN extracromosómico. El término "regeneración", tal como se utiliza en la presente en relación con materiales vegetales, se refiere al cultivo de una planta entera diferenciada a partir de una célula vegetal, un grupo de células vegetales, una parte de una planta tal como, por ejemplo, de un embrión, escutelo, protoplasto, callo y otro tejido, pero no incluye el cultivo de una planta a partir de una semilla.

La elección particular de una tecnología de transformación vendrá determinada por su eficiencia para transformar ciertas especies vegetales así como también por la experiencia y preferencia de la persona que ponga en práctica la invención con una metodología particular de elección. Será evidente para un experto que la elección particular de un sistema de transformación para introducir un constructo de ácido nucleico en células vegetales no es esencial para la invención ni es una limitación de esta, siempre que consiga un nivel aceptable de transférente de ácido nucleico. Se puede obtener más información sobre la implementación práctica de sistemas de transformación para la mejora de plantas en Birch, Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 48: 297-326, 1997.

La introducción y expresión de polinucleótidos foráneos o exógenos se puede llevar a cabo utilizando el ADNt del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (remítase, por ejemplo, a Umbeck, Patente de EE. UU. N.° 5.004.863 y la Solicitud Internacional PCT/US93/02480) . Un constructo de la invención se puede introducir en una célula vegetal utilizando A. tumefaciens que contenga el plásmido Ti. Al utilizar un cultivo de A. tumefaciens como vehículo de transformación, lo más conveniente es utilizar una cepa no oncogénica del Agrobacterium como vector portador de modo que la diferenciación no oncogénica normal de los tejidos transformados sea posible. Se prefiere que el Agrobacterium alberge un sistema plasmídico Ti binario. Este tipo de sistema binario comprende (1) un primer plásmido Ti que contiene una región virulenta esencial para introducir ADN de transferencia (ADNt) en plantas y (2) un plásmido quimérico. El plásmido quimérico contiene al menos una región limítrofe de la región del ADNt de un plásmido Ti natural que flanquea el ácido nucleico que se desea transferir. Se ha demostrado que los sistemas plasmídicos Ti binarios son eficaces para transformar células vegetales como, por ejemplo, los descritos en De Framond, Biotechnology, 1: 262, 1983 and Hoekema et al., Nature, 303: 179, 1983. Este tipo de sistema binario se prefiere, inter alia, porque no requiere integración en el plásmido Ti en Agrobacterium.

Los métodos que implican el uso de Agrobacterium incluyen, pero no se limitan a: (a) el cultivo conjunto de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados; (b) la transformación de células o tejidos vegetales con Agrobacterium; (c) la transformación de semillas, ápices o meristemos con Agrobacterium, o (d) la inoculación in planta tal como el método de inmersión floral descrito por Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. Paris, 316: 1194, 1993 o en trigo (como el descrito por O 00/63398, incorporado a la presente por referencia) . Este método se basa en la infiltración de una suspensión de células de Agrobacterium. Como alternativa, el constructo quimérico se puede introducir utilizando plásmidos inductores de raices (Ri) de Agrobacterium como vectores.

Los métodos para transformar plantas de cereales, tales como el trigo y la cebada, con el fin de introducir variación genética en la planta mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno y con el fin de regenerar plantas a partir de protoplastos o embriones vegetales inmaduros son muy conocidos en la técnica, remítase, por ejemplo, a Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104: 37-48, 1994, Tingay et al., Plant J. 11: 1369-1376, 1997, Solicitud de Patente Canadiense N.° 2.092.588, Solicitud de Patente Australiana N.° 61781/94, Patente Australiana N.° 667939, Patente de EE. UU. N.° 6.100.447, Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/10621, Patente de EE. UU. N.° 5.589.617 y Patente de EE. UU. N.° 6.541.257. Preferentemente, las plantas transgénicas se producen mediante procedimientos de transformación mediada por Agrojbacte iujn tumefaciens. Se pueden introducir vectores portadores del constructo de ácido nucleico deseado en células de cereales regenerables de plantas o explantes cultivados a partir de tejidos. Las células regenerables son preferentemente del escutelo de embriones inmaduros, embriones maduros, callos derivados de estos, o el tejido meristemático. Los embriones inmaduros son preferentemente aquellos de inflorescencias aproximadamente 10-15 días después de la antesis.

El constructo genético también se puede introducir en células vegetales mediante electroporación, por ejemplo, tal como describen Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82: 5824, 1985 y Shimamoto et al., Nature, 338: 274-276, 1989. En esta técnica, se electroporan protoplastos vegetales en presencia de vectores o ácidos nucleicos que contienen las secuencias de ácido nucleico relevantes. Los impulsos eléctricos con una alta intensidad de campo permeabilizan reversiblemente membranas permitiendo la introducción de ácidos nucleicos. Los protoplastos vegetales electroporados reforman la pared celular, se dividen y forman un callo vegetal.

Otro método para introducir el constructo de ácido nucleico en una célula vegetal es la penetración balística a alta velocidad de partículas pequeñas (conocido también como bombardeo de partículas o bombardeo de microproyectiles) , estando el ácido nucleico que se desea introducir contenido en la matriz de microesferas o partículas pequeñas o en su superficie, por ejemplo, como describe Klein et al., Nature, 327: 70, 1987.

Como alternativa, el constructo de ácido nucleico se puede introducir en una célula vegetal poniéndolo en contacto con la célula vegetal utilizando un medio mecánico o químico. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede transferir mecánicamente mediante microinyección directamente en células vegetales utilizando micropipetas . Como alternativa, se puede transferir un ácido nucleico en la célula vegetal utilizando polietilenglicol, el cual forma un complejo de precipitación con material genético que es absorbido por la célula.

Mutagénesis Las plantas de la invención se pueden producir e identificar después de la mutagénesis. Esta puede proporcionar una planta que no es transgénica, la cual puede ser deseable en algunos mercados.

Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, sometiendo el ácido nucleico a mutagénesis) o inducidos. Generalmente, una célula vegetal, tejido, semilla o planta progenitora se somete a mutagénesis para producir una o múltiples mutaciones tales como sustituciones, deleciones, adiciones de nucleótidos y/o modificaciones de codones. En el contexto de esta solicitud, una "mutación inducida" es una variación genética inducida artificialmente que puede ser el resultado de una mutagénesis química, inducida por radiación o con base biológica, por ejemplo, la inserción de un transposón o ADNt . Las mutaciones preferidas son mutaciones anuladoras, tales como mutaciones sin sentido, mutaciones por cambio de marco, mutaciones insercionales o variantes del sitio de corte y empalme que inactivan el gen completamente. Los derivados por inserción de nucleótidos incluyen fusiones en los extremos 3' y 5' así como también inserciones intrasecuenciales de uno o múltiples nucleótidos. Las variantes insercionales de una secuencia de nucleótidos son aquellas en las que se introducen uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos, las cuales se pueden obtener por inserción aleatoria con el cribado adecuado de los productos resultantes. Las variantes delecionales se caracterizan por la eliminación' de uno o más nucleótidos de la secuencia. Preferentemente, un gen mutante tiene solamente una única inserción o deleción de una secuencia de nucleótidos en comparación con el gen natural. Las variantes por sustitución de nucleótidos son aquellas en las que al menos un nucleótido de la secuencia se elimina y se inserta un nucleótido diferente en su lugar. El número preferido de nucleótidos afectados por las sustituciones en un gen mutante en comparación con el gen natural es un máximo de diez nucleótidos, más preferentemente un máximo de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2, o solamente un nucleótido. Dicha sustitución puede ser "silenciosa" en el sentido de que la sustitución no cambia el aminoácido definido por el codón. Como alternativa, los sustituyentes conservadores están diseñados para alternar un aminoácido por otro aminoácido que actúe de forma similar. Las sustituciones conservadoras habituales son aquellas realizadas de acuerdo con la Tabla 10 "Sustituciones ilustrativas".

El término "mutación", tal como se utiliza en la presente, no incluye sustituciones de nucleótidos silenciosas que no afectan a la actividad del gen y, por lo tanto, incluye únicamente alteraciones en la secuencia génica que afectan a la actividad del gen. El término "polimorfismo" se refiere a cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos incluidas las sustituciones de nucleótidos silenciosas.

En una realización preferida, la planta comprende una deleción de al menos parte de un gen SSII o una variación por cambio de marco o del sitio de corte y empalme en dicho gen.

En otra realización preferida, la planta comprende una mutación en un gen amol, tal como el alelo AC38 conocido en la técnica.

La mutagénesis se puede conseguir mediante métodos químicos ó con radiación, por ejemplo, tratamiento con EMS o azida sódica (Zwar and Chandler, Planta 197: 39-48, 1995) de semillas, o irradiación gamma, muy conocidos en la técnica.

La mutagénesis química tiende a favorecer las sustituciones de nucleótidos en vez de las deleciones. Se sabe que la irradiación con un haz iónico intenso (HIB, por sus siglas en inglés) es una técnica eficaz para el cultivo selectivo por mutaciones con el fin de producir cultivares vegetales nuevos, remítase, por ejemplo, a Hayashi et al., Effects of ion beam irradiation on mutation induction in rice. Cyclotrons and Their Applications 2007, Decimoctava Conferencia Internacional 237-239, 2007 y Kazama et al., Plant Biotechnology 25: 113-117, 2008. La irradiación con un haz iónico tiene dos factores físicos, la dosis (gy) y LET (transferencia de energía lineal, ke V/um) para efectos biológicos que determinan la cantidad de lesión del ADN y el tamaño de la deleción del ADN, y estos se pueden ajustar de acuerdo con la extensión deseada de la mutagénesis. HIB genera una colección de mutantes, muchos de los cuales comprenden deleciones que se pueden cribar para detectar mutaciones en genes SSIIa o Amol específicos. Los mutantes que se identifican se pueden retrocruzar con plantas de trigo no mutadas que actúen como progenitores recurrentes para eliminar y, por lo tanto, reducir el efecto de la mutación no ligada en el genoma mutagenizado .

Los agentes biológicos útiles para producir mutantes específicos para el sitio incluyen enzimas que incluyen espacios bicatenarios en el ADN que estimulan los mecanismos de reparación endógenos. Estos incluyen endonucleasas, nucleasas de dedos de cinc, transposasas y recombinasas específicas para el sitio. Las nucleasas de dedos de cinc (ZFN) , por ejemplo, facilitan la escisión específica para el sitio en un genoma que permite que mecanismos de reparación por unión de extremos endógenos o de otro tipo introduzcan deleciones o inserciones para reparar el hueco. La tecnología de nucleasas de dedos de cinc se revisa en Le Provost et al., Trends in Biotechnology 28(3): 134-141, 2009. Remítase también a Durai et al., Nucleic Acids Research 33(18): 5978-5990, 2005 y Liu et al., Biotechnology and Bioengineering, 106: 97-105, 2010.

Se puede conseguir aislar los mutantes cribando las plantas o semillas mutagenizadas . Por ejemplo, una población mutagenizada de plantas de cebada se puede cribar para detectar una actividad de SSIIa baja en el almidón de la hoja o el grano, una mutación del gen SSIIa o amol mediante una PCR o un ensayo basado en el heterodúplex, o la pérdida de la proteína SSII por ELISA. En una planta poliploide, el cribado se realiza preferentemente en un genotipo que ya carece una o dos de las actividades SSII, por ejemplo, en una planta de cebada que ya es mutante en los genes SSII de dos de los tres genomas, de modo que se obtenga un mutante que carezca completamente de la actividad funcional. Como alternativa, la mutación se puede identificar utilizando técnicas tales como " tilling" en una población mutagenizada con un agente tal como EMS (Slade and Knauf, Transgenic Res. 14: 109-115, 2005) . Estas mutaciones se pueden introducir posteriormente en códigos genéticos deseables cruzando el mutante con una planta portadora del código genético deseado y llevando a cabo un número adecuado de retrocruzamientos para eliminar el código parental no deseado en un principio.

La mutación se puede introducir en la planta directamente mediante mutagénesis o indirectamente cruzando dos plantas parentales, una de las cuales comprendía la mutación introducida. Las plantas modificadas, tales como plantas de cereales, pueden ser transgénicas o no transgénicas . Utilizando mutagénesis, se puede producir una planta no transgénica que carezca de la función de interés. La invención también se extiende al grano u otras partes de la planta producidas a partir de plantas y cualquier material de propagación de las plantas que se pueda utilizar para producir las plantas con las características deseadas, tales como tejido o células cultivadas. La invención se extiende claramente a métodos para producir o identificar tales plantas o el grano producido por estas .

Las plantas de la invención se pueden producir utilizando el proceso conocido como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes, siglas en inglés de lesiones locales inducidas por direccionamiento en genomas) . En un primer paso, las mutaciones introducidas, tales como nuevos cambios de un único par de bases, se inducen en una población de plantas tratando células, semillas, polen u otras partes de las plantas con un mutagen químico o radiación y después avanzando en la descendencia de las plantas hasta una generación en la que las mutaciones se heredarán de forma estable. Se extrae ADN y se almacenan semillas de todos los miembros de la población para crear una fuente a la que se pueda acceder repetidamente durante el tiempo.

Para un ensayo TILLING, se diseñan cebadores de PCR para que amplifiquen específicamente un único gen diana de interés. La especificidad es especialmente importante si una diana es un miembro de una familia de genes o parte de un genoma poliploide. A continuación, se pueden utilizar cebadores marcados con tinte para amplificar productos de PCR a partir de ADN combinados de múltiples individuos. Estos productos de PCR están desnaturalizados y reapareados para permitir la formación de pares de bases con errores de apareamiento. Los errores de apareamiento o heterodúplex representan ambos polimorfismos mononucleotidicos (SNP) naturales (es decir, es probable que varias plantas de la población porten el mismo polimorfismo) y SNP inducidos (es decir, es probable que solamente algunas plantas individuales presenten la mutación) . Después de la formación de heterodúplex, el uso de una endonucleasa, tal como Cell, que reconoce y escinde el ADN con errores de apareamiento es la clave para descubrir nuevos SNP en una población TILLING.

Utilizando este método, se pueden cribar muchas miles de plantas para identificar cualquier individuo con un único cambio de base asi como también pequeñas inserciones o deleciones (1-30 bp) en cualquier gen o región especifica del genoma. Los fragmentos genómicos objeto de estudio pueden tener un tamaño cualquiera comprendido entre 0.3 y 1.6 kb. Con combinaciones de 8, fragmentos de 1.4 kb (descontando los extremos de fragmentos en ios que la detección de SNP es problemática debido al ruido) y 96 lineas por ensayo, esta combinación, permite cribar hasta un millón de pares de bases de ADN genómico por cada ensayo, lo cual convierte a TILLING en una técnica de alto rendimiento. TILLING se describe más detalladamente en Slade and Knauf, 2005 (supra) , y Henikoff et al., Plant Physiol. 135: 630-636, 2004, incorporados a la presente por referencia.

Además de permitir la detección eficiente de mutaciones, la tecnología TILLING de alto rendimiento es ideal para detectar polimorfismos naturales. Por lo tanto, examinar un ADN homólogo desconocido mediante la formación de heterodúplex con una secuencia conocida revela el número y la posición de sitios polimórficos . Se identifican tanto los cambios nucleotídicos como las pequeñas inserciones y deleciones, incluido al menos algunos polimorfismos en el número de repeticiones. Esto se ha denominado Ecotilling (Comai et al., Plant J. 37: 778-786, 2004).

Cada SNP se registra por su posición aproximada con un error de unos pocos nucleótidos. Por lo tanto, cada haplotipo se puede archivar en función de su movilidad. Los datos secuenciales se pueden obtener realizando un esfuerzo adicional relativamente pequeño utilizando alícuotas del mismo ADN amplificado que se utiliza para el ensayo de escisión de errores de apareamiento. El cebador de secuenciación a la derecha o' izquierda para una única reacción se selecciona por su proximidad al polimorfismo. El software secuenciador lleva a cabo un alineamiento múltiple y descubre el cambio de base, que en cada caso confirmó la banda del gel.

El Ecotilling se puede llevar a cabo de una forma más económica que la secuenciación completa, el método utilizado en la actualidad para la mayor parte del descubrimiento de SNP. Se pueden analizar placas que contienen ADN ecotipico inmovilizado en vez de combinaciones de ADN de plantas mutagenizadas . Debido a que la detección es en geles con casi resolución de pares de bases y los patrones de fondo son uniformes entre las líneas, se pueden comparar bandas de tamaño idéntico y, de este modo, se pueden descubrir y genotipificar SNP en un único paso.. De esta forma, la secuenciación final del SNP es eficiente y simple, a lo que contribuye aún más el hecho de que las alícuotas de los mismos productos de PCR utilizadas para el análisis se pueden someter a secuenciación de ADN.

Ligamiento genético Tal como se utiliza en la presente, la expresión "ligados genéticamente" se refiere a un locus marcador y a un segungo locus que están lo suficientemente próximos a un cromosoma como para que se hereden juntos en más de un 50% de las meiosis, p. ej . , no aleatoriamente. Esta definición incluye la situación en la que el locus marcador y el segundo locus forman parte del mismo gen. Además, esta definición incluye la situación en la que el locus marcador comprende un polimorfismo que es responsable del rasgo de interés (dicho de otra forma, el locus marcador está "ligado" directamente al fenotipo) . Por lo tanto, el porcentaje de recombinación observado entre los locus por generación (centimórgans (c ) ) , será menor de 50. En realizaciones particulares de la invención, los locus ligados genéticamente pueden estar separados 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 cM, o menos en un cromosoma. Preferentemente, los marcadores están separados menos de 5 cM o 2 cM, y más preferentemente aproximadamente 0 cM.

Tal como se utiliza en la presente, "otro marcador genético" puede referirse a cualesquiera moléculas que estén ligadas a un rasgo deseado de una planta de cereal tal como el trigo o la cebada. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con este tipo de marcadores e incluyen marcadores moleculares ligados a genes que determinan rasgos tales como la resistencia a una enfermedad, rendimiento, morfología de la planta, calidad del grano, otros rasgos del estado latente tales como el color del grano, el contenido de ácido giberélico de la semilla, altura de la planta, color de la harina y similares.

La selección asistida de marcador es un método que goza de buen reconocimiento para la selección de plantas heterocigóticas requerida cuando se retrocruzan con un progenitor recurrente en un programa de cultivo selectivo clásico. La población de plantas en cada generación de retrocruzamiento será heterocigótica para el gen de interés, normalmente presente en una proporción 1:1 en una población de retrocruzamiento, . y el marcador molecular se puede utilizar para distinguir los dos alelos del gen. Al extraer ADN de, por ejemplo, brotes jóvenes, y analizarlo con un marcador especifico para el rasgo deseable introgresado, se lleva a cabo la detección temprana de plantas para su retrocruzamiento posterior al tiempo que se concentran energía y rescursos en menos plantas.

Se puede utilizar cualquier técnica de biología molecular conocida en la técnica que sea capaz de detectar alelos de un SSII u otro gen en los métodos de la presente invención. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de amplificación de ácidos nucleicos, secuenciación de ácidos nucleicos, hibridación de ácidos nucleicos con sondas marcadas de forma adecuada, análisis conformacional monocatenario (SSCA) , electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), análisis de heterodúplex (HET) , análisis de escisión química (CCM) , escisión catalítica de ácidos nucleicos o una combinación de estos (remítase, por ejemplo, a Lemieux, Current Genomies, 1: 301-311, 2000; Langridge et al., Aust J Agrie Res 52: 1043-1077, 2001). La invención también incluye el uso de técnicas de marcado molecular para detectar polimorfismos ligados a alelos de (por ejemplo) un gen SSII que confiere una acumulación alterada de fructano. Tales métodos incluyen la detección o el análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) , RAPD, polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y polimorfismos de microsatélite (SSR, repetición de secuencia simple) . Los marcadores ligados estrechamente se pueden obtener fácilmente mediante métodos muy conocidos en la técnica tales como el análisis de segregantes agrupados, revisado por Langridge et al., 2001 (supra) .

La "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en la que se crean copias repetidas de un polinucleótido diana utilizando un "par de cebadores" o "grupo de cebadores" que consiste en un cebador "previo" y uno "posterior", y un catalizador de la polimerización, tal como una ADN-polimerasa, y normalmente una enzima polimerasa térmicamente estable. Los métodos para la PCR son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en "PCR" (McPherson and Moller (Ed) , BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, 2000). La PCR se puede llevar a cabo en ADNc obtenido de ARNm de transcripción inversa aislado de células vegetales que expresan un gen SSII o un ADN genómico aislado de una planta.

Un cebador es una secuencia de oiigonucleótidos que puede hibridarse de una forma especifica para una secuencia con la secuencia diana y que puede extenderse durante la PCR. Los amplicones o productos de PCR o fragmentos de PCR o productos de la amplificación son productos de extensión que comprenden el cebador y las nuevas copias sintetizadas de las secuencias diana. Los sistemas de PCR multiplex contienen múltiples grupos de cebadores que hacen que se produzca de forma simultánea más de un amplicón. Los cebadores pueden concordar perfectamente con la secuencia diana o pueden contener errores de apareamiento de bases que pueden producir la introducción de sitios de reconocimiento/escisión de enzimas de restricción o ácidos nucleicos catalíticos en secuencias diana especificas. Los cebadores también pueden contener secuencias adicionales y/o contener nucleótidos modificados o marcados para facilitar la captura o detección de amplicones. Los ciclos repetidos de desnaturalización térmica del ADN, el apareamiento de cebadores con sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores apareados con la polimerasa produce la amplificación exponencial de la secuencia diana. Las expresiones "diana" o "secuencia diana" o "patrón" se refieren a secuencias de ácido nucleico que están amplificadas.

Los expertos en la técnica estarán familiarizados con los métodos para la secuenciación directa de secuencias de nucleótidos y estos se podrán consultar, por ejemplo, en Ausubel et al. {supra) y Sambrook et al. (supra) . La secuenciación se puede llevar a cabo mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, secuenciación didesoxi, secuenciación química o variaciones de estas. La secuenciación directa presenta la ventaja de determinar variaciones en cualquier par de bases de una secuencia particular.

Plantas El término "planta", tal como se utiliza en la presente, como sustantivo se refiere a plantas enteras, pero cuando se utiliza como adjetivo se refiere a cualquier sustancia que está presente, se obtiene, se deriva o está relacionada con una planta, tal como, por ejemplo, órganos de una planta (p. ej . , hojas, tallos, raíces, flores), células individuales (p. e . , polen), semillas, células vegetales y similares. Las plántulas y semillas germinadas de las cuales emergen raíces y brotes también quedan incluidas en el significado de "planta". La expresión "partes de una planta", tal como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más tejidos u órganos vegetales que se obtienen de una planta y que comprenden ADN genómico de la planta. Las partes de una planta incluyen estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos), raíces, órganos/estructuras florales, semilla (incluidos el embrión, endospermo y el tegumento de la semilla), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido basal y similares) , células y la progenie de esta. La expresión "célula vegetal", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una célula obtenida de una planta o en un planta e incluye protoplastos u otras células derivadas de plantas, células productoras de gametos y células que se regeneran como plantas enteras. Las células vegetales pueden ser células en cultivo. "Tejido vegetal" se refiere a tejido diferenciado en una planta u obtenido de una planta ("explante") o tejido no diferenciado derivado de embriones maduros o inmaduros, semillas, raices, brotes, frutos, polen, tejido tumoral, tal como tumores del cuello, y varias formas de agregados de células vegetales en cultivo, tales como callos. Los ejemplos de tejidos vegetales en o de semillas son el endospermo, escutelo, capa de aleurona y embrión. La invención incluye, por lo tanto, plantas, partes de plantas y productos que las comprenden, particularmente grano que comprende fructano.

Tal como se utiliza en la presente, el término "grano" se refiere a la semilla madura de una planta, tal como se suele recolectar con fines comerciales en el campo. Por lo tanto, el término incluye semillas recolectadas y semillas en una planta que están listas para ser recolectadas. El grano de cereal maduro, tal como el trigo o la cebada, suele tener un contenido de humedad inferior a aproximadamente un 18-20%.

Una "planta transgénica", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una planta que contiene un constructo génico que no se encuentra en una planta natural de la misma especie, variedad o cultivar. Es decir, las plantas transgénicas (plantas transformadas) contienen material genético (un transgén) que no contenían antes de la transformación. El transgén puede incluir secuencias genéticas obtenidas o derivadas de una célula vegetal, u otra célula vegetal, o una fuente que no sea vegetal, o una secuencia sintética. Normalmente, el transgén se ha introducido en la planta mediante manipulación humana tal como, por ejemplo, mediante transformación, pero, tal como se percatará un experto en la técnica, se puede utilizar cualquier método. El material genético se integra preferentemente de forma estable en el genoma de la planta. El material genético introducido puede comprender secuencias de origen natural en la misma especie pero con una disposición reordenada o con una disposición diferente de los elementos, por ejemplo, una secuencia antisentido. En la presente, las plantas que contienen estas secuencias quedan incluidas en "plantas transgénicas" . Una "planta no transgénica" es aquella que no se ha modificado genéticamente mediante la introducción de material genético utilizando técnicas de ADN recombinante. En una realización preferida, las plantas transgénicas son homocigoticas para cada uno y todos los genes que se han introducido (transgén) , de modo que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "planta no transgénica correspondiente" se refiere a una planta que es isogénica respecto a la planta transgénica pero que no contiene el transgén de interés. Preferentemente, la planta no transgénica correspondiente es del mismo cultivar o variedad que el progenitor de la planta transgénica de interés, o una linea de descendencia de la planta que carece del constructo, que se suele denominar "segregante", o una planta del mismo cultivar o variedad transformada con un constructo de tipo "vector vacio", y puede ser una planta no transgénica. "Natural", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una célula, tejido o planta que no se ha modificado de acuerdo con la invención. Se pueden utilizar células, tejidos o plantas naturales como controles para comparar los niveles de expresión de un ácido nucleico exógeno o, la extensión y la naturaleza de la modificación de un rasgo con células, tejido o plantas modificadas como las descritas en la presente.

Las plantas transgénicas, tal como se definen en el contexto de la presente invención, incluyen la progenie de las plantas que han sido genéticamente modificadas utilizando técnicas recombinantes, comprendiendo la progenie el transgén de interés. Dicha progenie se puede obtener mediante autofertilización de la planta transgénica primaria o cruzando dichas plantas con otra planta de la misma especie. Esto por lo general sería para modular la producción de al menos una proteína/enzima definida en la presente en la planta u órgano de la planta deseado. Las partes de las plantas transgénicas incluyen todas las partes y células de dichas plantas que comprenden el transgén tales como, por ejemplo, tejidos cultivados, callos y protoplastos .

Se puede emplear cualquiera de los diferentes métodos existentes para determinar la presencia de un transgén en una planta transformada. Por ejemplo, se puede utilizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias que son exclusivas de la planta transformada, y se pueden detectar los productos amplificados mediante electroforesis en gel u otros métodos. Se puede extraer ADN de las plantas utilizando métodos convencionales y la reacción de PCR se puede llevar a cabo utilizando cebadores para amplificar un ADN específico, cuya presencia servirá para diferenciar las plantas transformadas y no transformadas. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores que amplificarán una región de ADN a partir del vector de transformación en la dirección del constructo y el cebador inverso se diseña a partir del gen de interés. Estos cebadores solo amplificarán un fragmento si la planta se ha transformado con éxito. Un método alternativo para confirmar un transformante positivo es mediante la hibridación con análisis de inmunoelectrotransferencia de Southern, muy conocido en la técnica. Las plantas que se transforman también se pueden identificar, es decir, diferenciar de plantas no transformadas o naturales, por su fenotipo, por ejemplo, conferido por la presencia de un gen marcador seleccionable, o conferido por el fenotipo de contenido alterado de fructano del grano de la planta o un fenotipo relacionado tal como la actividad alterada de la almidón-sintasa .

Tal como se utiliza en la presente, "germinación" se refiere a cuando el extremo de la raiz emerge del tegumento de la semilla después de la imbibición. La "tasa de germinación" se refiere al porcentaje de semillas que ha germinado en una población en un periodo de tiempo, por ejemplo, 7 o 10 días, después de la imbibición. Una población de semillas se puede evaluar a diario durante varios días para determinar el porcentaje de germinación con el tiempo. En lo que respecta a las semillas de la presente invención, tal como se utiliza en la presente, la expresión "tasa de germinación que es sustancialmente la misma" se refiere a que la tasa de germinación de las semillas transgénicas es al menos un 90% de la de las semillas isogénicas naturales.

Tal como se utiliza en la presente, el término "cebada" se refiere a cualquier especie del género Hordeum, incluidos sus progenitores, asi como también su progenie obtenida mediante cruces con otras especies. Se prefiere que la planta sea de una especie Hordeum que se cultive con fines comerciales tal como, por ejemplo, una cepa o cultivar o variedad de Hordeum vulgare , o que sea adecuada para la producción comercial de grano.

Producción de alimentos En otro aspecto, la invención proporciona plantas y grano de cebada, y productos obtenidos a partir de este, que son útiles para producir alimentos o piensos, donde el grano contiene niveles elevados de almidón en comparación con los granos mutantes en SSIIa correspondientes y niveles elevados de componentes no amiláceos en comparación con los granos naturales correspondientes. Preferentemente, la planta a partir de la cual se obtiene el grano tiene un nivel reducido de actividad SSIIa en el endospermo durante el desarrollo. La planta de la presente invención es útil para producir alimentos y, en particular, para la producción de alimentos comerciales. Dicha producción de alimentos puede incluir la producción de harina, masa u otros productos que pueden ser un ingrediente en la producción de alimentos comerciales. En una realización, cuyo uso es deseable en la producción de alimentos, la semilla o el grano de la planta tiene un contenido de fructano incrementado en comparación con la planta natural. El grano puede tener un nivel de actividad de enzimas degradantes, particularmente de una o más amilasas tales como la a-amilasa o la ß-amilasa, que se reduce debido a la presencia de un transgén o una mutación introducida que reduce la expresión de un gen que codifica dicha enzima degradante en el grano. La harina o masa de dicho grano tiene propiedades deseables para el horneado u otra producción de alimentos.

El código genético deseado de la planta incluirá consideraciones sobre el rendimiento agronómico y otras características. Estas características pueden incluir si se desea tener tipos de invierno o primavera, el comportamiento agronómico, la resistencia a enfermedades y la resistencia al estrés abiótico. Otras variedades serán adecuadas para otras regiones de cultivo. Se prefiere que la variedad de planta de la invención proporcione un rendimiento que no sea inferior a un 80% de la variedad natural correspondiente en al menos algunas de las regiones de cultivo, más preferentemente que no sea inferior a un 85% e incluso más preferentemente que no sea inferior a un 90%. El rendimiento se puede medir fácilmente en ensayos de campo controlados.

En otras realizaciones, el contenido de almidón del grano es de al menos aproximadamente un 42%, de al menos aproximadamente un 43%, de al menos aproximadamente un 45%, de al menos aproximadamente un 47%, de al menos aproximadamente un 50% o de al menos aproximadamente un 55% (p/p) , de hasta un 65%, y más preferentemente no es inferior al del grano natural. El grano de cebada natural cultivada con fines comerciales normalmente tiene un contenido de almidón comprendido entre un 55 y un 65%, dependiendo en cierta medida del cultivar cultivado. Como alternativa, la semilla o el grano de la, invención tiene un contenido de almidón de al menos un 90% en comparación con el del grano de una planta natural y preferentemente de al menos un 95%. Otras características deseables incluyen la posibilidad de moler el grano, en particular la dureza del grano. Otro aspecto que puede incrementar el valor de la planta es el grado de extracción de fructano o almidón del grano, siendo las tasas de extracciones superiores más útiles, o el contenido proteico, la proporción de amilosa respecto a amilopectina, o el contenido de otros polisacáridos no amiláceos tales como ß-glucano, que también contribuyen al contenido de fibra dietética de los productos del grano. La forma del grano también es otra característica que puede afectar a la utilidad comercial de una planta, ya que la forma del grano puede afectar a la facilidad o a otra característica con que el grano se puede moler.

El almidón se aisla fácilmente del grano de la invención utilizando métodos estándares, por ejemplo, el método de Schulman and ammiovirta, Starch, 43: 387-389, 1991. A escala industrial, se puede utilizar molienda en húmedo o en seco. El tamaño de los gránulos de almidón es importante en la industria del procesado del almidón en la que hay separación de gránulos grandes A de los gránulos más pequeños B.

Productos alimentarios La invención también engloba alimentos, bebidas o preparados farmacéuticos, producidos con productos preferentemente los que comprenden más almidón resistente, fibra dietética, amilosa, ß-glucano, fructano u otros componentes obtenidos de las plantas o el grano de la invención. Dicha producción de alimentos puede incluir la producción de grano procesado, harina integral, harina, masa u otros productos que pueden ser un ingrediente en la producción de alimentos comerciales. El grano de la invención o los productos derivados de este que contienen almidón resistente, fibra dietética, amilosa, ß-glucano o fructano se pueden utilizar en varias aplicaciones alimentarias para el consumo humano. Tal como se utiliza en la presente, "seres humanos" se refiere al Homo sapiens. El grano se puede utilizar fácilmente en procedimientos de procesado de alimentos y, por lo tanto, la invención incluye grano molido, triturado, granulado, perlado o arrollado, o productos obtenidos a partir del grano entero o procesado de las plantas de la invención, incluida la harina. Estos productos se pueden utilizar posteriormente en diversos productos alimentarios, por ejemplo, productos a base de harina tales como cereales de desayuno, pan, pasteles, galletas y similares, o aditivos alimentarios tales como espesantes o aglutinantes, o para preparar bebidas, fideos, pasta o sopas rápidas. El grano o los productos derivados del grano de la invención se desean particularmente en cereales de desayuno o como productos extrudidos. El almidón u otros componentes se pueden incorporar en productos grasos u oleosos, tales como margarina o manteca, aderezo para ensaladas, ovoproductos tales como la mayonesa, productos lácteos tales como el helado, yogur o queso, productos derivados de cereales tales como la harina de trigo, jugos de fruta, otros alimentos o materiales alimentarios, o el almidón u otros componentes se pueden procesar en bebidas o alimentos tales como el pan, pastel, galletas, cereales de desayuno, pasta, fideos o salsas. El fructano también es útil como edulcorante hipocalórico.

En el pan, los ingredientes que comprenden fructano, que pueden estar en forma de harina o harina integral, pueden sustituir a un 10% (p/p) o más de harina o harina integral no alterada, preferentemente sustituyen al menos un 30% e incluso más preferentemente al menos un 50% de la harina o harina integral no alterada. Por lo tanto, la formulación puede estar compuesta, por ejemplo, por 70 partes de harina, 30 partes de almidón con un alto contenido de fructano, 2 partes de grasa, 2 partes de sal, 1 parte de mejorador, 2.5 partes de levadura. La producción del pan puede ser una técnica de masa rápida u otras técnicas con las que estén familiarizados los expertos en la técnica.

Como alternativa, el producto de la invención se puede incorporar en un producto de tipo pasta a base de harina. La cantidad de fructano de la invención empleada en la composición de tipo pasta puede estar comprendida entre un 5 y 20% (p/p) en función del peso total del material a base de harina, más particularmente entre un 10 y un 20%. El experto en la técnica podrá seleccionar fácilmente otros materiales a base de harina adecuados. Se puede añadir también otro material a la composición, por ejemplo, huevos secos o líquidos (yemas, claras o ambas) o sustancias con un alto contenido proteico como la proteína de la leche o la proteína del pescado.

También se pueden añadir vitaminas, minerales, sales de calcio, aminoácidos, agentes tamponantes tales como hidrogenofosfato disódico, condimentos, goma, gluten o monoestearato de glicerilo.

Otras partes de las plantas de la invención que sean comestibles se pueden utilizar como alimentos para el consumo humano o como pienso para el consumo animal. Por ejemplo, las hojas, tallos o extractos, o partes de estos que comprenden células de la invención de cualquiera de ellas se pueden utilizar para el consumo humano o animal. Un incremento del contenido de almidón resistente, fibra dietética, amilosa, ß-glucano o fructano de las plantas de la invención y partes de estas puede proporcionar ventajas para utilizar estos materiales como pienso para el consumo animal tal como, por ejemplo, como pienso para ganado porcino, bovino, equino, aves tales como gallinas, y otros animales.

Métodos Los productos o compuestos de la presente invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas que se preparan de acuerdo con técnicas de formulación farmacéutica convencionales. Remítase, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, EE. UU. 1990) . La composición puede contener el principio activo o el principio activo derivado farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias activas, un excipiente, portador, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Estos materiales deben ser atóxicos y no deben interferir en la eficacia del principio activo. El portador puede tomar muchas formas dependiendo de la forma del preparado deseada para la administración.

Para la administración oral, los compuestos se pueden formular en preparados sólidos o líquidos, tales como cápsulas, pastillas, comprimidos, grageas, polvos, suspensiones o emulsiones. Al preparar las composiciones como formas farmacéuticas orales, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales, tales como, por ejempo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, colorantes, agentes de suspensión y similares, en el caso de preparados líquidos orales (tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones) ; o portadores, tales como almidones, azúcares, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares, en el caso de preparados sólidos orales (tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos) . Debido a su fácil administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma farmacéutica unitaria oral más conveniente, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir con azúcar o una capa entérica mediante técnicas estándares.

Preferentemente se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del principio activo. La cantidad real administrada, la velocidad y la evolución temporal de la administración dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, p. ej . , las decisiones sobre la dosis, el régimen, etc., entra dentro de las responsabilidades de los médicos de cabecera o especialistas y se suele tener en cuenta el trastorno que se ha de tratar, el estado de salud del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores con los cuales estarán familiarizados los médicos de cabecera.

Se pueden consultar ejemplos de técnicas y protocolos en Remington's Pharmaceutical Sciences, (supra) .

El alimento, la bebida o el preparado farmacéutico pueden estar envasados listos para la venta o a granel. La invención también proporciona métodos para preparar el alimento, la bebida o el preparado farmacéutico de la invención , y recetas o instrucciones para preparar dichos alimentos o bebidas. Los métodos pueden comprender los pasos de recolectar la planta o parte de la planta, separar el grano de otras partes de la planta, machacar, extraer, moler, cocinar, enlatar, envasar u otros pasos de procesado conocidos en la técnica. Los métodos, las recetas o las instrucciones pueden incluir los pasos de procesar el producto vegetal de la invención y/o mezclarlo con otros ingredientes alimentarios, como calentar u hornear la mezcla o el producto hasta, por ejemplo, al menos 100 °C. El método puede incluir el paso de envasar el producto para que esté listo para la venta.

Uso industrial Los productos vegetales, preferentemente el grano, se pueden utilizar para producir productos industriales tales como, por ejemplo, etanol.

La presente invención se describe además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1: MÉTODOS Y MATERIALES ILUSTRATIVOS Material vegetal Las lineas de cebada (Hordeum vulgare) utilizadas provenían de una población retrocruzada que partía de un cruce entre variedades parentales Himalaya292 (M292 (SEQ ID NOs: 9-11), orell et ai. 2003b (supra)), que contenían la mutación en SSIIa denominada en la presente alelo sex6-292, y la variedad High Amylose Glacier (HAG, también conocida como AC38) . En la técnica se dispone de las variedades parentales adecuadas. La variedad HAG, por ejemplo (High Amylose Glacier, también conocida como AC38) se puede adquirir de CSIRO o de la Australian Winter Cereals Collection, Tamworth, NSW. El cruce de plantas de cebada se llevó a cabo en el invernadero mediante métodos estándares. Las poblaciones retrocruzadas se generaron mediante 3 retrocruzamientos partiendo de Himalaya292 (macho) y HAG (hembra), y después 3 generaciones de descendencia de semilla única (SSD) . Las semillas del 3.er retrocruzamiento se denominaron BC3F1 y de la 3.a SSD se denominaron BC3F4. Para incrementar la cantidad de semillas de cada línea, se cultivaron 2 o 3 generaciones más. Estas se denominaron las generaciones BC3F6 o BC3F7, y se utilizaron para este estudio.

Se cultivaron setenta líneas de cebada BC3F6 en la CSIRO Plant Industry, Canberra, en macetas en condiciones, por lo demás, naturales en 2005. Para confirmar las composiciones de las semillas y los parámetros seleccionados, un subgrupo de líneas de cebada BC3F7, que se seleccionaron por el peso de semilla, el contenido de amilosa, y la presencia de mutaciones en SSIIa y amol, se cultivaron en un invernadero de la CSIRO Plant Industry, Canberra, con luz natural y a temperaturas de 18 °C (por la noche) y 24 °C (durante el día) , o en un terreno en Yanco, Nueva Gales del Sur (NSW, por sus siglas en inglés) , Australia en 2007.

Las espigas de cebada se calificaron como en antesis 2 días después de que aparecieran las aristas por primera vez en la parte superior de la hoja bandera que contenía la espiga envuelta. Las semillas en desarrollo se recolectaron 20 días después de la antesis (DPA) y, después de retirar el embrión, el endosmerpo en desarrollo se extrudió a través de la superficie de corte y se almacenó a -80 °C.

Se adquirieron otras variedades descritas en la presente de proveedores comerciales o de la Australian Winter Cereals Collection, Tamworth, NSW, Australia.

Genotipificacion de la población BC3F6 mediante amplificación por FCR Se recolectaron hojas jóvenes de trigo de la generación BC3F6 de la población retrocruzada y se liofilizaron (sistemas de congelación FTS, Stone Ridge, Nueva York) . Se aisló el ADN genómico con un kit FastDNAR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Q-BIOgene) .

Para genotipificar la mutación en SSIIa, se utilizaron los cebadores SSIIaF ( 5 ' -CCTGGAACACTTCAGACTGTACG-3 ' (SEQ ID NO: 3)) que comenzaba en el nucleótido 1616 y SSIIaR (5'-AGCATCACCAGCTGCACGTCCT-3' (SEQ ID NO: 4)) que comenzaba en el nucléotido 2044 del ADNc de SSIIa (GenBank n.°: AY133249) para la amplificación por PCR de un producto de 451 bp que incluía el sitio de la mutación de SSIIa en el nucleótido 1829 de Himalaya292, tal como describieron Morell et al. 2003b {supra) (remítase también a la SEQ ID NO: 9) . El microsatélite marcador de PCR EBmac0501 se utilizó para detectar la mutación de amol ya que está ubicado en 68.0 cM en el cromosoma 1H y estaba estrechamente ligado al locus amol que también está ubicado en . 68.0 cM. Los cebadores HHac0501F (5' C CGACGTTGTAAAACGACACT AGTGCCATGCAAAG 3' (SEQ ID NO: 5) y HHac0501R (5' AGGGACAAAAATGGCTAAG 3' (SEQ ID NO: 6)) (base de datos GrainGenes ) se utilizaron para amplificar un fragmento de PCR del locus amol.

Para cada reacción de PCR de 20 µL, se utilizaron 50 ng de ADN genómico, MgCl2 1.5 mM, cada dNTP 0.125 mM, cebadores 10 pmol, glicina-betaina 0.5 M, 1 nL de DMSO y 1.5 U de Hotstar Taq polimerasa (QIAGEN) . Las reacciones por PCR se llevaron a cabo utilizando un equipo HYBAID PCR Express (Intergrated Sciences) con 1 ciclo de 95 °C durante 5 minutos, 35 ciclos de 94 °C durante 45 segundos, 58 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, 1 ciclo de 72 °C durante 10 minutos y 1 ciclo de 25 °C durante 1 minuto. Los productos de PCR para detectar la mutación en SSIIa se digirieron con la enzima de restricción WlalV a 37 °C durante la noche. Los fragmentos de PCR tanto digeridos (para la mutación en SSIIa) como no digeridos (para la mutación amol) se separaron en geles de agarosa al 2% y se visualizaron con un sistema de documentación de geles (UVitec) después de la tinción GelRed (Biotium) .

Para genotipificar lineas de cebada de la población retrocruzada de cebada entre Himalaya292 y HAG, se utilizaron los cebadores SSIIaF y SSIIaR descritos anteriormente para detectar la mutación en SSIIa de la linea parental Himalaya292, y se utilizó el microsatélite marcador EBmac0501 para detectar el locus amol de la linea parental HAG. Para la mutación SSIIa, tres tipos de patrones de fragmentación de PCR fueron evidentes tras la digestión del producto de PCR con NialV seguida de electroforesis en gel, que diferenció los alelos SSIIa imitados y naturales. Un único fragmento de ADN de 347 bp indicó la presencia del gen SSIIa mutado, un único fragmento de ADN de 236 bp indicó la presencia del gen SSIIa natural, y la presencia de tanto fragmentos de 347 bp como de 236 bp indicó las lineas de genotipo heterocigótico. Para la mutación en amol dé HAG, el microsatélite marcador EBmac0501 también presentó tres patrones de fragmentación PCR. Se detectó un fragmento de 167 bp del mutante amol, se detectó un fragmento de 141 bp de lineas naturales, y se detectaron tanto fragmentos de 167 bp como de 141 bp en las lineas heterocigóticas .

Características del grano Se recolectó el grano de plantas en la madurez. A menos que se indique lo contrario, se determinó el peso de semilla medio pesando 100 semillas por triplicado. El peso de semilla para las lineas seleccionadas también se determinó como un peso de semilla medio de 500 semillas por triplicado para materiales cultivados en el campo BC3F7 en Yanco, NSW. El contenido de humedad de la semilla del grano se midió mediante métodos de resonancia magnética nuclear (R N) estándares utilizando un imán de RMN Oxford 4000 (Oxford analytical instrumente Limited) . La textura del grano se midió utilizando el sistema de caracterización Single-Kernel. 4100 (Perten Instruments Inc., Sprinfield, IL, 62707, EE. UU.) utilizando el método de análisis oficial de la división sobre la química de cereales del RACI 12-01. El volumen de la semilla se clasificó en tres categorías: reducido, semirrelleno y relleno.

El examen microscópico de secciones transversales de semilla de cebada y microscopía electrónica de barrido Se produjeron secciones transversales con un espesor de aproximadamente 1 mm de la parte central de las semillas de cebada cortando secciones con cuchillas y se fotografiaron. También se revistieron con partículas de oro y se examinaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM) JSM-6400 que operaba a 15 KV.

Molienda del grano El grano se trituró hasta obtener harina integral que pudiera atravesar un tamiz de 0.5 mm, utilizando un molino ciclónico (Cyclotec 1093, Tecator, Suecia) . A continuación, la harina integral se utilizó para el análisis que se indica a continuación.

Análisis de ß-glucano y pentosano Se midió el contenido de ß-glucano como se describe en el método Megazyme (AACC32.23), utilizando 20 mg de harina integral para cada muestra de un triplicado. Se midió el contenido de pentosano mediante el método de Bell (1985) utilizando 20 mg de harina integral para cada muestra de un triplicado.

Extracción de almidón Se aisló almidón de harina integral mediante un método de extracción de proteasas (Morrison et al., J Cereal Sci, 2: 257-271, 1984) seguido de lavado con agua y la eliminación de residuos. El almidón se lavó a continuación con acetona y se secó al aire a temperatura ambiente (Konik-Rose et al. , 2007 (supra) ) .

Análisis de almidón total Se midió el contenido de almidón total como se describe en el método Megazyme (AACC76.13), utilizando 20 mg de harina integral para cada muestra de un triplicado.

Análisis de la composición de almidón y sus caracteristicas El contenido de amilosa y de amilopectina en el almidón del grano, o la proporción de amilosa respecto a la de amilopectina, se determinó mediante filtración en gel CL-2B Sepharose tal como se indica a continuación (método de filtración en gel) . Se disolvieron aproximadamente 10 mg de almidón total en 3.0 mL de NaOH 1 M y se fraccionaron en función del peso molecular mediante cromatografía en una columna Sepharose CL-2B (Regina et al., Proc Nati Acad Sci USA, 103: 3546-3551, 2006) . La cantidad de almidón en cada una de las fracciones de la columna se midieron utilizando un kit de ensayo del almidón (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se calculó la cantidad total de amilopectina (primer pico, peso molecular más alto) y amilosa (segundo pico, peso molecular más bajo) y se determinó la proporción o el contenido .

Como alternativa, el contenido de amilosa se midió utilizando un método de adsorción de yodo a escala pequeña (2 mg de almidón) (Morrison and Laignelet, J Cereal Sci, 1: 9-20, 1983) con algunas modificaciones como las descritas por Konik-Rose et al., 2007 (supra) .

Distribución de la longitud de las cadenas La distribución de la longitud de las cadenas de la amilopectina se midió, después de desrramificar las muestras de almidón, mediante el método de O'Shea et al., Carbohydr Res, 307: 1-12, 1998 utilizando un sistema de electroforesis capilar P/ACE 5510 (Beckman Coulter, NSW, Australia) con detección por fluorescencia inducida por un láser de argón (LIF) . Se generaron las curvas de diferencia molar sustrayendo la distribución de la longitud de las cadenas normalizada para el almidón modificado de la distribución normalizada para el almidón de un control isogénico no modificado.

Los perfiles de la temperatura de gelatinización de muestras de almidón se pueden medir utilizando un calorímetro diferencial de barrido Pyris 1 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EE. UU.). La viscosidad de soluciones de almidón se puede medir en un viscosímetro Rapid-Visco-Analyser (RVA, Newport Scientific Pty Ltd, Warriewood, Sídney) , utilizando condiciones como las descritas por Batey et al., Starch 48: 338-344, 1997. Los parámetros que se pueden medir incluyen viscosidad máxima (la viscosidad máxima de la pasta en caliente) , fuerza de sujeción, viscosidad final y temperatura de pastificación. Las propiedades de pastificación se pueden medir utilizando el viscosimetro Rapid-Visco-Analyser tal como se indica a continuación. Se añade almidón (3.0 g) a agua destilada (25.0 mL) en la cápsula de CDB y el perfil utilizado en el RVA es: 2 min a 50 °C, calentar durante 6 min a 95 °C, mantener a 95 °C durante 4 min, enfriar durante 4 min hasta 50 °C, mantener a 50 °C durante 4 min. Los parámetros medidos son: Viscosidad máxima a 95 °C, fuerza de sujeción al final del periodo de permanencia a 95 °C, fragilidad = viscosidad máxima - fuerza de sujeción, viscosidad final al final del periodo de permanencia de 50 °C, asentamiento = viscosidad final - fuerza de sujeción. Se puede utilizar el software Thermocline para Windows versión 2.2 (Newport Scientific Pty Ltd, NSW Australia) para recoger y analizar los datos.

El volumen de hinchamiento de harina o almidón se puede determinar de acuerdo con el método de Konik-Rose et ai., Starch-Stárke, 53: 14-20, 2001. La captación de agua se mide pesando la muestra antes y después de mezclar la harina o la muestra de almidón con agua a temperaturas definidas (por ejemplo, 90 °C) y después de recoger el material gelatinizado. Morfología de los granulos da almidón, birrefringencia y distribución del tamaño de los granulos La morfología de los gránulos se examinó mediante SEM (JSM-6400) y microscopía óptica con luz polarizada. Las formas y la birrefringencia de los gránulos de almidón se examinaron como se describe (Yamamori et ai., 2000 (supra)). La distribución del tamaño de los gránulos (en volumen) de las suspensiones de almidón se determinó utilizando un analizador del tamaño de partículas por difracción de láser (Mastersizer 2000, alvern Instruments, alvern, Inglaterra) . El porcentaje de gránulos de almidón de tipo B pequeños se determinó utilizando un diámetro de corte de 7 µp?.

Análisis lipidico El contenido lipidico total se puede evaluar mediante RMN utilizando un imán de RMN Oxford 4000, Oxford Analytical Instruments Limited, R.U. Para cada muestra, se seca 1 g de semillas a 38.8 °C durante 64 horas. Las semillas secas se miden después utilizando RMN y se comparan con los controles de aceite de cebada puro extraído de cultivar de Himalaya o grano M292.

Contenido proteico, contenido lipidico, contenido de humedad y contenido de ceniza El contenido proteico se determinó por medida del contenido de nitrógeno utilizando un método de espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas Europa 20-20 con un sistema de preparación analizador de nitrógeno y carbono automático. Se utilizaron de 3 a 8 mg de harina integral de cebada. Se utilizó un factor de conversión de nitrógeno a proteína de 6.25 para calcular el contenido proteico en semillas de cebada (Mosse 1990) . El contenido lipidico, el contenido de humedad y el contenido de ceniza se midió utilizando el método 983.23 de la AOAC, el método 44-19 de la AACC y el método 08-01 de AACC.

Ensayo de fibra dietética total El método gravimétrico de Prosky et al. (1985; AOAC 985.29) se utilizó para determinar la fibra dietética total (TDF) de la harina integral. Se analizaron las muestras por duplicado .

Ensayo de polisacáridos no amiláceos Los polisacáridos no amiláceos neutros totales (NSP) se midieron mediante una modificación del procedimiento de cromatografía de gases de Theander et al., J AOAC Int 78: 1030-1044, 1995. La modificación supuso una hidrólisis de 2 horas con ácido sulfúrico 1 M seguida de centrifugación para eliminar NSP insolubles y una hidrólisis posterior del sobrenadante utilizando ácido trifluoroacético 2 M para NSP solubles .

Ensayo de almidón resistente Se utilizó un procedimiento in vitro para determinar el contenido de almidón resistente (AR) . El método tiene dos secciones: en primer lugar, se hidrolizó el almidón en cada muestra en condiciones fisiológicas simuladas; en segundo lugar, se eliminaron los subproductos lavando y el almidón residual se determinó después de homogeneizar y secar la muestra. El almidón cuantificado al final del tratamiento de digestión representó el contenido de almidón resistente de la muestra. Normalmente, se mezclaron muestras por triplicado de harina integral junto con patrones adecuados con. saliva artificial y el bolo resultante se incubó con enzimas pancreáticas y gástricas en condiciones de pH y temperatura fisiológicas. La cantidad de almidón residual en el hidrolizado enzimático se determinó utilizando técnicas enzimáticas convencionales y espectrofotometría, y el contenido de almidón resistente de la muestra se expresó como un porcentaje del peso de la muestra o contenido de almidón total.

El día 1, se pesó una cantidad de muestra que representaba hasta 500 mg de carbohidratos en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Se preparó un tampón de carbonato disolviendo 121 mg de NaHCC>3 y 157 mg de KCl en aproximadamente 90 mL de agua purificada, añadiendo 159 ?> de solución 1 M de CaCl2.6H20 y 41 pL de MgCl2.6H20 0.49 , ajustando el pH a 7- 7.1 con HC1 0.32 M y ajustando el volumen hasta 100 mL. Este tampón se almacenó a 4 °C durante hasta 5 días. Se preparó una solución de saliva artificial que contenia 250 unidades de a-amilasa (Sigma A-3176 Tipo VI-B de páncreas porcino) por mL de tampón de carbonato. Se añadió una cantidad de la solución de saliva artificial, aproximadamente equivalente al peso del alimento, al matraz. Aproximadamente 15-20 segundos después de añadir la saliva, se añadieron 5 mL de solución de pepsina en HC1 (1 mg/mL de pepsina (Sigma) en HC1 0.02 M, pH 2.0, preparada el día que se debia utilizar) a cada matraz. La mezcla de la amilasa seguida de pepsina mimetizaba a un ser humano que masticaba la muestra antes de deglutirla. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min con agitación a 85 rpm. La mezcla se neutralizó posteriormente con 5 mL de NaOH 0.02 M. Se añadieron 25 mL de tampón de acetato (0.2 M, pH 6) y 5 mL de mezcla enzimática de pancreatina que contenia 2 mg/mL de pancreatina (Sigma, páncreas porcino a 4x actividad USP) y 28U de amiloglucosidasa (AMG, Sigma) de Aspergillus niger en tampón de acetato, pH6, a cada matraz. Cada matraz se tapó con papel de aluminio y se incubó a 37 °C durante 16 horas en un baño de agua con movimiento de vaivén ajustado a 85 rpm.

El dia 2, el contenido de cada matraz se transfirió cuantitativamente a un tubo de polipropileno de 50 mL y se centrifugó a 2000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Se retiraron los sobrenadantes y cada pellet se lavó tres veces con 20 mL de agua, el tubo se agitó suavemente en un vórtex en cada lavado para fragmentar el pellet y a continuación se centrifugó. 50 uL de el agua del último lavado se analizaron con reactivo glucosa Trinder para comprobar la ausencia de glucosa libre. A continuación, cada pellet se resuspendió en aproximadamente 6 mL de agua purificada y se homogeneizó tres veces durante 10 segundos utilizando un Ultra Turrax TP18/10 con una herramienta de dispersión S25N-8G. El contenido se transfirió cuantitativamente a un matraz volumétrico de 25 mL y se enrasó. El contenido se mezcló bien y se volvió a introducir en el tubo de polipropileno. Se transfirió una muestra de 5 mL de cada suspensión a un tubo de cultivo de 25 mL, se congeló su exterior inmediatamente en nitrógeno líquido y se liofilizó.

El día 3, se midió el almidón total en cada muestra utilizando los reactivos suministrados en el kit de procedimiento para el análisis de almidón total mediante el método Megazyme. Se prepararon patrones de almidón (almidón de maíz normal, Sigma S-5296) y un blanco de reactivos de ensayo. Las muestras, los controles y los blancos de reactivos se humedecieron con 0.4 mL de etanol al 80% para facilitar su dispersión y a continuación se agitó en un vórtex. Inmediatamente después se añadieron 2 mL de DMSO y las soluciones se mezclaron agitando con un vórtex. Los tubos se introdujeron en un baño María durante 5 min y se añadieron 3 mL de a-amilasa termoestable (100 U/mL) en tampón de MOPS (pH 7, que contenía CaCl2 5 mM y azida sódica al 0.02%) inmediatamente. Las soluciones se incubaron en el baño María durante 12 min más, mezclando con un vórtez a intervalos de 3 min. A continuación, los tubos se introdujeron en un baño de agua a 50 °C y se añadieron 4 mL de tampón de acetato de sodio (200 mM, pH 4.5, que contenía azida sódica al 0.02%) y 0.1 mL de amiloglucosidasa con una concentración de 300 U/mL. Las mezclas se incubaron a 50 °C durante 30 min con agitación suave en intervalos de 10 min. Las mezclas se enrasaron hasta 25 mL en un matraz volumétrico y se mezclaron bien. Se centrifugaron alícuotas a 2000 x g durante 10 min. Se determinó la cantidad de glucosa en 50 pL de sobrenadante con 1.0 mL de reactivo glucosa Trinder y midiendo la absorbancia a 505 nm después de incubar los tubos a temperatura ambiente y en ausencia de luz durante un mínimo de 18 min y un máximo de 45 min.

Cuantificacion del contenido de carbohidratos hidrosolubles Los carbohidratos hidrosolubles totales (WSC) se extrajeron de harina integral aplicando el método de Lunn and Hatch, Planta 197: 385-391, 1995 con las siguientes modificaciones. La harina integral se define en la presente como el producto obtenido al moler grano maduro, sin fraccionamiento posterior (p. e . , tamizado) para eliminar el salvado. Por lo tanto, la harina integral contiene todos los componentes del grano.

Se extrajo harina integral de cebada (100 mg) tres veces con 10 mL de etanol al 80% (v/v) en un baño María durante 10 min. Se combinó el sobrenadante de cada extracción, se liofilizó la mezcla y resuspendió en 2 mL de agua milliQ. Las cantidades de sacarosa, glucosa y fructosa se midieron utilizando un ensayo enzimático colorimétrico en una placa de microvaloración tal como se describe (Campbell et al., J Sci Food Agrie 79: 232-236, 1999; Ruuska et al., Fnct Plant Biol 33: 799-809, 2006) . También se analizaron los azúcares, la maltosa y los fructooligosacáridos (fructanos) mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) tal como describe Ruuska et al., 2006 (supra) . Se obtuvieron resultados comparables con ambos métodos.

Para determinar los niveles de maltosa, se analizaron los azúcares totales extraídos de harina integral de cebada esencialmente como describe Bernfeld, Amylases aplpha and beta; En: Colowick and aplan (ed.), Methods in enzymology, Academic, NY, p. 149, 1955, utilizando soluciones patrón de maltosa a efectos comparativos, tal como se indica a continuación. Los azúcares totales se diluyeron 10-100 veces. Se prepararon patrones de maltosa (10 tubos) con concentraciones de 0.3-5 micromoles por mL. Un mL de cada dilución de maltosa (en diluciones de azúcares totales o maltosa) se mezcló con 1 mL del reactivo colorante ácido dinitrosalicilico. La solución de los azúcares se incubó posteriormente a 100 °C durante 5 min y se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadieron 10 mL de agua de grado reactivo a cada tubo y se mezcló bien. Las muestras se midieron a A5 0 con un espectrofotómetro. También se determinó la maltosa mediante HPAEC como se describió anteriormente.

Ensayos enzim icos La actividad de almidón-sintasa total en muestras, tales como el endospermo en desarrollo de cereales, se puede medir extrayendo proteínas y mediante ensayos aplicando los métodos descritos en Libessart et al. Plant Cell. 7(8): 1117-1127, 1995 o Cao et al., Plant Physiol. 120(1): 205-16, 1999. Los ensayos emplean el sustrato ADPG marcado con 14C y miden la incorporación del monómero en los polímeros amiláceos. Se pueden separar isoformas individuales de almidón-sintasa en extractos mediante electroforesis en gel y se pueden ensayar en gel (zymogram) como se indica a continuación. Se pueden preparar extractos de muestras tales como semillas en desarrollo utilizando tampón de fosfato de potasio 50 mM, pH7.5, EDTA 5 mM, glicerol al 20%, Pefabloc 10µ? y ditiotreitol 0.05mM (DTT) . Tras triturar las semillas para obtener una pasta en el tampón u homogeneizar la muestra, la mezcla se centrifuga a 14 000 g durante 15 min a 4 °C y se retira el sobrenadante. La concentración proteica en el sobrenadante se puede medir utilizando el reactivo proteico Coomassie u otros métodos estándares. Los extractos se pueden almacenar a -80 °C si los extractos proteicos se han de correr en geles nativos. Para la electroforesis en gel desnaturalizante, se mezclan ???µ? de extracto con SDS y ß-mercaptoetanol, y las mezclas se incuban en agua hirviendo durante 4 min para desnaturalizar las proteínas. La electroforesis se lleva a cabo en geles de poliacrilamida desnaturalizantes estándares utilizando geles separadores que contienen un 8% de poliacrilamida con geles concentradores que contienen un 4.5% de poliacrilamida superpuestos. Después de la electroforesis, las proteínas se pueden volver a naturalizar sumergiendo los geles en tampones de Tris-HCl 40 mM durante un mínimo de 2 h, cambiando el tampón cada 30 min y utilizando al menos 100 mL de tampón para cada cambio de tampón. Para geles no desnaturalizantes, se omite el paso de desnaturalización con SDS y ß-mercaptoetanol, y se prescinde de SDS en los geles. Se puede utilizar un tampón para el ensayo de almidón-sintasa que incluya Tris-glicina (Tris 25 mM, glicina 0.19 M) , sulfato de amonio 0.133M, MgCl2 10 mM, 670µg/mL de BSA y sustrato ADPG 1 mM para la detección de bandas de almidón-sintasa, seguida de tinción con solución de yodo (I2 al 2% equilibrada con KI al 2%) para detectar el producto amiláceo.

Como alternativa, se puede detectar almidón-sintasa u otras enzimas biosintéticas del almidón en muestras utilizando anticuerpos específicos (ELISA) .

Análisis estadísticos de la relación entre los genotipos y los componentes de las semillas o las propiedades del almidón Se llevaron a cabo análisis estadísticos utilizando la versión 9 de Genstat. Se llevó a cabo un análisis de varianza para el peso de semilla, el contenido de almidón total, el contenido de amilasa, el contenido de beta-glucano, el contenido de azúcar, el tamaño de los gránulos de almidón y la distribución de la longitud de las cadenas de amilopectina para obtener la diferencia menos significativa (LSD, P < 0.05), teniendo en cuenta la variación entre los genotipos.

EJEMPLO 2: GENOTIPIFICACIÓN DE PLANTAS Se generó una población de lineas que se segregaban dependiendo de la presencia o ausencia de mutaciones en los locus SSIIa y amol llevando a cabo tres retrocruzamientos de una línea donante sex6-292 (Himalaya292) en un progenitor recurrente amol -AC38. Se obtuvieron tres generaciones de descendencia de semilla única a partir de las líneas BC3F2 para generar genotipos fijados suficientes con el fin de investigar el impacto relativo de los locus sex6 y amol, combinados o por separado, sobre la síntesis de almidón o la composición del grano. Se utilizó un marcador para la mutación causal del gen SSIIa para genotipificar el locus sex6 en las líneas BC3F6 (Morell et al. 2003b (supra)), mientras que el microsatélite marcador EBmac0501 estrechamente ligado se utilizó como un marcador indirecto del estatus amol-38 tal como se describe en el Ejemplo 1.

Entre las 70 líneas BC3F6 genotipificadas, 14 líneas fueron homocigóticas tanto para el alelo sex6-292 como para el alelo amol-AC38 (sex6-292/aínol-AC38) y, por lo tanto, se consideraron mutantes dobles en SSIIa-amol, 17 líneas fueron homocigóticas para el alelo sex6-292 y para el alelo amol natural ( sex6-292/amol-wt) y, por lo tanto, se denominaron mutantes únicos en SSIIa, 10 líneas fueron homocigóticas para el alelo sex6 natural y para el alelo mutante amol-AC38 (sex6-wt/ajnol-AC38 ) y, por lo tanto, se denominaron mutantes únicos en amol, mientras que 15 líneas fueron naturales tanto para sex6 como para amol (sex6-wt/amol-wt ) y se denominaron naturales. El resto de las líneas fueron heterocigóticas para la mutación sex6 (7 líneas) o para el marcador EBmac0501.

También se utilizó el marcador de ADN para el gen SSIIIa que era polimórfico entre las lineas parentales HAG e Himalaya292 (Ejemplo 3) para genotipificar las 56 lineas homocigóticas . Este análisis mostró la presencia del gen SSIIIa de HAG «n 26 lineas y el gen SSIIIa de Himalaya292 en 30 lineas. Entre las 56 lineas genotipificadas con el marcador EBmac0501 y el del gen SSIIIa, 5 lineas mostraron genotipos recombinantes . Cuando se correlacionaron los genotipos y los fenotipos, incluidos el volumen de las semillas y el contenido de almidón, 4 lineas genotipificadas con EBmac0501 y 1 linea genotipificada con el marcador del gen SSIIIa presentaron fenotipos recombinantes. Esto indicó que existia una cierta recombinación entre los marcadores y el locus amo! que proporcionaba los fenotipos de almidón, y también indicó que el gen amol y el gen SSIIIa se diferenciaban genéticamente incluso estando ligados estrechamente en la cebada.

Las variedades parentales también fueron diferentes en los fenotipos mondado o desnudo: HAG es una variedad mondada de cebada mientras que la Himalaya292 era una variedad desnuda. Los mutantes dobles en SSIIa-amol se segregaban dependiendo de esta característica y, por lo tanto, se podían clasificar en dos subgrupos: mondado o desnudo. Por consiguiente, los cuatro fenotipos de líneas de cebada diferenciados descritos anteriormente se clasificaron en cinco grupos, a saber: líneas naturales, mutantes únicos en SSIIa, mutantes únicos en amol, mutantes dobles mondados y mutantes dobles desnudos. Se utilizaron cuatro líneas de cada uno de los cinco grupos para el análisis de la distribución de los gránulos de almidón, WSC, CE y morfología de las semillas. Se utilizó una línea de cada genotipo para la estructura del endospermo y la morfología de los gránulos de almidón. Se emplearon 11 líneas naturales, 9 líneas mutantes en amol, 13 líneas mutantes en SSIIa, 4 líneas - in mutantes dobles desnudas y 6 líneas imitantes dobles mondadas para el análisis de la composición del grano, el contenido de amilosa y el peso de semilla tal como se indica a continuación. Peso de semilla Se midió el peso de semilla medio (promedio de 100 pesos de semilla) para líneas homocigóticas de la población BC3F6. El peso de semilla medio fue 52.7 ± 5.0 mg para 11 líneas naturales, 52.8 ± 2.8 mg para 9 líneas amol, 38.7 ± 2.5 mg para 13 líneas mutantes en SSIIa, y 47.6 ±4.5 mg para las 6 líneas mutantes dobles mondadas 6 y 44.7 ± 1.0 mg para las 4 líneas mutantes dobles desnudas. No se detectó ninguna diferencia significativa desde un punto de vista estadístico entre los pesos de semilla de las líneas mutantes amol y las líneas naturales (P<0.05), lo cual indica que la mutación amol no afectaba al peso de semilla. Sin embargo, se detectaron diferencias significativas desde un punto de vista estadístico (P<0.05) entre cada uno de los mutantes únicos en SSIIa y los mutantes dobles (mondados y desnudos) y cada uno de los otros tres genotipos respectivos. También se observó algo similar para los pesos de semilla de los 4 genotipos para las poblaciones BC3F7 en un invernadero independiente y ensayos de campo de las líneas en el 2007. El resultado sorprendente e inesperado fue que el peso de semilla reducido debido a la presencia de la mutación en SSIIa, que se sabe que se debe a la síntesis reducida de amilopectina en ausencia de actividad SSIIa, fue compensado en parte por la combinación con la mutación en amol.

Morfología de las semillas Se examinaron la cara dorsal y la ventral de semillas intactas de cuatro lineas representativas de cada genotipo con un microscopio estereoscópico. Las lineas imitantes únicas en SSIIa produjeron semillas reducidas mientras que las lineas mutantes naturales y las únicas en amol produjeron semillas voluminosas muy rellenas. Se observó que las semillas de mutantes dobles, tanto mondados como desnudos, presentaban un fenotipo intermedio, más voluminoso que las semillas de mutantes en SSIIa, pero no tan rellenas como las semillas amol ni las naturales. Estas observaciones concordaban con los pesos de semilla.

Para ilustrar aún más la naturaleza de la voluminosidad de las semillas de estos genotipos, se examinaron las secciones transversales de la parte central de las semillas a lo largo del mayor diámetro (Figura 1) . Las secciones transversales de lineas naturales o mutantes en amol mostraron endospermos completamente llenos mientras que las lineas mutantes en SSIIa mostraron semillas semirrellenas (reducidas) con una reducción considerable en la densidad de empaquetamiento del endospermo. Las lineas mutantes dobles en SSIIa-amol presentaron un fenotipo intermedio con un endospermo que estaba más lleno que el endospermo mutante en SSIIa pero menos lleno que las lineas naturales o mutantes en amol.

Para llevar a cabo un examen más minucioso, se examinaron las secciones transversales de las semillas de cebada de todos los genotipos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) . Sobre la superficie de las secciones en la cara dorsal, los granos de cebada natural mostraron células aleurónicas cuadradas con un tamaño de aproximadamente 20-25 um x 20-25 um, con capas de células subaleurónicas diferenciadas y el endospermo estaba lleno de células redondas y planas con limites celulares claros de un tamaño aproximado de 210 um x 130 um. Para el mutante sex6-wt/ajnol-AC38 , las células auleurónicas tenían una forma rectangular con unas dimensiones de aproximadamente 20-25 um x 10-15 um. Las células subaleurónicas estaban claramente diferenciadas y el endospermo contenía células planas con límites celulares claros que eran más largas y más estrechas que las de la línea natural, con un tamaño aproximado de 230 um x 30 um. El mutante sex6-292/amol-wt presentó células aleurónicas rectangulares irregulares con un tamaño de 45-50 um x 5-10 um, las células subaleurónicas no estaban claramente diferenciadas y el endospermo contenía células irregulares con un tamaño de 90-95 um x 25-30 um. Para el genotipo de mutante doble sex6-292/amol-AC38, las células aleurónicas eran prácticamente cuadradas y tenían un tamaño de aproximadamente 20 um x 20 um, las células subaleurónicas estaban tan poco diferenciadas que no se podían identificar, y el endospermo contenía células redondas y planas con límites claros de aproximadamente 110 um x 90 um.

Contenido de almidón total El contenido de almidón total se midió como se describe en el Ejemplo 1 en una semilla BC3F6 para los cuatro genotipos. El contenido de almidón promedio fue 64.3 ± 2.4% para las líneas naturales, 57.2 ± 2.8% para las líneas mutantes en amol, 34.9 ± 4.0% para las líneas mutantes en SSIIa, 50.8 ± 2.8% para las líneas mutantes dobles desnudas y 47.6 ± 2.3% para las líneas mutantes dobles mondadas (Figura 2) . En comparación con las lineas naturales, los mutantes en amol, mutantes dobles desnudos, mutantes dobles mondados y líneas mutantes en SSIIa contenían un 7.1%, 13.5%, 16.7% y 29.4% menos almidón total, respectivamente. Estos valores fueron estadísticamente diferentes entre los cinco grupos (P<0.05) salvo que los valores para los grupos desnudos o mondados no fueron significativamente diferentes. También se obtuvieron relaciones consistentes entre los pesos de semilla de los cinco grupos (P<0.05) para el grano BC3F7 de un invernadero independiente y ensayos de campo en el 2007. Estos datos mostraron que el incremento del peso de semilla observado para las semillas de mutantes dobles en SSIIa-amol en comparación con las semillas de mutantes únicos en SSIIa se debía al incremento del contenido de almidón.

Contenido de amilosa Se midió el contenido de amilosa para 'todas las líneas de los cuatro genotipos. El contenido de amilosa estuvo comprendido entre 32.0 ± 3.2% para líneas naturales, 49.5 ± 2.7% para mutantes en amol, 57.6 ± 10.0% para líneas mutantes en SSIIa, 62.2 ± 4.1% para mutantes. dobles desnudos y 59.8 ± 2.3% para mutantes dobles mondados. El análisis estadístico mostró que las líneas mutantes en SSIIa y las líneas mutantes dobles contenían un contenido de amilosa significativamente mayor en la semilla que el de los mutantes en amol y las líneas naturales, sin embargo, el contenido de amilosa de mutantes en SSIIa y mutantes dobles no fue significativamente diferente (P<0.05), lo cual indica que la mutación en SSIIa incrementó la proporción de amilosa en el almidón total del grano pero la adición de la mutación en amol no supuso un incremento adicional significativo de la proporción de amilosa. Estas diferencias en el contenido de amilosa entre los genotipos concordaron en líneas BC3F7 cultivadas en el 2007.

Distribución de la longitud de las cadenas de almidón Para examinar los efectos de los genotipos sobre la distribución de la longitud de las cadenas de almidón, se aisló almidón de cuatro lineas de cada grupo de la población cruzada BC3F6 y se analizó mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE) . El porcentaje de cadenas se combinó en grupos DP 6-8, DP 9-14, DP 15-24, DP 35-34, DP 35-44 y DP >45. No se observó ninguna diferencia significativa desde un punto de vista estadístico (P<0.05) entre los grupos de mutantes en SSIIa, mutantes dobles desnudos y imitantes dobles mondados. Sin embargo, hubo una diferencia fundamental (P<0.05) entre los grupos que contenían el alelo SSIIa natural en comparación con grupos que contenían el alelo SSIIa mutante. Aquellos genotipos con el alelo mutante SSIIa contenían una proporción incrementada de cadenas de DP6-8, siendo más de un 10% de las cadenas de este tamaño, y también una proporción incrementada de cadenas de DP 9-14. También exhibieron una proporción reducida de cadenas con DP15-24. Las líneas naturales tenían menos de un 5% de longitudes de cadenas DP6-8. Los mutantes en amol contenían una cantidad significativamente reducida desde un punto de vista estadístico de DP 9-14 y una cantidad incrementada de DP 15-24.

Distribución del tamaño de los granulos de almidón Para investigar los efectos del genotipo sex6 y amol sobre el tamaño de los gránulos de almidón en el almidón del endospermo, se examinó la distribución del tamaño de los gránulos de almidón para cuatro líneas seleccionadas de cada grupo de la población retrocruzada BC3F6. Los resultados mostraron que el contenido de los gránulos de almidón B (definidos como <7 um de diámetro) en líneas naturales, mutantes en amol, mutantes en SSIIa, mutantes dobles desnudos y mutantes dobles mondados fue 20.2 ± 6.4%, 30.7 ± 3.6%, 17.5 ±1.8%, 19.7 ± 3.6% y 18.3 ± 7.2% de almidón total en cada línea, respectivamente. Las semillas de mutantes en amol contenían significativamente más gránulos de almidón B que las semillas de los otros cuatro grupos.

También se evaluó el tamaño medio de los gránulos de los máximos de distribución con un diámetro superior a 10 µp? (gránulos de almidón A) . El tamaño medio de los gránulos de almidón A fue 18.9 ± 0.5 um para lineas naturales, 10.9 ±0.3 uní para mutantes en amol, 16.4 ± 2.6 um para mutantes en SSIIa, 18.7 ± 0 um para mutantes dobles desnudos y 17.5 ± 0.6um para mutantes dobles mondados. El análisis estadístico mostró que las semillas de mutantes en amol contenían gránulos de almidón A significativamente más pequeños que las semillas de cada uno de los cuatro grupos de cebada (P<0.05). No se observó ninguna diferencia significativa desde un punto de vista estadístico (P<0.05) entre los gránulos A en semillas de líneas naturales, mutantes en SSIIa, mutantes dobles desnudos y mutantes dobles mondados .

Morfología de los gránulos de almidón Se tiñeron almidones de cebada purificados de los cinco grupos con yodo y se examinaron mediante microscopía óptica normal. Concordando con su contenido de amilosa, los gránulos de almidón de todos los genotipos presentaron un color violeta después de la tinción con yodo. Bajo microscopía óptica polarizada, más de un 90% de los gránulos de almidón de las semillas naturales y las semillas amol presentaron la característica específica de birrefringencia "cruce de maltosa" de gránulos de almidón cristalinos. Sin embargo, menos de un 10% de los gránulos de almidón de las semillas de mutantes en SSIIa o mutantes dobles exhibieron dicha birrefringencia .

Cuando se observa bajo SEM, el grano de las líneas naturales exhibió gránulos de almidón esféricos normales, mientras que el genotipo de mutantes en amol presentó gránulos de almidón A esféricos más pequeños que concordaban con los resultados del análisis descrito anteriormente. Los almidones de las semillas de mutantes en SSIIa y mutantes dobles mostraron gránulos de almidón deformes predominantemente más pequeños. De los dos mutantes que presentaron gránulos de almidón deformes, la línea mutante en SSIIa produjo gránulos A tubulares elongados (26 um x 12 um) mientras que las semillas de mutantes dobles desnudos exhibió elongaciones tubulares más pronunciadas de los gránulos A (28 um x 21 um) .

Se examinó la ubicación de los gránulos de almidón en la matriz endospérmica en secciones transversales de las semillas de cebada. Las líneas naturales contenían múltiples gránulos de almidón A esféricos y planos que rodeaban múltiples gránulos de almidón B pequeños, mientras que la línea mutante en amol contenia múltiples gránulos de almidón con empaquetamiento no compacto que rodeaban gránulos de almidón B más pequeños. Los gránulos de almidón no se pudieron identificar con claridad para las semillas de mutantes en SSIIa en las secciones transversales. Las líneas mutantes dobles desnudas contenían gránulos de almidón A con forma lenticular empaquetados de forma compacta en las células del endospermo. Contenido de beta-glucano Se midió el contenido de beta-glucano para todas las líneas de la población BC3F6. El contenido de beta-glucano fue 6.0 ± 0.5% (comprendido entre un 5.3% y un 7.0%) para líneas naturales, 8.2± 0.5% (comprendido entre un 7.6% y un 8.4%) para líneas mutantes en amol, 7.6 ± 1.4% (comprendido entre un 5.9% y un 11.3%) para mutantes en SSIIa, 7.1 ± 0.4% para mutantes dobles desnudos y 6.5 ± 0.8% (comprendido entre un 5.5% y un 7.7%) para mutantes dobles mondados. El análisis estadístico mostró que las semillas de mutantes en amol, mutantes en SSIIa y mutantes dobles desnudos contenían significativamente más ß-glucano que las semillas de las líneas naturales y las líneas mutantes dobles mondadas (P<0.05), pero no se detectó ninguna diferencia significativa desde un punto de vista estadístico en el contenido de beta-glucano entre mutantes en amol, mutantes en SSIIa y mutantes dobles desnudos, o entre semillas de líneas naturales o mutantes dobles mondados, respectivamente.

El análisis estadístico para estas líneas F7 seleccionadas de cinco grupos cultivados en condiciones de invernadero o de campo mostró que, para cada ensayo, las semillas de líneas mutantes en amol contenían más ß-glucano que las semillas de líneas mutantes dobles. No se detectó ninguna diferencia significativa en el contenido de ß-glucano entre semillas de mutantes en SSIIa o mutantes dobles.

Contenido de pentosano Se midió el contenido de pentosano para las líneas de los cinco grupos. El contenido de pentosano fue 4.9 + 0.6% para líneas naturales, 4.9± 1.1% para líneas mutantes en amol, 7.3 ± 1.4% para mutantes en SSIIa , 5.0 ± 0.3% para mutantes dobles desnudos y 6.5 ± 1.0% para mutantes dobles mondados. El análisis estadístico mostró que tanto las líneas mutantes en SSIIa como los mutantes dobles mondados contenían significativamente más pentosano que las líneas naturales, mutantes en amol y mutantes dobles desnudos (P<0.05), pero, no se detectó ninguna diferencia significativa en el contenido de pentosano entre líneas mutantes en SSIIa y mutantes dobles mondados o entre líneas naturales, mutantes en amol y mutantes dobles desnudos, respectivamente..

Contenido de ceniza Se midió el contenido de ceniza para las semillas de los cinco grupos. El contenido de ceniza fue 2.5 ± 0.1% para semillas de lineas naturales, 2.6± 0.2% para semillas de mutantes en amol , 3.1 ± 0.3% para semillas de mutantes en SSIIa, 2.1 ± 0.1% para semillas de mutantes dobles desnudos y 2.7 ± 0.1% para semillas de mutantes dobles mondados. Las semillas de mutantes en SSIIa contenían significativamente más ceniza y las semillas de mutantes dobles desnudos contenían significativamente menos ceniza que las líneas naturales, semillas de mutantes en amol o mutantes dobles mondados, pero, no se detectó ninguna diferencia significativa en el contenido de ceniza entre las líneas naturales, líneas mutantes en amol y mutantes dobles mondados, respectivamente.

Carbohidratos hidrosolubles Para determinar el efecto de las mutaciones por separado o combinadas sobre el contenido de carbohidratos hidrosolubles en semillas de cebada, se analizaron cuatro líneas de cada grupo. En comparación con la composición de carbohidratos hidrosolubles de las semillas naturales, las semillas amol no contenían niveles significativamente diferentes de WSC totales, glucosa, sacarosa o maltosa libre, o fructano. Sin embargo, las semillas de mutantes en SSIIa y mutantes dobles contenían cantidades significativamente superiores de cada uno de estos carbohidratos (P<0.05). Las semillas de los mutantes únicos en SSIIa contenían significativamente más fructosa, sacarosa y WSC totales.

Contenido proteico Se midió el contenido proteico en las semillas de los cinco grupos. El contenido proteico fue 10.3 ± 0.8% para semillas de líneas naturales, 10.4± 1.1% para semillas de mutantes en amol , 12.6 ± 0.9% para semillas de mutantes en SSIIa, 14.6 ± 0.6% para semillas de mutantes dobles desnudos y 13.8 ± 1.4% para semillas de mutantes dobles mondados. Tanto las semillas de mutantes desnudos y mutantes dobles mondados contenian significativamente más proteínas que las semillas de mutantes en SSIIa, semillas de líneas naturales o mutantes en amol, pero no se detectó ninguna diferencia significativa en el contenido proteico entre semillas de mutantes dobles desnudos y mondados o entre semillas de mutantes en amol y de líneas naturales .

Contenido lipidico Se midió el contenido lipidico para las semillas de los cinco grupos. El contenido lipidico total fue 2.9 ± 0.2% para semillas de líneas naturales, 3.5± 0.3% para semillas de mutantes en amol , 6.4 ± 0.9% para semillas de mutantes en SSIIa, 4.9 ± 0.3% para semillas de mutantes dobles desnudos y 5.0 ± 0.3% para semillas de mutantes dobles mondados. Las semillas de mutantes en SSIIa contenían significativamente más lípidos que las semillas de mutantes dobles desnudos o mondados, semillas de líneas naturales y semillas de mutantes en amol, pero no se detectó ninguna diferencia significativa entre semillas de mutantes dobles desnudos o mondados o entre semillas de mutantes en amol y de líneas naturales.

Conclusión El objetivo del presente estudio era examinar la interacción entre mutaciones recesivas en los locus sex6 y amol. Cada una de estas mutaciones produce un fenotipo de amilosa elevada en comparación con la línea natural, con contenidos de amilosa típicos de un 60-70% en el almidón de semillas de mutantes en SSIIa y un 35-45% en semillas de mutantes en amol-AC38. La determinación de los 4 posibles genotipos para los locus sex6 (sex6-wt y sex6-292) y amol (amol-wt y amol-AC38) fue un aspecto importante de este estudio . Los alelos mutantes o naturales del locus Sex6 se pudieron distinguir de forma no ambigua utilizando un marcador basado en la mutación causal en el gen de la almidón-sintasa lia. Se sigue desconociendo la naturaleza precisa de la mutación en el locus amol, por lo tanto, se utilizó un marcador estrechamente ligado (Bmac0501, ubicación en el mapa consenso 58.0 cM) para comprobar la presencia de la región cromosomica que contiene el locus amol.

Un objetivo del presente estudio era examinar el impacto de la combinación de estas mutaciones sobre el contenido de amilosa. Los datos mostraron que no existia ninguna diferencia significativa en la proporción de amilosa al combinar los locus de mutantes en SSIIa y a-iiol-AC38 en comparación con lineas portadoras del locus de mutantes en SSIIa únicamente. Sin embargo, la combinación de las mutaciones en SSIIa y ajnol-AC38 tuvo consecuencias inesperadas sobre la síntesis de almidón y el peso del grano, incrementado el contenido de almidón y el peso de semilla en comparación con la mutación en SSIIa únicamente.

Los mutantes en SSIIa de cebada contenían almidón con un alto porcentaje de amilosa. Los datos mostraron que el grano de mutantes en SSIIa contenía como promedio solamente un 40% de contenido de almidón del grano natural expresado por grano. El fenotipo de amilosa elevada de la semilla de mutantes en SSIIa se debía, por lo tanto, a una reducción preferente de la amilopectina, que se redujo un 75%, en comparación con la amilosa que se redujo únicamente un 25%. En el caso del grano de mutantes dobles en SSIIa-amol, también se observó una reducción en la síntesis de amilopectina en comparación con las líneas naturales (31% de reducción) pero un incremento en el contenido de amilosa (37% de incremento) por semilla. Estos resultados fueron intrigantes, lo que sugiere que el producto del gen amol no solo participó en la síntesis de amilopectina sino que también reprimió la síntesis de amilosa.

Unos estudios previos sobre la función del gen de la almidón-sintasa III en la síntesis de almidón transitorio en Arabidopsis llevaron a Zhang et al., Plant Physiol. 138: 663-674, 2005 a concluir que la almidón-sintasa III era un regulador negativo de la síntesis de almidón en hojas. En el arroz, se conocen dos genes de la almidón-sintasa III, SSIIIa y SSIIIb. De estos genes, SSIIIa se expresa en el endospermo durante la síntesis de almidón mientras que SSIIIb se expresa al principio del desarrollo del endospermo pero no durante periodos de síntesis muy activa de almidón posteriores en el llenado del grano (Ohdan et al., J Exp Bo 56: 3229-3244, 2005). Las mutaciones en SSIIIa en arroz no redujeron el contenido de almidón, sin embargo, se detectó un incremento en el contenido de amilosa de aproximadamente un 15% a un 20%, lo cual sugiere que se produjo una reducción de la síntesis de amilopectina y un incremento concomitante de la síntesis de amilosa (Fujita et al., 2007 (supra)). Un incremento de la actividad de GBSSI y SSI concordó con esta observación (Fujita et al., 2007 (supra)). Li et al., 2000 (supra) ubicaron el gen SSIII (actualmente denominado SSIIIa) en el brazo corto del cromosoma 1 del trigo, una ubicación que no concuerda con la ubicación del locus amol en la cebada. Por lo tanto, el gen SSIIIa fue un gen candidato para el gen causal interrumpido en el locus ajnol. Sin embargo, los experimentos demostraron que la proteína SSIIIa se expresaba en mutantes en ajnol y presentaba actividad de almidón sintasa, y que existía un evento de recombinación entre los genes SSIIIa y amol, lo cual indica que son genes diferentes.

El impacto del alelo mutante amol sobre la distribución de la longitud de las cadenas de almidón fue sutil. En un código genético natural, la presencia del alelo mutante amol provocó una ligera reducción de las longitudes de las cadenas cortas (DP 9-14) y un incremento en la fracción DP 15-24. En códigos genéticos mutantes en SSIIa, el impacto del locus mutante amol sobre la distribución de la longitud de las cadenas fue insignificante. En cambio, el alelo mutante SSIIa ejerció un efecto considerable sobre la estructura de la amilopectina y, por lo tanto, sobre la distribución de la longitud de las cadenas, incrementado la proporción de cadenas cortas (DP 6-8 y DP 9-14) y reduciendo las cadenas con DP15-25.

La combinación de los alelos mutantes SSIIa y aiiiol proporcionó un fenotipo inesperado en el que el contenido de almidón y el peso de semilla se restauraron parcialmente en comparación con las propiedades de lineas que contenían solamente el alelo mutante SSIIa.

EJEMPLO 3: MARCADORES GENÉTICOS LIGADOS AL LOCUS AMOl DE LA CEBADA El locus de la mutación amol ha sido ubicado a aproximadamente 56.5 cM en el cromosoma 1H de la cebada (Barley- BinMap 2005, base de datos GrainGene) . Para evaluar los marcadores genéticos ligados estrechamente al locus amol, se seleccionaron 11 marcadores SSR (repetición de secuencia simple) (Ramsay et al., Genetics. 156(4): 1997-2005, 2000) ubicados entre 56.00 cM y 64.60 cM en el cromosoma 1H de la cebada y se estudiaron para comprobar la amplificación de los productos de PCR de dos líneas parentales, High Amylose Glacier (HAG) e Himalaya292. Estos marcadores SSR fueron EBmac0405, Bmag0105, Bmac0063, HVM20F, EBmac0560a, EBmac0501, Bmac0044, Bmac0032, Bmag0113, Bmag0211 y Bmag0350. Los cebadores para estos marcadores SSR se sintetizaron de acuerdo con las secuencias enumeradas en la base.de datos GrainGenes .

Para cada reacción de PCR (20 µL) , se utilizaron 50 ng de ADN genómico, MgCl2 1.5 mM, cada dNTP 0.125 mM, cebadores 10 pmol, glicina-betaina 0.5 M, 1 µ?? de DMSO y 1.5 U de Hotstar Taq polimerasa (QIAGEN, Australia) . Las condiciones de PCR para la amplificación de los marcadores SSR fueron: 1 ciclo de 95 °C durante 4 minutos, 15 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, de 65 "C a 50 °C con reducciones de 1 °C en cada ciclo durante 30 segundos, y 72 °C durante 1 minuto 20 segundos, 30 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 50 "C durante 15 segundos y 72 °C durante 45 segundos y 1 ciclo de 25 °C durante 1 minuto. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% y se visualizaron con un sistema de documentación de geles (UVitec) después de la tinción GelRed (Biotium) .

Cuando se evaluaron los 11 marcadores SSR, 2 de los 11 marcadores, concretamente Bmac0032 ubicado en 64.6 cM y EBmac0501 ubicado en 58.0 cM, produjeron productos de PCR de diferentes tamaños para el ADN de las plantas parentales HAG e Himalaya292. Es decir, estos marcadores mostraron polimorfismo entre las dos variedades parentales. El tamaño de los productos de amplificación fue de fragmentos de 175 bp y 189 bp para HAG, y 230 bp y 150 bp para Himalaya292, con los marcadores Bmac0032 y EBmac0501, respectivamente. Ambos marcadores SSR se utilizaron posteriormente para genotipificar las 70 lineas BC3F6. Todas las lineas genotipificadas con el marcador Bmac0032 produjeron fragmentos del mismo tamaño que HAG, lo cual demostró que todas las lineas se habían recombinado entre los locus Bmac0032 y amol, y el marcador SSR Bmac0032 no estaba estrechamente ligado con el locus amol. En cambio, de las 70 lineas BC3F6 genotipificadas con el marcador EBmac0501, 56 eran homocigóticas para uno u otro de los patrones de los fragmentos. De las 56 lineas homocigóticas, 25 presentaron el marcador EBmac0501 de HAG y 31 exhibieron el marcador EBmac0501 de Himalaya292. Estos resultados mostraron que el marcador EBmacO501 no tuvo una alta frecuencia de recombinación genética con el locus airiol . Por lo tanto, el marcador SSR EBmac0501 era un microsatélite marcador estrechamente ligado para el locus a.nol-AC38.

Marcadores basados en el gen SSIIIa de la cebada Se creía que el locus amol podía estar próximo al gen SSIIIa de la cebada. Para evaluar esta posibilidad y diseñar un marcador de ADN basado en el gen SSIIIa en la cebada, se aislaron inicialmente porciones del gen SSIIIa de las dos variedades parentales. Se utilizaron ADN de HAG e Himalaya292 para amplificar fragmentos de PCR utilizando cebadores basados en la secuencia de ADN genómico de SSIIIa del trigo (Li et al., 2000 [supra)). Se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos SSIIIaF ( 5 ' -GGAGGTCTCGGGGATGT-3 ' (SEQ ID NO: 7)) ubicado en el exón 7 y SSIIaR (5 ' -AGCATCACCAGCTGCACGTCCT-3 ' (SEQ ID NO: 8)) ubicado en el exón 8 del gen SSIIIa del trigo para la amplificación por PCR de un producto de 464 bp. Para cada reacción de PCR (20 µ??) , se utilizaron 50 ng de ADN genómico, MgCl2 1.5 m , cada dNTP 0.125 mM, cebadores 10 pmol, glicina-betaína 0.5 M, 1 µL de DMSO y 1.5 U de Hotstar Taq polimerasa. Las reacciones por PCR se llevaron a cabo utilizando 1 ciclo de 95 °C durante 5 minutos, 35 ciclos de 94 °C durante 45 segundos, 58 °C durante 30 segundos y 72 "C durante 1 minuto, 1 ciclo de 72 °C durante 10 minutos y 1 ciclo de 25 °C durante 1 minuto. Se produjo un fragmento de 464 bp en cada amplificación. Los fragmentos de PCR se trataron con 0.5 unidades de fosfatasa alcalina de camarón (USB Corporation, EE. UU.), 2.5 unidades de exonucleasa I y lx tampón de PCR (QIAGEN, Australia) de acuerdo con el protocolo de la USB Corporation y se secuenció utilizando el sistema ABI automático con terminadores colorantes tal como describen los fabricantes.

Los fragmentos de 464 bp tenían una secuencia diferente que proporcionó un sitio de restricción NIalV en un fragmento pero no en el otro. Por lo tanto, el tratamiento de productos de PCR con esta enzima seguido de la electroforesis en geles de agarosa al 2% proporcionaron una forma conveniente de distinguir los genes SSIIIa de las dos variedades parentales. La producción de únicamente el fragmento de ADN de 464 bp indicó la presencia del gen SSIIIa de Himalaya292 y la producción de ambos fragmentos de ADN de 303 bp y 161 bp indicó la presencia del gen SSIIIa de HAG.

EJEMPLO 4: ENSAYOS DE CAMPO PARA MOTANTES DOBLES EN SSIIA-AMOl Para evaluar el rendimiento productivo de los mutantes dobles en SSIIa-amol cuando se cultivan en el campo, se cultivaron 3 líneas mutantes dobles desnudas, 2 líneas mutantes dobles mondadas, 4 mutantes en SSIIa desnudos, 1 línea mutante en SSIIa mondada, 1 línea de cebada natural desnuda (cultivar Torrens) y 2 líneas de cebada natural mondada (cultivares Tantangara, Sloop) en Narrandera y Moree, NSW, Australia en el 2008. Cada una de las líneas de cebada se cultivó tanto en condiciones de irrigación como sin irrigación (tierra seca) en ambos centros. Se cultivaron dos parcelas para cada línea en cada una de las condiciones en ambos centros en un patrón aletorizado. Se plantaron semillas de cebada (120 g) en cada parcela (19 m2) .

Se midió el peso del grano obtenido después de cosechar cada parcela en diciembre del 2008. En el centro de Narrandera, en condiciones de irrigación, las lineas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales desnudas produjeron 2.23 ± 0.16 kg, 1.14 ± 0.57 kg y 1.65 ± 0.79 kg de grano, respectivamente, por parcela. En condiciones de tierra seca, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales desnudas produjeron 0.55 ± 0.34 kg, 0.11 ± 0.12 kg y 0.41 ± 0.16 kg de grano, respectivamente, por parcela.

En el centro de Moree, en condiciones de irrigación, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales desnudas produjeron 1.62 ± 0.72 kg, 0.54 ± 0.40 kg y 2.11 ± 0.08 kg de grano, respectivamente. En condiciones de tierra seca, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales desnudas produjeron 0.88 ± 0.33 kg, 0.38 ± 0.27 kg y 1.14 ± 0.34 kg de granos de cebada, respectivamente.

Por lo tanto, tanto en condiciones de irrigación como sin irrigación en ambos centros, las líneas mutantes dobles desnudas y naturales desnudas produjeron rendimientos de grano similares, que fueron significativamente superiores al rendimiento de los mutantes SSIIa desnudos .

Rendimiento del grano de lineas de cebada mondadas En el centro de Narrandera, en condiciones de irrigación, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales mondadas produjeron 2.77 ± 0.37 kg, 2.09 ± 0.76 kg y 4.39 ± 2.59 kg de grano, respectivamente, por parcela. En condiciones de tierra seca, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales mondadas produjeron 0.60 ± 0.06 kg, 0.35 ± 0.14 kg y 0.59 ± 0.46 kg de grano, respectivamente.

En el centro de Moree, en condiciones de irrigación, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales mondadas produjeron 2.15 ± 0.81 kg, 1.24 ± 0.12 kg y 2.73 ± 0.96 kg de grano, respectivamente, por parcela. En condiciones de tierra seca, las líneas mutantes dobles, mutantes en SSIIa y naturales mondadas produjeron 1.19 ± 0.40 kg, 0.76 ± 0.60 kg y 2.13 ± 0.23 kg de grano, respectivamente, por parcela.

Por lo tanto, tanto en condiciones de irrigación como sin irrigación en ambos centros, las líneas naturales mondadas produjeron más grano que las líneas mutantes dobles mondadas y mutantes en SSIIa mondadas, y los mutantes dobles mondados produjeron más grano que los mutantes en SSIIa mondados .

EJEMPLO 5: PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS ALIMENTARIOS Se recolectó el grano de once líneas de cebada cultivadas en el campo en Yanco, NSW, Australia, en el 2008 y se molieron para producir harina. Las líneas eran 3 mutantes dobles desnudos, 2 mutantes dobles mondados, 3 mutantes en SSIIa que incluyen Himalaya292, 2 líneas naturales (cultivares Tantangara e Himalaya) y 1 mutante en amol (HAG) . El grano recolectado de estas líneas se molió utilizando un molino Quadrumat Jnr. (molino Brabender Quadrumat Jnr., Cyrulla's Instruments, Sídney, NSW Australia) para producir harina que a continuación se tamizó a través de un diámetro de 300 µp?. No se aplicó ningún régimen de ablandamiento antes de moler con el Quadrumat .

Se hornearon dos tipos de pan a pequeña escala (10 g) para cada una de 11 líneas de cebada. Se hornearon dos barras a pequeña escala para llevar a cabo estas pruebas, pero el método se puede adaptar fácilmente para escalas mayores de hasta cantidades comerciales. Un tipo de pan se preparó con 100% harina de cebada como ingrediente, molida como se describió anteriormente, mientras que el otro tipo de pan consistía en una mezcla de un 30% de harina y un 70% de harina de trigo comercial como ingrediente de la harina. Se mezclaron harina (13.02 g) y los demás ingredientes para obtener una masa con el fin de maximizar el tiempo de desarrollo de la masa en un mixógrafo de 35 g. La receta utilizada, basada en los 13.02 g de harina en cada caso, fue: 100% de harina, 2% de sal, 1.5% de levadura seca, 2% de aceite vegetal y 1.5% de mej orador. El nivel de adición de agua se basó en los valores de absorción de agua de la micromezcladora de hoja en forma de Z que se ajustaron para la fórmula completa. El moldeo y la colocación en el molde se llevaron a cabo en pasos de fermentación en dos etapas a 40 °C y con un 85% de humedad ambiental. El horneado se llevó a cabo en un horno Rotel durante 14 min a 190 °C.

Tras hornear, las barras de pan de 10 g se conservaron a -80 °C durante tres semanas para el lote de pan con un 100% de cebada o durante 1 semana para el lote de pan con un 30% de cebada, y después se analizaron para determinar el contenido de AR tal como se describe en el Ejemplo 1 y el nivel de IG. Para determinar el contenido de AR, el procedimiento in vitro determinó el contenido de almidón resistente. Se mezclaron muestras duplicadas de barras de pan de 10 g, junto con los patrones adecuados, con saliva artificial y el bolo resultante se incubó con enzimas pancreáticas y gástricas en condiciones fisiológicas de pH y temperatura. La cantidad de almidón residual en el hidrolizado enzimático se determinó utilizando técnicas enzimáticas y espectrofotométricas convencionales, y el contenido de almidón resistente de la muestra se expresó como un porcentaje del peso de la muestra.

Para determinar el nivel de IG, se empleó un procedimiento in vitro.

Contenido de AR de harinas integrales de cebada El contenido de AR y el nivel de IG se determinaron primero para la harina integral molida de cada uno de los grupos de los genotipos de cebada. El contenido de AR fue 0.9%, 3.5 ± 0.3%, 3.4 ± 0.1%, 1.9% y 0.5 ± 0.1% para la harina integral de mutante en ajnol, mutante doble desnudo, mutante doble mondado, mutante en SSIIa y linea natural, respectivamente (Tabla 1) . Inesperadamente, tanto la harina integral de mutante doble desnudo y mondado contenia un contenido de AR 3.5, 2.3 y 10 veces superior al de la harina integral de mutante en amol, mutante en SSIIa y linea natural, respectivamente. Cabe destacar que las harinas integrales tanto de mutante doble desnudo como mondado contenían significativamente más AR que la harina integral del mutante en SSIIa. No se observó ninguna diferencia significativa desde un punto de vista estadístico en el contenido de AR entre la harina integral de mutante doble desnudo y mutante doble mondado, o entre la harina integral de mutante en ajnol y línea natural. Aunque el nivel de IG difería entre las harinas integrales de los 5 grupos de cebada, no fue significativamente diferente desde un punto de vista estadístico.

Contenido de AR de pan con un 100% de harina de cebada Se determinó el contenido de AR de pan que contenía un 100% de harina de cebada y los resultados se presentan en la Tabla 2. Los análisis mostraron que el contenido de AR en el pan con un 100% de harina integral de cebada como ingrediente de la harina fue 2.2 ± 0.3 %, 5.5 ± 0.1% , 5.6 ± 0.3 %, 2.1 ± 0.4 % y 0.8 ± 0.3% para grano mutante en amol, mutante doble desnudo, mutante doble mondado, mutante en SSIIa y línea natural (Tabla 3) . El análisis estadístico indicó que el pan producido con harina integral de cebada de mutante doble desnudo y mutante doble mondado produjo un contenido de AR significati amente superior al de líneas de cebada mutante en SSIIa, rtiutante en amol y normal (Tabla 3) . No se observó ninguna diferencia significativa en el contenido de AR entre el pan que contenia un 100% de harina de mutantes dobles desnudos y mondados. El pan de mutantes dobles desnudos y mondados produjo un contenido de AR 2.5, 2.5 y 6.7 veces superior al pan producido a partir de cebada de mutante en SSIIa, mutante en amol y normal, respectivamente (Tabla 3) .

Contenido de AR de pan con un 30% de harina de cebada Se determinó el contenido de AR de pan que contenia un 30% de harina de cebada y los resultados se presentan en la Tabla 4. El contenido de AR de pan preparado a partir de harina integral de mutante en ainol, mutante doble desnudo, mutante doble mondado, mutante en SSIIa y linea natural fue 1.9 ± 0.3%, 3.1 ± 0.2%, 3.0 ± 0.1%, 2.0 ± 0.3%, 0.9 ± 0.1%, respectivamente (Tabla 3) . El pan producido con cebada mutante doble desnuda y mutante doble mondada produjo un contenido de AR significativamente superior al del pan producido con grano de cebada mutante en SSIIa, mutante en amol y normal (Tabla 3) . No se observó ninguna diferencia significativa en el contenido de AR entre el pan que contenia un 30% de harina de mutantes dobles desnudos y mondados. El pan de mutantes dobles desnudos y mondados produjo un contenido de AR 1.6, 1.6 y 3.3 veces superior al pan producido a partir de líneas de cebada mutante en SSIIa, mutante en amol y normal, respectivamente (Tabla 3) .

Se calculó el contenido de AR como mg de AR por gramo de almidón para analizar la naturaleza del incremento de AR en pan preparado a partir de mutantes dobles. Estos datos se analizaron para comprobar si el incremento del contenido de AR se debía al incremento del almidón total o a los cambios de la estructura del almidón. Los resultados mostraron que el pan producido con un 100% de harina de cebada de grano de mutante en amol, mutante doble desnudo, mutante doble mondado, mutante en SSIIa y linea natural contenia 41.7, 105.1 ± 2.8, 106.9 ± 3.3, 75.0 ± 8.1 y 16.3 ± 4.5 mg de AR por g de almidón del pan (Figura 4.6). Tanto el pan de mutante doble desnudo como de mutante doble mondado produjo aproximadamente 2.5, 1.4 y 6.5 más AR que el pan de grano de mutante en amol, mutante en SSIIa y linea natural. El análisis estadístico mostró que aunque el pan de los 4 grupos de cebada contenían más AR que el de las líneas naturales, el contenido de AR (mg de AR por g de almidón) del pan de ambos mutantes dobles fue significativamente superior desde un punto de vista estadístico que el de los mutantes en amol y los mutantes en SSIIa (P<0.05). El pan de grano mutante en SSIIa contenía significativamente más AR desde un punto de vista estadístico que los mutantes en ainol.

Nivel de IG de pan con un 100% de cebada Se determinó el nivel de IG de pan que contenía un 100% de harina de cebada de todas las líneas de cebada y los resultados se presentan en la Tabla 2. El nivel de IG de pan de grano de mutante en amol, mutante doble desnudo, mutante doble mondado, mutante en SSIIa y línea natural fue 68.5 ± 2.1, 63.5 ± 4.5, 60.8 ± 4.1, 63.9 .± 10.3, 80.3 ± 2.9, respectivamente (Tabla 7) . El análisis estadístico indicó que el pan de tanto mutante doble desnudo como mondado, y grano de mutante en SSIIa producía un nivel de IG significativamente inferior a las líneas de cebada mutante en amol y normal (Tabla 7) . No se observó ninguna diferencia significativa en el valor de IG entre el pan que contenía un 100% de harina de grano de mutantes dobles desnudos y mondados, y mutantes en SSIIa. El pan de grano de mutantes dobles desnudos y mondados, y mutantes en SSIIa produjo aproximadamente un 80% del nivel de IG de lineas de cebada mutante en amol y normal, respectivamente (Tabla 7) .

Nivel de 16 de pan con un 30% de cebada Se determinó el nivel de IG de pan que contenia un 30% de harina de cebada de todas las lineas de cebada y los resultados se presentan en la Tabla 4. El nivel de IG de pan de mutantes en a ol, mutantes dobles desnudos, mutantes dobles mondados, mutantes en SSIIa y lineas naturales fue 84.5 ± 3.5, 83.2 ± 2.1, 83.5 ± 0.8, 82.3 ± 3.9, 87.8 ± 4.5, respectivamente (Tabla 7) . El valor de IG para pan preparado a partir de los 5 grupos de cebada no fue significativamente diferente desde un punto de vista estadístico.

Conclusiones La harina integral de grano de cebada mutante doble desnuda y mondada contenia significativamente un contenido mayor de AR que la harina integral del grano de mutante en amol, mutante en SSIIa y linea natural. La harina integral de ambos mutantes dobles contenia aproximadamente un contenido de AR 3.5, 1.8 y 7.0 veces superior a la harina integral de mutantes en amol, mutantes en SSIIa y lineas naturales. En un patrón similar, el pan preparado a partir de grano de cebada mutante doble contenia un. contenido de AR significativamente superior que el pan preparado a partir de cebada mutante en SSIIa, mutante en amol y natural. El incremento del contenido de AR no se debía únicamente al incremento de la cantidad de almidón con un contenido alto de amilosa, sino que también a los cambios de la estructura del almidón ya que se observó un incremento del contenido de AR por g de almidón.

El pan de grano de ambos mutantes dobles y de mutante en SSIIa produjo un valor de IG significativamente inferior al del grano de mutante en amol y línea natural. El valor de IG de pan que contenía grano de mutante doble en SSIIa-auiol y grano de mutante en SSIIa fue aproximadamente un 7% y un 20% inferior al de pan que contenia grano de mutante en amol y linea natural cuando el pan se preparó a partir de un 100% de harina de cebada.

EJEMPLO 6: PRODUCCIÓN DE FRUCTANO A GRAN ESCALA Al contener un 10% de fructano, el grano de cebada mutante en SSIIa y amol se puede utilizar para aislar y purificar fructano asi como también otros productos tales como almidón con un alto contenido de amilosa y ß-glucano. Dicha producción a partir de grano que se puede producir fácilmente en agricultura a gran escala será más rentable en comparación con los métodos existentes para la producción de fructano, por ejemplo, los que implican la extracción de inulinas de la achicoria.

La extracción a gran escala de fructano se puede conseguir moliendo el grano, para obtener harina integral y después extraer los azúcares totales, incluidos los fructanos, de la harina al agua. Esto se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y posteriormente la mezcla se centrifuga o filtra. A continuación, el sobrenadante se calienta hasta 80 °C, se centrifuga para eliminar las proteínas y después se seca. Como alternativa, la extracción de harina se puede llevar a cabo utilizando etanol al 80%. Posteriormente se separan las fases utilizando mezclas de agua/cloroformo, y la fase acuosa que contiene los azúcares y el fructano se seca y redisuelve en agua. La sacarosa del extracto preparado de cualquiera de las dos formas anteriores se puede eliminar enzimáticamente añadiendo a-glucosidasa, y a continuación se pueden eliminar ' las hexósas (monosacáridos) mediante filtración en gel para producir fracciones de fructano de varios tamaños. De este modo se produciría una fracción enriquecida en fructano contendría al menos un 80% de fructano.

Tabla 1 Contenido da AR y el nivel da IG da harina intagxal da cebada L.S.D.: es la diferencia menos significativa; las diferencias superiores a esta son significativas (P < 0.05). a, b y c: tomando LSD como base, los valores medios con la misma letra no son significativamente diferentes y con una letra diferente son significativamente diferentes con una diferencia significativa (P < 0.05).

Tabla 2 Contenido da AR y nivel da IG da pan producido utilizando un 100% da harina integral da cabada Tabla 3 Análisis estadístico de los afectos del genotipo sobre el contenido de AR de pan producido con un 30% o un 100% da harina de cebada Nota : contenido de AR 30%: contenido de AR de pan que contenia un 30% de harina de cebada. contenido de AR 100%: contenido de AR de pan que contenia un 100% de harina de cebada.

L.S.D. : es la diferencia menos significativa; las diferencias superiores a esta son significativas (P < 0.05). a, b y c: tomando LSD como base, los valores medios con la misma letra no son significativamente diferentes y con una letra diferente son significativamente diferentes con una diferencia significativa (P < 0.05).

Tabla 4 Contenido de AR y nivel de IG de pan producido con un 30% de harina de cebada Tabla 5 Análisis estadístico da los afectos del genotipo sobre el contenido de AR (mg da AR por g da almidón) da pan producido con un 100% da harina da cebada Tabla 6 Análisis estadístico da los efectos del genotipo sobra el contenido da AR (mg da AR por g de almidón) da pan producido con un 30% da harina da cebada Tabla 7 Análisis estadístico de los efectos del genotipo sobre el nivel de IG de 10 g de pan producido con un 30% o un 100% de harina da cebada Nivel de IG 30%: nivel de IG de pan que contenia un 30% de harina de cebada. .

Nivel de IG 100%: nivel de IG de pan que contenia un 100% de harina de cebada.

L.S.D. : es la diferencia menos significativa; las diferencias superiores a esta son significativas (P < 0.05). a y b: tomando LSD como base, los valores medios con la misma letra no son significativamente diferentes y con una letra diferente son significativamente diferentes con una diferencia significativa (P < 0.05).

Tabla 8 Resumen de los identifícadores de las secuencias - 144 - TABLA 9 Subclasificación da aminoácidos Ácidos Ácido aspártico, Ácido glutámico Bases Aciclicos: Arginina, Lisina; Cíclicos Histidina Cargados Ácido aspártico, Ácido glutámico, Arginina, Lisina, Histidina Pequeños Glicina, Serina, Alanina, Treonina, Prolina Polares/neutros Asparagina, Histidina, Glutamina, Cisteina, Serina, Treonina Polares/grandes Asparagina, Glutamina Hidrófobos Tirosina , Valina, Isoleucina , Leucina Metionina, Fenilalanina , Triptófano Aromáticos Triptófano, Tirosina , Fenilalanina Residuos que Glicina y Prolina influencian la orientación de las cadenas TABLA 10 Sustituciones aminoacídicaa ilustrativas y preferidas Val lie, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu Leu Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

BIBLIOGRAFÍA Adams et al., Anal. Biochem. , 266: 77-84, 1999 Almeida and Allshire, Trends Cell Biol. 15: 251-258, 2005 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997 An, Methods in Enzymology, 153: 292, 1987 Andersson et al, J. Cereal Sci 30: 183-191, 1999 Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, Unidad 19.3 y Capítulo 15, 1994-1998 Ausubel et al., (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 6.3.1-6.3.6., 1989 Ball and Morell, Annu Rev Plant Biol, 54: 207-233, 2003 Ball et al., Cell 86(3): 349-52, 1996 Barker et al., Plant Mol. Biol., 2: 235-350, 1983 Batey et al., Starch 48: 338-344, 1997 Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. París, 316: 1194, 1993 Bernfeld, Araylases aplpha and beta. En: Colowick and Kaplan (ed.), Methods in enzymology, Academic, NY, p. 149, 1955 Bevan et al., Nucí. Acid Res., 11: 369, 1983 Birch, Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 48: 297-326, 1997 Bird et al. Br. J. Nutr. 92: 607-615, 2004b Bird et al., J Nutr, 134: 831-835, 2004a Bourque, Plant Sci. 105: 125-149, 1995 Boyer and Preiss, Carbohydrate Research, 61: 321-334, 1978 Buléon et al., International Journal of Biological Macromolecules, 23: 85-112, 1998 Campbell et al., J Sci Food Agrie 79: 232-236, 1999 Cao et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 373: 135- 146, 2000 Cao et al., Plant Physiol. 120(1): 205-16, 1999 Comai et al., Plant J. 37: 778-786, 2004 Craig et al., Plant Cell, 10: 413-426, 1998 De Framond, Biotechnology, 1: 262, 1983 Deikman et al., EMBO J. , 2: 3315-3320, 1998 DellaPenna et al., Plant Cell, 1: 53-63, 1989 Delvalle et al., Plant J. 43(3): 398-412, 2005 Denyer et al., Plant Physiol. 112(2) :779-85, 1996 Durai et al., Nucleic Acids Research 33(18): 5978-5990, 2005 Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82: 5824, 1985 Fujita et al., Plant Physiol, 144: 2009-2023, 2007 Fujita et al., Plant Physiol. 140: 1070-1084, 2006 Gao et al., Plant Cell, 10: 399-412, 1998 Garfinkel et al., Cell, 27: 143-153, 1983 Greve, J. Mol. Appl. Genet., 1: 499-511, 1983 Harayama, Trends Biotechnol. 16: 76-82, 1998 Hartmann and Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer, 1999 Haseloff and Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988 Hayashi et al., Effects of ion beam irradiation on mutation induction in rice. Cyclotrons and Their Applications 2001, Decimoctava Conferencia Internacional 237-239, 2007 Hedman and Boyer, Biochemical Genetics, 20: 483-492, 1982 Hendrix et al., J. Insect Physiol., 47: 423-432, 2001 Henikoff et al., Plant Physiol. 135: 630-636, 2004 Hinchee et al., Biotech. 6: 915, 1988 Hirose and Terao, Planta, 220: 9-16, 2004 Hoekema et al., Nature, 303: 179, 1983 James et al., Curr Opin Plant Biol, 6: 215-222, 2003 James et al., Plant Cell, 7: 417-429, 1995 Jane et al., Cereal Chem. 76: 629-637, 1999 Joshi, Nucí. Acid Res. 15: 6643, 1987 Kazama et al., Plant Biotechnology 25: 113-117, 2008 im et al., J Cereal Sci, 37: 195-204, 2003 Klein et al., Nature, 327: 70, 1987 Konik-Rose et al., Starch-Stárke, 53: 14-20, 2001 Konik-Rose et al., Theor Appl Genet, 115: 1053-1065, 2007 Kossmann and Lloyd, Crit Rev Plant Sci, 19: 171-226, 2000 Kubo et al., Plant Physiology, 121: 399-409, 1999 Langridge et al., Aust J Agrie Res 52: 1043-1077, 2001 Le Provost et al., Trends in Biotechnology 28(3): 134-141, 2009 Lemieux, Current Genomics, 1: 301-311, 2000 Li et al., Funct Integr Genomics, 3: 76-85, 2003 Li et al., Plant Physiol, 120: 1147-1156, 1999a Li et al., Plant Physiology, 123: 613-624, 2000 Li et al., Theoretical and Applied Genetics, 98: 1208-1216, 1999b Libessart et al. Plant Cell. 7(8): 1117-1127, 1995 Liu et al., Biotechnology and Bioengineering, 106: 97-105, 2010 Lunn and Hatch, Planta 197: 385-391, 1995 Maddelein et al., J Biol Chem. 269(40): 25150-7, 1994 McPherson and Moller (Ed) , BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, 2000 Medberry et al., Plant Cell, 4: 185-192, 1992 Medberry et al., Plant J. 3: 619-626, 1993 Millar and Waterhouse, Funct Integr Genomics, 5: 129-135, 2005 Miura et al., Euphytica, 108: 91-95, 1999 Miura et al. ,Euphytica, 123: 353-359, 2002 Mizuno et al., Journal of Biochemistry, 112: 643-651, 1992 Morell et al., Control of starch biosynthesis in vascular plants and algae. En: Plaxton WC, McManus MT (ed.) Control of primary metabolism in plants. Annual plant reviews, vol 22, Blackwell, Oxford, págs. 258-289, 2006 Morell et al., Euphytica, 119: 55-58, 2001 Morell et al., J Appl Glycosci, 50: 217-224, 2003a Morell et al., Plant, J 34: 173-185, 2003b Morrison and Laignelet, J Cereal Sci, 1: 9-20, 1983 Morrison et al., J Cereal Sci, 2: 257-271, 1984 Myers et al., Plant Physiology, 122: 989-997, 2000 Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970 Niedz et al., Plant Cell Reports, 14: 403, 1995 O'Shea et al., Carbohydr Res, 307: 1-12, 1998 Ohdan et al., J Exp Bo 56: 3229-3244, 2005 Ow et al., Science, 234: 856, 1986 Pasquinelli et al., Curr Opin Genet Develop 15: 200-205, 2005 Perriman et al., Gene, 113: 157-163, 1992 Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183, 1985 Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 126: 1259-68, 1985 Rahman et al., J Cereal Sci, 31: 91-110, 2000 Ramsay et al., Genetics. 156(A): 1997-2005, 2000 Regina et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103: 3546-3551, 2006 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, EE. UU. 1990 Robinson, The Organic Constituents of Higher Plants, Cordus Press, North Amherst, EE. UU., Ejemplo 9, 1980 Roldan et al., Plant J. 49: 492-504, 2007 Ruuska et al., Funct Plant Biol 33: 799-809, 2006 Salomón et al., EMBO J. , 3: 141-146, 1984 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed.). Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1989 Schondelmaier et al., Plant Breeding, 109: 274-281, 1992 Sénior, Biotech. Genet. Engin. Revs . 15: 79-119, 1998 Shimamoto et al., Nature, 338: 274-276, 1989 Shippy et al., Mol. Biotech. 12: 117-129, 1999 Slade and Knauf, Transgenic Res. 14: 109-115, 2005 Smith et al., Nature, 407: 319-320, 2000 Smith, Biojnacrojnoiecules, 2: 335-341, 2001 Stalker et al., Science, 242: 419, 1988 Sun et al., The New Phytologist, 137: 215-215, 1997 Tetlow et al., J Exp Bot, 55: 2131-2145, 2004 Theander et al., J AOAC Int 78: 1030-1044, 1995 Thillet et al., J. Biol. Chem. 263: 12500, 1988 Thompson et al., Carbohydrate Res., 331: 149-161, 2001 Tingay et al., Plant J. 11: 1369-1376, 1997 Topping et al., Starch-Stárke, 55: 539-545, 2003 Veronese et al., Enz. Microbial Tech., 24: 263-269, 1999 Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104: 37-48, 1994 Waterhouse et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 95: 13959-13964, 1998 Yamamori and Quynh, Theor Appl Genet, 100:- 32-38, 2000 Yamamori et al., Theor Appl Genet, 101: 21-29, 2000 Yasui et al., J Cereal Sci, 24: 131-137, .1996 Zhang et al., Plant Physiol. 138: 663-674, 2005 Zwar and Chandler, Planta 197: 39-48, 1995

Claims

REIVINDICACIONES Un grano de cebada que comprende un nivel o una actividad reducida de la proteína SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) . El grano de cebada de la reivindicación 1 que comprende un contenido de almidón de al menos un 43% (p/p) , al menos un 45% (p/p) al menos un 47% (p/p) , al menos un 50% (p/p) o que comprende un contenido de almidón de un 41-65% (p/p) . El grano de la reivindicación 1 o 2 que comprende un contenido de amilosa de al menos un 50% como una proporción del almidón total en el grano. El grano de la reivindicación 3 que comprende un contenido de amilosa de al menos un 60% como una proporción del almidón total en el grano. El grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende un contenido de ß-glucano de un 5-9% (p/p) o superior a un 9% (p/p) . El grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende un contenido de fructano de un 3-11% (p/p) o un 4-11% (p/p) . El grano de la reivindicación 6 donde el fructano comprende un grado de polimerización de aproximadamente 3 a aproximadamente 12. El grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende una mutación en un gen endógeno que codifica un polipéptido con actividad SSIIa, donde la mutación reduce la expresión del gen que codifica SSIIa en una planta de cebada o produce la expresión de SSIIa con un nivel o una actividad reducida. El grano de la reivindicación 8 que es homocigótico para el alelo sex -292. El grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el nivel de SSIIa es reducido por una molécula de ácido nucleico exógena que reduce la expresión de un gen que codifica SSIIa en una planta de cebada. El grano de la reivindicación 10 donde la molécula de ácido nucleico exógena comprende un gen quimérico de silenciamiento génico, una molécula antisentido, una ribozima, una molécula de cosupresión, ARNbc, ARN horquillado o microARN que reduce la expresión de SSIIa endógeno. El grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde el grano comprende además una variación genética que reduce la actividad de un gen amol. El grano de la reivindicación 12 donde la variación genética comprende una mutación en un gen amol. El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que es homocigótico para el alelo amol-AC38. El grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que es grano entero o partido, triturado, pulido, molido, granulado, arrollado o perlado. Una planta de cebada capaz de producir el grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. La harina o harina integral de cebada producida a partir del grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. Un método para producir un producto alimentario o una bebida donde el método comprende: (i) obtener o producir grano de cebada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15; y (ii) procesar el grano para producir el producto. El método de la reivindicación 18 donde el producto se selecciona entre el grupo conformado por harina, harina integral, almidón, salvado, ß-glucano, fructano, un polisacárido no amiláceo y grano partido, triturado, pulido, molido, granulado, arrollado o perlado. El método de la reivindicación 18 o 19 donde el grano de cebada procesado se mezcla con uno o más ingredientes para preparar el producto alimentario o la bebida. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 que comprende además: (iii) comprobar el nivel o el tipo de almidón, el contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacáridos no amiláceos, fibra dietética o almidón resistente en el grano de cebada o el producto de este. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 donde el producto alimentario o la bebida es un grano, harina, cereal de desayuno, galleta, panqué, barrita de muesli, fideo, un agente edulcorante, un aditivo hipocalórico, un agente espesante, una fibra dietética, un agente texturizante, un conservante, un agente probiótico o similar, o cualquier combinación de estos. Un método para producir una planta de cebada que permite producir grano con un nivel o actividad reducida de la proteina SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41%, donde el método comprende: (i) introducir en dicha planta un agente que reduce el nivel o la actividad de la almidón-sintasa lia (SSIIa) endógena en la planta en relación con una planta de control, o una mutación en un gen endógeno que codifica SSIIa en la planta, y (ii) seleccionar la planta de cebada que produce dicho grano y una variación genética que reduce la actividad de un gen amol . El método de la reivindicación 23 que comprende introducir en la planta una variación genética que reduce la actividad de un gen amol. El método de la reivindicación 23 donde el agente comprende una molécula de ácido nucleico que reduce la expresión del gen SSIIa endógeno. El método de la reivindicación 25 donde la molécula de ácido nucleico comprende un gen quimérico de silenciamiento génico, una molécula antisentido, una ribozima, una molécula de cosupresión, ARNbc, ARN horquillado u otra molécula de ácido nucleico exógena que reduce la expresión de SSII endógeno. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 donde el método comprende además comprobar el nivel, la actividad y/o el tipo de almidón, el contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacáridos no amiláceos, fibra dietética o almidón resistente en el grano de cebada o un producto de este, o analizar la planta con uno o más marcadores genéticos. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 donde el nivel o la actividad reducida de la proteina SSIIa es inferior a un 25%, inferior a un 10%, inferior a un 5%, o esencialmente se carece de ella en relación con la de una planta de control, o la planta antes de introducir el agente o la mutación. Un método para producir el grano de cebada de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende los pasos de cultivar una planta de cebada y recolectar el grano. La planta, el grano, la harina o harina integral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que se utilizan o se pueden utilizar en la producción de un producto con el fin de incrementar el nivel de almidón resistente, fibra dietética, carbohidrato hidrosoluble, ß-glucano, fructano o carbohidrato no amiláceo en dicho producto, o para reducir el índice glucémico (IG) de dicho producto. El uso de almidón, ß-glucano o fructano aislado de una planta, grano, harina o harina integral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en un alimento como un agente edulcorante, un aditivo hipocalórico, un agente espesante, una fibra dietética, un agente texturizante, un conservante, un agente probiótico o similares, o cualquier combinación de estos. El uso de grano, harina, harina integral, almidón, ß-glucano o fructano aislado de una planta, grano, harina o harina integral de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la producción de un producto alimentario para incrementar el nivel de almidón resistente, fibra dietética, carbohidrato hidrosoluble, ß-glucano o fructano en dicho producto alimentario o para reducir el índice glucémico (IG) de dicho producto alimentario. El uso de la reivindicación 32 donde se incrementa el nivel de amilosa, ß-glucano y fructano. Un producto alimentario que comprende un ingrediente alimentario en un nivel de al menos un 10%, expresado en peso seco, donde el ingrediente alimentario es un grano de cebada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o harina o harina integral obtenida a partir de este, donde la harina o harina integral comprende un nivel o una actividad reducida de la proteína SSIIa y un contenido de almidón de al menos un 41% (p/p) . El producto alimentario de la reivindicación 34 donde la harina o harina integral comprende un 3-11% de fructano (p/p) o un 4-11% (p/p) de fructano expresado en peso. El producto alimentario de la reivindicación 34 o 35 donde la harina o harina integral comprende un contenido de ß-glucano de un 5-9% (p/p) o superior a un 9% (p/p) . El producto alimentario de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36 donde la harina o harina integral comprende un 50% o un 60% de amilosa como una proporción de almidón total en la harina o harina integral. El producto alimentario de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37 donde el producto se selecciona entre el grupo compuesto por pan, bollos, cereales de desayuno, pastel, galleta, masa, galletas saladas, panqués, pizza, croissants, bagels, pretzels, pasta, fideos, ingredientes para hornear, mezclas para hornear, sopa, salsa, agente espesante, productos de confitería y otros productos a base de harina. El producto de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38 donde la cebada comprende el alelo sex6-292. El uso de un grano o harina aislada de una planta o grano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en el producto de un producto alimentario para incrementar el nivel de almidón contenido de almidón, amilosa, amílopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en el producto alimentario. Un método para identificar una variedad de grano de cebada que tiene niveles elevados de amilosa y uno o más de los siguientes: almidón, contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente: (i) obteniendo grano de cebada cuyo almidón se altera mediante síntesis o catabolismo, (ii) determinando la cantidad de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en el grano, (iii) comparando el nivel en (ii) con el de un grano de control o . grano parental; y (iv) si aumenta el nivel de uno o más de los siguientes: almidón, contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente, en el grano alterado, seleccionando el grano. El método de la reivindicación 41 que comprende además la mutagénesis o transformación de células de la planta antes del paso (i) . Un método para determinar la cantidad de fructano en el grano de cebada que comprende el paso de obtener grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 procesando el grano para extraer el fructano y medir la cantidad de fructano extraído para determinar la cantidad de fructano en el grano. Un método para preparar un alimento o una bebida que comprende mezclar el grano de cebada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o la harina o harina integral de cebada de la reivindicación 17 con otro ingrediente del alimento o la bebida. Un método para proporcionar almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente para mejorar uno o más indicadores de la salud en un mamífero donde el método comprende administrar al mamífero una composición que comprende grano, harina o harina integral de cebada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o el producto alimentario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39. El método de la reivindicación 45 donde el grano, harina, almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente está en forma de un producto alimentario, una bebida o una composición farmacéutica. El método de la reivindicación 45 o 46 donde el indicador o indicadores de la salud son un número mayor de bacterias intestinales beneficiosas, un número menor de focos de criptas aberrantes, absorción de minerales incrementada, nivel reducido de insulina, índice glucémico reducido, carga glucémica reducida, glucosa en sangre reducida, presión arterial reducida, peso corporal reducido, nivel de colesterol en sangre reducido, nivel incrementado de colesterol HDL, densidad ósea incrementada, niveles elevados de calcio, movimiento intestinal más frecuente o perfil cardiovascular en suero sanguíneo mejorado. Un método para paliar uno o más síntomas de una afección asociada con unos niveles bajos de almidón dietético, contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto por via oral grano de la presente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o un producto procesado que comprende el almidón, contenido de almidón, amilosa, amilopectina, ß-glucano, fructano, polisacárido no amiláceo, fibra dietética o almidón resistente obtenidos a partir de dicho grano, durante un tiempo y en condiciones suficientes para paliar uno o más síntomas. El método de la reivindicación 48 donde la afección se selecciona del grupo conformado por diabetes, obesidad, enfermedad cardiovascular, hipertensión, estreñimiento, osteoporosis y cáncer. El método de la reivindicación 48 donde el sujeto es un ser humano.