ES2343618B1 - Polinucleotido que comprende secuencias de gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante rnai. - Google Patents
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Abstract
Polinucleótido que comprende secuencias de
gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante RNAi.
La presente invención se refiere al
silenciamiento especifico de las \alpha (alfa), \beta (beta),
\gamma (gamma) y \omega (omega)-gliadinas de
trigo duro y harinero mediante RNA de interferencia (ARNi) por medio
del empleo de un polinucleótido que se transcribe a un hpRNA
(hairpin RNA). Además, la presente invención también se refiere a un
vector, célula, planta o semilla que comprenden el polinucleótido,
cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretos de
las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de la
expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de
\gamma-gliadinas o el promotor del gen que
codifica para una D-hordeína.
Description
Polinucleótido que comprende secuencias de
gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante RNAi.
La presente invención se refiere al
silenciamiento específico de las \alpha (alfa), \beta (beta),
\gamma (gamma) y \omega (omega)-gliadinas de
trigo duro y harinero mediante RNA de interferencia (ARNi) por medio
del empleo de un polinucleótido que se transcribe a un hpRNA
(hairpin RNA). Además, la presente invención también se
refiere a un vector, célula, planta o semilla que comprenden el
polinucleótido, cuya expresión se dirige de forma específica en
tejidos concretos de las semillas de trigo mediante secuencias
reguladoras de la expresión génica como por ejemplo, el promotor de
un gen de \gamma-gliadinas o el promotor del gen
que codifica para una D-hordeína.
La interferencia de RNA (RNAi) es un sistema de
degradación del RNA mensajero mediado por RNA de doble cadena que
permite el silenciamiento específico de determinados genes. Su
descubriendo ha permitido el diseño de vectores compuestos de un
promotor y señales de terminación, y entre ellos la secuencia del
gen que se desea silenciar, en orientación sentido y antisentido,
separados por una secuencia espadadora de longitud variable.
Los siRNAs (de las siglas en inglés small
interfering RNA, o short interfering RNA) son moléculas
de RNA de doble hebra (dsRNA de las siglas en inglés
double-stranded RNA) de 21-25
nucleótidos (nts), que se originan a partir de un dsRNA precursor
más largo. Los dsRNAs precursores pueden ser de origen endógeno, en
cuyo caso se habla de miRNA (codificados en el genoma del organismo)
o de origen exógeno (como virus o transgenes). Tanto siRNA como
miRNA son dos tipos de RNAi (RNA de interferencia). El RNAi suprime
la expresión post-transcripcional de un determinado
mRNA (de las siglas en inglés messenger RNA) reconocidos por
la secuencia de RNAi.
Cuando una célula recibe un dsRNA precursor (los
RNA de hebra simple no producen este efecto), que puede generarse a
partir de un transgén exógeno, un agente viral o un elemento
genético propio, se fragmenta en siRNAs por la acción de una enzima
denominada Dicer, una enzima citoplásmica de la familia RNAsa III.
Dicer corta el dsRNA en fragmentos de doble cadena de alrededor de
21-25 nucleótidos (siRNA), con el extremo 5'
fosforilado y dos nucleótidos sobresaliendo, sin aparear, en el
extremo 3'. De las dos cadenas del siRNA solo una, denominada hebra
guía, se incorpora en el complejo enzimático RISC
(RNA-induced silencing complex) mientras que
la otra hebra se degrada. Las características termodinámicas del
extremo 5' del siRNA determinan cual de las dos hebras se incorpora
al complejo RISC. Normalmente se incorpora como hebra guía aquella
con menor estabilidad en el extremo 5', bien porque contenga un
mayor contenido en bases AU o bien por apareamientos imperfectos.
Para que se produzca el silenciamiento
post-transcripcional la hebra guía debe ser
complementaria al mRNA que se pretende silenciar. A continuación, el
complejo RISC se une al mRNA complementario de la hebra guía del
siRNA presente en el complejo y se produce el corte del mRNA.
Posteriormente se produce la degradación de los fragmentos
obtenidos. De esta manera, los siRNAs provocan el silenciamiento
post-transcripcional de las secuencias nucleotídicas
diana, de forma que no se obtiene la proteína resultante de la
expresión de estas secuencias.
En trigo, las proteínas del grano, aunque
minoritarias (7-18%) respecto a los hidratos de
carbono (60-75%), son fundamentales para las
propiedades funcionales de la harina. Las principales proteínas del
grano son las gluteninas y las gliadinas, que constituyen el gluten.
Las gliadinas son responsables del desarrollo de la enfermedad
celíaca ya que epítopos (determinantes antigénicos) reconocidos por
las células T intestinales han sido identificados en regiones de
\alpha y \gamma-gliadinas
(Arentz-Hansen, et al., 2002.
Gastroenterology 123:803-809). Las personas
que sufren la enfermedad celíaca tienen intolerancia al gluten. La
intolerancia al gluten se caracteriza por una inflamación crónica de
la parte proximal del intestino delgado, causada por la exposición
de gliadina. Mediante un trigo que tenga muy disminuido el contenido
de gliadinas, se podría elaborar un alimento para celiacos.
Se conocen cuatro tipos de gliadina; \alpha
(alfa), \beta (beta), \gamma (gamma) y \omega (omega). La
supresión de gliadinas de granos de trigo empleando la tecnología de
RNAise ha venido utilizando en los últimos años. Hasta la fecha,
solamente se ha conseguido suprimir una parte de las gliadinas. Por
ejemplo, mediante el empleo de construcciones genéticas que dan
lugar a RNAi tipo hairpin (horquilla), cuya estructura es:
Promotor-Secuencia
sentido-Espaciador-Secuencia
antisentido-Terminador, se han conseguido eliminar
gliadinas del tipo \alpha (Folck et al., 2005. XII
International Conference on Plant Embryology. Oral presentation) o
del tipo \gamma (Gil-Humanes et al. 2008.
Journal of Cereal Science
48(3):565-568), casi por completo, pero no se
han conseguido eliminar todos los tipos de gliadinas de manera
eficaz.
La obtención de plantas que tengan muy reducida
la cantidad de gliadinas en sus semillas presenta dificultades
técnicas como son, en primer lugar, el número elevado de genes que
codifican para gliadinas y, en segundo lugar, que las plantas de
trigo son hexaploides. Conseguir una transformación estable en las
plantas de trigo presenta más dificultades que la transformación de
cualquier otra planta con menor número de copias del genoma.
La presente invención se refiere a un
polinucleótido que comprende dos pares de secuencias donde cada
subsecuencia se combina en un orden determinado para dar lugar a una
secuencia cuya transcripción a RNA sea capaz de originar un hpRNA
(haipin RNA), es decir, un RNA en forma de horquilla, un RNA
de doble hebra que será procesado por endoribonucleasas descritas en
el estado de la técnica, por mediación de las cuales se generan los
siRNA que producen el silenciamiento
post-transcripcional de todos los mRNA (RNA
mensajeros) que codifican para todos los tipos de gliadinas de
trigo. Para ello, las cuatro subsecuencias son; la secuencia en
orientación sentido de las \omega-gliadinas, la
secuencia en orientación sentido de las \alpha, \beta y
\gamma-gliadinas y las dos secuencias anteriores
en orientación
antisentido.
antisentido.
Mediante este polinucleótido, cuya expresión se
dirige de forma específica en tejidos concretos de las semillas de
trigo mediante secuencias reguladoras de la expresión génica como
por ejemplo, el promotor de un gen de
\gamma-gliadinas o el promotor del gen que
codifica para una D-hordeína, se consigue el
silenciamiento post-transcripcional de todos los
genes de especies de trigo blando y de especies de trigo duro de
manera eficaz y sinérgica, ya que se consiguen silenciar más
cantidad de genes de gliadinas cuando se comparan con los resultados
de silenciamiento de \alpha y \gamma-gliadinas
mediante hpRNA que se describen en el estado de la técnica. Ello se
debe fundamentalmente al diseño específico de las subsecuencias en
orientación sentido y antisentido cuyos siRNA generados hibridan con
todos los mRNA de las \alpha, \beta, \gamma y
\omega-gliadinas de trigo en combinación con
promotores de las gliadinas con niveles de expresión más elevados,
inducibles en tejidos específicos de la semilla de trigo. Este
diseño se ha llevado a cabo mediante la identificación de grupos de
gliadinas que contienen epítopos reconocidos por las células T
humanas, de modo que el silenciamiento de las proteínas que los
contienen da lugar a semillas de trigo con las que se pueden obtener
productos aptos para personas que presentan alergia al gluten.
En la presente invención se emplean los términos
DNA o RNA para referirse al ácido desoxirribonucleico o al ácido
desoxirribonucleico respectivamente.
En este sentido, un aspecto de la presente
invención es un polinucleótido con al menos un 90% de identidad con
respecto a una secuencia que comprende dos pares de secuencias
(a1-a2) y (b2-b1) separadas por una
secuencia espadadora donde:
- a.
- las secuencias a1, a2, b1 y b2 son diferentes entre sí y se seleccionan de entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, de la siguiente forma:
- b.
- si a1 es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4, b1 es SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 1 y a2 es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y
- c.
- si a1 es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, b1 es SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 2 y a2 es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la presente invención es un
polinucleótido que comprende dos pares de secuencias
(a1-a2) y
(b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora donde las secuencias a1, a2, b1 y b2 se describen en los apartados (a) a (c) del aspecto anterior.
(b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora donde las secuencias a1, a2, b1 y b2 se describen en los apartados (a) a (c) del aspecto anterior.
Las secuencias a1-a2 y
b2-b1 (en adelante, pares de secuencias de la
invención), están unidas formando una secuencia lineal y continua de
nucleótidos, a su vez, ambos pares están unidos entre sí por medio
de una secuencia espaciadora cuya longitud es de al menos un
nucleótido. Preferiblemente la secuencia espaciadora es una
secuencia no codificante que es eliminada tras el procesado del
dsRNA formado. La secuencia espaciadora puede ser parte de una
secuencia de un intrón de un gen. La función de la secuencia
espadadora es actuar de bisagra de los pares de secuencias descritos
para que se pueda producir el apareamiento o hibridación de las
secuencias de RNA codificadas por el polinucleótido.
El polinucleótido tiene, al menos, un 90% de
identidad con la secuencia que comprende los pares de secuencias de
la invención. De este modo se contemplan las modificaciones en
alguno de los nucleótidos que constituyen los pares de secuencias,
hasta llegar a un porcentaje de un 90% de identidad con respecto a
la secuencia original, cuya composición nucleotídica se ha definido
en este aspecto.
SEQ ID NO: 1 es la secuencia en orientación
sentido que contiene parte del fragmento que codifica los epítopos
de \omega-gliadinas reconocidos por las células T
humanas que dan lugar a una respuesta inmune en personas que padecen
enfermedad celíaca. SEQ ID NO: 2 es la secuencia en orientación
sentido que contiene parte del fragmento que codifica los epítopos
de \alpha, \beta, y \gamma-gliadinas. SEQ ID
NO: 3 es la secuencia antisentido de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 es
la secuencia antisentido de SEQ ID NO: 1.
El polinucleótido de la invención da lugar a un
RNA donde los dos pares de secuencias hibridan entre sí formando una
horquilla. Por tanto, según estos dos primeros aspectos de la
presente invención, las combinaciones de secuencias mediante las
cuales pueden obtenerse horquillas de RNA se representan en la tabla
1 y en la tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la presente
invención, el polinucleótido comprende dos pares de
secuencias
(a1-a2) y (b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora donde a1 es SEQ ID NO: 1, a2 es SEQ ID NO: 2, b2 es SEQ ID NO: 3 y b1 es SEQ ID NO: 4.
(a1-a2) y (b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora donde a1 es SEQ ID NO: 1, a2 es SEQ ID NO: 2, b2 es SEQ ID NO: 3 y b1 es SEQ ID NO: 4.
Según otra realización preferida, el
polinucleótido comprende dos pares de secuencias
(a1-a2) y (b2-b1) donde la secuencia
espaciadora es SEQ ID NO: 5. La secuencia SEQ ID NO: 5 es un
fragmento de un intrón del gen Ubi1 que codifica para la
Ubiquitina de maíz. Un intrón es una región del DNA que es eliminada
del transcrito primario de RNA mediante un proceso que se denomina
splicing, es decir, el intrón no codifica para ninguna
secuencia de una proteína. La ubiquitina es una proteína cuya
función es la de marcar otras proteínas para su destrucción.
Otra realización preferida es un polinucleótido
que además comprende una secuencia reguladora de la expresión génica
unida funcionalmente a su extremo 5'. En la presente invención, el
término "secuencia reguladora de la expresión génica" hace
referencia a una secuencia de ácidos nucleicos que tenga efecto
sobre la funcionalidad del gen en lo que se refiere al comienzo de
la transcripción de una secuencia de DNA o al inicio de traducción
de una secuencia de RNA u otras secuencias no descritas. A modo de
ejemplo, entre las secuencias reguladoras de la expresión génica
contempladas en la presente invención están los promotores y otras
menos comunes como determinados intrones. La secuencia reguladora se
une al extremo 5' del polinucleótido de la presente invención de
forma funcional, es decir, que es capaz de dirigir la expresión del
polinucleótido con una intensidad y localización que dependen de la
propia secuencia reguladora.
Según una realización más preferida, la
secuencia reguladora de la expresión génica es SEQ ID NO: 6 y/o SEQ
ID NO: 7. La secuencia SEQ ID NO: 6 corresponde con la secuencia de
un promotor del gen \gamma-gliadina que presenta
una duplicación en una caja prolina. SEQ ID NO: 7 corresponde con la
secuencia de un promotor del gen D-Hordeína (la
secuencia nucleotídica de este gen tiene un número de acceso
AY998009 y pertenece a la especie Hordeum chilense). Ambos
promotores se expresan en el endospermo de las semillas.
También se contemplan las secuencias
complementarias de cualquiera de los polinucleótidos de la presente
invención.
En adelante, para referirse a cualquiera de los
polinucleótidos anteriores, se usará el término "polinucleótidos
de la invención" o "polinucleótidos de la presente
invención".
Otro aspecto de la presente invención es una
secuencia de RNA, codificada por cualquiera de los polinucleótidos
de la invención, capaz de formar un hpRNA donde la secuencia
codificada por el par a1-a2 híbrida completamente
con la secuencia codificada por el par b2-b1.
Un hpRNA (del inglés hairpin RNA) es una
horquilla formada por la hibridación de las secuencias transcritas.
En la presente invención, para la síntesis de las secuencias
transcritas se ha usado como molde el polinucleótido de la invención
donde los pares de secuencias a1-a2 y
b2-b1 hibridan completamente entre sí, tal como se
observa en la figura 1B. Un hpRNA es un RNA de doble hebra (dsRNA)
que es cortado por una endoribonucleasa, por ejemplo, la
endoribonucleasa Dicer, dando como resultado fragmentos de alrededor
de 21-25 nts. Estos fragmentos se conocen como
siRNA. Tal como se ha descrito anteriormente, los siRNAs provocan el
silenciamiento post-transcripcional de las
secuencias nucleotídicas diana, de forma que no se obtiene la
proteína resultante de la expresión de las secuencias de mRNA.
Un aspecto más de la presente invención es al
menos un siRNA generado a partir de la secuencia del hpRNA según el
aspecto anterior. El siRNA también se puede denominar RNAi. El siRNA
es un RNA de doble hebra de entre 21 y 25 nucleótidos, pero sin
limitarse a este número de nucleótidos, que se genera a partir de la
secuencia del hpRNA de la invención. En la presente invención, al
definir el número de nucleótidos aproximado (de alrededor de 21 y 25
nucleótidos) del siRNA se entiende que hay otra hebra complementaria
a esa secuencia, es decir, que se puede hablar indistintamente de
nucleótidos o pares de bases (pb).
Como se ha descrito, la enzima Dicer corta el
dsRNA en fragmentos de doble cadena de alrededor de
21-25 nucleótidos (siRNA), con el extremo 5'
fosforilado y dos nucleótidos sobresaliendo, sin aparear, en el
extremo 3'. De las dos cadenas del siRNA solo una, denominada hebra
guía, se incorpora en el complejo enzimático RISC mientras que la
otra hebra se degrada. Las características termodinámicas del
extremo 5' del siRNA determinan cual de las dos hebras se incorpora
al complejo RISC. Normalmente se incorpora como hebra guía aquella
con menor estabilidad en el extremo 5'. Para que se produzca el
silenciamiento post-transcripcional, la hebra guía
debe ser complementaria al mRNA que se pretende silenciar. A
continuación, el complejo RISC se une al mRNA complementario de la
hebra guía del siRNA presente en el complejo y se produce el corte
del mRNA.
Otro aspecto de la presente invención es un
vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos
de la invención. En adelante, "vector de la invención" o
"vector de la presente invención".
El término "vector" se refiere a un
fragmento de DNA que tiene la capacidad de replicarse en un
determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de
vehículo para multiplicar otro fragmento de DNA que haya sido
fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de
DNA que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención,
el vector comprende el polinucleótido de la invención que fusionado
al mismo puede replicarse en el huésped correspondiente. Los
vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores
virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con
la definición realizada de vector.
Un aspecto más de la presente invención es una
célula aislada transfectada con el vector de la invención. En
adelante, "célula de la invención" o "célula de la presente
invención". El término "célula" tal como se entiende en la
presente invención hace referencia a una célula procariótica o
eucariótica. La célula puede ser una bacteria capaz de replicar un
DNA ajeno transformado como por ejemplo cualquiera de las cepas de
la especie Escherichia coli o una bacteria capaz de
transferir el DNA de interés al interior de una planta como por
ejemplo Agrobacterium tumefaciens. Preferiblemente, la célula
hace referencia a una célula eucariótica vegetal y dentro de este
grupo, más preferiblemente, a aquellas células pertenecientes al
reino Plantae. Así pues, en el caso de que la célula sea
vegetal, el término célula comprende, al menos, una célula del
parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o
indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un
protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).
El término "transfección" hace referencia a
la introducción de material genético externo en células mediante
plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de
transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término
transfección para métodos no-virales es usado en
referencia a células eucarióticas de mamífero, mientras que el
término transformación se prefiere para describir las transferencias
no-virales de material genético en bacterias y
células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas. En el
caso de la presente invención, el término transfección es
equivalente al término transformación.
Otro aspecto de la presente invención es una
planta modificada genéticamente que comprende la célula de la
invención. El término "planta" engloba cada una de las partes
de la misma, que pueden ser conservadas o cultivadas de forma
aislada o en combinación, así como el germoplasma. El germoplasma
queda definido por aquel material biológico que contiene la
variabilidad genética intraespecífica o por los materiales genéticos
que pueden perpetuar una especie o una población de un organismo
(ver más adelante semillas, propágulos o progenie). La planta debe
comprender la célula de la presente invención de forma que se
exprese en un tejido específico (en un momento concreto del
desarrollo vegetativo o dependiendo de las condiciones ambientales
en donde se desarrolla) o de forma constitutiva o de forma ectópica
(que se expresa en otras células o tejidos diferentes de las
habituales y esperadas).
La planta de la invención puede contener el
polinucleótido de la invención en homocigosis, heterocigosis o
hemicigosis.
Según una realización preferida, la planta
pertenece al género Triticum. La planta se selecciona de la
lista que comprende, pero sin limitarse, Triticum aestivum, T.
aethiopicum, T. araraticum, T. boeoticum, T. carthlicum, T.
compactum, T. dicoccoides, T. dicoccum, T. durum, T. ispahanicum, T.
karamyschevii, T. macha, T. militinae, T. monococcum, T. polonicum,
T. repens, T. spelta, T. sphaerococcum, T. timopheevii, T.
turanicum, T. turgidum, T. urartu, T. vavilovii o T.
zhukovskyi.
Según otra realización preferida, la planta es
de la especie Triticum aestivum o Triticum turgidum.
Según otra realización preferida la planta pertenece al cultivar
Bobwhite o al cultivar Don Pedro. Más preferiblemente se seleccionan
los cultivares BW208 y BW2003 (Bobwhite) que pertenecen a la especie
de trigo Triticum aestivum L. ssp aestivum y la
variedad Don Pedro pertenece a la especie de trigo Triticum
turgidum L. ssp durum.
Bobwhite es el nombre del cultivar, obtenido en
el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo
(CIMMYT). BW208 y BW2003, son diferentes líneas de Bobwhite. Don Pedro es una variedad de trigo duro también del CIMMYT. Bobwhite y Don Pedro son variedades públicas.
(CIMMYT). BW208 y BW2003, son diferentes líneas de Bobwhite. Don Pedro es una variedad de trigo duro también del CIMMYT. Bobwhite y Don Pedro son variedades públicas.
La planta de la invención puede conseguirse por
transformación genética de células vegetales mediada por biolística,
Agrobacterium tumefaciens o cualquier otra técnica que
permita la integración del polinucleótido de la invención en el DNA
de la planta, ya sea éste genómico, cloroplástico o mitocondrial
seguida, aunque no necesariamente, de un programa de regeneración
in vitro adecuado a las características y necesidades de la
especie vegetal transformada. Asimismo, la planta también puede
conseguirse por transferencia de cualquiera de las secuencias de la
invención por cruzamiento, es decir, empleando polen de la planta de
la invención para polinizar cualquier otra planta que no contenga el
polinucleótido de la invención o polinizando los gineceos de plantas
que contengan el polinucleótido de la invención con otro polen de
plantas que no contengan estas secuencias. Los métodos para
conseguir la planta de la invención no se limitan exclusivamente a
los métodos descritos en este párrafo, por ejemplo, se podría llevar
a cabo la transformación genética de células germinales de espigas
tal como se ha mencionado pero sin necesidad de tener que regenerar
una planta posteriormente (ver más adelante). Asimismo también se
incluye la planta que comprende la célula de la presente invención
de forma estable o de forma transitoria.
Otro aspecto de la presente invención es una
semilla que procede de cualquiera de la plantas de la invención. En
adelante, "semilla de la invención" o "semilla de la presente
invención".
Un aspecto más de la presente invención es un
grano de polen, propágulo, progenie o parte de la planta que procede
de cualquiera de las plantas de la invención.
En la presente invención se tiene en cuenta el
polen como transmisor de los caracteres genéticos y fenotípicos, que
puede llevarse a cabo por la polinización de cualquier variedad
vegetal compatible con el polen al que se hace referencia. De este
modo se consigue una planta que comprende el polinucleótido de la
presente invención y, tras los respectivos cruces y/o selecciones,
se puede obtener una planta en la que la secuencia está integrada de
forma estable (aunque también pueden expresarse de forma
transitoria) y en un número de copias adecuado para obtener los
mismos caracteres deseables en las posteriores generaciones.
Los propágulos son partes de la planta que
permiten la propagación o reproducción asexual en vegetales, por la
que se obtienen nuevas plantas u órganos individualizados. Los
tejidos de la porción separada deben recuperar la condición de
meristemos para producir todo el conjunto de órganos de la planta.
El propágulo se selecciona, pero sin excluir, de la lista que
comprende estolones, rizomas, tubérculos o bulbos.
El término "progenie" hace referencia al
resultado de la reproducción, es decir, el individuo o individuos
producidos mediante la intervención de uno o más individuos
parentales. Por ejemplo, la progenie de las plantas, obtenida
mediante reproducción sexual, son las semillas, sin embargo la
progenie de una planta puede ser cualquier célula resultante de la
fusión de cualquier contenido celular, plasto, compartimento
celular, DNA o cualquiera de sus combinaciones. En los procesos de
división celular (como por ejemplo en el cultivo in vitro) la
progenie son las células resultantes de la división.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
del polinucleótido, vector o célula de la invención para el
silenciamiento de alfa, beta, gamma y omega gliadinas de
Triticum spp.
Tal como se demuestra en el ejemplo 2 de la
presente invención, la integración del polinucleótido de la
invención en el genoma de plantas de trigo de dos genotipos de trigo
harinero (Triticum aestivum L.); cultivar Bobwhite (BW208 y
BW2003), y uno de trigo duro (Triticum turgidum ssp
durum); cultivar Don Pedro, produce el silenciamiento de las
alfa, beta, gamma y omega-gliadinas de las semillas
de plantas transformantes (Fig. 3, Fig. 4 y Fig. 5).
Un aspecto más de la presente invención es el
uso de la semilla de la invención para preparar una composición
alimenticia (en adelante "composición de la invención" o
"composición de la presente invención"). La composición
alimenticia se prepara, por ejemplo, pero sin limitarse, a partir de
la harina y/o sémola de las semillas de la invención en combinación
o no con otras harinas y/o sémolas, u otros compuestos.
El término "harina" según se entiende en la
presente invención, es el producto obtenido de la molturación de
cualquier semilla de plantas del género Triticum despojado en
mayor o menor grado del salvado o la cascarilla de la semilla.
\newpage
El término "sémola" hace referencia a la
harina gruesa (semillas de trigo poco molidas), es decir, fragmentos
de endospermo con una cantidad variable de cascarilla de
semilla.
El alimento preparado se selecciona, pero sin
limitarse, de la lista que comprende pan, productos de bollería,
productos de pastelería, productos de repostería, pasta alimenticia,
masa alimenticia, cereales, bebidas o lácteos.
Otro aspecto de la invención es el uso de la
composición de la invención para preparar un alimento funcional,
complemento vitamínico o complemento nutricional. Tal como se
entiende en la presente invención, un alimento funcional cumple una
función específica como puede ser la de mejorar la dieta de las
personas que lo consumen. Para ello al alimento funcional se le
puede agregar un complemento vitamínico y/o complemento
nutricional.
El alimento que comprende la composición
alimentaria de la presente invención puede ser consumido incluso por
personas que tienen alergias al gluten, es decir, que padecen la
enfermedad celiaca.
Un aspecto más de la presente invención es un
método para la obtención de la planta de la invención, que
comprende:
- a.
- Seleccionar una parte de la planta,
- b.
- transfectar las células de la parte de la planta del apartado (a) con el vector según la reivindicación 9,
- c.
- seleccionar la célula transfectada del apartado (b) que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
- d.
- regenerar al menos una planta procedente de la célula seleccionada en el apartado (c),
- e.
- seleccionar una o varias plantas regeneradas según el apartado (d) donde el polinucleótido se transcribe a un hpRNA,
- f.
- seleccionar una o varias plantas obtenidas según el apartado (e) que presentan silenciamiento de las alfa, beta, gamma y omega gliadinas en sus semillas.
En el caso de las plantas de trigo se selecciona
preferiblemente el escutelo para ser transfectado por el vector de
la invención. La inserción del polinucleótido de la presente
invención en un vector se puede llevar a cabo por medio de los
métodos de clonación que forman parte del conocimiento general
común, mediante corte del polinucleótido y el vector con enzimas de
restricción (digestión) y su posterior ligación, de forma que la
secuencia del vector integre el polinucleótido de la invención. El
vector ha sido definido en un párrafo anterior.
La selección del vector que comprende la
secuencia de la invención escogida, puede llevarse a cabo mediante
técnicas como;
- Selección de células que contengan los
vectores de la invención mediante la adición de antibióticos al
medio de cultivo. La resistencia de estas células a sustancias como
los antibióticos está producida por la síntesis de moléculas
codificadas por una secuencia contenida en la secuencia del
vector.
- Digestión con enzimas de restricción mediante
las cuales se obtenga un fragmento de alguna de las secuencias de la
invención insertada en el vector.
La célula se obtiene de cualquier tipo de
cultivo microbiológico (por ejemplo E. coli o
Agrobacterium tumefaciens) o tejido vegetal.
La transformación genética de las células se
lleva a cabo por medio de técnicas que forman parte del conocimiento
general común, como por ejemplo, electroporación, transformación
genética mediada por biolística, Agrobacterium tumefaciens o
cualquier otra técnica que permita la integración de cualquiera de
las secuencias de la invención en el DNA de la célula.
Preferiblemente la transformación se lleva a cabo por medio de
biolística. Mediante estas técnicas se consigue introducir, de forma
estable, un vector que incluye cualquiera de las secuencias de la
invención, de forma que, tras sucesivas divisiones de la célula, la
secuencia incorporada sigue expresándose. También se incluyen las
células que comprenden cualquiera de las secuencias de la invención
de forma transitoria.
La célula transformada con un vector que incluye
cualquiera de los polinucleótidos de la invención puede incorporar
la secuencia en alguno de los DNA de la célula; nuclear,
mitocondrial y/o cloroplástico, en este caso se suele insertar el
DNA, que contiene, entre otras secuencias, el polinucleótido de la
invención. La selección de la célula que ha incorporado cualquiera
de las secuencias de la invención se lleva a cabo por medio de la
adición de antibióticos al medio de cultivo que suministra
nutrientes a las mismas. La resistencia de estas células a
sustancias como los antibióticos o herbicidas está producida por la
síntesis de moléculas codificadas por una secuencia contenida en la
secuencia del DNA del vector. También se puede seleccionar la célula
que comprende el polinucleótido de la invención mediante cualquier
otra técnica que permita discriminar su presencia o ausencia y/o su
expresión.
Las células vegetales seleccionadas, pueden
someterse a un programa de organogénesis o embriogénesis somática
mediante el cual se da lugar a una planta completa que contiene el
material genético de la célula original de la que procede. Esto es
posible gracias a que las células vegetales son totipotentes, es
decir, mediante la combinación hormonal adecuada se las puede
desdiferenciar y originar células embrionarias, que al contener una
copia íntegra del material genético de la planta a la que
pertenecen, tienen el potencial para regenerar una nueva planta
completa. Además son necesarias condiciones de luz y temperatura
idóneas para cada especie vegetal. Una vez que se ha regenerado la
planta procedente de la célula vegetal seleccionada, se puede llevar
a cabo un análisis de la presencia y/o de la expresión de la
secuencia nucleotídica que codifica para el polinucleótido de la
invención o de cualquier otra secuencia de la presente invención
(secuencia promotora, etc.).
El método comprende, además, la selección de una
planta que presenta un silenciamiento sustancial de las alfa, beta,
gamma y omega gliadinas en sus semillas. Preferiblemente se
seleccionan las plantas que presentan un silenciamiento casi
completo o completo de todas las gliadinas de las semillas. La
reducción del contenido total de gliadinas respecto de una planta
control (planta que no comprende el polinucleótido de la invención)
es mayor o igual del 90%. Preferiblemente las plantas control no
contienen el polinucleótido de la invención en la célula vegetal. El
control también puede ser una planta tipo salvaje antes de ser
transformadas, que ha pasado por los mismos pasos de cultivo in
vitro que las plantas de la invención o que no ha pasado por
estos pasos de cultivo.
Las células transfectadas pueden ser células
germinales de la espiga de la planta y, en este caso, se regeneraría
al menos una planta procedente de las semillas generadas por la
citada espiga de la planta y se seleccionaría al menos una planta
que presente silenciamiento de las alfa, beta, gamma y omega
gliadinas en sus semillas.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Muestra la estructura del
polinucleótido de la invención.
La figura A muestra un polinucleótido que
comprende los pares de secuencias a1-a2 y
b2-b1, separados por una secuencia espadadora (E) y
cuya expresión está dirigida por una secuencia reguladora de la
expresión génica (R).
La figura B muestra el hpRNA resultante de la
transcripción del polinucleótido representado en la figura A en el
que se forma una horquilla donde las secuencias Sec a1, a2, b2 y b1
hibridan tal como se describe. Posteriormente, este RNA es
procesado, produciéndose una nueva secuencia de RNA de doble hebra
(dsRNA). El último paso representado se refiere al fraccionamiento
de la secuencia anterior por medio de enzimas como por ejemplo la
enzima Dicer de modo que se forman secuencias de RNA de doble hebra
de unos 21-25 nucleótidos, llamados siRNA (small
interfering RNA).
Fig. 2. Muestra un ejemplo concreto del
polinucleótido de la invención.
En este caso, la secuencia R es una secuencia
promotora del gen de gamma-gliadina
(\gamma-Gliadina) o de D-Hordeína.
La secuencia E es un fragmento de un intrón del gen de la Ubiquitina
de maíz. NOSt es una secuencia terminadora de la transcripción. Este
polinucleótido se inserta, en este ejemplo concreto, en un vector
pUC18 que tiene un gen de resistencia a ampicilina (APr).
Fig. 3. Muestra la separación e
identificación de gliadinas de semillas de plantas de la variedad de
trigo BW208, por las técnicas A-PAGE y
MALDI-TOF, transformadas con el polinucleótido de la
invención.
La figura A muestra la separación mediante
A-PAGE de las gliadinas de la muestra de semillas de
una línea de trigo harinero control (Triticum aestivum L.
ssp. aestivum) variedad BW208 y una línea de trigo harinero
del mismo genotipo transformada con el vector
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma
(B377-2-3). Se indican los grupos de
gliadinas que se obtienen en la separación.
La figura B muestra un análisis de gliadinas por
MALDI-TOF de una muestra de semillas de una línea de
trigo harinero control (Triticum aestivum L. ssp.
aestivum) variedad BW208 y una línea de trigo harinero del
mismo genotipo transformada con el vector
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma. En la
gráfica correspondiente a la línea control se indican las diferentes
fracciones de alfa (\alpha), beta (\beta), gamma (\gamma) y
omega (\omega)-gliadinas. El eje X representa la
relación (m/z) entre la masa de un ión dado (m) y el número de
protones que contiene (z).
Fig 4. Muestra la separación e identificación
de gliadinas de semillas de plantas de la variedad de trigo BW2003,
por la técnica A-PAGE, transformadas con el
polinucleótido de la invención.
Separación de gliadinas en geles
A-PAGE de una línea de trigo harinero control
(Triticum aestivum L. ssp. aestivum) variedad BW2003 y
una línea de trigo harinero del mismo genotipo transformada con el
vector pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma. Se
indican los grupos de gliadinas que se obtienen en la
separación.
Fig. 5. Muestra la separación e
identificación de gliadinas de semillas de plantas de la variedad de
trigo duro Don Pedro, por la técnica A-PAGE,
transformadas con el polinucleótido de la invención.
Separación de gliadinas en geles
A-PAGE de una línea de trigo duro control
(Triticum turgidum L. ssp durum) variedad Don Pedro y
una línea de trigo duro del mismo genotipo transformada con el
vector pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma. Se
indican los grupos de gliadinas que se obtienen en la
separación.
Fig. 6. Muestra la separación e
identificación de gliadinas de semillas de plantas de la variedad de
BW208, por la técnica A-PAGE, transformadas con el
polinucleótido de la invención.
Separación de gliadinas en geles
A-PAGE de una línea control BW208 y tres semillas de
una línea (B382-4-1) del mismo
genotipo transformada con el vector
pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma. Se indican
los grupos de gliadinas. Nótese que el promotor que contiene este
vector es promotor D-Hordeína (SEQ ID NO: 7).
Fig. 7. Muestra el análisis por Western Blot
de dos líneas de trigo harinero (Triticum aestivum L.)
transformadas con el vector
pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma.
A: Las gliadinas de tres granos de la línea
B382-4-1, denotados como I1, I2, I3,
del genotipo BW208 se han separado en geles SDS e hibridado con el
anticuerpo monoclonal R5 específico de gluten.
B: Las gliadinas de dos granos de la línea
B374-6-2, denotados como O2 y O3,
del genotipo BW2003 se han separado en geles SDS e hibridado con el
anticuerpo monoclonal R5 específico de gluten.
Los números a la izquierda de A indican el peso
molecular en KDa tanto para A como para B.
Fig. 8. Muestra el análisis por Western Blot
de dos líneas de trigo harinero (Triticum aestivum L.) de la
variedad BW208 transformadas con el vector
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma.
Las gliadinas de tres granos de la línea
transgénica B375-3-1, denotados como
A1, A2, A3 y las gliadinas de dos granos de trigo de la línea
transgénica B377-2-3, denotados
como C1 y C2, ambas del genotipo BW208 se han separado en geles SDS
e hibridado con el anticuerpo monoclonal R5 específico de
gluten.
Los números a la izquierda de la figura indican
el peso molecular en KDa.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la
construcción del polinucleótido de la invención, la generación de
plantas de trigo de 3 variedades distintas transformadas con el
vector de la invención y los análisis del contenido de gliadinas por
las técnicas A-PAGE y MALDI-TOF.
Las secuencias de ADN depositadas en el
Genebank pertenecientes a \alpha/\beta/\gamma y
\omega-gliadinas de trigo se alinearon por
separado y se identificaron las regiones que presentaban un mayor
grado de homología. A partir de estos alineamientos se seleccionó
una secuencia de 170 pb de
\alpha/\beta/\gamma-gliadinas y otra de 191pb
de \omega-gliadinas y se diseñaron los cebadores
Alpha_hp-F (SEQ ID NO: 8) y
Alpha_hp-R (SEQ ID NO: 9) para la amplificación del
fragmento \alpha/\beta/\gamma y los cebadores
Omega_III-F (SEQ ID NO: 10) y
Omega_III-R (SEQ ID NO: 11) para la amplificación
del fragmento \omega (Tabla 1). Las condiciones de PCR para ambos
fragmentos fueron: cDNA de T. aestivum cv Bobwhite
sintetizado a partir de 50 ng de RNA total extraído de granos
inmaduros, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,2 mM dNTPs, 0.2 \muM de cada
cebador, 1x buffer y 0,625 unidades de una mezcla de polimerasas en
una relación 100:1 de Tth (Thermus thermophilus) y
Pfu (Pyrococcus furiosus) (BIOTOOLS, Madrid,
España) en una reacción final de 25 \mul. Las condiciones de los
ciclos de PCR fueron: un paso inicial de 94ºC 5 min, 35 ciclos de
94ºC 30 seg, 55ºC 30 seg y 72ºC 30 seg; y una extensión final de
72ºC 4 min en un termociclador GeneAmp PCR system 9700
(Applied Biosystems). Los productos de cada PCR se
purificaron utilizando el GFX PCR DNA Purification
Kit(Amersham Biosciences, Amersham, UK) y fueron
secuenciados por la empresa Secugen SL. Para conseguir el
solapamiento de los fragmentos \alpha/\beta y \omega se volvió
a amplificar el fragmento de \omega-gliadinas
utilizando un cebador solapante (Omega III R solapante (SEQ ID NO:
12) junto con el cebador directo SEQ ID NO: 10) y el fragmento
\alpha/\beta-gliadinas utilizando otro cebador
solapante Alfa F solapante (SEQ ID NO: 13) junto con el cebador
reverso SEQ ID NO: 9) que añadían a cada fragmento 12 pares de bases
complementarias al otro fragmento. Mediante estas últimas
amplificaciones se obtuvieron dos fragmentos que complementan entre
el extremo 3' del fragmento de \omega-gliadinas y
el extremo 5' del fragmento
\alpha/\beta/\gamma-gliadinas. Las condiciones
de las PCRs fueron las mismas que las descritas anteriormente; el
producto de éstas se separó en un gel de agarosa 1% y la banda
correspondiente a cada fragmento se purificó con el QUIAquick Gel
Extraction Kit (QUIAGEN Inc., Valencia, CA). La PCR solapante
final se llevó a cabo utilizando 10 ng del fragmento
\alpha/\beta/\gamma solapante purificado, 10 ng del fragmento
\omega solapante purificado, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,2 mM dNTPs, 0.2
\muM del cebador alpha_hp-F, 0.2 \muM del
cebador omega_III-R, 1x buffer y 0,625 unidades de
una mezcla 100:1 de Tth/Pfu polimerasas en una reacción final
de 50 \mul. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron: un paso
inicial de 94ºC 2 min, 35 ciclos de 94ºC 30 seg, 57ºC 30 seg y 72ºC
30 seg; y una extensión final de 72ºC 4 min en un termociclador
GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). El
producto de PCR se separó en un gel de agarosa 1% y la banda que
presentaba el tamaño correspondiente al fragmento
\omega/\alpha/\beta (361 pb) se purificó con el QUIAquick
Gel Extaction Kit (QUIAGEN Inc., Valencia, CA) y se clonó en el
plásmido TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este plásmido contiene los
sitios attL1 y attL2 que permiten la transferencia
mediante recombinación del gen de interés en cualquier vector
Gateway® que contenga los sitios attR1 y
attR2.
El vector de transformación se sintetizó
utilizando el vector puc18 (2616 pb). Los distintos fragmentos que
componen el vector de transformación
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma se fueron
introduciendo uno a uno en el sitio de clonación múltiple del vector
puc18. El fragmento Nost (272 pb) se extrajo del vector
pANDA-\beta mediante restricción con la enzima
EcoRI y se introdujo en el puc18, dando lugar al puc18_Nost.
Seguidamente se extrajo el fragmento attRsense_GUS_attRantisense
(4,4 kb) del vector pANDA mediante la restricción combinada con las
enzimas Sacl y Kpnl y se introdujo en el vector puc18_Nost dando
lugar al puc18_attR_GUS_Nost. Este fragmento contenía los sitios
attR1 y attR2 en sentido y antisentido separados por
una secuencia de unión de 1 kb (gus linker). Esta secuencia gus
linker fue sustituida por el fragmento Ubi intrón (1019pb),
previamente clonado en nuestro laboratorio, medíante restricción con
la enzima EcoRV dando lugar al plásmido puc18_attR_Ubi_Nost.
Finalmente el promotor de gliadinas (885 pb) fue introducido
mediante restricción doble con las enzimas SphI y XhoI dando lugar
al plásmido puc18_Gli_attR_Ubi_Nost.
El promotor del gen D-hordeína
(836 pb) fue introducido también mediante restricción doble con las
enzimas SphI y XhoI dando lugar al vector puc18_D_attR_Ubi_Nost. La
diferencia entre los vectores
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma y
pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma es que el
primero contiene el promotor de \gamma-gliadinas
de trigo y el segundo contiene el promotor de
H-hordeína de trigo.
El siguiente paso fue la introducción del
fragmento \omega/\alpha/\beta en los plásmidos
puc18_Gli_attR_Ubi_Nost y
puc18_D_attR_Ubi_Nost. El plásmido TOPO+ \omega/\alpha/\beta contenía los sitios attL1 y attL2 mientras que los plásmidos puc18_Gli_attR_Ubi_NOSt y puc18_D_attR_Ubi_Nost contenían los sitios attR1 y attR2 en sentido y antisentido separados por el intrón Ubi. Esto permitió realizar una reacción de recombinacíón LR utilizando el kit Gateway® LR Clonase TM Enzyme Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El resultado fue la introducción del fragmento \omega/\alpha/\beta/\gamma en sentido y en antisentido separados por el intrón Ubi y dentro de la estructura de los plásmidos puc18_Gli_attR_Ubi_NOSt y puc18_D_attR_Ubi_Nost. Los vectores resultantes se denominaron pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma y pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma (Fig. 2) y fueron introducidos mediante transformación en células competentes de E. coli (DH5\alpha) para su posterior multiplicación.
puc18_D_attR_Ubi_Nost. El plásmido TOPO+ \omega/\alpha/\beta contenía los sitios attL1 y attL2 mientras que los plásmidos puc18_Gli_attR_Ubi_NOSt y puc18_D_attR_Ubi_Nost contenían los sitios attR1 y attR2 en sentido y antisentido separados por el intrón Ubi. Esto permitió realizar una reacción de recombinacíón LR utilizando el kit Gateway® LR Clonase TM Enzyme Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El resultado fue la introducción del fragmento \omega/\alpha/\beta/\gamma en sentido y en antisentido separados por el intrón Ubi y dentro de la estructura de los plásmidos puc18_Gli_attR_Ubi_NOSt y puc18_D_attR_Ubi_Nost. Los vectores resultantes se denominaron pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma y pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma (Fig. 2) y fueron introducidos mediante transformación en células competentes de E. coli (DH5\alpha) para su posterior multiplicación.
La transformación genética se llevó a cabo
mediante biolística, utilizando el sistema de aceleración de las
partículas mediante presión de helio (PDS1000/He™. BIORAD, Hercules,
CA). Se utilizaron dos genotipos de trigo harinero (Triticum
aestivum L.) cultivar Bobwhite (BW208 y BW2003) y uno de trigo
duro (Triticum turgidum ssp durum) cultivar Don Pedro
para el aislamiento de escutelos de embriones inmaduros. El
aislamiento se llevó a cabo en un ambiente de esterilidad a partir
de granos de trigo inmaduros recogidos 12-16 días
después de la antesis, previamente esterilizados mediante inmersión
durante 3 min en una solución de etanol 70%, 10 min en una solución
de hipoclorito sódico 20% y dos enjuagues con H_{2}O destilada
estéril. Para la transformación genética se utilizaron partículas de
oro de 0,6 \mum de diámetro y se mezclaron 1,5 pmoles/mg oro del
vector pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma o del
vector pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma
y
0,5 pmoles/mg oro del vector pAHC25 (Christensen et al., 1996. Transgenic Research 5, 213-218). Las condiciones de cada disparo fueron: 91,4 KPa (27 inHg) de presión de vacío 7,584 MPa (1100PSI) de presión de disparo, 6 cm de distancia de disparo, 60 \mug de la mezcla de oro y plásmidos por disparo.
0,5 pmoles/mg oro del vector pAHC25 (Christensen et al., 1996. Transgenic Research 5, 213-218). Las condiciones de cada disparo fueron: 91,4 KPa (27 inHg) de presión de vacío 7,584 MPa (1100PSI) de presión de disparo, 6 cm de distancia de disparo, 60 \mug de la mezcla de oro y plásmidos por disparo.
La cotransformación con el plásmido pAHC25 que
contiene el gen bar de selección (resistencia a
fosfonotricina) y el gen uidA (síntesis de
\beta-glucuronidasa) permitió la selección de los
tejidos transformados en medios con 4 mg/l de fosfinotricina (PPT) y
la posterior identificación de los transgénicos mediante el ensayo
de la \beta glucuronidasa (GUS) de acuerdo al protocolo descrito
por Jefferson (1987, Plant Mol Biol Rep
5:387-405). Los medios, el proceso de cultivo in
vitro y la regeneración de plantas se llevó a cabo según Barro
et al (Barro et al., 1998. Theoretical and Applied
Genetics 97, 684-695).
Las plantas regeneradas en cultivo in
vitro se sembraron en tierra y se les realizó el ensayo GUS como
tal y como se describe en el párrafo anterior. A las plantas que
dieron un resultado positivo en el ensayo GUS se les extrajo DNA
utilizando DNAzol reagent (Invitrogen, Carisbad, CA) y
siguiendo las instrucciones del fabricante, y se realizó una PCR
para confirmar la presencia de los plásmidos
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma,
pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma y pAHC25 en
el genoma de la planta adulta. Las condiciones de PCR fueron: 100 ng
de DNA extraído de hojas jóvenes, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,2 mM dNTPs,
0.2 \muM de cada cebador, 1x buffer y 0,625 unidades de polimerasa
Tth (BIOTOOLS, Madrid, España). Los cebadores utilizados
fueron prGliF (SEQ ID NO: 14) y Omega_III_R solapante (SEQ ID NO:
12) para el plásmido
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma, prHorDF
(SEQ ID NO: 15) y Omega_III_R solapante (SEQ ID NO: 12) para el
plásmido pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma y
BAR_F (SEQ ID NO: 16) y BAR_R (SEQ ID NO: 17) para el pAHC25 (Tabla
3). Las condiciones de los ciclos de PCR fueron: un paso inicial de
94ºC 5 min, 35 ciclos de 94ºC 30 seg, 55ºC 30 seg y 72ºC 2 min; y
una extensión final de 72ºC 7 min en un termociclador GeneAmp PCR
system 9700 (Applied Biosystems). El producto de cada PCR
se separó mediante electroforesis en un gel de agarosa 1% y las
líneas positivas se seleccionaron para su posterior análisis.
Las semillas de las líneas positivas se
machacaron en un mortero hasta obtener harina. A continuación la
harina se lavó con 1 mi de una solución de 0,5 M de NaCl durante 15
minutos a temperatura ambiente (TA) en un agitador y se
centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se
desechó y el precipitado se lavó con agua destilada durante 15 min a
TA también en agitación. Posteriormente las muestras se
centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min, desechándose el
sobrenadante. Las gliadinas se extrajeron del precipitado con una
solución acuosa de etanol al 60% (v/v) en una relación 5:1 (\mul
etanokmg harina) y agitación durante 45 min a TA. Posteriormente las
muestras se centrifugaron a 13.000 rpm y el sobrenadante que
contenía las gliadinas se recogió en tubos nuevos. Una fracción del
extracto se utilizó para identificación de gliadinas mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF, y otra fracción
se separó por electroforesis en geles ácidos de poliacrilamida
(A-PAGE). Para el análisis MALDI, a 5 \mul del
extracto de gliadinas se le añadió 2 \mul de una solución 50 mM
octyl-\beta-D-glucopyranoside
(ODGP) y 25 \mul de ácido sinapínico saturado en una solución
acuosa al 30% (v/v) de acetonitrilo que contenía 0,1% (v/v) de ácido
trifluoroáctico (TFA) que se usa como solución matriz. La mezcla se
secó en una centrifugadora Speed-Vac durante
15 min y el residuo se disolvió en 6 \mul de una solución acuosa
de etanol al 60% (v/v) que contenía TFA al 0,1%. La mezcla se colocó
en un portamuestras de acero inoxidable y se dejo secar durante 5
min a TA. Las muestras se analizaron en un MALDI-TOF
Voyager DE-PRO (PE Biosystems) en la
configuración estándar del instrumento. Los espectros se registraron
en el modo linear positivo a una aceleración de voltaje de 25 kV con
una rejilla de voltaje del 93% y 700 nanosegundos de retardo. Se
acumularon 200 espectros del láser para construir los perfiles de
gliadinas.
Las gliadinas se separaron en geles
A-PAGE siguiendo los protocolos estándares descritos
por (Khan et al., 1985. Cereal Chemistry 62:
310-313).
Se llevó a cabo la hibridación (Western blot) de
las gliadinas separadas en los geles SDS-PAGE con al
anticuerpo R5 (Valdez et al. 2003, Eur. J. Gastroenterol.
Hepatol. 15:465-474), ya que éste es el método
oficial reconocido por el Codex Alimentarius para la detección de
gluten en alimentos.
Los análisis en geles A-PAGE y
MALDI-TOF mostraron que la combinación de esta
secuencia híbrida es altamente eficaz en el silenciamiento de
gliadinas de trigo.
En la Fig. 3 se muestra la separación e
identificación de gliadinas de semillas de plantas del cultivar de
trigo BW208, transformadas con el polinucleótido de la invención,
por medio de las técnicas A-PAGE y
MALDI-TOF. En la Fig. 3A se observa la atenuación de
las bandas que corresponde con cada una de las alfa, beta, gamma y
omega-gliadinas procedente de semillas de una línea
de trigo harinero transformada con el vector
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma
(B377-2-3) cuando se compara con el
cultivar BW208 de trigo control de la que procede (Triticum
aestivum L. ssp. aestivum). En la Fig. 3B se observa el
perfil de expresión del espectro que corresponde con las alfa, beta,
gamma y omega-gliadinas, donde cada uno de los picos
corresponde con una proteína diferente. En la gráfica se señalan los
picos que corresponden con cada uno de los tipos de gliadina. Tal
como se observa en los perfiles de expresión correspondiente a
plantas control y en los perfiles de expresión de las plantas
transformadas con el polinucleótido de la invención, la supresión de
los picos correspondientes a cada una de las gliadinas que se
observan en el perfil de las plantas control, es muy notoria,
demostrándose de este modo la eficacia del polinucleótido y del
método de la presente invención en el silenciamiento
post-transcripcional de las gliadinas presentes en
los granos de trigo pertenecientes a este cultivar.
En las Fig. 4 y 5 se muestra la separación e
identificación de gliadinas de semillas de plantas del cultivar de
trigo BW2003 (Triticum aestivum L. ssp. aestivum) y de
la variedad Don Pedro (Triticum turgidum L. ssp durum)
respectivamente, transformadas con el polinucleótido de la
invención, por medio de la técnica A-PAGE. En ambos
casos se observa la atenuación de las bandas que corresponde con
cada una de las alfa, beta, gamma y omega-gliadinas
procedente de las semillas de las líneas de trigo transformadas con
el vector pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma
(B377-2-3) cuando se compara con sus
respectivos controles.
En la Fig. 6 se muestra la separación de
gliadinas en geles A-PAGE de una línea control BW208
y tres semillas de una línea
(B382-4-1) del mismo genotipo
transformada con el vector
pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma. El promotor
que contiene este vector es el promotor de un gen
D-Hordeína (SEQ ID NO: 7). Se observa la atenuación
de las bandas en las semillas de las líneas transgénicas que
corresponde con cada una de las alfa, beta, gamma y
omega-gliadinas de trigo.
En la Fig. 7 se muestra el análisis por Western
Blot de dos líneas de trigo harinero (Triticum aestivum L.
ssp. aestivum) transformadas con el vector
pDhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma que contiene
el promotor codificado por la secuencia SEQ ID NO: 7.
En el gel A se muestra la separación de
gliadinas en geles SDS-PAGE de tres granos de trigo
(I1, I2 e I3) de la línea transgénica
B382-4-1. En el gel B se muestra la
separación de gliadinas de dos granos de trigo (O2 y O3) de la línea
transgénica B374-6-2. Posteriormente
ambos geles se han hibridado con el anticuerpo monoclonal R5 que
reconoce péptidos que son potencialmente tóxicos para los celiacos.
El anticuerpo monoclonal R5 es el método oficial reconocido por el
Codex Alimentarius para la detección de gluten en alimentos.
En la Fig. 7A no se observa un nivel apreciable
de gliadinas en las líneas de trigo BW208 que expresan el péptido de
la invención, atendiendo a este tipo de detección con el anticuerpo
R5. En la Fig. 7B se observa una considerable reducción de gliadinas
en esta otra variedad BW2003 transgénica de trigo.
En la Fig. 8 se observa en un gel
SDS-PAGE la atenuación de las gliadinas de tres
granos de la línea transgénica
B375-3-1, denotados como A1, A2, A3
y las gliadinas de dos granos de trigo de la línea transgénica
B377-2-3, ambas del genotipo BW208
cuando se hibridan con los anticuerpos específicos de gluten R5. Las
líneas transgénicas contienen el promotor de
\gamma-gliadinas, es decir, se transformaron con
el vector
pGhp-\omega/\alpha/\beta/\gamma.
<110> CSIC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polinucleótido que comprende
secuencias de gliadinas de trigo y su uso para silenciamento
mediante RNAi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.271
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia sentido
omega-gliadinas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sentido de alfa, beta,
gamma-gliadinas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia antisentido de alfa, beta
y gamma-gliadinas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia antisentido de
omega-gliadinas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 836
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum chilense
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum spp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum chilense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces
hygroscopicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptomyces
hygroscopicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
Claims (22)
1. Polinucleótido con al menos un 90% de
identidad con respecto a una secuencia que comprende dos pares de
secuencias (a1-a2) y (b2-b1)
separadas por una secuencia espaciadora donde:
- a.
- las secuencias a1, a2, b1 y b2 son diferentes entre sí y se seleccionan de entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, de la siguiente forma:
- b.
- si a1 es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4, b1 es SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 1 y a2 es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y
- c.
- si a1 es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, b1 es SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 2 y a2 es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polinucleótido que comprende dos pares de
secuencias (a1-a2) y (b2-b1)
separadas por una secuencia espaciadora donde las secuencias a1, a2,
b1 y b2 se describen en los apartados (a) a (c) de la reivindicación
1.
3. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 donde a1 es SEQ ID NO: 1, a2 es SEQ ID NO: 2,
b2 es SEQ ID NO: 3 y b1 es SEQ ID NO: 4.
4. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 donde la secuencia espaciadora es SEQ ID NO:
5.
5. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 que además comprende una secuencia reguladora
de la expresión génica unida funcionalmente a su extremo 5'.
6. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 donde la secuencia reguladora de la expresión
génica es SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7.
7. Secuencia de RNA codificada por el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 capaz
de formar un hpRNA donde la secuencia codificada por el par
a1-a2 híbrida completamente con la secuencia
codificada por el par b2-b1.
8. siRNA generado a partir de la secuencia del
hpRNA según la reivindicación 7.
9. Vector de expresión que comprende el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. Célula aislada transfectada con el vector de
expresión según la reivindicación 9.
11. Planta modificada genéticamente que
comprende la célula transfectada según la reivindicación 10.
12. Planta según la reivindicación 11 que
pertenece al género Triticum.
13. Planta según la reivindicación 12 que
pertenece a la especie Triticum aestivum o Triticum
turgidum.
14. Planta según la reivindicación 13 donde
dicha planta es un cultivar Bobwhite o un cultivar Don Pedro.
15. Semilla que procede de la planta según
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
16. Polen, propágulo, progenie o parte de la
planta que procede de cualquiera de las plantas según las
reivindicaciones 11 a 14.
17. Uso del polinucleótido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 para el silenciamiento de alfa, beta,
gamma y omega gliadinas de Triticum spp.
18. Uso del vector según la reivindicación 9
para el silenciamiento de alfa, beta, gamma y omega gliadinas de
Triticum spp.
19. Uso de la célula según la reivindicación 10
para el silenciamiento de alfa, beta, gamma y omega gliadinas de
Triticum spp.
20. Uso de la semilla según la reivindicación 15
para preparar una composición alimenticia.
21. Uso de la composición de la reivindicación
20 para preparar un alimento funcional, complemento vitamínico o
complemento nutricional.
\newpage
22. Método para la obtención de la planta
modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 11
a 14, que comprende:
- a.
- Seleccionar una parte de la planta,
- b.
- transfectar las células de la parte de la planta del apartado (a) con el vector según la reivindicación 9,
- c.
- seleccionar la célula transfectada del apartado (b) que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
- d.
- regenerar al menos una planta procedente de la célula seleccionada en el apartado (c),
- e.
- seleccionar una o varias plantas regeneradas según el apartado (d) donde el polinucleótido se transcribe a un hpRNA,
- f.
- seleccionar una o varias plantas obtenidas según el apartado (e) que presentan silenciamiento de las alfa, beta, gamma y omega gliadinas en sus semillas.
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