CN115197332A - 一种创制高锌低镉水稻的植物表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种创制高锌低镉水稻的植物表达载体、构建方法及应用，属于分子生物学技术领域，提供一种导入两个目标基因表达框的植物表达载体pCactF‑HMA3‑MT2c，目标之一是水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框pRcc3‑HMA3‑OCS，目标之二是金属硫蛋白OsMT2c表达框pActin‑OsMT2c‑OCS。该载体系统可通过农杆菌介导法转入水稻或其他植物，可以限制转基因植物根系吸收的镉离子向地上部分运输，促进锌离子向地上部分及籽粒运输，从而降低籽粒中的镉含量，增加籽粒中是锌含量，为中低镉污染地区的粮食作物的种植提供可能，为低镉高锌作物品种的选育提供新的技术手段。

Description

一种创制高锌低镉水稻的植物表达载体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种创制高锌低镉水稻的植物表达载体及其应用。
背景技术
随着矿产资源的开发利用、污水灌溉、以及各种化学产品和农药的广泛使用等，农田及农产品的重金属污染，已经成为危害生态环境和人类健康的突出问题。稻米是膳食中镉的主要来源，占我国人均镉摄入量的55-65%。减少水稻根系对镉的吸收，或者减少镉向地上部分运输，从而降低籽粒镉含量，减少镉污染带来的健康风险，是当前亟需解决的科学技术问题。
另一方面，植物细胞中有超过300个酶或转录因子是依赖锌起作用的，缺锌或者锌过量均导致农作物减产及品质下降。目前世界上有三分之一人口，由于膳食中锌供给不足而导致营养不良。不少育种家提出，生物强化提高稻米锌含量，是解决人类锌缺乏最经济有效的途径。
利用分子遗传学方法能够快速将这些特定性状导入，以培育适应重金属轻/中度污染土壤的水稻品种，生产出合格的稻米，实现“边治理边生产”。
OsHMA3是位于水稻根液泡膜上的镉/锌转运蛋白，它能够将根吸收的镉或锌运至液泡内隔离起来，解除细胞内的镉毒害并限制其向地上部分的运输，降低地上部分及籽粒的镉含量。Lu等（2019, Environment International, 126:619-626）利用35S强启动子调控OsHMA3过表达，能够使水稻籽粒的镉含量下降10倍左右。但35S为组成型表达的强启动子，它启动OsHMA3过量表达的后果是，导致水稻全身细胞将胞内绝大部分镉和锌都转至液泡隔离起来，限制镉转运的同时，也限制水稻对必需元素锌的利用。并且当镉污染程度增加时，引起的植物缺锌症状会表现得更为突出。
金属硫蛋白 (MTs) 是一类广泛存在于生物体内、低分子量、富含半胱氨酸的诱导性金属结合蛋白，具有螯合金属及抗氧化等特性。我们的前期研究发现（Zhang et al.,2017, Int. J. Mol. Sci. 18:2083），OsMT2c过表达显著增加水稻对镉的耐性，稻杆和籽粒中锌含量均显著高于野生型，而镉含量则没有明显变化；另一方面，OsMT2c在茎节部位表达最为丰富，对锌的长距离运输以及再分配起着至关重要的作用（Lei et al., 2021, NewPhytol. 229:1007–1020）。
传统的转基因植物绝大多数是通过单个目的基因的遗传转化来定向改良单一性状获得的。而长期以来，培育具备生产上有用的多种优良品质的作物品种，一直是科学家进行植物遗传改良的终极目标。因此，我们考虑将植物耐重金属代谢途径的两个关键基因克隆，整合进入一个新的植株中，可以实现植物的多目标分子聚合育种。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种创制高锌低镉水稻的植物表达载体，以及其在高锌低镉作物品种创制和选育中的应用，将所述植物表达载体导入植株中，获得的阳性植株能限制镉离子向地上部分运输、同时促进锌离子向籽粒运输。
本发明的第一方面，是提供一种水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框，所述表达框为pRcc3-HMA3-OCS，是将水稻组织特异表达基因OsCc3的启动子pRcc3，与液泡膜上的金属转运蛋白基因OsHMA3的CDS以及终止子OCS组合而成。
本发明的第二方面，是提供一种植物表达载体，所述植物表达载体是将两个目标基因表达框组合导入载体pCactF中构建所得；两个所述目标基因表达框分别为水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS和金属硫蛋白OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS；
所述水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS是将水稻组织特异表达基因OsCc3的启动子pRcc3，与液泡膜上的金属转运蛋白基因OsHMA3的CDS以及终止子OCS组合而成；
所述金属硫蛋白OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS是将组成型表达启动子pActin和金属硫蛋白OsMT2c基因的CDS以及终止子OCS组合而成。
优选地，所述植物表达载体中还包含卡那霉素和潮霉素的抗性基因。
本发明的第二方面，是提供一种转化体，所述转化体是将上述植物表达载体转化宿主细胞所得。优选地，所述宿主细胞为农杆菌。
本发明的第三方面，是提供上述植物表达载体或转化体在高锌低镉作物品种创制及选育中的应用。优选地，所述作物品种为水稻。
本发明的第四方面，是提供一种高锌低镉水稻的创制方法，是将上述植物表达载体转入水稻植株中，使OsHMA3基因和OsMT2c基因过表达，经验证正确后获取转基因阳性植株，即为高锌低镉水稻。
有益效果：本发明提供一种导入两个目标基因表达框的植物表达载体pCactF-HMA3-MT2c，目标之一是水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS，目标之二是金属硫蛋白OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS，并且该载体具有卡那霉素和潮霉素的抗性基因，便于在原核和真核水平的筛选。该载体系统可通过农杆菌介导法转入水稻或其他植物，可以限制转基因植物根系吸收的镉离子向地上部分运输，促进锌离子向地上部分及籽粒运输，从而降低籽粒中的镉含量，增加籽粒中是锌含量，为中低镉污染地区的经济作物的种植提供可能，为低镉高锌作物品种的选育提供新的技术手段。
附图说明
图1是OsHMA3和OsMT2c双基因过表达载体pCactF-HMA3-MT2c的构建示意图；
图2是重组质粒pCactF-MT2c的酶切位点汇总示意图；
图3是重组质粒pCactF-pRCc3-HMA3的酶切位点汇总示意图；
图4是重组质粒pCactF-HMA3-MT2c的酶切位点汇总示意图；
图5是pRcc3-OsHMA3-OCS插入片段的克隆(A)及质粒pCactF-HMA3-MT2c的KpnI酶切验证(B)结果图；
图6是重组菌落pCactF-HMA3-MT2c的PCR筛选结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
为了实现本发明的目的，我们将组成型表达启动子pActin和金属硫蛋白OsMT2c基因的CDS以及终止子OCS，组合而成的OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS，导入植物表达载体pCactF-OsMT2c（图2）；将水稻组织特异表达基因OsCc3的启动子pRcc3，与液泡膜上的金属转运蛋白基因OsHMA3的CDS以及终止子OCS，组合而成的OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS，导入植物表达载体pCactF-pRcc3-HMA3（图3）；最后组合导入植物表达载体pCactF-HMA3-MT2c（图1和图4）。载体pCactF-OsMT2c是由实验室前期构建并保存。
实施例1 pCactF-MT2c载体的构建。
将启动子pActin和金属硫蛋白OsMT2c基因的CDS以及终止子OCS组合而成的OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS，导入植物表达载体pCactF。具体构建方法如下：
1、利用南京诺唯赞开发的同源重组专用引物设计软件CE Design，选择“单片段克隆”中的“双酶切线性化”设计引物。选择pCactF载体本身的启动子pActin与终止子OCS之前的SpeI和PstI作为线性化酶切位点，扩展两端各约50-100bp序列作为载体序列，以OsMT2c基因的CDS（序列号为：AB002800）作为插入序列，利用该软件设计出的OsMT2c插入引物为：OsMT2c-Ca-F和OsMT2c -Ca-R。
2、提取日本晴水稻根系RNA并反转录cDNA, 以该cDNA为模板，利用1设计的引物和高保真 Taq 酶 PrimeSTAR（TAKARA），PCR扩增OsMT2c 基因的CDS全长为243bp, 并用OMEGA的Cycle-Pure Kit试剂盒对插入片段进行纯化。
3、对pCactF载体进行SpeI和PstI（TAKARA）双酶切，37℃保温4h后并用OMEGA的Cycle-Pure Kit试剂盒进行质粒纯化。
4、用南京诺唯赞的ClonExpress One Step Cloning Kit试剂盒，将2获得的插入片段和3获得的酶切质粒进行重组，连接后转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，利用鉴定引物（Ca-OsMT2c-F和M13-F）对具有卡那霉素抗性的菌落进行PCR扩增，获得预期片段产物442bp的确定阳性载体pCactF-OsMT2c，然后提取质粒，并检验测序结果完全正确。
该实施例中所用引物具体见下表1。
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
实施例2 pCactF-pRcc3-HMA3载体的构建。
将OsRcc3基因的启动子pRcc3、液泡膜上的金属转运蛋白基因OsHMA3的CDS以及终止子OCS组合而成的OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS（图1），导入植物表达载体pCactF，构建pCactF-pRcc3-HMA3。具体构建方法如下：
1、利用南京诺唯赞开发的同源重组专用引物设计软件CE Design，选择“单片段克隆”中的“双酶切线性化”设计引物。pCactF载体上终止子OCS前面的KpnI和ApaI作为线性化酶切位点，扩展两端各约100bp序列作为载体序列，以OsRcc3基因的部分启动子序列pRcc3（序列号为：NC_029257.1）作为插入序列，利用该软件设计出的pRcc3插入片段的引物为：pRcc3-Ca-F和pRcc3-Ca-R。
2、以日本晴基因组DNA为模板，利用高保真Taq 酶 PrimeSTAR 扩增组织特异表达基因OsRcc3的启动子pRcc3片段1298bp。
3、对pCactF载体进行KpnI和ApaI双酶切，37℃保温4h后并用OMEGA的Cycle-PureKit试剂盒进行质粒纯化。
4、用南京诺唯赞的ClonExpress One Step Cloning Kit试剂盒，将2获得的插入片段和3获得的酶切质粒进行重组，连接后转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，利用鉴定引物（Ca-Rcc3-F和M13-F）对具有卡那霉素抗性的菌落进行PCR扩增，获得预期片段产物1546bp的确定阳性载体pCactF-pRcc3，然后提取质粒，KpnI和ApaI双酶切验证目的片段为1298bp，并测序正确。
5、利用同源重组专用引物设计软件CE Design，选择“单片段克隆”中的“单酶切线性化”设计引物。首先选择pCactF-pRcc3-OCS载体上启动子pRcc3与终止子OCS之间的Sal I为酶切位点，扩展两端各约100bp序列作为载体序列，以OsHMA3基因的CDS全长（序列号为：AB559519）作为插入序列，设计OsHMA3插入片段的引物为：OsHMA3-Ca-F和OsHMA3-Ca-R。
6、提取日本晴水稻根系RNA并反转录cDNA, 以该cDNA为模板，利用高保真 Taq 酶PrimeSTAR 扩增OsHMA3 基因的CDS全长3015bp 。
7、对pCactF-pRcc3载体进行TAKARA的SalI单酶切，37℃保温4h后用OMEGA的Cycle-Pure Kit试剂盒进行质粒纯化。
8、将由6获得的OsHMA3的CDS全长，和由7获得的线性化载体pCactF-pRcc3，用南京诺维赞的ClonExpress One Step Cloning Kit试剂盒进行重组，重组产物转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，用鉴定引物（Ca-pRcc3-F和Ca-HMA3-R）对具有卡那霉素抗性的菌落进行PCR扩增，获得预期片段产物741bp的确定为阳性载体pCactF-pRcc3-HMA3，然后提取质粒，KpnI酶切验证目的片段为4175bp，并测序正确。
该实施例中所用引物具体见下表2。
表2 试验所用的克隆、载体构建和鉴定引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
实施例3 pCactF-HMA3-MT2c载体的构建。
在实施例1和实施例2的基础上，本发明提供的限制镉向水稻地上部分运输，促进锌向籽粒运输的植物表达载体的构建方法包括如下步骤：
1、利用南京诺唯赞开发的同源重组专用引物设计软件CE Design，选择“单片段克隆”中的“单酶切线性化”设计引物。pCactF-MT2c载体上启动子pActin前面的KpnI作为线性化酶切位点（图2），扩展两端各约50-100bp序列作为载体序列，以OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS作为插入序列，利用该软件设计出OsHMA3表达框的扩增引物为：HMA3-CaMT2c-F和HMA3-CaMT2c-R。
2、以质粒pCactF-pRcc3-HMA3为模板（图3），利用1设计的引物和高保真Taq 酶PrimeSTAR 扩增OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS的插入片段约为4545bp（图5A）。由于出现杂带，对该PCR产物进行切胶回收。
3、对pCactF-MT2c载体进行TAKARA的KpnI酶切，37℃保温4h后并用OMEGA的Cycle-Pure Kit试剂盒进行质粒纯化。
4、用南京诺唯赞的ClonExpress One Step Cloning Kit试剂盒对2获得的插入片段和3获得的酶切产物进行重组，连接后转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，利用鉴定引物（gLacZ-F和gRcc3-R）对具有卡那霉素抗性的菌落进行PCR扩增，获得预期片段产物580bp的确定阳性载体pCactF-HMA3-MT2c（图6中8），然后提取质粒，KpnI酶切验证目的片段为4175bp（图5B），并测序正确。
5、将pCactF-pCactF-HMA3-MT2c质粒通过农杆菌介导法转入日本晴水稻，获得 T0抗性植株，利用通用的潮霉素特异引物（HPT-F和HPT-R），PCR扩增筛选获得20个转基因阳性植株，扩繁得到F1代种子。
对鉴定阳性的转基因水稻，木村B溶液培养到两叶一心时，进行0-5 μM氯化镉处理5天，取转基因水稻的根系和地上部分，Realtime PCR分析OsHMA3 基因和OsMT2c基因的相对表达的同时，用ICP-MS检测镉锌元素含量。结果发现，与野生日本晴相比，该转基因水稻根系中OsHMA3 基因的表达增加了21-133倍，OsMT2c 基因的表达增加了90-192倍；地上部分镉含量降低了31-77%，地上部分锌含量增加了153-196%。
对鉴定阳性的转基因水稻，木村B溶液培养到两叶一心时，移入盆钵土培，0-5 mg/kg 氯化镉处理直到成熟，取转基因水稻的籽粒，用ICP-OES（Optima 8000, PerkinElmer）检测锌镉的含量，与野生日本晴相比，该转基因水稻籽粒中的镉含量降低了2-13倍，镉浓度降低了92-98%；籽粒中的锌含量增加了2-11倍，锌浓度增加了122-198%。
质粒pCactF-OsMT2c由实验室前期自制并保存。大肠杆菌DH10B感受态细胞及农杆菌感受态细胞 EHA105由实验室自制。
利用同源重组专用引物设计软件CE Design，设计启动子pRcc3、OsHMA3基因和OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS的扩增引物。利用 Primer Premier 5.0 设计阳性菌液或质粒的鉴定引物，利用INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES 网站上的PrimerQuest Tool设计OsHMA3基因和OsMT2c基因的 Realtime PCR引物，本专利涉及到的所有引物汇总于表1-3。菌液、质粒以及PCR产物等回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果通过NCBI Blast与目标序列进行比对，确保碱基排列完全一致。
表3 试验所用的克隆、载体构建和鉴定引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框，其特征在于：所述表达框为pRcc3-HMA3-OCS，是将水稻组织特异表达基因OsCc3的启动子pRcc3，与液泡膜上的金属转运蛋白基因OsHMA3的CDS以及终止子OCS组合而成。
2.一种植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是将两个目标基因表达框组合导入载体pCactF中构建所得；两个所述目标基因表达框分别为水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS和金属硫蛋白OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS；
所述水稻金属转运蛋白OsHMA3表达框pRcc3-HMA3-OCS是将水稻组织特异表达基因OsCc3的启动子pRcc3，与液泡膜上的金属转运蛋白基因OsHMA3的CDS以及终止子OCS组合而成；
所述水稻金属硫蛋白OsMT2c表达框pActin-OsMT2c-OCS是将组成型表达启动子pActin和金属硫蛋白OsMT2c基因的CDS以及终止子OCS组合而成。
3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体中还包含卡那霉素和潮霉素的抗性基因。
4.一种转化体，所述转化体是将权利要求2所述的植物表达载体转化宿主细胞所得。
5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌。
6.权利要求2所述的植物表达载体或权利要求4所述的转化体在高锌低镉作物品种创制及选育中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述作物品种为水稻。
8.一种高锌低镉水稻的创制方法，其特征在于：所述方法是将上述植物表达载体转入水稻植株中，使OsHMA3 基因和OsMT2c基因过表达，经验证正确后获取转基因阳性植株，即为高锌低镉水稻。
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