CN117448369A - 一种提高遗传编辑率的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高遗传编辑率的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用，包括sgRNA转录单元和Cas9转录单元，所述sgRNA转录单元由顺次连接的启动子、靶向目标基因的gRNA基因和终止子组成，所述Cas9转录单元由顺次连接的植物愈伤组织特异表达启动子和Cas9基因组成，所述植物愈伤组织特异表达启动子包括ZmCTA1启动子或ZmPLTP启动子，所述ZmCTA1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ZmPLTP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。与现有技术相比，本发明愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统能在植物愈伤组织中高效表达并能遗传编辑。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种提高遗传编辑率的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是一种在细菌和其他原核基因组中发现的天然免疫系统。目前广泛使用的CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和引导RNA(sgRNA)组成。在Cas9sgRNA蛋白复合物识别原间隔区相邻基序(PAM)并且sgRNA与靶DNA序列结合后，在靶位点诱导双链断裂(DSB)。作为一种强大高效的基因组编辑工具，CRISPR/Cas9系统已广泛应用于各种生物体和细胞类型的基因编辑。在植物中，CRISPR/Cas9系统最初应用于拟南芥，并逐渐应用于烟草、番茄、水稻、小麦和玉米
CRISPR/Cas9系统由于其编辑的准确性和载体构建的简单性，为作物遗传育种提供了一个极好的工具。CRISPR/Cas9系统可以提高作物产量、抗病性和抗逆性。为了实现高编辑效率，通常使用强组成型启动子来驱动Cas9和sgRNA转录。然而，同时引起大量不可遗传的体细胞突变，这会增加识别编辑事件的难度，并可能导致植物生长异常。
玉米作为世界上最不可或缺的作物之一，用途广泛，在植物研究中发挥着重要作用。自2014年以来，研究人员开始在玉米中使用CRISPR/Cas9系统诱导靶基因突变。在大多数研究中，Cas9的表达是由玉米泛素启动子驱动的。然而，该启动子的使用不可避免地导致体细胞突变。目前，使用种系特异性启动子驱动Cas9基因可以缓解体细胞突变的问题，例如花粉特异性系统。然而，在T0植物生长的早期阶段无法检测到突变，并且在这种花粉特异性系统中突变效率相对较低。愈伤组织是由植物产生的大量无组织细胞。愈伤组织细胞是全能的，可以再生成完整的植物。在玉米转化实验中，幼胚通过形成胚性愈伤组织再生为完整的玉米植株。愈伤组织中产生的突变是可遗传的，可以在T0植物生长的早期阶段检测到。然而，尚未在玉米中报道愈伤组织特异性启动子驱动的CRISPR/Cas9系统。
发明内容
本发明的目的就是为了克服现有CRISPR/Cas9基因编辑系统遗传编辑效率低等问题而提供一种提高遗传编辑率的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一为提供一种愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括sgRNA转录单元和Cas9转录单元，所述sgRNA转录单元由顺次连接的启动子、靶向目标基因的gRNA基因和终止子组成，所述Cas9转录单元由顺次连接的植物愈伤组织特异表达启动子和Cas9基因组成，
所述植物愈伤组织特异表达启动子包括ZmCTA1启动子或ZmPLTP启动子，所述ZmCTA1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ZmPLTP启动子的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
在一些具体实施方式中，所述sgRNA转录单元中的启动子为U6启动子，终止子为U6终止子。
本发明的技术方案之二为提供一种重组载体，其包括上述技术方案之一所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统。
本发明的技术方案之三为提供一种如上述技术方案之二所述的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
S1、克隆获得ZmCTA1启动子或ZmPLTP启动子，并将其与Cas9基因顺次连接，组成Cas9转录单元；
S2、构建识别靶位点的sgRNA转录单元，并将Cas9转录单元和sgRNA转录单元同时导入双元载体，得到重组载体。
本发明的技术方案之四为提供一种重组质粒，包括包括上述技术方案之一所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，或上述技术方案之二所述的重组载体。
本发明的技术方案之五为提供一种重组菌，包括上述技术方案之一所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，或上述技术方案之二所述的重组载体，或上述技术方案之四所述的重组质粒。
本发明的技术方案之六为提供一种应用上述技术方案之一所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统对植物基因组进行编辑的方法，其包括：将上述技术方案之二所述的重组载体转化受体植物组织，获得被编辑的转基因材料。
在一些具体实施方式中，所述植物为单子叶植物。
在一些具体实施方式中，所述植物包括玉米。
在一些具体实施方式中，所述受体植物组织为未成熟的幼胚。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统是通过利用愈伤组织特异性启动子ZmCTA1或ZmPLTP驱动Cas9基因在愈伤组织中进行的高效表达，并在当代及后代中均能检测到突变，具有可遗传编辑作用。
(2)本发明的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统由于是通过愈伤组织特异性启动子ZmCTA1或ZmPLTP驱动的Cas9基因在愈伤组织中的表达，在转基因植物当代中并没有产生大量体细胞突变，一方面缓解了现有技术由玉米泛素启动子驱动造成的体细胞突变的问题，另一方面也提高了遗传编辑率。
(3)本发明提供了一种提高遗传编辑率的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，在植物育种等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统载体示意图。
图2是愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在转基因当代愈伤组织中的编辑效率。
图3是Cas9基因在愈伤特异CRISPR/Cas9基因编辑系统中的组织特异表达情况。
图4是愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在转基因当代植株中的编辑效率。
图5是愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在转基因后代籽粒中的可遗传编辑率。
图6是愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在转基因后代籽粒中的新增编辑情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.)或植物分子生物学－实验手册(Plant MolecularBiology－A Laboratory Manual,Melody S.Clark编，Springer-verlag BerlinHeidelberg,1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。
双元tRNA-gRNA单元参考文献“High-efficiency CRISPR/Cas9 multiplex geneediting using the glycine tRNA-processing system-based strategy in maize.BMCBiotechnology 2016.Qi et al.”。
靶向Opaque2基因的双元tRNA-gRNA单元参考文献“Pollen-Specific CRISPR/Cas9 System to Increase Heritable Gene Mutations in Maize.Agriculture2021.Jing et al.”。
含有玉米密码子优化Cas9基因的pCAMBIA3301载体来源文献“Efficiency andInheritance of Targeted Mutagenesis in Maize Using CRISPR-Cas9.J.Genet.Genom.2016.Lai et al.”
实施例1：愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及遗传转化
根据前期转录组数据筛选出ZmCTA1和ZmPLTP这两个玉米愈伤组织特异表达基因，根据启动子一般长度确定选取ATG前2000bp作为有效启动子序列，ZmCTA1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ZmPLTP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实验选择玉米Gly-tRNA系统，设计了靶向Opaque2基因的双元tRNA-gRNA单元，克隆到含有玉米密码子优化Cas9基因的pCAMBIA3301载体的PstⅠ位点，分别通过PCR扩增ZmCTA1和ZmPLTP启动子序列插入到Cas9基因表达序列前的HindⅢ位点，构建得到含有如图1所示的载体，靶向Opaque2基因的双元tRNA-gRNA单元在来源于玉米第一号染色体上的U6启动子的启动下同时产生两个guide RNA，引导Cas9蛋白在同一个基因的四个位点进行编辑(如图1所示)，极大地提升基因编辑效率。以玉米泛素启动子(pZmUbi)驱动的CRISPR/Cas9(UC)系统作为对照。
玉米密码子优化的Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
gRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
ZmCTA1启动子序列的扩增引物为ZmCTA1-F和ZmCTA1-R，核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示。
ZmPLTP启动子序列的扩增引物为ZmPLTP-F和ZmPLTP-R，核苷酸序列分别如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示。
将上述制备得到的载体电击转化到EHA105菌株。
选取B104玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程为：
(1)农杆菌侵染10min共培养20℃3天；
(2)恢复培养28℃7天，筛选培养(双丙氨磷1.5mg/L)28℃14天。
(3)筛选培养(双丙氨磷3mg/L)28℃14天，3-5轮；
(4)获得抗性愈伤组织，暗再生培养28℃14-21天；
(5)移入盆中，长成玉米当代，记为T0代；
(6)授粉到B104野生型玉米植株并获得后代，记为T1代。
结果：选取1000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得几十个转基因愈伤组织，并最终获得不同数量的转基因阳性事件。对各个事件进行鉴定，通过TPS法抽提各事件植株的基因组，并针对Cas9基因设计PCR引物，扩增得到目的片段为阳性事件。
Cas9基因的扩增引物为Cas9-F和Cas9-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示。
实施例2：愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统转基因阳性事件的基因组抽提
(1)首先向50mL离心管中加入10mL基因组抽提液，并在离心管盖和离心管壁上做相应的标记；
(2)取1-3g新鲜愈伤或叶片组织，放进-80℃冰箱进行备用；或者，放入液氮中进行速冻，研磨成泛白的粉末，直接进行实验。将粉末放进相应编号的50mL离心管中(含有DNA大抽提取液)，并加入20uL的10mg/mL的RNA酶母液，上下颠倒，混合均匀，室温静置10min；
(3)每管加入与提取液等量的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡，充分混匀，4℃，12000rpm离心10min；
(4)吸取全部上清到新的50mL离心管中，写上编号，向其中加入总体积0.7倍的异丙醇，上下轻轻颠倒，出现絮状沉淀，立即进行下一步；也可放置于-20℃，30min，使基因组DNA充分沉淀；
(5)将絮状沉淀挑出，移到2mL EP管中，用70％乙醇洗3次；
(6)吸尽乙醇，将沉淀放在65℃条件下烘干，加入1mL 1×TE溶液溶解沉淀，再加入20uL的10mg/mL RNAase，37℃，1h，消化RNA；
(7)电泳检测：取1uL的样品加3uL的染色液进行琼脂糖凝胶电泳，判断RNA是否被完全消化；
(8)确定样品中RNA降解完全后，向其中加入与溶液等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀，4℃，12000rpm，离心10min；
(9)将上清转移到另一个新的2mL EP管中(注意不要吸到下层杂质)，加入7/10体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(pH＝5.2)，轻柔混匀，待出现絮状沉淀；
(10)将沉淀转移至新的2mL EP管中，用70％乙醇洗3遍，除尽乙醇，将沉淀在37℃条件下烘干，加入100μL的1×TE溶解沉淀，用于做HI-TOM高通量基因编辑分析实验。
实施例3：愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统转基因阳性事件的不同组织RNA抽提
(1)RNA抽提：取适量叶片、茎秆、根、愈伤、雄穗、胚、胚乳组织，液氮迅速磨成粉，研磨后的植物组织粉末转移到2 mL离心管中置于液氮中等待下一步操作。之后的操作按照天根公司RNAprep Pure Plant Kit(多糖多酚总RNA提取试剂盒)说明书进行。
(2)RNA反转录：按照Toyobo公司的TransScript First-Strand cDNASynthesisSuperMix试剂盒说明书反转RNA为cDNA，-80℃保存。
(3)实时定量PCR：用Tubulin基因作为内参，得到Ct值并换算得到表达水平。
结果：如图3所示，ZmCTA1和ZmPLTP启动子分别驱动的Cas9基因在转基因材料的愈伤组织中均显著高表达，表明ZmCTA1和ZmPLTP启动子均有效。
实施例4：HI-TOM高通量测序分析愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率
(1)目的片段添加桥接序列：选择鉴定为Cas9基因阳性事件的转基因材料基因组，使用桥接引物(TargeN-Bridge-Primer-F/R，N选自1-4)扩增Opaque2基因靶标片段，桥接引物扩增反应体系(10μL)见表1：
表1桥接引物扩增反应体系
TargeN-Bridge-Primer-F/R由生物公司合成，Targe1-Bridge-Primer-F/R、Targe2-Bridge-Primer-F/R、Targe3-Bridge-Primer-F/R Targe4-Bridge-Primer-F/R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11-18所示。
(2)目的片段添加barcoding样本标识序列(包含测序接头)：以步骤1中的PCR原始产物为模板，在桥接序列的基础上添加barcoding样本标识序列(Barcoding-Primer-F(N)/R(X))(以每组Barcoding-Primer-F(N)/R(X)标记96孔板每个孔，以得到96个不同的样本)。将得到的第二轮PCR产物全部混合后进行胶回收，纯化后的片段送公司进行二代测序检测。添加barcoding样本标识序列的反应体系(19μL)见表2：
表2添加测序接头和barcoding样本标识序列的反应体系
Barcoding-Primer-F(N)、Barcoding-Primer-R(X)由生物公司合成，其中N选自1-12，X选自A-H，Barcoding-Primer-F(1)-Barcoding-Primer-F(12)的核苷酸序列分别如SEQID NO.19-30所示，Barcoding-Primer-R(A)-Barcoding-Primer-R(H)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31-38所示。
(4)数据处理：二代测序返回数据使用http://www.hi-tom.net/hi-tom/线上分析。
结果：如图2所示，愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在转基因当代愈伤组织中编辑效率明显升高，含有ZmCTA1启动子的pZmCTA1 CSC系统的突变率为50％，含有ZmPLTP启动子的pZmPLTP CSC系统的突变率为30％，而对照组UC系统的突变率仅为10％。
如图4所示，愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在转基因当代植株中没有产生大量体细胞编辑，含有ZmCTA1启动子的pZmCTA1 CSC系统的突变率为50％，含有ZmPLTP启动子的pZmPLTP CSC系统的突变率为36％，而对照组UC系统的突变率为100％。
如图5所示，愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在后代籽粒中可遗传编辑率明显升高，含有ZmCTA1启动子的pZmCTA1 CSC系统的T1代中来源于T0代的T1代突变率为100％，含有ZmPLTP启动子的pZmPLTP CSC系统的T1代中来源于T0代的T1代突变率也为100％，而对照组UC系统的T1代来源于T0代的T1代突变率仅在6％-17％之间。
如图6所示，愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统在后代籽粒中只产生极少量新编辑，仅有10％-20％。
本发明涉及到的序列信息如下：
SEQ ID NO.1(ZmCTA1启动子的核苷酸序列)：
TACTAGATTCGTACAATATTTAATGTATGTGTTATATATACATGGCTAGATTAATTGTTACTCATTTGAATATAGACATAAAATATATGTTGAATTAATGTGGGCATGGCCCAAATTAATATTCAATAATAGTCAATGCTAAATGTTCACTTTAATGGTACGATGTACTAGTATTTCAGTATCATACCAGAAGTTCAAGGGACAATTCAATCAACTTAAATATGTGGACCATTGATGCGTCTATTGAGAAGCTGAGAAAAGGATGAGGAACTGCCACACGCGCGCGCCGCTGGCCCGACTAGGCCGTGGCCGTGGTAGATCAGACTTTGGTCCGAATATTTATTCCTAACGGTTGCGATTTTGCCTGGAGTGATGATCGTCCGTTACTGGTCGTTTCCTGTGTTATGACTATTAACAGACGGGTTGTAATGACTGTCAGCTAGTAACAGACGTCACTGATGGCGCCAGTTTCTGGCAGGCTGTAACGGTAGCTCTGATGGCGACCGTTACTTCCCGTTGGTCTCCATCTGCGCGTGTATATATACGGAGGAGCTAGGTGAGACTGCTTCTGGTGACGACATCACGTACGAACACCAAACAGTCTCAGACACGTTACACACATCTATTCCCGTCCCCACCTTCTGCGAGCACAAAGAGTGTGGGAGAGCAGGCCTTCGAAATCGCCGTCCACAGAGCGACACTTGCACGAGTGTGCGGGTGATCAGGTTTTTAGGGAGCGTACTCGCGACTGCTTGCTTCGTCTGCTCGACCAGCACTAATCAGGTTGCTCATCGCCGACGCCGTTAGAGGGACCGCACTGCGTATATCTGCCTGCGTCGACTGCGTACGATTACATCGAACATGCACACGAGATATCTCGTGTGAATGAAGCCACTTTTGCCTTGAGCATCGGAGCATCCGTAGGGCACACTTTGTTCTAAGTATTTGTGCATATTTTACTGTTGTTTACTGTTTACGTGAGTAGTAATACACATACATATACATGTTGTCACATATATCACTGTGATTTTCTAGATTAAATTAAAACTGAAAATATCTATTTCTTGAACAATATAAGTGCTAAAACAACTAATATTTTGGTCTGGAGGGAGTTTTACATAACAAGGGGGGAGTATGTCGTTGTATAGACGAGGCAATTTATTGTTTTAGCTCAAGCCCCACGAAACTAACTCCGTCTCAAGAAAATCTTCTAAATTCCTCGCGAGAGAACACAATACTCTATTATACTCCCTTTTTATTTTCTTTACTTGACGTTTTGTAGTTCATTTTTGTACTATTTAGCGTCAGATATAAAAAGATGAATATACTCTAAGAGTAGCGAAACCATGAATAGTGAATAAGGAAGAAAAACTCTAAAGAGCTTTCTAGAGAAATACTAAAAATATATAAAAAGGGAAAATCCTAGTCTTCGTTTGATCGTGCATGCATATGTGTGGCCCAACCGCCCAATCCATCACCGGTACGTGCTCCAGGCTGTAGCTGCTTGGAAGTCTTCCGTTCTTGCTTGACCGATTCCTGCTAGCCTTTGGAACACGGAGACCGAGGCCACCAATAAATCCTCACATGCGTGGTACTGGTACGTGGAATTGAAGCAAACAAAATACGGCTGCCCGCGGCGGCCGGATAATATATAAGATGATGGCGGCAAATTGTCTTCGCAGACGAGAAAAATCGCAGGAAAGCGGTGACTTCTAGCAGGTAGCATGTGCGGATTTTCCACCGCGATGGGCGGCGGCGGCGGCAATCCAAATCTGATGATATCTCAACCTAGGCTAGAGTGCTTGTGTCTCGATACATGGTGCGTTGCATGCATTGCTGACCCATGCGTCAAAAGTTCATCATAAAACGTGGGACAGCTGTACGTTCCCGCGTGCAATGGTGGACATCACACCTAGCCACTCCACGTCGCATGCCATGCATCGACAGGATGCACGTTCCGATCCCTATATAAAGGGGCACCCTTGTGACACCTCAAATCA
SEQ ID NO.2(ZmPLTP启动子的核苷酸序列)：
CTGTGTTTGCACTAATCAGTCTCACGTCTCCTTTGTTGGCTGTCTCTCCCTAGGCCCACGAAAGAATGACCTTACGAATTATTGGGCCCTTGGGCCGTTCGTGAGGCCTTTTACTTCTTTAGTGGACCCAGGGGATATCTATCCCCCACAACCACGCTCTAGCTTTTCAGAGAACATGTTGTTATATATAACCCCGAATTGTTCAACTATATATTGCAGCTAATGACACTTTAACTTTGTTAAGAATAGCTATTTGGTTTACTTGTGACTTTTTTTAATGCCACTAGTACTGACTTATTAGACAAATGTTCATTCTTTAATCTAGCTCTAATTCTAATATCTACCAGACTATATATCTTGTGTTGCTTACTTAATAAATGCTTTTATAAAAAAACATTTTAAAATGTTGATCTGTTTATTACTGAACATTGATTTGATTATTAGTGTTAACTATAGAGTAGACGAAAGTATGTTTCTTTGTAATTTAAAGGTTTTTTTACCACACGTGTAGTTCATATTTTTAGATCAAAAAAGTGAACAGCCTAGTGGCTACGGCCAAAGAAGCTCCCAACTCAAAAGTGTTAGGCATTGCTTCGTAATTTAAAGCATGAATTTCTTCGTGTGTCATCTCTTCACGCGGTCGCTCCCGGTCCGCACGCACGCCCCCACACAGGAAAAAAATAGTCCGCGCCCTCGCACCAGAAAATAAAAATAGAGGCACTAGGGTTCGAATCCAACCCTAGTTACTAGGGAAGCGATTGCTCGGCTGCTACCGCAGGTTCGATTATATTGCACAAGGATTGATATTGTAAATATAAATATATAGTAATAATTTAAAAATTAAAAATATAATAATACAAACCTAGCAATGTATGGGAACTAACTAGTATCCCCTCAGTCCTAAAATATAATTCTTTCTAGCCTATTTTTTTGTCCACATTCGTTCAAATGATAATGAATATAGATATATATGGAAACTATATTTATATGTTACTCAATGAATATGTAATTAATCTAAAACGAATTATATTTTAGGATAGAGGGAAGTATAAATAAAAGAAAGGAAATTCAAGAGACAAGTACGAGGAGTCGGGGACTTGGGGGAGGCAATTCCCTCAAACGACTAGCTGGCCTCCTCATTCGTTACGCAGGCCAGGCCGCACTGCGCTCACGGCTTTTAGGTTGCACCAGTCCGGTAGCTTGGTCCACGAACGGCCTAGCGGATCCGTTACCGGCAATGCCGACTTGGGCCACGTTCACAGCAGCCCAGCAATGACGGCTCGTCATGTTAAAAATCCGCTACAACTTTGTAAATTCCATACCTCTAGTATTCATGTGCCATGAATCATGAACCTATTGTTTGTCTTGGGAGTTTTCTGGATTCAAACTTACTAATTTATTTTCTGTCTATAAATACCCTGTAAAACTACTGGTAAATAAAAAGGAGAAACCAATCATTTTGTTCCATTTGTCTCGTTGCTTCCTTGTTTTAGAGAAAAATGTATCAGCAATTCTTAAACTTGACACACCGTCATTTGGACCCTAAACTTAGAAAATCAGGAAAACGAGTTTGGAGCTCTTGGACTCTGATGCAAATAAAGCATGAGATTTGCACGGGATAGAGGAAATTAATATATCACAGGTCCCGTTTAGTGTCCGTTCGGTTACCTAGAATTCGACCCCGTTCTACCTCATTAAGAGTATACGTATATACTCTCTTTATTTGTCGCGTTTTAGTTTAAAAATGAACTAGCAAGCCATAAGTATTGGCCCTAGTAGTAATAAACCATTTCAGCCAGGAATCATTCCAGTATTCAATCCGAAGGAACCGGAGAGGGTACATCAGCCCCTCGCCCAGCTTTGTTTTATAGTTTTTGTTTTGTATTTTCTGAATTATTAAGACAAATTTTGTAGTATCCGAGTAGCACATGCAGTGCGTGTCGTCGTACGTGTCATGAAAAAAAGGCGTGTGGACATATGGAACACACGGTCACATATGC
SEQ ID NO.3(玉米密码子优化的Cas9基因的核苷酸序列)：
ATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTCGACATCGGCACCAACTCCGTCGGCTGGGCCGTCATCACCGACGAGTACAAGGTCCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTCGGCAACACCGACCGCCACTCCATCAAGAAGAACCTCATCGGCGCCCTCCTCTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCCTCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCTACACCCGCCGCAAGAACCGCATCTGCTACCTCCAGGAGATTTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTCGACGACTCCTTCTTCCACCGCCTCGAGGAGTCCTTCCTCGTCGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCACCCCATCTTCGGCAACATCGTCGACGAGGTCGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTCCGCAAGAAGCTCGTCGACTCCACCGACAAGGCCGACCTCCGCCTCATCTACCTCGCCCTCGCCCACATGATCAAGTTCCGCGGCCACTTCCTCATCGAGGGCGACCTCAACCCCGACAACTCCGACGTCGACAAGCTCTTCATCCAGCTCGTCCAGACCTACAACCAGCTCTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTCGACGCCAAGGCCATCCTCTCCGCCCGCCTCTCCAAGTCCCGCCGCCTCGAGAACCTCATCGCCCAGCTCCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTCTTCGGCAACCTCATCGCCCTCTCCCTCGGCCTCACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTCGCCGAGGACGCCAAGCTCCAGCTCTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTCGACAACCTCCTCGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTCTTCCTCGCCGCCAAGAACCTCTCCGACGCCATCCTCCTCTCCGACATCCTCCGCGTCAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTCTCCGCCTCCATGATCAAGCGCTACGACGAGCACCACCAGGACCTCACCCTCCTCAAGGCCCTCGTCCGCCAGCAGCTCCCCGAGAAGTACAAGGAGATTTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTCGTCAAGCTCAACCGCGAGGACCTCCTCCGCAAGCAGCGCACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTCGGCGAGCTGCACGCCATCCTCCGCCGCCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTCAAGGACAACCGCGAGAAGATCGAGAAGATCCTCACCTTCCGCATCCCCTACTACGTCGGCCCCCTCGCCCGCGGCAACTCCCGCTTCGCCTGGATGACCCGCAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTCGTCGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGCATGACCAACTTCGACAAGAACCTCCCCAACGAGAAGGTCCTCCCCAAGCACTCCCTCCTCTACGAGTACTTCACCGTCTACAACGAGCTGACCAAGGTCAAGTACGTCACCGAGGGCATGCGCAAGCCCGCCTTCCTCTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTCGACCTCCTCTTCAAGACCAACCGCAAGGTCACGGTCAAGCAGCTCAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTCGAGATCAGCGGCGTCGAGGACCGCTTCAACGCCTCCCTCGGCACCTACCACGACCTCCTCAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTCGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTCGAGGACATCGTCCTCACCCTCACCCTCTTCGAGGACCGCGAGATGATCGAGGAGCGCCTCAAGACCTACGCCCACCTCTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTCAAGCGCCGCCGCTACACCGGCTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTCATCAACGGCATCCGCGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTCGACTTCCTCAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGCAACTTCATGCAGCTCATCCACGACGACTCCCTCACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTCTCCGGCCAGGGCGACTCCCTCCACGAGCACATCGCCAACCTCGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTCCAGACCGTCAAGGTCGTCGACGAGCTGGTCAAGGTCATGGGCCGCCACAAGCCCGAGAACATCGTCATCGAGATGGCCCGCGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAGCGCATGAAGCGCATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTCAAGGAGCACCCCGTCGAGAACACCCAGCTCCAGAACGAGAAGCTCTACCTCTACTACCTCCAGAACGGCCGCGACATGTACGTCGACCAGGAGCTGGACATCAACCGCCTCTCCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCCCAGTCCTTCCTCAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTCACCCGCTCCGACAAGAACCGCGGCAAGTCCGACAACGTCCCCTCCGAGGAGGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGCCAGCTCCTCAACGCCAAGCTCATCACCCAGCGCAAGTTCGACAACCTCACCAAGGCCGAGCGCGGCGGCCTCTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGCCAGCTCGTCGAGACCCGCCAGATCACCAAGCACGTCGCCCAGATCCTCGACTCCCGCATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTCATCCGCGAGGTCAAGGTCATCACCCTCAAGTCCAAGCTCGTCTCCGACTTCCGCAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTCAACGCCGTCGTCGGCACCGCCCTCATCAAGAAGTACCCCAAGCTCGAGTCCGAGTTCGTCTACGGCGACTACAAGGTCTACGACGTCCGCAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCCGCAAGCGCCCCCTCATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTCTGGGACAAGGGCCGCGACTTCGCCACCGTCCGCAAGGTCCTCTCCATGCCCCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACCGAGGTCCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTCCCCAAGCGCAACTCCGACAAGCTCATCGCCCGCAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTCGCCTACTCCGTCCTCGTCGTCGCCAAGGTCGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTCAAGTCCGTCAAGGAGCTGCTCGGCATCACCATCATGGAGCGCTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTCAAGAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTCTTCGAGCTGGAGAACGGCCGCAAGCGCATGCTCGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAAAAGGGCAACGAGCTGGCCCTCCCCTCCAAGTACGTCAACTTCCTCTACCTCGCCTCCCACTACGAGAAGCTCAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTCTTCGTCGAGCAGCACAAGCACTACCTCGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGCGCGTCATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAGGTCCTCTCCGCCTACAACAAGCACCGCGACAAGCCCATCCGCGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTCTTCACCCTCACCAACCTCGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGCAAGCGCTACACCTCCACCAAGGAGGTCCTCGACGCCACCCTCATCCACCAGTCCATCACCGGCCTCTACGAGACCCGCATCGACCTCTCCCAGCTCGGCGGCGACGGCTCCGGATCCAAGCGCCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGTGA
SEQ ID NO.4(gRNA基因的核苷酸序列)：
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
SEQ ID NO.5(ZmCTA1-F的核苷酸序列)：TACTAGATTCGTACAATATTTAATGTATGTGT
SEQ ID NO.6(ZmCTA1-R的核苷酸序列)：TGATTTGAGGTGTCACAAGGGTG
SEQ ID NO.7(ZmPLTP-F的核苷酸序列)：CTGTGTTTGCACTAATCAGTCTCA
SEQ ID NO.8(ZmPLTP-R的核苷酸序列)：GCATATGTGACCGTGTGTTCCA
SEQ ID NO.9(Cas9-F的核苷酸序列)：ACAACTCCGACGTCGACAAG
SEQ ID NO.10(Cas9-R的核苷酸序列)：CGTAGCCGTTCTTGGACTGG
SEQ ID NO.11(Targe1-Bridge-Primer-F的核苷酸序列)：
GGAGTGAGTACGGTGTGCCTTATTATTGGGCATGGAGCACG
SEQ ID NO.12(Targe1-Bridge-Primer-R的核苷酸序列)：
GAGTTGGATGCTGGATGGTGCTGATCCATCATGTCGCC
SEQ ID NO.13(Targe2-Bridge-Primer-F的核苷酸序列)：
GGAGTGAGTACGGTGTGCGCCAGAGCCAGAGCCAG
SEQ ID NO.14(Targe2-Bridge-Primer-R的核苷酸序列)：
GAGTTGGATGCTGGATGGAACAAGAGTTCGGCACCACC
SEQ ID NO.15(Targe3-Bridge-Primer-F的核苷酸序列)：
GGAGTGAGTACGGTGTGCGCCCTAAATGTTGACCGGC
SEQ ID NO.16(Targe3-Bridge-Primer-R的核苷酸序列)：
GAGTTGGATGCTGGATGGGCCGAAGATATAGCGAGGGA
SEQ ID NO.17(Targe4-Bridge-Primer-F的核苷酸序列)：
GGAGTGAGTACGGTGTGCTGACTCTCGATCTGGCTCAC
SEQ ID NO.18(Targe4-Bridge-Primer-R的核苷酸序列)：
GAGTTGGATGCTGGATGGGGTAGGCATCTTGAACCCCA
SEQ ID NO.19(Barcoding-Primer-F(1)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTGCGTTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.20(Barcoding-Primer-F(2)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTGTAGTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.21(Barcoding-Primer-F(3)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTACGCTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.22(Barcoding-Primer-F(4)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTCTCGTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.23(Barcoding-Primer-F(5)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTGCTCTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.24(Barcoding-Primer-F(6)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTAGTCTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.25(Barcoding-Primer-F(7)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTCGACTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.26(Barcoding-Primer-F(8)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTGATGTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.27(Barcoding-Primer-F(9)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTATACTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.28(Barcoding-Primer-F(10)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTCACATGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.29(Barcoding-Primer-F(11)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTGTGCTGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.30(Barcoding-Primer-F(12)的核苷酸序列)：
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTACTATGGAGTGAGTACGGTGTGC
SEQ ID NO.31(Barcoding-Primer-R(A)的核苷酸序列)：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACCGACAAACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TT
SEQ ID NO.32(Barcoding-Primer-R(B)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTGCGTTGAGTTGGATGCTGGATGG
SEQ ID NO.33(Barcoding-Primer-R(C)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTGTAGTGAGTTGGATGCTGGATGG
SEQ ID NO.34(Barcoding-Primer-R(D)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTACGCTGAGTTGGATGCTGGATGG
SEQ ID NO.35(Barcoding-Primer-R(E)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTCTCGTGAGTTGGATGCTGGATGG
SEQ ID NO.36(Barcoding-Primer-R(F)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTGCTCTGAGTTGGATGCTGGATGG
SEQ ID NO.37(Barcoding-Primer-R(G)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTAGTCTGAGTTGGATGCTGGATGG
SEQ ID NO.38(Barcoding-Primer-R(H)的核苷酸序列)：
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGTCGACTGAGTTGGATGCTGGATGG
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，包括sgRNA转录单元和Cas9转录单元，所述sgRNA转录单元由顺次连接的启动子、靶向目标基因的gRNA基因和终止子组成，所述Cas9转录单元由顺次连接的植物愈伤组织特异表达启动子和Cas9基因组成，
所述植物愈伤组织特异表达启动子包括ZmCTA1启动子或ZmPLTP启动子，所述ZmCTA1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ZmPLTP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA转录单元中的启动子为U6启动子，终止子为U6终止子。
3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统。
4.权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、克隆获得ZmCTA1启动子或ZmPLTP启动子，并将其与Cas9基因顺次连接，组成Cas9转录单元；
S2、构建识别靶位点的sgRNA转录单元，并将Cas9转录单元和sgRNA转录单元同时导入双元载体，得到重组载体。
5.一种重组质粒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，或权利要求3所述的重组载体。
6.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求1或2所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求5所述的重组质粒。
7.一种应用权利要求1所述的愈伤组织特异CRISPR/Cas9基因编辑系统对植物基因组进行编辑的方法，其包括：将权利要求6所述的重组菌转化受体植物组织，获得被编辑的转基因植物材料。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括玉米。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述受体植物组织为未成熟的幼胚。
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