CN1471578A - 在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明人成功地开发出一种载体，该载体通过利用编码种子储藏蛋白的基因的5′－非翻译区在植物种子中高水平地表达外源基因。本发明人还利用种子储藏蛋白缺陷型突变体作为外源基因转移的靶而成功地在植物种子中高水平地蓄积外源基因产物。

Description

在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法

技术领域

本发明涉及在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法。

背景技术

根据种子储藏蛋白的溶解度，通常可将其分为四组蛋白，即谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白。不同于其它谷物诸如小麦和玉米，水稻种子的储藏蛋白主要是谷蛋白，约占种子储藏蛋白的70-80％。每一个单倍体基因组中的谷蛋白基因群包含约10个基因，这些基因分为两类，GluA和GluB，它们在编码区内在氨基酸序列水平上具有60-65％的同源性。每类包括约5种在氨基酸序列水平上具有80％或更高同源性的基团。谷蛋白基因在胚乳中特异地表达并蓄积。谷蛋白表达的组织特异性受到非常严格调控，并且谷蛋白不在其它组织诸如叶和根中表达。除了GluA-3外，谷蛋白基因的表达通常是受到调控的；它们的mRNA水平显示下面的模式：开花的5天后(第5天)出现，在约15天时达到最大值，并在之后降低。在谷蛋白基因群中GluB-1基因具有最强的启动子活性。

已经分离出这样的水稻突变体，其蓄积的谷蛋白即主要的种子储藏蛋白的量降低。例如Iida等从γ射线照射过的水稻品种Koshihikari中分离出下述隐性突变体，该突变体缺乏谷蛋白酸性亚基α1，αα2或α3之一。这些表型分别受单个隐性基因(即glu1，glu2或glu3)调控。通过上述三种突变体的杂交还可获得α1，α2和α3都缺乏的突变植株(α123)(Iida，S et al.，Theor.Appl.Genet.94：177-183(1997))。

LGC-1(低谷蛋白含量-1)是选自用EMS处理的Nihonmasari的突变体，其具有谷蛋白水平显著减低的表型(Iida，S.et al.，Theor.Appl.Genet.87：374-378(1993))。进一步鉴定出LGC-1具有谷醇溶蛋白和球蛋白的水平增高特征。LGC-1受单个显性基因调控。通过对LGC-1和α1，α 2和α3缺陷型突变体中缺陷型基因作图，显示LGC-1中突变的蛋白基因(lgc-1)和缺少α1的突变体中的突变的谷蛋白基因(glu1)位于相同的座位。使用谷蛋白(GluB)基因为探针进行的Southern杂交的结果显示，LGC-1在GluB基因或其附近包含突变。比较LGC-1和原始品种Nihonmasari抽穗(head spout)约16天后胚乳中GluB基因的表达水平，Northem印迹的分析结果显示，GluB在LGC-1中的表达显著降低。

已知大豆中的大豆球蛋白是一种种子储藏蛋白。大豆球蛋白以约60kDa的前体多肽的形式产生，其中信号肽，酸性多肽和碱性多肽结合在一起；后续过程中，信号肽被切离。此后，形成亚基，其中因Asn-Gly位点的切割产生的两种多肽-即特异性酸性多肽(A)和碱性多肽(B)-通过二硫键聚合。六个这样的亚基装配成六聚体，并储藏在蛋白体(PB)中。这种六聚体由于其沉降系数(11S)的缘故也称“11S种子储藏蛋白”。大豆球蛋白亚基基于其cDNA的一级结构和其氨基酸序列的同源性，分为组I和组II。目前已知组I的亚基A1aB1b，A1bB2和A2B1a以及组II的亚基A3B4和A5A4B3。已知6个这样的亚基在大豆的大豆球蛋白中几乎是随机组合。而且，据报道衍生自大豆的大豆球蛋白的A1aB1b亚基的肽能与胆汁酸结合(Shio Makino，The FoodIndustry 39(24)：77-87(1996))，这表明大豆蛋白降低血液中胆固醇水平的能力取决于A1aB1b亚基。

发明内容

本发明人集中研究大豆的大豆球蛋白的有利的生理功能，诸如上述降低胆固醇的效应，并且已成功得到一种水稻，其种子中储藏蛋白的组成已经通过在水稻种子胚乳中表达A1aB1b基因而改变(专利3030339)。然而，为了能通过食用这种水稻而产生预期的生理作用，需要高水平的表达。因此，需要开发和利用能在水稻中蓄积高水平外源基因产物的技术。本发明就是考虑到这些需求而进行的，本发明的目的是提供一种在植物种子中蓄积高水平外源基因产物的方法。

为了达到以上目的，本发明人力图改进启动子以在植物种子中高水平表达外源基因。通过检测水稻种子储藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的启动子区，显示出用于表达大豆球蛋白基因的常规载体未完全包含谷蛋白基因的5′-非翻译区。本发明人集中研究谷蛋白基因的5′-非翻译区(尚未认识到其重要性)，并检测将5′-非翻译区插入表达载体是否会改进mRNA的蓄积水平。结果显示，与常规大豆球蛋白基因转导体相比，在表达水平上没有改进，该转导体在GluB-1基因启动子和大豆球蛋白基因(A1aB1b)间插入了烟草光合基因的增强子序列(pSaDb)。然而，谷蛋白的完整5′-非翻译区的插入(ATG)显著升高mRNA和蛋白质的蓄积水平。

先前的研究从未考虑到在植物中表达外源基因的基因表达(转录和翻译)的最大能力。因此，仅仅力图将外源基因导入通常用于试验的植物品种。本发明人集中研究植物的“最大能力”，并假定用具体蛋白质缺陷型突变体可以更高水平的蓄积外源基因产物。因此，本发明人尝试用突变的植物表达和蓄积外源基因。

目前已知水稻中的几种缺少主要储藏蛋白的突变体，诸如LGC-1和α123。本发明人预计，这类种子储藏蛋白缺陷型突变体中，可用于蛋白质翻译的游离氨基酸的数量高于正常植物中的数量，因为这类游离氨基酸并未用于正常蓄积的储藏蛋白的生物合成。而且，本发明人认为LGC-1中谷蛋白启动子的使用能高水平表达外源基因，因为在LGC-1中谷蛋白基因的表达受到抑制，并由此可以使用最初用于谷蛋白表达的转录因子来表达外源基因。因此，本发明人将LGC-1或α123与大豆球蛋白转导体11-5杂交，以将大豆球蛋白基因导入该突变体，检测其种子中蓄积大豆球蛋白的水平。结果发现与11-5相比，所蓄积的大豆球蛋白的量在LGC×11-5和α123×11-5系统中显著升高。

因此本发明人通过利用编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区成功地开发了一种在植物种子中高水平表达外源基因的载体。本发明人还通过利用种子储藏蛋白缺陷型突变体作为基因转移的靶而成功地在植物种子中高水平地蓄积外源基因产物，并最终由此得出本发明。

更具体的是，本发明提供：

(1)一种在植物种子中蓄积外源基因产物的方法，包括下面的步骤：将外源基因导入内源种子储藏蛋白缺陷的植物中，并在该植物中表达外源基因；

(2)根据(1)的方法，其中外源基因导入使用的是一种载体，该载体包括与启动子下游操纵地连接的外源基因，所述启动子确保外源基因在植物种子中表达；

(3)根据(1)的方法，其中外源基因的导入是通过与包含所述外源基因的植物杂交进行的；

(4)根据(2)的方法，其中将编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区插入到外源基因和确保外源基因在植物种子中表达的启动子间；

(5)根据(4)的方法，其中5′-非翻译区是完整的；

(6)根据(4)或(5)的方法，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白组中蛋白的基因的5′-非翻译区；

(7)根据(6)的方法，其中5′-非翻译区包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(8)根据(1)-(7)中任一项所述的方法，其中植物中缺陷型种子储藏蛋白选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白；

(9)内源种子储藏蛋白缺陷的转化植物细胞，其中已导有外源基因；

(10)内源种子储藏蛋白缺陷的转化植物细胞，其中已导入一种包括与启动子下游操纵地连接的外源基因的载体，所述启动子确保外源基因在植物种子中表达；

(11)根据(10)的转化植物细胞，其中将编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区插入到外源基因和确保外源基因在植物种子中表达的启动子间；

(12)根据(11)的转化植物细胞，其中5′-非翻译区是完整的；

(13)根据(11)或(12)的转化植物细胞，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白中蛋白的基因5′-非翻译区；

(14)根据(13)的转化植物细胞，其中5′-非翻译区包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(15)根据(9)-(14)中任一项所述的转化植物细胞，其中植物中缺陷型种子储藏蛋白是选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白；

(16)一种转基因植物，包括(9)-(15)中任一项所述的转化植物细胞；

(17)一种载体，包含确保在植物种子中表达的启动子和与该启动子相连的编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区；

(18)根据(17)的载体，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白中蛋白的基因5′-非翻译区；

(19)根据(18)的载体，其中谷蛋白基因的5′-非翻译区包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(20)根据(17)-(19)中任一项所述的载体，其中确保在植物种子中表达的启动子是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白中蛋白的基因的启动子；

(21)根据(17)-(20)中任一项所述的载体，其中外源基因与5′-非翻译区的下游操纵地连接；

(22)一种导有(21)所述载体的转化植物细胞；

(23)一种包含(22)所述的转化植物细胞的转基因植物；

(24)一种是(16)或(23)的转化植物的后代或克隆的转基因植物；和

(25)一种(16)，(23)和(24)中任一项所述的转基因植物的育种材料。

本发明提供一种在植物种子中蓄积高水平外源基因产物的方法。该方法的特征在于利用内源种子储藏蛋白缺陷型突变体植物作为表达外源基因的靶。本文中术语“缺陷型”不仅包括完全缺陷还包括部分缺陷。在所述植物中，可用于蛋白质翻译的游离氨基酸的数量被认为高于正常植物中的，这导致能在种子中有效地蓄积外源基因的翻译产物。对植物中缺陷型种子储藏蛋白无特别限制；本发明包括，例如，谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白。

这些蛋白质缺陷型植物可选自放射诸如γ-射线处理过的植物种子，或突变诱导试剂诸如EMS和MNU处理过的植物种子。突变体植物可通过种子剖面法(bisection method)筛选。具体的是，将种子一分为二，自胚乳中提取蛋白质以筛选具有所需表型的种子。后代可得自相应于具有所需表型的选定胚乳的胚。

或者，具有蓄积水平降低的种子储藏蛋白的植物可通过共抑制或反义方法产生。对于共抑制而言，对需要降低的种子储藏蛋白的基因中一部分进行修饰，并将其导入植物。这种方式中，相对于该修饰基因的同源性高于一定值的基因，其表达被抑制(例如，在上述LGC-1突变体中，谷蛋白α1亚基基因发生突变，提示已经产生共抑制，该突变体源于用γ-射线照射过的植物)。另一方面，在反义方法中，将编码反义RNA的DNA导入植物，该RNA与要降低的基因的转录产物互补。

根据本发明，还可以使用已知缺少主要储藏蛋白的水稻突变体，诸如LGC-1和α123。

任何适合在植物种子中表达的基因都可用作外源基因。例如，可使用大豆大豆球蛋白作为外源基因产生具有较高附加价值、富含营养、具有极好的加工特征、和/或通过降低人血胆固醇水平能保持和改进健康的作物(专利3030339)。或者，可将被动免疫治疗的疫苗基因、修饰的谷蛋白基因(其中已将生理活性肽掺入其可变区)、或有用的酶基因导入水稻，以产生高附加价值的水稻。

为了在植物种子中表达外源基因，优先使用包含外源基因的载体，该外源基因可操纵地与确保在植物种子中表达的启动子的下游相连。本文中短语“可操纵地连接”是指外源基因与启动子相连，导致能应答启动子的激活而表达外源基因。

例如，为了在水稻种子中表达，谷蛋白基因启动子(Takaiwa，F.et al.，PlantMol.Biol.17：875-885(1991))可用作外源基因表达启动子。在豆科植物，诸如扁豆(string bean)，蚕豆，豌豆；或在油料种子植物诸如花生，芝麻，油菜籽，棉籽，向日葵，和红花中表达时，可以使用大豆球蛋白基因启动子或每种植物各自的主要储藏蛋白基因的启动子。例如，菜豆蛋白基因启动子(Murai，N.et al.，Science 222：476-482(1983))和cruciferin基因启动子(Rodin，J.et al.，Plant Mol.Biol.20：559-563(1992))分别用于扁豆和油菜籽。上述所给的启动子仅是实例，还可以使用用于组成型表达的启动子诸如35S启动子。

为了在植物种子中有效地蓄积外源基因产物，优选的是在载体内启动子和外源基因间插入编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区。所述5′-非翻译区的实例包括那些编码下述蛋白的基因的5′-非翻译区：谷蛋白基因(X54313，稻的(Oryza sativa)的谷蛋白GluA-3基因，gi|20207|emb|X54313.1|OSGLUA3[20207]；X54314，稻的谷蛋白GluB-1基因，gi|20209|emb|X54314.1|OSGLUB1[20209])，球蛋白(X62091，低分子量球蛋白，gi|5777591|emb|X62091.1|OSLMWG[5777591])，谷醇溶蛋白(D11385，稻的谷醇溶蛋白mRNA，完整cds，gi|218186|dbj|D11385.1|RICPLM[218186])，和清蛋白(D11431，水稻变应原蛋白的RA17基因，完整cds，gi|218194|dbj|D11431.1|RICRA17[218194]；D11432，水稻变应原蛋白的RA14基因，完整cds，gi|218192|dbj|D11432.1|RICRA14[218192])。特别优选的是完整形式的5′-非翻译区。本发明中还可使用衍生自编码两种不同种子储藏蛋白的基因的嵌合型5′-非翻译区。GluB-1基因的完整5′-非翻译区在SEQ IDNO：1中显示。

使用本领域技术人员所知的基因操作技术构建两种载体，一种是其中5′-非翻译区被插入到确保在植物种子中表达的启动子下游的载体，一种其中进一步插入外源基因的载体。

就本发明的实质而言，对用以导入载体的植物细胞的来源植物并无限制，只要是种子植物即可。例如，本发明的植物包括谷物，例如水稻，大麦，小麦，黑麦和玉米；豆科，例如扁豆，蚕豆和豌豆；和油料种子植物例如花生，芝麻，油菜籽，棉籽，向日葵，和红花等。

本发明中用以导入载体的植物细胞形式包括可再生为植物的各种形式。例如，包括在本发明中的形式有培养的细胞，原生质体，苗原基，多芽体，毛状根和愈伤组织，但并不限于这些。本发明的植物细胞还包括植物中的细胞。

可使用本领域技术人员所知的方法来将载体导入植物细胞。例如，这些方法包括使用根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌进行间接转导(Hiei，Y.et al.，Plant J.6：271-282(1994)；Takaiwa，F.et al.，Plant Sci.111：39-49(1995))；和直接转导，代表是电穿孔方法(Tada，Y.et al.，Theor.Appl.Genet.80：475(1990))，聚乙二醇方法(Datta，S.K.et al.，Plant Mol.Biol.20：619-629(1992))，以及粒子轰击的方法(Christou，P.et al.，Plant J.2：275-281(1992)；Fromm，M.E.，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

通过使转化的植物细胞再生可产生植物。再生的方法根据植物的类型有所不同。然而，代表性的方法包括Fujimura等的方法(Fujimura，T.et al.，PlantTissue Culture Lett.2：74(1995))，Armstrong等的方法(Armstrong，C.L andPhillips R.L.，Crop Sci.28：363-369(1988))，和Radke，S.E.等的方法(Radke，S.E.et al.，Theor.Appl.genet.75：685-694(1988))，分别对应于水稻，玉米和油菜籽。

除了上述方法，可利用杂交将外源基因导入内源种子储藏蛋白缺陷型植物。例如，首先，基因组中携带外源基因的植物通过将上述载体导入而产生。然后，该植物与内源种子储藏蛋白缺陷型植物杂交以将外源基因导入内源种子储藏蛋白缺陷型植物。

一旦获得其中已将外源基因导入基因组的转基因植物，就可通过有性繁殖获得植物后代。或者，可从植物和其后代或其克隆获得繁殖材料(例如种子，植株，愈伤组织和原生质体)，将其作为起始材料，用以产生大量的植物。通过表达外源基因，本发明的转基因植物可以在种子中蓄积高水平的外源基因产物。因此，根据种子中蓄积的具体外源基因产物的特征，种子的食用价值(fbod value)，加工特征，促进健康的作用等可以被有效地改变。而且，通过在种子中蓄积抗体或酶，可以有效地制备药用产物和工业材料。

附图简述

图1为用于检测5′-非翻译区(UTR)的效果的构建体。

图2为植物中所测的大豆球蛋白蓄积水平的比较结果，该植物用含有图1的5′-非翻译区的构建体转化。

图3为在转基因水稻种子中大豆大豆球蛋白的蓄积和表达。(A)为证明SDS-PAGE分析(上图)和Northern印迹分析(下图)结果的照片。(B)为显示(A)中结果的定量和比较。N表示包含谷蛋白和大豆球蛋白非翻译区嵌合序列的植物；ATG表示包含谷蛋白基因的完全5′-非翻译区；11-5表示常规大豆球蛋白基因转导体；Non-tra为非转基因植物。

图4的照片是通过胚乳蛋白的SDS-PAGE分析显示的、谷蛋白缺陷型表型对外源基因产物蓄积的影响。11-5为包含大豆球蛋白(A1aB1b)基因的转基因Matsuyama-mii；LGC指的是LGC-1；Non-tra为非转基因植物。

具体实施方式

下面将使用实施例具体描述本发明，但这并不推断为对本发明的限制。

(实施例1) 利用改进的启动子构建大豆大豆球蛋白表达载体以及产生表 达大豆大豆球蛋白的水稻植物

(1) 嵌合基因的构建和基因转移

将编码大豆球蛋白(A1aB1b)的cDNA与GluB-1基因启动子相连。在该cDNA和启动子之间，插入谷蛋白非翻译区(+1到18)和大豆球蛋白(-27到ATG)非翻译区的嵌合序列(45bp)(对于N而言)，或插入GluB-1基因的完全5′-非翻译区(对于ATG而言)(图1)。作为对照，构建一种表达载体，其插入了烟草光合基因翻译增强子序列pSaDb的5′-非翻译区。利用土壤杆菌法将包含这些嵌合基因的这些质粒导入水稻(Oryza sativa cv kitaake)(Goto，F.et al.，Nat.Biotechnol.17：282-286(1999))。

从水稻(Oryza sativa cv Mateuyama-mii)选出11-5，其中编码大豆球蛋白(A1aB1b)的cDNA与GluB-1基因启动子(-1302到+18)相连的嵌合基因通过电穿孔方法转移。

(2) GluB-1基因的5′-非翻译区对植物种子中外源基因表达的影响

通过土壤杆菌法将基因导入植物，对所得植物种子(T1)的蛋白水平进行分析。N，pSaDb和ATG的比较显示，蓄积高水平大豆球蛋白的植物出现的频率较高，顺序如下ATG＞N＞pSaDb(图2)。

然后，分别从蓄积高水平大豆球蛋白的N和ATG转基因植株中选出具有最高表达水平的植株，使其自交以筛选纯合子。接着，如下分析纯合子中的mRNA和蛋白质水平。在RNA分析中，首先通过SDS-酚方法提取RNA。开花后约15天的12粒未成熟种子用液氮冷冻，研钵内研磨成细小的粉末。使之与缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH9.0)，1％SDS，0.1M NaCl，5mM EDTA)和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合，提取总核酸。离心样品回收上清，并再次用酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)提取。通过乙醇沉淀法收集总核酸，重溶于蒸馏水中。然后，在2M LiCl中沉淀RNA。通过离心回收作为RNA样品。将RNA在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。所制得的膜42℃于50％(v/v)甲酰胺，6×SSC，0.5％(w/v)SDS，和5×Denhardt溶液中与³²p-标记的大豆球蛋白(A1aB1b)cDNA杂交。然后，将膜在室温于2×SSC，0.1％SDS溶液洗三次，然后在55℃于0.1×SSC，0.1％SDS溶液中冲洗20分钟。在蛋白质分析中，总蛋白通过每10mg成熟种子使用250ul提取缓冲液(62.5mMTris-HCl(pH6.8)，包含10％(v/v)甘油，0.25％w/v)SDS，和5％2-巯基乙醇)。所提取的蛋白质在100℃处理5分钟，然后进行SDS-PAGE。SDS-PAGE是用1 5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行的(丙烯酰胺：N，N′亚甲双丙烯酰胺＝30∶0.8)。

结果，发现N和ATG中A1aB1b的表达水平分别为11-5中的1.43倍和6.56倍(图3)。通过SDS-PAGE分离大豆球蛋白的酸性亚基，以比较蛋白质蓄积水平，结果发现，N和ATG中A1aB1b蓄积水平分别为11-5中的1.40倍和1.62倍(图3)。这些结果显示，GluB-1基因的5′-非翻译区特别是完全的5′-非翻译区插入在GluB-1基因启动子和编码大豆球蛋白(A1aB1b)的cDNA之间，可有效地改进外源基因的表达水平。

(实施例2) 利用突变体开发高水平蓄积外源基因产物的技术

11-5(Momma，K.et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.63：314-318(1999))与LGC-1(Iida，S.et al.，Theor.Appl.Genet.87：314-378(1993))或者α123(Iida，S.etal.，Theor.Appl.Genet.94：177-183(1997))杂交，收集它们的F1种子，将种子一分为二(种子剖面法)，用胚乳蛋白质提取和通过SDS-PAGE进行分析。基于SDS-PAGE的分析结果，显示相应于大豆球蛋白的强带和相应于谷蛋白酸性亚基的弱带的种子被筛选出来。重复这样的筛选，得到所有表型都均一的植物。

通过SDS-PAGE分析LGC×11-5和α123×11-5中的胚乳蛋白(图4)。结果，LGC×11-5显示LGC-1的表型，其中对应于所有37-39kDa的大豆球蛋白酸性亚基的带变弱(谷蛋白的总量减少到约三分之一)。相反，与大豆球蛋白转导体11-5相比，相应于转基因产物谷蛋白的酸性亚基的带显著变强(1.4倍)。另一方面，α123×11-5缺陷了在谷蛋白的酸性亚基α1，α2和α3，并且显示与α123相同的表型。在α123×11-5中，与大豆球蛋白转导体11-5相比，相应于转基因产物大豆球蛋白的酸性亚基的带显著变强(1.7倍)。

接着，定量蓄积转基因产物大豆球蛋白A1aB1b的量。具体的是，自从种子中提取总蛋白，点在硝酸纤维素膜上，利用抗-大豆球蛋白(A1aB1b)抗体进行免疫印迹。结果，在与LGC-1杂交的植物种子中，转基因产物大豆球蛋白酸性亚基的带显著增强。而且，在与α123杂交的那些中获得相似的结果。这些结果显示，将种子储藏蛋白缺陷型表型增加到可在种子胚乳中蓄积外源基因产物的品系中，可高水平地蓄积外源基因产物。

工业应用

本发明提供一种在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法。本发明的方法可作为重要的基础技术用于开发有用的农业产品和食物。

                                    序列表<110>独立行政法人农业生物资源研究所(National Institute of Agrobiological Sciences)

 生物系特定产业技术研究推进机构(Bio-oriented Technology ResearchAdvancement Institution)<120>在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法<130>MOA-A0004P<140><141><150>JP 2000-251606<151>2000-08-22<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>44<212>DNA<213>稻(Oryza sativa(Kasalath))<400>1tcacatcaat tagcttaagt ttccataagc aagtacaaat agct               44

Claims (25)

1.一种在植物种子中蓄积外源基因产物的方法，包括下面的步骤：将外源基因导入缺陷内源种子储藏蛋白的植物中，并在该植物中表达外源基因。

2.权利要求1的方法，其中外源基因使用载体来导入，该载体包括与启动子下游操纵地连接的外源基因，所述启动子可确保外源基因在植物种子中表达。

3.权利要求1的方法，其中外源基因的导入是通过与包含所述外源基因的植物的杂交进行的。

4.权利要求2的方法，其中将编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区插入到外源基因和确保外源基因在植物种子中表达的启动子间。

5.权利要求4的方法，其中5′-非翻译区是完整的。

6.权利要求4或5的方法，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白组中蛋白的基因的5′-非翻译区。

7.权利要求6的方法，其中5′-非翻译区包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中植物中缺陷型种子储藏蛋白选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白。

9.一种缺陷内源种子储藏蛋白的转化植物细胞，其中已导有外源基因。

10.一种缺陷内源种子储藏蛋白的转化植物细胞，其中已导入一种包括与启动子下游操纵地连接的外源基因的载体，所述启动子确保外源基因在植物种子中表达。

11.权利要求10的转化植物细胞，其中将编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区插入到表达载体中外源基因和确保外源基因在植物种子中表达的启动子间。

12.权利要求11的转化植物细胞，其中5′-非翻译区是完整的。

13.权利要求11或12的转化植物细胞，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白组中蛋白的基因5′-非翻译区。

14.权利要求13的转化植物细胞，其中5′-非翻译区包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

15.权利要求9-14中任一项所述的转化植物细胞，其中植物中缺陷型种子储藏蛋白选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白。

16.一种转基因植物，包括权利要求9-15中任一项所述的转化植物细胞。

17.一种载体，包含确保在植物种子中表达的启动子和与该启动子相连并编码种子储藏蛋白的基因的完整5′-非翻译区。

18.权利要求17的载体，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白中蛋白的基因5′-非翻译区。

19.权利要求18的载体，其中谷蛋白基因的5′-非翻译区包含SEQ IDNO：1的核苷酸序列。

20.权利要求17-19中任一项所述的载体，其中确保在植物种子中表达的启动子是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白中蛋白的基因的启动子。

21.权利要求17-20中任一项所述的载体，其中外源基因与5′-非翻译区的下游操纵地连接。

22.一种转化植物细胞，其中导入了权利要求21所述载体。

23.一种包含权利要求22所述的转化植物细胞的转基因植物。

24.一种转基因植物，其是权利要求16或23所述的转化植物的后代或克隆。

25.一种权利要求16，23和24中任一项所述的转基因植物的育种材料。

Images